CN101765660A - 具有提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产的植物细胞和植物 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及包含失活或下调的基因的转化植物细胞和植物，与未转化的野生型细胞相比较，所述失活或下调的基因导致提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，并涉及产生此类植物细胞或植物的方法。

Description

具有提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产的植物细胞和植物
本发明总体上涉及包含失活或下调的基因的转化植物细胞和植物，其中与未转化的野生型细胞相比时，所述失活或下调的基因产生提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，并涉及产生此类植物细胞或植物的方法。
特别地，本发明涉及适合在水缺乏条件下生长的植物。
本发明也涉及产生并筛选此类植物细胞或植物和对其育种的方法。
在田间条件下，植物性能就生长、发育、生物量积累和产量而言取决于对环境变化和胁迫的适应性。非生物性环境胁迫如干旱胁迫、盐度胁迫、热胁迫和寒冷胁迫是植物生长和生产力的主要限制性因素(Boyer.1982.Science 218，443-448)。暴露于热和/或少水或干旱条件的植物一般具有低产量的植物材料、种子、果实和其他可食用产物。由这些胁迫所致的主要作物如稻、玉米(maize)(谷物(corn))和小麦的作物损失和作物产量损失代表了重要的经济和政治因素并且在许多欠发达及第三世界国家造成食品短缺。
干旱、热、冷和盐胁迫具有对于植物生长而言重要的共同主题，即水分有效性。植物在其生活周期期间一般暴露于环境水分有效性降低的条件。大多数植物已经进化出针对这些少水或干燥条件保护自身的策略。但是，如果干旱环境过于严重且持续时间太长，则对大多数作物植物的植物发育、生长、和产量的影响严重。连续暴露于干旱造成植物代谢方面的重大改变。这些在植物上的重大变化最终导致细胞死亡并且因而造成产量损失。
开发胁迫耐受性和/或抗性植物是具有解决或至少促成解决这些问题中某些问题的潜力的一项策略(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping in Cultivated Plants，Kluwer AcademicPublishers)。但是，开发针对这些类型胁迫表现抗性(耐受性)的新植物品系的传统植物育种策略是进展相对缓慢的并且需要特定抗性品系用于与所需品系杂交。相对于胁迫耐受性的有限种质资源以及远缘相关植物种之间杂交的不兼容性代表了常规育种中遭遇的主要问题。此外，引起干旱、寒冷和盐耐受性和/或抗性的细胞过程在本质上是复杂的并且涉及细胞适应性的多种机制和许多代谢途径(McKersie和Leshem，1994.Stress andStress Coping in Cultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。胁迫耐受性和/或抗性的这种多因素性质不仅导致耐受性育种过程基本上不成功，而且还限制了使用生物技术方法遗传改造胁迫耐受性植物的能力。
植物在其生活周期期间还暴露于热、寒冷和盐胁迫。其保护策略与针对干旱抗性的那些策略相似。因为在某些土壤中的高盐含量导致细胞摄取可用的水更少，因而它的作用与干旱条件下观察到的那些作用相似。此外，在冰冻温度下，植物细胞因始于质外体并从共质体抽取水分的冰形成而失水(McKersie和Leshem，1994.Stress and Stress Coping inCultivated Plants，Kluwer Academic Publishers)。在生理学上，这些胁迫也是相互联系的并可以诱导相似的细胞损伤。例如干旱和盐胁迫主要表现为渗透胁迫，导致细胞中内环境稳定的破坏和离子分布的破坏(Serrano等人，1999；Zhu，2001a；Wang等人，2003)。经常伴随高温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性(Smirnoff，1998。因此，这些非生物性胁迫经常激活相似的信号途径(Shinozaki和Ymaguchi-Shinozaki，2000；Knight和Knight，2001；Zhu 2001b，2002)和细胞应答，例如产生某些胁迫蛋白质、抗氧化剂和相容的溶质(Vierling和Kimpel，1992；Zhu等人，1997；Cushman和Bohnert，2000)。
从WO 2004/092349A和WO 2006/032707已知因基因敲除而具有提高的非生物性胁迫抗性的植物。通常，经转化的和胁迫抗性的植物显示较慢的生长和降低的生物量，原因是生长速率降低(Serrano等人)，这是植物的发育和生理学不平衡所致，因而具有明显的适应性成本(Kasuga等人，1999，Danby和Gehring等人，2005)。尽管维持了基础代谢功能，这仍导致严重的生物量和产量损失。有时，根/茎干重比随着植物的水胁迫发展而提高。这种提高大多因茎干重相对降低所致。种子产量对地上部分干重的比率在许多环境条件下是相对稳定的并且因而经常可以获得植物大小与谷物产量之间的强相关。这些过程是内在关联的，因为谷物生物量的大部分取决于植物叶和茎当前储备的光合生产能力。因此，选择植物大小(甚至在发育早期)已经用作未来产能的指示物。在一些情况下(US20060037108)，通过停水6至8日进行干旱处理后观察到提高的生物量，主要地是更大的苗生物量。
