CN105505988A - 可实现农杆菌共转化的双t-dna载体及其构建方法和应用 - Google Patents

可实现农杆菌共转化的双t-dna载体及其构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体，其是将报告基因GUS和抗性筛选标记基因串联，将荧光报告基因和目的基因串联，然后将两个串联序列分别连入两个独立的T-DNA区，并构建到植物双元表达载体上构建得到的。利用该载体培育无选择标记的转基因植物，能快速从后代中检测阳性转基因植株。

Description

可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于基因工程领域，具体地说，涉及一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体及其构建方法和应用。
背景技术
当今中国，粮食供需矛盾日益突出。基因工程技术作为现今改良农作物品种，提高农作物的产量和品质最直接有效的技术手段具有越来越重要的现实意义。
转基因技术兴起于二十世纪八十年代，目前该技术已成为作物高产、优质、高抗、广适育种最直接有效的技术手段。该技术已成功应用于包括经济作物、粮食作物、蔬菜、花卉、药用植物、果树以及牧草等的改良。数据报告指出，2014年全球转基因作物种植面积为创纪录的1.815亿公顷，比2013年增加了600万公顷。中国转基因作物种植面积为390万公顷，位于世界第六位。可见转基因技术已成为近代农业史上发展利用最快的新技术。但是，在该技术迅猛发展与高效利用的背后，人们关注的焦点也由转基因植物带来的经济和社会效益转向转基因植物的安全问题。抗生素抗性和除草剂抗性的选择标记基因的使用导致临床用抗生素失效；抗除草剂基因流入大自然创造出超级杂草；该类基因及其表达产物危害动物和人类健康等问题引发热议。因此，如何高效快捷的避免常规转基因植物标记基因在转基因植物中留存成为现今植物转基因技术的重要目标和迫切任务。
目前，针对以上问题研究者对该技术进行了改进：后期对选择标记基因实行敲除；使用无争议的生物安全基因作为标记基因；不使用选择标记基因。三种方案中使用无争议的生物安全基因作为标记基因克服了不使用标记基因导致的工作量大的问题，成为主流技术手段。而在后期实施选择标记基因敲除则可以在避免选择标记基因所带来的安全隐患的同时提高多基因转化的成功率。因此，利用生物学手段将已获得的转基因植株中的选择标记基因敲除和使用无争议的生物安全基因作为标记基因成为当前转基因研究的主要手段。
植物转基因体系要求报告基因是一种表达产物非常容易被鉴定的基因。GUS基因和绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前最常用的两种报告基因，二者虽然在作用机理和检测手段上完全不同，但是作为报告基因二者共同点就是检测方便快捷。GUS基因(β-D-葡萄糖苷酸酶基因)，作为常用报告基因之一，其作用机理是在植物体内表达产生β-葡萄糖苷酸酶从而催化裂解一系列的β-葡萄糖苷酸，将5-溴-4氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸脂(X-Gluc)分解为蓝色物质。因此，通过含有X-Gluc的染液对植物组织染色就可直观的判断植物组织中GUS基因存在与否。绿色荧光蛋白(GFP)基因作为另一种常用的报告基因是海洋生物中分离得到的一种控制生物体内生物发光蛋白合成的基因，外界对该类生物发光蛋白施与紫外或蓝光时，GFP会发出绿色荧光。对GFP进行检测时激发光源是唯一需要的条件，通过激发光源照射活体材料就可以直观的判断材料中GFP的表达情况。此外GFP基因无论在原核生物还是真核生物中都能表达出对细胞没有毒害作用且不影响细胞正常生长的蛋白质。
报告基因的使用是为了迅速准确的检测到转基因阳性组织或个体，在转基因过程中还有另外一个不容忽视的问题，任何转基因技术手段得到的转化细胞与非转化细胞相比都只占少数，两者存在竞争，而作为异种细胞的转化细胞的竞争力很弱。因此，必须对转化细胞进行筛选。在有选择压力的条件下，利用抗性基因在转化体内的表达，有利于从大量的非转化细胞中选择出转化克隆。此类基因即为选择标记基因，该类基因的使用大大减少后期工作量，目前使用的选择标记基因主要是抗潮霉素基因、抗除草剂基因等。
