CN103074353A - 一种人工合成的对鳞翅目高毒力的Bt双价融合蛋白及编码基因 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种对鳞翅目有毒的人工合成的苏云金芽孢杆菌杀虫基因，该人工合成的基因包含Vip83Cry9Ca^*基因的核苷酸序列及其编码的氨基酸序列。包含该基因质粒的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/Bt./6p/pGEVC9C保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2011363。经过生物学实验验证，证明该杀虫融合基因对鳞翅目具有毒性，可专一性毒杀小菜蛾等农业害虫。本发明公开了上述融合蛋白在转基因杀虫微生物方面的应用。

Description

一种人工合成的对鳞翅目高毒力的Bt双价融合蛋白及编码基因

技术领域

本发明涉及微生物基因工程领域，具体涉及一种人工合成的对鳞翅目有高毒力的Bt双价融合蛋白及其编码基因，该基因包括Vip83*和Cry9Ca*基因及其所述的构成和编码序列。 

技术背景

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)是口前最常用的商品化杀虫微生物，其表达杀虫晶体蛋白(Insecticidal crystal proteins)，营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal proteins)，对鳞翅目等农业上常见害虫具有专一性毒杀作用(喻子牛et al.，1996)。 

目前，在生产应用中使用最多的是杀虫晶体蛋白(ICPs)，ICPs主要分为俩大类，Cry类蛋白和Cyt类蛋白，截止2009年6月6日，克隆得到的ICPs基因已增至58群449中Cry类基因，2群27种Cyt基因(Crickmoreet al.，1998)。其晶体结构与功能以及杀虫机制已有了一定的了解(Li et al.，1991)。 

Cry类蛋白又称为δ内毒素，在序列结构上分为明显的N-半段跟C-半段，其中C-半段富含二硫键，而N-半段为核心毒性区，在空间结构上有分为3个结构域(Schnepf et al.，1998)。Domain I 6个亲水的α螺旋围绕一个疏水的α5螺旋，Domain II三个反平行β折叠片.Domain III两个反平行β折叠片形成β-sandwich(Galitsky et al..2001)。Cry类蛋白在进入敏感昆虫的中肠之后，在碱性环境下水解，切掉C-半段和N-段的几个氨基酸残基，活化成具有活性的δ内毒素，然后Domain II上各突起与敏感昆虫中肠上皮细胞的受体钙粘蛋白(Cadherin-like Protein)结合，形成毒素寡聚体，然后再与第二受体糖基磷酰肌糖锚定氨基多肽酶(GPI-APN)或者糖基磷酰肌糖锚定碱性磷酸酶(GPI-ALP)结合(Bravo et al.，2004)，诱使毒素构象发生变化，Domain I中疏水的α5螺旋伸出插入到昆虫中场上皮细胞的细胞膜，形成膜离子通道，进而引起细胞渗透平衡被破坏，细胞吸胀破裂，最后导致肠壁破裂，昆虫死亡(Bravo et al.，2004)。一般认为Domain III起到防止毒素被蛋白酶降解的作用，并参与到一部分受体的识别过程(Li et al.，1991)。 

自1996年转基因作物实现商业化以来，全球转基因作物种植面积每年均以两位数的百分率迅速增长。继2006年突破了1亿公顷后，2007年全球转基因作物种植面积已达1.143亿公顷，较1996年增长了67倍(张锐et al.，2007)。转基因作物育种已成为最富活力的农业技术，不仅创造了可观的经济、社会和生态效益，而且显示出对于未来解决环境、能源等重大问题的巨大潜力。 

