CN111849989B - 一种利用转长链非编码rna基因砧木增强果桑耐盐能力的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的方法。本发明利用一种来源于桑树的长链非编码RNA(lncRNA)，命名为LncR‑SR，通过发根农杆菌介导的转基因技术转化实生桑幼苗，获得转LncR‑SR基因桑树毛状根，利用获得的转基因毛状根为砧木，通过嫁接获得果桑苗。通过该方法获得的果桑苗木的耐盐性显著提高，且在高盐土壤栽培的果桑生产的桑椹含糖量明显高于正常土壤栽培的果桑。本发明为耐盐果桑苗的培育提供了一种方法，提高了果桑的耐盐力，拓宽了果桑的种植范围，改善了桑椹品质，并可减少对转基因生物安全性的担忧，为提高其它果树的耐盐力提供了参考，具有广阔的应用价值。

Description

一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的 方法

技术领域

本发明涉及生物和农业技术领域，具体涉及一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的方法。

背景技术

随着世界人口不断增加，土地盐碱化日益加剧，盐渍化土壤在我国的面积已超过3700万公顷，其中耕地盐渍化面积达到920.9万公顷，占我国总耕地面积的6.62％，土壤盐渍化已成为影响我国农林业健康发展的重要因素。桑树是蚕业生产的物质基础，也是水土保持、防风固沙、盐碱地改良的重要生态树种。另外，桑椹营养丰富，酸甜可口，具有多种保健功能，被我国卫生部列入“既是食品又是药品”的名单，享有“中华果王”、“民间圣果”之美誉，具有很高的经济价值。因此，加强桑树在盐碱地中的应用研究，提高果桑的耐盐性，扩大栽培面积，不仅有利于实现桑树的经济和生态价值，对于盐碱地植被恢复和重建、增加其物种多样性、改善生态环境质量等方面也具有重要意义。

果桑可用嫁接、扦插、压条等方法繁殖，生产中多以嫁接来繁育果桑苗木。通过嫁接，不仅能够保持母本的优良性状，还可以提高果桑的抗逆性。但是，果桑嫁接所用砧木主要来源于实生桑苗木，没有经过耐盐性筛选，获得的果桑嫁接苗木的耐盐能力没有明显提高。目前，还未见利用转基因技术获得耐盐砧木继而通过嫁接的方法繁育果桑苗木、提高果桑耐盐力的报道。

长链非编码RNA通常是指那些大于200个核苷酸长度、几乎没有可编码大于100个氨基酸开放阅读框的RNA分子。LncRNAs可以在表观遗传水平、转录水平及转录后水平等多个层面调控基因的表达，广泛参与生物的生长发育和多种逆境胁迫反应。近几年来，一些报道表明土壤盐分胁迫可以改变多种植物，如拟南芥、谷子、玉米、水稻、棉花、苜蓿、毛白杨中lncRNAs的表达丰度。但到目前为止，仅有拟南芥中的npc536和DRIR，以及棉花中lncRNA973等少数几个lncRNAs的耐盐功能被证明。国内仅有沈法富等发明的“棉花长链非编码RNA及其在植物耐盐性中的应用”(中国专利CN 108795944 A)，公开了一种棉花长链非编码RNA-lnc973序列及其在植物耐盐性中的应用。关于lncRNA在桑树抗盐育种及栽培中的应用还未见有报道。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的方法。采用本发明的方法，可以提高果桑的耐盐力，拓宽果桑的种植范围，改善桑椹品质，并可减少对转基因生物安全性的担忧，为提高其它果树的耐盐力提供了参考，具有广阔的应用价值。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种与桑树耐盐性相关的lncRNA，其选自如下(1)-(3)所示的核酸分子中的至少一种：

(1)序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

(2)序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子；

(3)与SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列具有90％或以上序列同源性，且功能上与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列等同的核酸分子。