目前，在众多转基因植株选择标记基因剔除的方法中，共转化法备受关注，该方法具有简便高效的特性，已被广泛应用于粮食作物、油料作物以及经济作物的转基因植株选择标记基因的剔除。众所周知，将选择标记基因和待转化的目标基因分别构建到两个独立的载体上，通过将两个载体同时转化植物受体，得到转基因共整合体T0代，在T1代生殖生长阶段通过配子体重组得到只含目的基因的转基因阳性植株T2代，即为共转化法。在对共转化法深入研究的过程中，研究人员逐渐认识到该方法存在弊端，首先不同的受体组织对选择标记基因和目的基因的整合效率有差异，T0代中只含有目的基因的个体将被淘汰，而只含有选择标记基因的个体则会被错误的留存；再者选择标记基因和目的基因在转化过程中容易整合到受体植物基因组的同一个位点，最终在后代中难以达到分离的目的。在之后的研究中通过将选择标记基因和目的基因插入到同一质粒中相互独立的T-DNA区内构成的含有两个T-DNA区的超级双元载体大幅度提高了选择标记基因和目的基因的共整合效率，但是大部分的选择标记基因和目的基因都整合到了基因组的同一位点使得在T1代生殖生长过程中，双T-DNA载体上的基因不能分离，无法获得只含有目的基因的转基因阳性植株。建立简便快速的，剔除选择标记基因得到仅含有目的基因的安全转基因植株的方法，是目前植物转基因工作的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体。
本发明的另一目的是提供上述双T-DNA载体的构建方法及应用。
为了实现本发明目的，本发明的一种可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体，其是将报告基因GUS和抗性筛选标记基因串联，将荧光报告基因和目的基因串联，然后将两个串联序列分别连入两个独立的T-DNA区，并构建到植物双元表达载体(例如pCAMBIA1302)上构建得到的。
所述抗性筛选标记基因包括抗生素抗性基因和抗除草剂基因；所述抗生素抗性基因包括潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因；所述荧光报告基因包括GFP、RFP、YFP、BFP以及它们的增强型基因等。
本发明的可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体其核苷酸序列如SEQIDNO:25所示。
本发明还提供所述双T-DNA载体的构建方法，包括以下步骤：
1)载体A的构建：以pCAMBIA1302载体为骨架，设计引物分别通过PCR扩增得到终止子NOS和T-DNA左边界LB，NOS引入酶切位点BsteII和BamHI，LB引入酶切位点BglII和SphI，其中BamHI和BglII是同尾酶；将扩增得到的NOS和LB分别连到PMD19-T载体上，用酶BsteII和BamHI将NOS片段切下，用酶BglII和SphI将LB切下，将得到的酶切两个片段与载体PCAMBIA1302经BsteII和SphI酶切后回收的大片段，用T4连接酶进行三片段连接，得到含有两个LB边界的载体A；
2)载体B的构建：设计同源重组特异引物，通过PCR扩增得到两个独立UBI启动子片段，用酶BamHI和SpeI对载体A进行酶切，回收大片段，与上述扩增得到的两个独立UBI启动子片段采用同源重组的方法进行连接，得到含有两个背对的UBI启动子，且两个背对的UBI之间含有SalI酶切位点的载体B；
3)载体C的构建：以pCAMBIA1302载体为骨架，设计引物通过PCR扩增得到两个独立右边界RB，对载体B进行SalI单酶切，与上述扩增得到的两个独立RB片段采用同源重组的方法进行连接，得到含有两个背对的RB的载体C；
4)双T-DNA载体的构建：设计同源重组特异引物扩增GUS156基因片段和Nospoly-A，分别回收PCR产物，对载体C进行KpnI单酶切，利用多片段同源重组将酶切后的载体C与扩增得到GUS156基因片段和Nospoly-A连接，构建得到双T-DNA载体。
其中，步骤1)扩增终止子NOS的引物序列如SEQIDNO:1和2所示，扩增T-DNA左边界LB的引物序列如SEQIDNO:3和4所示；扩增得到的终止子NOS和T-DNA左边界LB序列分别如SEQIDNO:5和6所示。
步骤2)扩增两个独立UBI启动子片段的引物序列分别如SEQIDNO:7-10所示；扩增得到的两个独立UBI启动子片段分别如SEQIDNO:11和12所示。
步骤3)扩增两个独立右边界RB的引物序列分别如SEQIDNO:13-16所示；扩增得到的两个独立右边界RB序列分别如SEQIDNO:17和18所示。
步骤4)扩增Nospoly-A的引物序列分别如SEQIDNO:19和20所示，扩增GUS156基因片段的引物序列分别如SEQIDNO:21和22所示；扩增得到的Nospoly-A和GUS156基因片段序列分别如SEQIDNO:23和24所示。
本发明进一步提供所述双T-DNA载体在制备无选择标记的转基因植物中的应用。