目前，应用在发酵生物农药和转基因植物的主要为Cry类蛋白，但由于现在使用的Bt.杀虫基因存在着种类单一，害虫抗性增加迅速的问题。大多数为Bt.δ-内毒素晶体毒蛋白的Cry1Ac，少部分为嵌合的Cry1Ab；另外许多准备释放的转抗虫基因玉米和水稻大多数也是这两种基因。这种单一的抗虫基因推广给各种抗虫作物种植的抗虫性保持存在较大的风险，会缩短害虫对这两种基因产生抗性的时间。经实验证实，Cry1Ac在棉铃虫中肠上皮细胞结合区位于钙粘蛋白Cadherin第1217-1461位于245个氨基酸残基组成的肽链上。这个区域的缺失或者突变可能导致棉铃虫抗性的急剧增加(Peng et al.，2010)。因此，开发新型杀虫蛋自，或者将不存在交叉抗性的几种杀虫蛋白构建成融合基因，可以减缓害虫抗性产生的速率，这已经成为当前转基因研究的热点。 

营养期杀虫蛋白Vip3A被誉为第二代杀虫蛋白，与杀虫晶体蛋白ICPs不同，Vip3A苏云金芽孢杆菌营养生长期所产生的蛋白，对鳞翅目昆虫具有很独特的杀虫活性，尤其对ICPs有抗性的小地老虎的毒性比Cry1Ac高260倍，对鞘翅目无效。它不同于Bt芽孢期产生的晶体毒蛋白ICPs，其晶体结构，敏感昆虫肠道受体，杀虫作用机理尚不明确(Estruch et al.，1996)。Vip3A在昆虫肠道内被水解为四种主要蛋白产物，其中33KD的蛋白水解产物为Vip3A蛋白的毒性核心结构。Vip3A毒蛋白只要在pH5.0-10.0时均可溶解，其C-末端也不被切除，与敏感昆虫上皮细胞结合，诱发昆虫细胞凋亡，细胞核溶解，最终昆虫死亡。这个可能的毒性机制不能排除孔形成机制(Yu et al.，1997)。 

与晶体毒素相比较，营养期杀虫蛋白的研究还刚刚起步不久。Estruch已经成功地将Vip3Aa基因与不同的启动子(如PEPC，Ubi和MTL等)构成表达质粒通过粒子轰击法导入玉米愈伤组织，得到的转基因玉米，对小地老虎和草地贪夜蛾的杀虫效果都很好。peng等评价了转BtVip3A基因的安全性，急性和亚急性的毒理学研究未发现负面的作用，证明利用Vip3A进行生物害虫防治是安全的(Peng et al.，2007)。相信在未来的时间里，营养期杀虫蛋白在延缓害虫对Bt毒素抗性进化上将发挥重要作用。 

Vip83基因是本申请人所在的农业微生物国家重点实验室从苏云金芽孢杆菌YBT-833中克隆得到的，这个基因与Vip3A存在两个氨基酸的差异(即Gln²⁸⁴→Lys²⁸⁴，Pro⁸⁰⁴→Ser⁸⁰⁴)，属于Vip3A家族，对小菜蛾，棉铃虫，甜菜夜蛾等鳞翅目具有毒力(蔡启良et al.，2002)。 

Vip3A与ICP两种毒蛋白在昆虫中肠作用机制不同，二者对昆虫不产生交叉抗性，因此将两种杀虫蛋白同时喂食害虫可以减缓其产生抗性的速率，目前将Vip3A和Cry9Ca作融合表达未见先例。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，针对目前转基因Bt.杀虫蛋白资源存在的不足，本发明合成了一种能够提高杀虫毒力和减缓害虫抗性的抗虫融合基因，该基因根据陆地棉偏爱性密码子优化后的基因序列(其核苷酸序列和编码的氨基酸序列见序列表SEQ ID NO：1所示，其蛋白质的序列见SEQ ID NO：2所示)，本发明涉及该基因编码的融合蛋白以及该融合蛋白的用途。 

本发明以申请人所在的农业微生物国家重点实验室保存的Vip83基因(参见：Genebank登录号AY044227)和Cry9Ca基因的氨基酸序列(参见：Genebank登录号AX100534)为蓝本，根据陆地棉偏爱的密码子，优化后人工合成了二个Bt.杀虫基因，申请人将该两个基因分别命名为Vip83*和Cry9Ca*。其中，Cry9Ca*只包括有活性的N-半段δ内毒素。申请人将上述得到的Vip83*和Cry9Ca*进行融合后得到如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO：2所示蛋白质的序列。 