当前研究的结果表明干旱耐受性和/或抗性是复杂的数量性状并且实际的特征标志仍没未获得。机理性理解的这种缺乏导致难以设计转基因方法以改善水胁迫耐受性和/或抗性。
通过使用微阵列技术鉴定到表达依赖于不同胁迫条件下植物生长的植物胁迫调节型基因并且在WO 03/000898 A1、WO 02/16655 A、WO 02/22675 A2和WO 03/008540 A2中公开。认为鉴定这些植物基因会有助于赋予植物选择优势，例如通过提高针对细菌性或真菌性病原体感染的抗性、除草剂抗性、昆虫抗性、环境或胁迫抗性和疾病抗性而更好地繁殖、发育、生长、存活。另外，也可能分别增强谷物组成或品质，例如几种限制性氨基酸、含油量、淀粉含量、色素形成、维生素。但是，没有形成缺失(或分别敲除)所述基因的实用方法。因此，本公开涉及胁迫条件对植物的后果，不过没有参与植物胁迫抗性的证据。根据WO 03/020015 A2，在拟南芥(A.thaliana)C24中通过缺失或通过失活(诱变或反义)表达编码9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶双加氧酶的nced3基因，还通过过量表达该基因展示了提高的盐抗性。与其盐抗性相反，突变植物对土壤脱水比野生型植物敏感得多。
在当前，已知许多遗传学和生物技术方法以获得低水分有效性条件下的植物生长。
仍需要鉴定在胁迫耐受性植物中表达的基因，所述基因具有向其宿主植物和向其他植物物种赋予胁迫抗性的能力，尤其赋予、优选在缺水条件下引起提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和赋予提高的生物量生产的能力。本发明的一个目的是鉴定在植物或植物细胞赋予胁迫耐受性和/或抗性的新方法。非生物性胁迫现象的复杂性状导致遗传优化困难。但是，修饰单个基因例如转录因子或反向转运蛋白在几种情况下导致胁迫耐受性明显提高(Wang等人，2003)。
本发明的另一个目的还是提供植物，其中与相应的非转化野生型植物相比较而言，所述植物抵抗干旱至少1.0日、优选1.5日缺水时间，并且在少水或脱水条件下额外地表现相等的、优选地表现提高的生物量生产。
总而言之，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)降低、阻抑或缺失植物细胞、植物或其部分中一种或多种选自以下的活性：1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶(hydro-lyase)/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶，和b)产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转化植物并在允许植物发育的条件下培育。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)降低、阻抑或缺失植物细胞、植物或其部分中以下对象的活性(i)分别包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或(ii)包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，(iii)或者(i)或(ii)的功能等同物。和b)产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转化植物并在允许植物发育的条件下培育。优选地，本发明的方法还包括降低、减少或缺失至少一种核酸分子的表达或活性，所述核酸分子具有或编码如表I第5列中显示的核酸分子所代表的至少一种核酸分子的活性并且包含选自以下的核酸分子：a)编码如表II第5列或第7列中所示多肽的分离的核酸分子；b)如表I第5列或第7列中所述的分离的核酸分子；c)分离的核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从如表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生；d)分离的核酸分子，其与包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并且具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可以借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体分离，并且具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列中所述的共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由包含如表II或表IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；h)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；i)分离的核酸分子，其包含通过使用如表III第7列中所述的在5’端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并且优选地具有由包含如表II或表IV的第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；j)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加由核酸分子(a)至(d)编码的多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生；和k)分离的核酸分子，其通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库可获得，其具有与在(a)至(d)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示蛋白质代表的活性；或其包含与之互补的序列；优选地，本发明的方法还包括降低、阻抑、减少或缺失包含如上文(a)至(j)中所示核酸分子的核酸分子的表达产物，例如包含如表II第5列或第7列中所述多肽的多肽，或降低、阻抑、减少或缺失由所述核酸分子编码的蛋白质。