本发明的第二方面，提供含有上述与桑树耐盐性相关的lncRNA的植物表达载体。

进一步的，本发明还提供包含上述植物表达载体的重组菌。

本发明的第三方面，提供上述lncRNA、植物表达载体或重组菌在提高植物耐盐性中的应用。

优选的，所述植物为桑树。

本发明的第四方面，提供上述lncRNA、植物表达载体或重组菌在培育耐盐植物品种中的应用。

本发明的第五方面，提供一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的方法，包括以下步骤：

(1)将lncRNA基因序列置于CaMV35S强启动子之下，构建植物表达载体；

(2)将步骤(1)构建的植物表达载体转入发根农杆菌K599感受态细胞，获得转化子；

(3)利用步骤(2)的转化子转化桑树，得到转基因桑树毛状根；

(4)以转基因桑树毛状根为砧木，通过嫁接获得耐盐性提高的果桑嫁接苗。

优选的，步骤(1)中，所述植物表达载体的具体构建方法为：

以桑树叶片cDNA为模板，利用SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行PCR反应，将PCR产物与pMD18-T Simple克隆载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，并进行序列测定；将经序列测定含有桑树LncR-SR基因正确片段的重组质粒用BamH I和Sac I酶切，回收LncR-SR基因片段与用相同的限制性内切酶酶切的pROKII表达载体连接，即构建得到植物表达载体。

优选的，步骤(3)中，所述转基因桑树毛状根的具体获得方法为：

将转化子悬浮液注射至桑树实生苗真叶与子叶之间的上胚轴内，注射后用湿的细沙土培埋接种幼苗的上胚轴，将幼苗培养至注射部位长出毛状根。

更优选的，所述培养包括：弱光下培养3d后转为正常光照培养20d，逐步撤除拱棚，继续培养30d；将苗木起出，筛选出注射部位生出毛状根的幼苗。

本发明的有益效果：

(1)本发明首次提供了桑树中的一个内源lncRNA基因，该lncRNA可以提高桑树的抗盐能力。

(2)本发明利用lncRNA获得耐盐桑树砧木，并以此砧木通过嫁接获得具有较强耐盐能力的果桑苗木。

(3)本发明通过发根农杆菌介导的转基因技术转化实生桑幼苗，获得转LncR-SR基因桑树毛状根，利用获得的转基因毛状根为砧木，通过嫁接获得果桑苗。通过该方法获得的果桑苗木的耐盐性显著提高，且在高盐土壤栽培的果桑生产的桑椹含糖量明显高于正常土壤栽培的果桑。本发明为耐盐果桑苗的培育提供了一种方法，提高了果桑的耐盐力，拓宽了果桑的种植范围，改善了桑椹品质；转基因桑树通过花粉和果实传播和遗传漂变的风险降低，可显著减少对转基因生物安全性的担忧，本发明也为提高其它果树、林木及蔬菜的耐盐力提供了参考，具有广阔的应用价值。

附图说明

图1：桑树lncRNA基因植物超表达载体的构建示意图。

图2：转基因桑树毛状根的获得。A:获得的转基因桑树毛状根；B:部分转基因桑树毛状根的PCR鉴定结果，WT：野生型桑树根系；1-5：转基因桑树毛状根；M：marker DL2000。

图3：LncR-SR在转基因桑树毛状根中的表达丰度检测。WT：野生型桑树根系；OE1-4：不同株系的转基因桑树毛状根。

图4：转基因桑树毛状根为砧木嫁接获得的果桑的耐盐能力分析。A：成活率分析结果；B：盐害指数分析结果。

图5：盐分胁迫处理第二年调查桑椹单果重和含糖量分析结果。A：单果重分析结果；B：总糖含量分析结果；野生型桑树和转基因桑树分别指以野生型桑树根系和转基因桑树毛状根为砧木，通过嫁接获得的果桑苗木。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，关于lncRNA在桑树抗盐育种及栽培中的应用还未见有报道。基于此，为实现利用lncRNA提高桑树的耐盐性，发明对桑树中的lncRNA进行了深入研究，获得了一个来源于桑树(Morus multicaulis Perr)的长链非编码RNA(lncRNA)，命名为LncR-SR，其RNA序列如SEQ ID NO.1所示；LncR-SR的编码基因序列如SEQ ID NO.2所示。研究发现，LncR-SR可以提高桑树的抗盐能力，拓宽了桑树的种植范围，并且改善了桑葚品质，由此提出了本发明。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。