通过叶盘法转化烟草，通过对再生植株叶片进行GUS染色和GFP检测，筛选得到既能被X-GLUC染液染成蓝色，又能在紫外或蓝光激发下观察到绿色荧光蛋白的阳性转基因植株。
本发明针对如何快速的剔除选择标记基因得到只含有目的基因的安全转基因植株的方法的问题，结合生物安全标记基因的利用以及剔除转基因植株选择标记基因这两个研究热点，对传统的双T-DNA载体进行了改进。在载体构建过程中，为了有效提高基因整合的效率以及安全转基因植株的产生，将报告基因GUS基因和筛选基因抗潮霉素基因串联，将GFP基因和目的基因串联(串联过程保证四个基因均具有本身完整的表达框)，分别连入两个独立的T-DNA区，这样就构建得到含有双报告基因的双T-DNA载体，后续通过检测两个报告基因，就能快速筛选得到含有目的基因和生物安全标记GFP的转基因安全植株。
本发明具有以下优点：
(一)本发明仅通过简单的PCR酶切位点引入以及连接转化即构建得到双T-DNA载体。将该载体用于植物转基因，在T1代便可得到无选择标记的转基因安全植株。
(二)本发明将报告基因GUS基因和筛选基因抗潮霉素基因串联，将GFP基因和目的基因串联，分别连入两个独立的T-DNA区，在后续的转基因检测中仅需要对报告基因进行直接检测就能快速、准确的检测出转基因后代植株，避免了使用假阳性高的PCR以及操作不便且高成本的Southern杂交。
(三)本发明中GUS和GFP基因分别存在于两个T-DNA中，同时检测两种报告基因，便可以简便直观地从转基因后代植株中准确快速的筛选出目的基因与选择标记基因发生分离的植株(仅含GFP基因)，从而简单快速剔除目的基因与选择标记基因发生共整合的转基因植株(同时含有GUS、GFP基因)。
附图说明
图1为本发明实施例1中PCR扩增片段LB和NOS的电泳检测结果；1.MarkerIII；2-6.目的片段NOS；7-11.目的片段LB。
图2为本发明实施例1中载体A的酶切验证电泳结果；1.MarkerIII；2.酶切样品；3.载体A。
图3为本发明实施例2中PCR扩增两个独立UBI片段的电泳检测结果；1.MarkerIII；2-6.目的片段UBI-1；7-11.目的片段UBI-2。
图4为本发明实施例3中PCR扩增两个独立RB片段的电泳检测结果；1.MarkerIII；2-4.目的片段RB-1；5-7.目的片段RB-2。
图5为本发明实施例4中PCR扩增GUS156和NOSPoly片段的电泳检测结果；1.MarkerIII；2-6.目的片段GUS156；7-11.目的片段NOSPoly。
图6为本发明实施例1中载体A的质粒图谱。
图7为本发明实施例2中载体B的质粒图谱。
图8为本发明实施例3中载体C的质粒图谱。
图9为本发明实施例4中载体D(双T-DNA载体)的质粒图谱。
图10为本发明实施例5中转基因烟草T1代GUS染色图；a、c为非阳性植株；b、d图为阳性转基因植株。
图11为本发明实施例5中转基因烟草T1代GFP基因PCR检测结果；1.MarkerI；2-10.转基因烟草DNA检测；11.非转基因烟草阴性对照；12.质粒阳性对照。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,Molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
以下实施例使用的pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司，T4连接酶购自NEB公司，限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司。DH5α制备试剂购自北京全式金生物技术有限公司。
GUS染液配方：X-GLUC染色液:50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH7.0)；10mmol/LNa2EDTA(pH＝8.0)；0.5mmol/LK3[Fe(CN)6]；0.5mmol/LK4[Fe(CN)6]；0.1％Triton-X100；0.8g/LX-Gluc。
DH5α感受态细胞制备流程：取-80℃保存的DH5α空菌在空白LB平板上活化，取单菌落用LB液体培养基扩繁，测定菌液OD值到0.5停止摇菌，按每管1ml的量将菌液加入遇冷的1.5ml离心管中，4℃，4000转每分钟离心10min，取出在冰上将上清尽可能去除干净，按每管100μL的量加入遇冷的solutionⅠ轻柔打匀菌体，4℃，4000转每分钟离心10min，取出在冰上将上清尽可能去除干净，按每管100μL的量加入遇冷的solutionII轻柔打匀菌体，放到-80℃保存备用。