优选地，本发明的方法还包括降低植物或其部分中多肽的活性或表达，所述多肽包含由上文表征的核酸分子编码的多肽。优选地，本发明的方法还包括至少一个选自以下的步骤：a)导入编码下述核糖核酸序列的核酸分子，其能够形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt的片段与选自以下的核酸分子具有至少50％的同源性：(aa)如上文表征的分离的核酸分子；(ab)如表I第5列或第7列中描述的或编码如表II第5列或第7列中所示多肽的分离的核酸分子，和(ac)分离的核酸分子，其编码具有表II第5列中所述多肽的活性的多肽或编码包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的表达产物；b)导入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子，从而所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子包含与选自本权利要求的(a)部分的核酸分子具有至少50％同源性的至少17nt的片段；c)导入特异性切割选自本权利要求的(a)部分的核酸分子的核酶；d)导入在(b)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子和在(c)中表征的核酶；e)导入赋予下述核酸分子表达的有义核酸分子，其中所述核酸分子包含选自本文以上所定义的或在上文(ab)或(ac)部分中所定义的核酸分子或包含编码下述多肽的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)部分中提及的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有由包含如表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性以诱导对内源性表达产物的共抑制作用；f)导入赋予下述蛋白质的显性失活突变体表达的核酸分子，所述的蛋白质具有如表II第5列或第7列中所示蛋白质的活性或包含如本文以上表征的核酸分子所编码的多肽；g)导入编码下述因子的核酸分子，其中所述因子与这样的核酸分子结合，该核酸分子包含选自本文以上或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的赋予蛋白质表达的核酸分子，所述的蛋白质具有如本文以上表征的核酸分子所编码蛋白质的活性；h)导入引起RNA分子下降的病毒核酸分子，其中所述RNA分子包含选自本文以上所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的赋予蛋白质表达的核酸分子，所述的蛋白质由本文以上表征的核酸分子编码；i)导入核酸构建体，所述核酸构建体能够与下述内源基因重组并沉默、失活、阻抑或降低该内源基因的活性，其中所述内源基因包含选自本文以上所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的赋予蛋白质表达的核酸分子，所述的蛋白质由本文以上表征的核酸分子编码；j)在包含核酸分子的内源基因中导入非沉默突变，所述的核酸分子选自本文以上所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的核酸分子；和k)导入赋予在(a)至(i)任一项中表征的核酸分子表达的表达构建体。优选地，在本发明的方法中，序列的3’-或5’-核酸序列的至少17bp的片段用于减少上文表征的核酸分子或由所述核酸分子编码的多肽，所述序列包含选自上文所定义或在本权利要求书(ab)或(ac)部分中所定义的具有至少50％同一性的核酸分子。优选地，在本发明的方法中，所述降低或缺失通过应用化学化合物至非人生物引起。优选地，在本发明的方法中，所述植物选自由漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、核桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、多年生牧草、草料作物、蔬菜植物和观赏植物组成的组。优选地，本发明的方法还包括导入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体和/或反义核酸的步骤，其中已经设计前述各分子旨在靶向包含如以上所表征核酸分子的基因的表达产物以诱导所述目的基因的mRNA断裂并且因而使基因表达沉默，或以诱导确保所述目的基因表达的表达盒断裂。