本发明通过以下技术方案来实现目的： 

申请人提供了一段杀虫融合基因，该基因包括从5’-3’，依次含有编码Vip83*毒素的核苷酸序列和编码或切除了C半段的Cry9Ca*的核苷酸序列；且上述两个蛋白的核苷酸序列使用同一个开放阅读框内，中间用一段肠激酶序列(EK site)分开。该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，序列全长为4269bp，其中1-4269bp为该基因的编码区，它编码1422个氨基酸。SEQ ID：2是本发明合成的该基因的蛋白质的序列。 

将上述杀虫融合基因装载在pGEX-6P-1表达载体(购自美国GE Healthcare公司)上，构成重组质粒 pGEVC9C(图谱见图7A)，其融合基因位于GST标签后，可以在Escherichia coliBL21(该大肠杆菌Escherichia coliBL21购自Invitrogen公司)中进行异源表达，表达出的融合蛋白大小为183.7kDa(见图6)，表达产物对鳞翅目具有毒力，以小菜蛾作为生测昆虫的结果表明：Vip83Cry9Ca*的LC50为0.3ug/ml。 

申请人已将包含该基因质粒pGEVC9C的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/Bt./6p/pGEVC9C，于2011年10月24日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO：M2011363 

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明合成的杀虫基因Vip83Cry9Ca*核苷酸序列和编码序列，序列全长为4269bp，其中第1-4269bp处为编码区。 

序列表SEQ ID NO：2是本发明合成杀虫基因Vip83Cry9Ca*的蛋白质的序列。共1422氨基酸，分子量为159.433.40kDa。 

图1：本发明技术流程图。 

图2：是陆地棉偏爱密码子序列。 

图3：Vip83基因和Cry9Ca基因的优化前后的序列对比。在基因名称后有*标记的为优化后的合成基因。阴影区黑底白字区域代表合成的序列与原始序列一致(相同)的核苷酸，浅色阴影区代表改变后的核苷酸。其中图3A：是优化前后Vip83基因序列的对比。图3B：是优化前后Cry9Ca基因的对比。 

图4：优化后的Vip83*序列对比野生型Vip83序列各项改变指标。其中，图4A是优化前后的Vip83*的CAI值对比，图4B是优化前后的Vip83的GC含量变化。 

图5：优化后的Cry9Ca*序列对比野生型Cry9Ca序列各项改变指标，其中，图5A是优化前后的Cry9Ca的CAI值对比，图5B是优化前后的Cry9Ca的GC含量变化。 

图6：用大肠杆菌BL21表达的杀虫融合蛋白的SDS-PAGE分析。 

图中1.Takara wide range proteins Marker；2.空载体pGEX-6P-1；3.质粒pGEVip83；4.质粒pGECry9Ca；5.质粒pGEVC9C. 

图7：是本发明的实施例构建的所有质粒图谱。其中：图7A：原核表达质粒pGEVC9C图谱。图7B：原核表达载体质粒pGEX-6P-1图谱；图7C：原核表达质粒pGEVip图谱：图7D：原核表达质粒pGEC9C图谱；图7E：原核克隆质粒pUC57-V83图谱；图7F：原核克隆质粒pUC57-C9C图谱。 

具体实施方式

实施例1陆地棉密码子偏爱的Vip83*；Cry9Ca*基因优化 

优化步骤：使用密码子偏爱性查询使用在线数据库Codon Usage Database(http://www.kazusa.or.jp/codon)在QUERY Box for search with Latin name of organism对话框中输入Gossypium hirsutum，点击submit，在弹出的网页中选择Gossypium hirsutum。得到陆地棉偏爱氨基酸密码子序列表(见图2)。从图2中可以分析得出，陆地棉使用的基因GC含量为45.83％，第二位，第三位密码密码子偏爱A或者T。 