实施例1：桑树LncR-SR基因的克隆方法

1.用核酸提取试剂盒提取桑树叶片总RNA，使用反转录试剂盒将RNA反转为cDNA，反应体系如下：

按上述体系加完后混匀，在42℃水浴锅中反应90min，反应结束后迅速冰浴3min，在75℃水浴锅中继续反应15min，反应产物即为桑树cDNA，置于-20℃保存。

2.设计一对特异性引物LncR-SR-5和LncR-SR-3，具体序列如下：

LncR-SR-5：5′-TCATCCCCAGGAGACCTCCATTCT-3′；(SEQ ID NO.3)

LncR-SR-3：5′-TTGGCGCAAAACCTTGAGCTT-3′；(SEQ ID NO.4)

以桑树叶片cDNA为模板进行PCR扩增，体系如下：

反应程序如下：

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，回收目的片段进行测序，得到测序正确的桑树LncR-SR基因(序列如SEQ ID NO.2所示)。

实施例2：桑树LncR-SR植物表达载体的构建

1.根据分离出的桑树LncR-SR基因的核苷酸序列，设计带酶切位点的引物LncR-SR-F和LncR-SR-R，其序列具体如下：

LncR-SR-F：5′-GGATCCTCATCCCCAGGAGACCTC-3′；(SEQ ID NO.5)

LncR-SR-R：5′-GAGCTCTTGGCGCAAAACCTTG-3′；(SEQ ID NO.6)

以桑树叶片cDNA为模板，进行PCR反应，PCR扩增体系和扩增条件同实施例1。

2.取PCR产物与pMD18-T Simple克隆载体连接，连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，氨苄青霉素(50mg/L)抗性筛选阳性克隆，菌液PCR鉴定后提取重组质粒DNA，酶切鉴定后进行序列测定。

3.将经序列测定含有桑树LncR-SR基因正确片段的重组质粒用BamH I和Sac I酶切，回收LncR-SR基因片段与用相同的限制性内切酶酶切的pROKII表达载体连接。连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，卡那霉素(50mg/L)抗性筛选阳性克隆，对选取的阳性克隆进行菌液PCR鉴定和质粒DNA的酶切鉴定。即构建得到桑树LncR-SR植物表达载体(图1)。

实施例3：转基因桑树毛状根的获得

1.采用冻融法将构建好的LncR-SR植物表达载体转化发根农杆菌K599感受态细胞，卡那霉素(50mg/L)抗性筛选阳性克隆。

挑取农杆菌(携带重组质粒的农杆菌单菌落)接种于LB液体培养基(胰蛋白陈l0g/L，酵母粉5g/L，氯化钠l0g/L，卡那霉素50mg/L)中，28℃，250rpm，振荡培养约48h至对数生长后期；将菌液用MS培养液稀释10倍，备用。

2.将饱满的桂桑优12号种子播种于苗床上，罩小拱棚保护培养，当苗木长出两片真叶时，定苗，保持苗距5cm。用上述发根农杆菌悬浮液注射到幼苗的上胚轴部，注射后用湿润的细沙土培埋上胚轴，弱光下(20％透光率)培养3d后转为正常光照培养20d左右，逐步撤除拱棚，继续培养30d左右。

3.将苗木起出，筛选出注射部位生出毛状根的幼苗(图2A)，剪掉原始根系，将地上部分剪留2片叶，移栽到大田培养，苗距7-10cm。

实施例4：毛状根转基因桑树的PCR鉴定

1.采用CTAB法提取毛状根转基因桑树植株及野生型植株根系的DNA。

2.根据35S启动子序列设计一对特异引物35S-5和35S-3，具体如下：

35S-5：5′-GGCCATGGAGTCAAAGATTC-3′；(SEQ ID NO.7)

35S-3：5′-CCGTGTTCTCTCCAAATG-3′；(SEQ ID NO.8)

分别以提取的转基因桑树毛状根及野生型桑树根系的DNA为模板，进行PCR，扩增35S启动子，反应体系如下:

反应程序如下：

反应结束后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。通过琼脂糖凝胶电泳检测结果(图2B)可以看出，转基因植株根系DNA中均能扩增出一条530bp左右的条带(该条带是扩增35S启动子得到的；由于未转基因植株DNA中也有LncR-SR的核苷酸序列，所以转基因植株鉴定扩增的是35S启动子序列)，而野生型植株DNA中未能扩增出该条带，表明我们已成功将LncR-SR基因导入了桑树毛状根基因组中。