实施例1含有两个独立左边界LB序列的载体A的构建
1、设计引物扩增增终止子NOS和左边界LB
根据已公布的pCMBIA1302载体的序列(GenBank：AF234298.1)，设计扩增终止子NOS的引物，引物中包括限制性酶切位点BsteII和BamHI，序列见SEQIDNO:1，SEQIDNO:2；设计扩增左边界LB的引物，引物中包括限制性酶切位点BglII和SphI，其中BamHI和BglII是同尾酶。序列见SEQIDNO:3，SEQIDNO:4。引物由上海英俊公司合成。
以pCAMBIA1302为模板，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:2为引物进行PCR扩增NOS，即SEQIDNO:5，目的片段约为273bp(图1)。以SEQIDNO:3和SEQIDNO:4为引物进行PCR扩增LB，即SEQIDNO:6，目的片段约为170bp(图1)。对扩增产物进行胶回收，连接pMD19-T载体，16℃连接过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，筛选阳性克隆。测序并命名为T-NOS和T-LB。
2、含有两个LB边界载体的验证
将经过测序验证的含有目的片段SEQIDNO:5和SEQIDNO:6的质粒T-NOS和T-LB分别在37℃下用BsteII,BamHI和BglII,SphI进行双酶切，将酶切产物跑胶分别回收168bp和156bp的片段；同时，将骨架载体pCMBIA1302在37℃下经BsteII和SphI双酶切后跑胶回收大的载体片段。两条目的片段和一条载体片段在T4连接酶的作用下22℃连接过夜。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，以SEQIDNO:1和SEQIDNO:4为引物进行PCR鉴定，若NOS和LB连入载体，则扩增出443bp的片段，然后将阳性克隆摇菌提取质粒，用BsteII和SphI双酶切得到一条与预期大小一致的片段(图2)。最后进行测序验证，将测序正确的载体命名A(图6)。
实施例2含有两个背对UBI启动子序列的载体B的构建
1、设计引物扩增两个独立的UBI启动子片段
根据已公布的BinaryvectorpGA1611载体的序列(GenBank:AY373338.1)，设计扩增两个独立的UBI启动子片段的引物，该引物按照同源重组引物要求设计，序列见SEQIDNO:7，SEQIDNO:8，SEQIDNO:9，SEQIDNO:10；在引物SEQIDNO:8和9中引入酶切位点SalI。
以含有UBI启动子的载体为模板，以SEQIDNO:7和SEQIDNO:8为引物进行PCR扩增UBI-1，即SEQIDNO:11，目的片段约为2050bp(图3)。以SEQIDNO:9和SEQIDNO:10为引物进行PCR扩增UBI-2，即SEQIDNO:12，目的片段约为2063bp(图3)。对扩增产物进行切胶回收。
2、同源重组连接及测序验证
对实施例1中得到的载体进行BamHI和SpeI双酶切过胶回收大片段，与步骤1回收到的两个独立UBI片段采用同源重组的方法进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，以SEQIDNO:7，SEQIDNO:8和SEQIDNO:9，SEQIDNO:10为引物进行PCR鉴定，若同时扩增出SEQIDNO:11，SEQIDNO:12对应大小的片段，判定为阳性菌斑，选取阳性克隆摇菌提取质粒，送公司进行测序验证，将测序正确的载体命名B(图7)。
实施例3含有两个右边界RB序列的载体C的构建
1、两个独立的RB片段的PCR扩增
根据已公布的pCMBIA1302载体的序列(GenBank：AF234298.1)，设计同源重组引物扩增两个独立的RB-1，RB-2片段，引物序列分别为SEQIDNO:13，SEQIDNO:14和SEQIDNO:15，SEQIDNO:16。
以pCAMBIA1302为模板，以SEQIDNO:13，SEQIDNO:14为引物进行PCR扩增得到RB-1片段，序列编号为SEQIDNO:17，目的片段约为179bp(图4)。以和SEQIDNO:15，SEQIDNO:16为引物进行PCR扩增得到RB-2片段，即SEQIDNO:18，目的片段约为173bp(图4)。对扩增产物进行胶回收。
2、同源重组连接及测序验证