从Genebank中查找出Vip83(登录号AY044227)和Cry9Ca(登录号AX100534)的序列，根据从Codon Usage Database中得到的图2所述的偏爱密码子，采用植物基因高频使用密码子部分置换Vip83和Cry9Ca的原始序列对应的密码子，部分去除ATTTA，AATGAA等富含AT序列和不明确内含子序列，以及排除基因中大的反向重复序列和常用的限制性内切酶序列，并且去掉Vip83*序列的终止密码子并在3’端添加了一段肠激酶切点序列，在序列的两端分别添加PstI和XhoI酶切位点方便今后转基因克隆，后将设计好的序列交南京金斯瑞生物科技公司人工化学合成。优化合成后的基因通过EcoRV平末端的酶切位点分别装载在pUC57-V83(图谱见图7E)；pUC57-C9C(图谱见图7F)载体上，优化前后的序列对比见图3A，图3B。经测序后的Blastn分析，人工合成的Vip83*和Cry9Ca*基因氨基酸序列与原始序列完全一致。 

人工合成后的Vip83*序列核苷酸序列与原始Vip83序列同源性71.4％，偏爱密码子的分布值CAI从0.78上升到0.87，GC含量的变化从30.91％上升到40.51％(见图4A，图4B)，并且在其3’端添加了一段由4个天冬氨酸1个赖氨酸构成的肠激酶切点及其位点保护序列(EK site)。 

人工合成后的Cry9Ca*序列与原始Cry9Ca序列同源性72.58％，偏爱密码子的分布值CAI从0.68上升到0.91，GC含量的变化从64.55％下降到42.62％(见图5A，图5B)。 

实施例2原核表达质粒pGEVC9C，pGEVip，pGEC9C的构建。 

Vip83^＊基因的扩增：根据Vip83*序列(序列见图3A)见，设计扩增引物，引物5’端添加BamH I酶切位点，3’端去除终止密码子，添加酶切位点EcoR I，该引物设计序列如下： 

正向引物(5’-Vip83-BamH I)：5’-ACCGGATCCATGAACAAAAACAAT-3’下划线部分为酶切位点。 

反向引物(3’-Vip83-EcoR I)：5’-AAGGAATTCCTTATCATCATCATC-3’下划线部分为酶切位点。 

以pUC57-V83质粒为模板，PCR扩增Vip83*。 

PCR反应体系如下(反应总体积50μl)： 

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min20s；30个循环；72℃延伸10min，4℃保存5min结束。 

PCR产物纯化采用AxyGen公司PCR纯化试剂盒(按照试剂盒的说明书操作)进行产物回收纯化。 

质粒载体的提取：从划线平板上挑取保存有pGEX-6P-1载体(图谱见图7B，购自美国GE Healthcare公司)单菌落，用装有5ml LB液体培养基(含有100μg/ml Amp购自北京全式金公司)的试管内，37℃过夜。取1.5ml LB液体培养基12000rpm离心1min，弃上清，沉淀中加入200μl溶液I(50mM葡萄糖，25mM Tris·HCI(PH8.0)，10mM EDAT(pH8.0)，Lysoznyle 20mg/ml；混匀，加入400ml溶液II(0.2M NaOH，1％SDS)，轻轻颠倒混匀，放置1-2min，加入300ml溶液III(3MKAc，用冰乙酸调至pH4.8)。冰上放置5min。12000rpm离心10min，取上清，加入等体积异丙醇，12000min 4℃低温离心10min；弃上清，沉淀用70％乙醇洗涤后，12000min 4℃低温离心10min；弃上清，沉淀用50μl去离子水溶解。取3μl电泳检测。 

酶解PCR产物和质粒载体pGEX-6P-1：PCR产物用限制性内切酶BamHI/EcoRI(购自宝生物工程大连有限公司)酶解，得到酶解产物。酶解体系如下：(1)100μl酶解体系中含90μl PCR产物；5μl 10×H Buffer；2.5μl BamH I；2.5μl EcoR I。(2)100μl酶解体系中含90μl pGEX-6P-1质粒载体；5μl 10×H Buffer；2.5μlBamH I；2.5μl EcoR I。均在37℃过夜。 