实施例5：LncR-SR在转基因桑树毛状根中的表达丰度检测

1.本试验采用荧光定量PCR的方法对转基因桑树根系中LncR-SR的表达量进行检测。

2.用Trizol法提取野生型和转基因桑树根系的总RNA，使用DNase I除去基因组DNA，反转录为cDNA。

3.以桑树EF-1为内参基因，以野生型和转基因桑树RNA的反转录产物为模板，荧光定量PCR的引物如下：

qPCR-F：ATCTGGTTCAGCAAGGGTTCC(SEQ ID NO.9)；

qPCR-R：TCTGCGCTTCCTCTTCAACCT(SEQ ID NO.10)。

反应体系和反应步骤参照

Premix Ex TaqTM II说明书进行反应，分析桑树LncR-SR在转基因桑树根系中能否成功表达及其表达丰度。

结果如图3所示。由图3可以看出：LncR-SR在转基因桑树毛状根系中均得以高效表达。

实施例6：以转基因桑树毛状根为砧木嫁接获得的果桑的耐盐能力分析

1.将培养一年的转基因桑树毛转根在第二年春季桑树发芽前起出，并以其为砧木，选取果桑大10为接穗，通过嫁接繁育果桑苗木。同时以野生型桂桑优12桑树根系为砧木选取果桑大10为接穗，通过嫁接繁育的果桑苗木为对照。

2.以含盐量为1g/kg左右的中壤耕层土(正常土壤)为对照，以含盐量为6g/kg混合盐土为处理，分别装入盐碱鉴定池。分别选取生长相对一致的野生型桑为砧木嫁接苗和转基因桑为砧木嫁接苗栽植。每个样本每种处理各30株；3次重复，随机排列。试验期进行土壤水分监测，土壤含水量保持在17％-20％，期间定量补水，要求每处理补水一致。

3.幼苗经盐处理30d后，调查成活率及盐害指数：盐害分级标准定为：0级：完全正常；1级：叶尖叶缘轻微枯焦或叶片黄化面积小于20％；2级：大约有50％的叶尖、叶缘受害；3级：大部分叶片受害，基本停止生长；4级：植株叶片黄化、脱落。

盐害指数(SI％)＝(盐害级数×相应盐害株数)/(盐害最高级数×总株数)。

从图4可以看出，以毛状根转基因桑树为砧木嫁接的大10果桑在0.6％的盐分含量的盐土上仍能正常生长，而对照果桑苗存活率极低，且存活的植株受盐害严重。因此，以毛状根转基因桑树为砧木嫁接果桑苗，可以明显提高苗木的耐盐性能。

4.盐分胁迫处理第二年调查桑椹单果重和含糖量分析。从相同方位枝条中部随机选取20颗成熟桑椹，测定平均单果重和含糖量。桑椹糖含量的测定参照国家标准《柑橘鲜果检验方法》(GB/T 8210-2011)。

从图5可以看出，以转基因桑树毛状根为砧木嫁接的大10果桑在0.6％的盐分含量的土壤上不仅可以正常生长，桑椹单果重与正常土壤上生长的果桑所结桑椹没有明显差异，显著高于高盐土壤上以野生型桑树根系为砧木嫁接的果桑所结桑椹。在高盐土壤上栽植的以转基因桑树毛状根为砧木嫁接的果桑所产桑椹含糖量高于以野生型桑树根系为砧木嫁接的果桑所产桑椹含糖量；而且，高盐土壤上栽植的桑树所产桑椹的含糖量高于正常土壤上种植的桑树所产桑椹的含糖量。

通过以上分析看出，以转基因桑树毛状根为砧木嫁接的果桑苗具有较强的耐盐能力，繁育的苗木在盐碱地栽植不影响桑椹的生长发育，而且可以显著提高桑椹含糖量，具有很好的应用前景。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东农业大学