对实施例2中得到的载体进行SalI单酶切过胶回收，与步骤1回收到的两个独立RB片段采用同源重组的方法进行连接，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，以SEQIDNO:13，SEQIDNO:14和SEQIDNO:15，SEQIDNO:16为引物进行PCR鉴定，若同时扩增出SEQIDNO:17，SEQIDNO:18对应大小的片段，判定为阳性菌斑，选取阳性克隆摇菌提取质粒，送公司进行测序验证，将测序正确的载体命名C(图8)。
实施例4双T-DNA载体的构建
1、GUS156基因和Nospoly-A片段的PCR扩增
根据已公布的BinaryvectorpCLEAN-G156的序列(GenBank：JN654719.1)，设计同源重组引物扩增GUS156基因和Nospoly-A片段，引物序列分别为SEQIDNO:19，SEQIDNO:20和SEQIDNO:21，SEQIDNO:22，
以含有GUS基因的载体为模板，以SEQIDNO:19，SEQIDNO:20为引物进行PCR扩增得到Nospoly-A片段，序列编号为SEQIDNO:23，目的片段约为313bp(图5)。以和SEQIDNO:21，SEQIDNO:22为引物进行PCR扩增得到GUS156片段，即SEQIDNO:24，目的片段约为2106bp(图5)。对扩增产物进行胶回收。
2、同源重组连接
对实施例3中得到的载体C进行KpnI单酶切，过胶回收，与步骤1中得到的两个片段进行多片段同源重组，将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，以SEQIDNO:19，SEQIDNO:20和SEQIDNO:21，SEQIDNO:22为引物进行PCR鉴定，若同时扩增出SEQIDNO:23，SEQIDNO:24对应大小的片段，判定为阳性菌斑，选取阳性克隆摇菌提取质粒，送公司进行测序验证，将测序正确的载体命名D(图9)，即可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体。
实施例5双T-DNA载体的遗传转化及后代植株阳性筛选
D载体(即双T-DNA载体)叶盘法转化烟草(常规叶盘法)
1)采用电击转化法(方法参考分子克隆：实验手册)，将重组质粒D导入根癌农杆菌AGL1的感受态细胞，经筛选鉴定为阳性的重组子命名为AGL1-D。
2)采用叶盘法将重组子转化烟草，具体操作步骤如下：
a.取培养基中培养的无菌烟草苗幼嫩健康的叶片。
b.挑取一个单菌落根癌农杆菌，接种到3-5ml含利福平和卡那霉素抗生素的MG/L培养液中，在28℃、200rpm恒温摇床上培养。取以上培养菌液按1％的比例，转入新鲜的含利福平和卡那霉素抗生素的MG/L培养液中，继续培养8-12小时，当OD值为0.4-0.6时即可用于转化。
c.将步骤b中的菌液3000rpm离心10min，用MS液体培养基重悬，在b培养条件下培养1-2h。
d.在无菌环境中，将菌液倒入无菌小培养皿，添加终浓度为120μm/L的乙酰丁香酮，将无菌叶片剪成0.5cm×0.5cm的小块，放入菌液中泡6-8分钟，期间轻微晃动培养皿，保证所有叶片菌侵入菌液。取出外植体在无菌滤纸上吸去附着的菌液。然后接种在表面放有一层无菌滤纸的MS培养基上，28℃暗培养3天。
e.将经过共培养的外植体转移到含2.0mg/L6-BA,0.5mg/LNAA，40mg/L潮霉素和150mg/LTimentin的MS培养基上。在光照的条件下，25℃进行选择培养。
f.选择培养2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到含有40mg/L潮霉素和150mg/LTimentin的MS培养基上进行生根培养。
g.两周左右长出不定根，然后移栽到土壤中。
3)转基因烟草阳性植株的检测
以上得到的具有潮霉素抗性的转基因烟草阳性植株包括三种情况，一种为只有选择标记基因转入植株；第二种为选择标记基因和GFP基因共整合到染色体同一位置；第三种为选择标记基因和GFP基因共整合到染色体的的不同位置。其中第三种是可以通过后代自交分离得到无选择标记的转基因植株。通过GUS染色和GFP检测可以筛选到第二种和第三种情况的转基因植株。
具体方法如下：
①.GUS染色
取再生植株的叶片进行GUS染色，将准备好的叶片放入EP管中，加入X-GLUC染色液浸没叶片，封好盖子；放入37℃培养箱温浴1-12h；倒掉侵染液加入70％乙醇脱色2-3次，去除叶绿素至阴性对照为白色为止，观察叶片颜色。
②.GFP检测
取再生植株的叶片或根尖制作切片；使用荧光显微镜在紫外或488nm波长蓝光激发下，观察GFP的表达；设计引物对植株基因组DNA进行PCR检测。
4)无选择标记转基因植株的获得