酶切产物经7％的琼脂糖电泳后，使用AxyGen公司的胶回收试剂盒，按照说明书回收电泳产物。 

原核表达质粒pGEVip的构建： 

酶连：25μl连接体系中含有： 

经BamHI/EcoRI双酶切的pGEX-6P-1载体0.03nmol以及经BamH I/EcoR I双酶切后的Vip83*PCR产物0.21nmol；T4 DNA ligase(购自Fermentas公司)2.5μl；T4 DNA ligase Buffer 2.5μl；加水补至25μl，16℃酶连4h。 

转化：取酶连产物1μl与50μl大肠杆菌感受态细胞DH5α(购自Invitrogen公司)混合，加入到预冷的1mm电转杯(购自BioRad公司)中，在2.1KV电压下电击；然后迅速加入600μl LB液体培养基，37℃复苏1h；涂布在含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)抗生素的LB固体平板上，37℃过夜，挑取转化子，接液体LB培养基抽取质粒电泳验证。 

将把Vip83*基因插入到pGEX-6P-1载体的质粒命名为pGEVip(图谱见图7C)，质粒的DNA序列全长为7366bp，其中Vip83*基因位于GST标签之后(见附图7，)3’末端添加有由4个天冬氨酸1个赖氨酸组成的肠激酶识别切点，终止密码子使用位于pGEX-6P-1质粒之后的多联终止密码子序列防止通读，构建好的pGEVip质粒可以表达携带有肠激酶切点完整的单价Vip83*基因，作为单价对照。 

大量提取验证正确的阳性转化子的pGEVip，后使用EcoR I/Xho I限制性内切酶(购自宝生物工程大连有限公司)将pGEVip酶解，酶解体系：100μl中含，90μl pGEVip质粒载体；5μl 10×H Buffer；2.5μl BamHI；2.5μl EcoR I。37℃过夜。 

Cry9Ca^＊基因的扩增：根据Cry9Ca*基因的序列(见图3B)，设计扩增引物，引物5’端添加EcoR I酶切位点，3’端添加酶切位点Xho I，该引物的DNA序列如下所述： 

正向引物(5’-Cry9Ca-EcoR I)：5’AAGGAATTCATGGCTGATTACCTT-3’下划线部分为酶切位点 

反向引物(3’-Cry9Ca-Xho I)：5’AAGCTCGAGTCAATCCTCTTCTGCC-3’下划线部分为酶切位点 

以pUC57-C9C质粒(图谱见图7F)为模板，PCR扩增Cry9Ca*。PCR体系如下： 

PCR反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min；30个循环；72℃延伸10min，4℃保存5min结束。 

将扩增出来的Cry9Ca*PCR产物用EcoR I/Xho I限制性内切酶酶解，酶解条件跟体系同上一致。 

原核表达质粒pGEVC9C的构建：将上述酶解后的pGEVip载体与Cry9Ca*PCR产物使用纯化试剂盒回收。按照上述连接反应体系连接，转化。 

挑去转化子，验证阳性克隆，将正确插入的克隆质粒命名为pGEVC9C，质粒全长为9235bp，图谱如图6所示。 

原核表达质粒pGEC9C的构建：将提取的pGEX-6P-1质粒使用限制性内切酶EcoR I和Xho I酶解，酶解条件跟体系同上(同原核表达质粒pGEVip的构建步骤)一致。琼脂糖电泳后使用胶回收试剂盒将酶解产物回收，与经EcoR I和Xho I限制性内切酶酶解后的Cry9Ca片段酶连，酶连条件与体系同上一致(同原核表达质粒pGEVip的构建步骤)。转化后，挑去转化子，验证阳性克隆，将正确插入的克隆质粒命名为pGEC9C(图谱如图8所示)，质粒全长为6853bp。构建好的pGEC9C质粒可以表达完整的Cry9Ca*基因，作为单价对照 