<120> 一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的方法

<130> 2020

<160> 10

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 576

<212> RNA

<213> 桑树（Morus multicaulis Perr）

<400> 1

aagagccgcg acgcccucau ccccaggaga ccuccauucu caucugguuc agcaaggguu 60

ccgaagaaac agagacagag agagcuuuua ggguuuguuc aucgccgucu caccaugaga 120

gccaagugga agaagaagcg caugaggagg uugaagagga agcgcagaaa gaugaggcag 180

agaucuaagu gagagcugua gcuguagcug uagcgguagc gguuucgucg ccucggcaag 240

agcucuuucg cuuggcgugu uugggucuua ucgguuucug gucuuuuguu uuuauuuuug 300

uuuccguguu uuuuaggauu aauaugugga aaaucuagag cuguucaagc cugguguuug 360

ucacauucuc uagucguuaa aaguugaauu cuacuuuguu aagaacucau uuuugcugau 420

gaaucuauua gauuugcuuu ugcugauaca uucgauuaug uuuuauaugu uauauuuugg 480

uuaauuuucu guuuauugag gauucucuug cucguuuauu acgauucugc guguuaaugg 540

auuuacagaa aagaaaagcu caagguuuug cgccaa 576

<210> 2

<211> 576

<212> DNA

<213> 桑树（Morus multicaulis Perr）

<400> 2

aagagccgcg acgccctcat ccccaggaga cctccattct catctggttc agcaagggtt 60

ccgaagaaac agagacagag agagctttta gggtttgttc atcgccgtct caccatgaga 120

gccaagtgga agaagaagcg catgaggagg ttgaagagga agcgcagaaa gatgaggcag 180

agatctaagt gagagctgta gctgtagctg tagcggtagc ggtttcgtcg cctcggcaag 240

agctctttcg cttggcgtgt ttgggtctta tcggtttctg gtcttttgtt tttatttttg 300

tttccgtgtt ttttaggatt aatatgtgga aaatctagag ctgttcaagc ctggtgtttg 360

tcacattctc tagtcgttaa aagttgaatt ctactttgtt aagaactcat ttttgctgat 420

gaatctatta gatttgcttt tgctgataca ttcgattatg ttttatatgt tatattttgg 480

ttaattttct gtttattgag gattctcttg ctcgtttatt acgattctgc gtgttaatgg 540

atttacagaa aagaaaagct caaggttttg cgccaa 576

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcatccccag gagacctcca ttct 24

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttggcgcaaa accttgagct t 21

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggatcctcat ccccaggaga cctc 24

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gagctcttgg cgcaaaacct tg 22

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggccatggag tcaaagattc 20

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ccgtgttctc tccaaatg 18

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

atctggttca gcaagggttc c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

tctgcgcttc ctcttcaacc t 21

Claims (7)

1.一种与桑树耐盐性相关的lncRNA，其选自如下（1）或（2）所示的核酸分子中的至少一种：

（1）序列如SEQ ID NO.1所示的核酸分子；

（2）序列如SEQ ID NO.2所示的核酸分子。

2.含有权利要求1所述lncRNA的植物表达载体。

3.含有权利要求2所述植物表达载体的重组菌。

4.权利要求1所述的lncRNA、权利要求2所述的植物表达载体或权利要求3所述的重组菌在提高植物耐盐性中的应用；所述植物为桑树。

5.一种利用转长链非编码RNA基因砧木增强果桑耐盐能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）将权利要求1所述的lncRNA基因序列置于CaMV35S强启动子之下，构建植物表达载体；

（2）将步骤（1）构建的植物表达载体转入发根农杆菌K599感受态细胞，获得转化子；

（3）利用步骤（2）的转化子转化桑树，得到转基因桑树毛状根；

（4）以转基因桑树毛状根为砧木，通过嫁接获得具有较强耐盐能力的果桑嫁接苗。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤（3）中，所述转基因桑树毛状根的具体获得方法为：

将转化子悬浮液注射至桑树实生苗真叶与子叶之间的上胚轴内，注射后用湿的细沙土培埋接种幼苗的上胚轴，将幼苗培养至注射部位长出毛状根。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述培养包括：弱光下培养3d后转为正常光照培养20d，逐步撤除拱棚，继续培养30d；将苗木起出，筛选出注射部位生出毛状根的幼苗。

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