采用GUS染色和GFP观察的方法，对经潮霉素筛选存活的30株烟草再生植株进行检测，结果如下：13株再生烟草苗只检测到GUS基因的表达(图10)，图10为采用同类植株幼苗染色所得，实验用9株筛选存活苗全部种植，采用叶片染色以及叶片DNA提取用于后续验证；17株再生烟草苗同时检测到GUS基因和GFP基因的存在(图10和图11)，此类植株可以通过T2-Tn代筛选只有GFP基因而不携带潮霉素抗性的安全植株。该结果表明，本发明所构建的双报告基因双T-DNA载体可用于获得无标记基因的安全植株。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.可实现农杆菌共转化的双T-DNA载体，其特征在于，其是将报告基因GUS和抗性筛选标记基因串联，将荧光报告基因和目的基因串联，然后将两个串联序列分别连入两个独立的T-DNA区，并构建到植物双元表达载体上构建得到的。
2.根据权利要求1所述的双T-DNA载体，其特征在于，所述抗性筛选标记基因包括抗生素抗性基因和抗除草剂基因；所述抗生素抗性基因包括潮霉素抗性基因、新霉素抗性基因；所述荧光报告基因包括GFP、RFP、YFP、BFP以及它们的增强型基因。
3.根据权利要求1或2所述的双T-DNA载体，其特征在于，所述植物双元表达载体为pCAMBIA1302。
4.根据权利要求3所述的双T-DNA载体，其特征在于，所述双T-DNA载体的核苷酸序列如SEQIDNO:25所示。
5.根据权利要求1-4任一项所述双T-DNA载体的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)载体A的构建：以pCAMBIA1302载体为骨架，设计引物分别通过PCR扩增得到终止子NOS和T-DNA左边界LB，NOS引入酶切位点BsteII和BamHI，LB引入酶切位点BglII和SphI，将扩增得到的NOS和LB分别连到PMD19-T载体上，用酶BsteII和BamHI将NOS片段切下，用酶BglII和SphI将LB切下，将得到的酶切两个片段与载体PCAMBIA1302经BsteII和SphI酶切后回收的大片段，用T4连接酶进行三片段连接，得到含有两个LB边界的载体A；
2)载体B的构建：设计同源重组特异引物，通过PCR扩增得到两个独立UBI启动子片段，用酶BamHI和SpeI对载体A进行酶切，回收大片段，与上述扩增得到的两个独立UBI启动子片段采用同源重组的方法进行连接，得到含有两个背对的UBI启动子，且两个背对的UBI之间含有SalI酶切位点的载体B；
3)载体C的构建：以pCAMBIA1302载体为骨架，设计引物通过PCR扩增得到两个独立右边界RB，对载体B进行SalI单酶切，与上述扩增得到的两个独立RB片段采用同源重组的方法进行连接，得到含有两个背对的RB的载体C；
4)双T-DNA载体的构建：设计同源重组特异引物扩增GUS156基因片段和Nospoly-A，分别回收PCR产物，对载体C进行KpnI单酶切，利用多片段同源重组将酶切后的载体C与扩增得到GUS156基因片段和Nospoly-A连接，构建得到双T-DNA载体。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤1)扩增终止子NOS的引物序列如SEQIDNO:1和2所示，扩增T-DNA左边界LB的引物序列如SEQIDNO:3和4所示；扩增得到的终止子NOS和T-DNA左边界LB序列分别如SEQIDNO:5和6所示。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)扩增两个独立UBI启动子片段的引物序列分别如SEQIDNO:7-10所示；扩增得到的两个独立UBI启动子片段分别如SEQIDNO:11和12所示。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)扩增两个独立右边界RB的引物序列分别如SEQIDNO:13-16所示；扩增得到的两个独立右边界RB序列分别如SEQIDNO:17和18所示。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤4)扩增Nospoly-A的引物序列分别如SEQIDNO:19和20所示，扩增GUS156基因片段的引物序列分别如SEQIDNO:21和22所示；扩增得到的Nospoly-A和GUS156基因片段序列分别如SEQIDNO:23和24所示。
10.权利要求1-4任一项所述双T-DNA载体在制备无选择标记的转基因植物中的应用。
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