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：a)分离的核酸分子，其编码包含如表IIB第5列或第7列中所述多肽的多肽，或；b)分离的核酸分子，其包含如表IB第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子，或；c)分离的核酸分子，其包含能够因遗传密码的简并性而从表IIB第5列或第7列中所述的多肽序列衍生的核酸序列并且具有由如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；d)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与由(a)或(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽借助针对由(a)至(c)的核酸分子之一编码的多肽的单克隆抗体分离，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列中所述的共有序列或多肽基序并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的生物学活性；g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；h)分离的核酸分子，其包含通过使用如表III第7列中所述的在5’端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸；和i)分离的核酸分子，其通过严格杂交条件下用包含(a)至(c)的核酸分子的序列之一的探针或用在(a)至(h)任一项中表征并编码下述多肽的核酸分子的至少17nt的片段筛选合适文库可获得，所述多肽具有如表II第5列中所示蛋白质代表的活性；或其包含与之互补的序列；因而根据(a)至(i)的核酸分子与如表IA第5列或第7列中所述并且优选编码下述蛋白质的序列至少一个或多个核苷酸不同，其中所述蛋白质与如表IIA第5列或第7列中描述的蛋白质序列至少一个或多个氨基酸不同。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或反义核酸分子，用于降低以上表征的活性或降低如本文以上所表征核酸分子的或由该核酸分子编码的多肽的活性或表达。优选地，本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子包含本文以上定义的核酸分子的至少17nt的片段。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及双链RNA(dsRNA)、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、反义或ta-siRNA分子或核酶，其能够形成双链核糖核酸分子，从而所述双链核糖核酸分子的至少17nt的片段与下述核酸分子具有至少50％同源性，其中所述的核酸分子选自以下分离的核酸分子：(aa)如本文以上表征的分离的核酸分子；(ab)如表I第5列或第7列中描述的或编码如表II第5列或第7列中所示多肽的分离的核酸分子，和(ac)分离的核酸分子，其编码具有如表II第5列或第7列中所述多肽的活性的多肽或编码包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的表达产物。优选地，在本发明的dsRNA分子中，有义链和反义链彼此共价地结合并且所述反义链基本上是“有义”RNA链的互补物。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及引起RNA分子下降的病毒核酸分子，其中所述RNA分子引起具有以上所表征活性的蛋白质表达，或涉及引起如本文以上表征的核酸分子或由该核酸分子编码的多肽的活性或表达下降的病毒核酸分子。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定敲除基因的TILLING引物，所述基因包含如表I第5列或第7列的任一列中所示核酸分子的核酸序列。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及包含如表II第5列或第7列中所述多肽的多肽的显性失活突变体。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及编码以上定义的显性失活突变体的核酸分子。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及赋予本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或反义核酸分子、本发明的病毒核酸分子或本发明的核酸分子表达的核酸构建体。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明的分离核酸分子或本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子、或本发明的病毒核酸分子的核酸构建体，其中所述核酸分子功能性地连接于一种或多种调节信号。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及载体，其包含本发明的核酸分子或本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或反义核酸分子，或本发明的病毒核酸分子，或本发明的核酸构建体。优选地，在本发明的载体中，所述核酸分子与用于植物宿主中表达的调节序列有效连接。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及已经用本发明载体或本发明核酸分子或本发明的核酸构建体稳定或瞬时地转化的转基因植物宿主细胞。