实施例3 Vip83Cry9Ca*融合基因在大肠杆菌中的原核表达和生物测定。 

将pGEVC9C质粒，pGEVip质粒，和pGEC9C质粒分别转入大肠杆菌表达宿主BL21。验证阳性克隆，将鉴定正确的克隆子过夜活化，以体积比为1％的接种量转接至1L含100μg/ml Amp的LB液体培养基中，37℃培养2-3h，当A600达到0.6左右，加入诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，22℃，180rpm培养25h。离心收集菌体，然后用1％Tris缓冲液(1％Tris，50mM NaCl)将菌体洗涤一遍，再用50ml 50mM NaNO₃，加入2％巯基乙醇溶液重悬菌体。然后使用高压破碎仪(购自GEA Niro Soari公司型号：NSI0012K)破碎细胞，收集细胞破碎液。 

利用SDS-PAGE方法检测融合蛋白表达量。 

浓缩胶浓度为5％，配方如下： 

分离胶浓度为12％，配方如下： 

取80μl细胞破碎液，加入20μl蛋白上样缓冲液(5×，购买自宝生物工程大连有限公司)，沸水浴5min，然后上样10μl电泳检测，SDS-PAGE电泳检测结果见图6，表明本发明构建的杀虫融合基因Vip83Cry9Ca*在大肠杆菌中得到正确表达，加上5’端的GST标签大小为183.7kDa。而作为对照的单价Vip83*基因和Cry9Ca*基因也得到了止确表达，Vip83*基因加上5’端得GST标签后大小为114kDa，Cry9Ca*基因加上前边的GST标签后大小为95.7kDa(见图6)。 

使用BioRad公司的Quantity One 1D凝胶分析软件，以宝生物工程大连有限公司的Wide Range ProteinMarker中的200kDa条带为标准(浓度约为1ng/μl)，根据光密度定量融合蛋白浓度。 

杀虫融合蛋白毒力的生物测定： 

使用小菜蛾作为测试昆虫，所作生物测定由湖北科诺生物农药技术公司完成。 

小菜蛾的测定采用浸叶法，具体步骤是：将甘蓝叶片用清水洗净晾干，选取鲜嫩一致的甘蓝叶片切成大小相近的块状，将诱导的样品细胞超声波破碎(600Hz)，将破碎液两倍稀释后浸泡甘蓝叶片10min，将叶片晾干，放入生测瓶中，每瓶接2-3龄小菜蛾幼虫20头，每个处理重复三次，25℃生化培养箱中保温，培养48h后调查死、活虫数，并观察幼虫取食情况。统计结果使用SPSS软件计算半致死浓度LC₅₀，本发明合成的杀虫融合基因Vip83Cry9Ca与单价杀虫基因Vip83，Cry9Ca对小菜蛾的毒力测定如表1所示。 

表1本发明合成的杀虫融合基因对小菜蛾的毒力 

说明：在本说明书中，来源于Genebank的原序列用Vip83，Cry9Ca表示(无＊号标记)，人工合成的序列用Vip83^＊，Cry9Ca^＊，Vip83Cry9Ca^＊表示(有＊号标记)。 

参考文献： 

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Claims (6)

1.一种人工合成的融合杀虫基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所述。

2.一种融合杀虫蛋白，其蛋白质的序列如序列表SEQ ID NO：2所述，其分子量为159.433.40kDa。

3.一种表达苏云金芽胞杆菌杀虫融合蛋白的大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α/Bt./6p/pGEVC9C，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCCNO：M2011363，它包含如序列表SEQ ID NO：2所述的蛋白质的序列。

4.权利要要求1所述的基因在制备苏云金芽胞杆菌微生物制剂中的应用。

5.权利要求3所述的大肠杆菌在制备苏云金芽胞杆菌微生物制剂中的应用。

6.权利要求2所述的杀虫蛋白在制备苏云金芽胞杆菌微生物制剂中的应用。 

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