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及植物细胞、植物或其部分，其中包含如表II、优选表IIB的第5列或第7列或表IV第5列或第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的蛋白质的活性或包含如表I、优选表IB的第5列或第7列所示核酸分子的核酸分子的活性降低。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生由本发明核酸序列编码的多肽的方法，所述多肽在本发明的植物细胞、植物或其部分中表达。优选地，在用于产生本发明多肽的方法中或在本发明的宿主细胞中，所述宿主细胞选自由漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科、牻牛儿苗科、禾本科、核桃科、樟科、豆科、亚麻科、多年生牧草、草料作物、蔬菜植物和观赏植物组成的组，或是如上文定义的微生物。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及由本发明核酸分子编码的或包含如表IIB第7列中所示多肽的分离多肽。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及抗体，其与本发明的多肽特异性结合。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明植物细胞的植物组织、植物、收获的植物材料或植物的繁殖材料。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于筛选如本发明以上方法中表征的活性的或由下述多肽代表的活性的拮抗物的方法，所述多肽由本发明以上方法表征的核酸分子编码。a)使表达所述多肽的生物、其细胞、组织或部分与化学化合物或包含多种化学化合物的样品在下述条件下接触，所述的条件允许编码由该蛋白质所代表活性的核酸分子的表达降低或缺失或允许该蛋白质的活性降低或缺失；b)测试植物、其细胞、组织或其部分中该蛋白质活性的水平或多肽的表达水平，其中将所述植物、其细胞、组织或部分培养或维持；和c)通过将该蛋白质活性的测量水平或该多肽表达水平与所述化学化合物或包含所述多种化学化合物的样品不存在下测量的该蛋白质活性的标准水平或该多肽表达水平比较而鉴定拮抗物，因而与标准相比的降低水平表明该化学化合物或包含所述多种化学化合物的样品是拮抗物。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定化合物的方法，该化合物在植物中赋予与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，所述方法包括步骤：a)培养或维持植物、植物细胞或其组织或其部分和下述读出系统，所述的植物、植物细胞或其组织或其部分表达具有在以上本发明方法中所表征活性的多肽或由以上本发明方法中表征的核酸分子所编码的多肽或编码所述多肽和下述读出系统的多核苷酸，其中所述读出系统在允许该多肽与所述读出系统相互作用的合适条件下，在化学化合物或包含多种化学化合物的样品存在时能够与所述多肽相互作用，并且在允许阻抑所述读出系统和所述多肽的条件下，能够提供反映化学化合物与所述多肽结合的可检测信号；和b)通过检测由所述读出系统产生的信号存在或不存在或降低或提高来鉴定该化学化合物是否为有效拮抗物。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生农业用组合物的方法，包括步骤：用于鉴定化合物的过程，该化合物在本发明的植物、植物细胞或其部分中赋予与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，并以适于在农业中应用的形式配制如所述权利要求书中鉴定的化合物。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明蛋白质的组合物、本发明的核酸分子、本发明的核酸构建体、本发明载体、根据用于鉴定本发明拮抗物的方法所鉴定的拮抗物、本发明抗体、本发明的宿主细胞、在本发明方法中表征的核酸分子、本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子和任选地可农业用载体。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及包含本发明蛋白质的食物或饲料、本发明的核酸分子、本发明的核酸构建体、本发明载体、根据用于鉴定本发明拮抗物的方法所鉴定的拮抗物、本发明抗体、本发明的宿主细胞、在本发明方法中表征的核酸分子、本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子、本发明植物的植物、植物组织、收获的植物材料或繁殖材料。另外，在另一个实施方案中，本发明涉及本发明蛋白质、本发明核酸分子、本发明核酸构建体、本发明载体、根据用于鉴定本发明拮抗物的方法所鉴定的拮抗物、本发明抗体、本发明宿主细胞、在本发明方法中表征的核酸分子、本发明的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子的用途，用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物。
表I显示相关多核苷酸的SEQ ID NO。表II显示相关多肽的SEQ ID NO。表IV显示相关共有序列和相关多肽基序的SEQ ID NO。在全部这些表中，缩写“A.th.”用于生物“拟南芥(Arabidopsis thaliana)”。在下文中，术语“如表II或表IV中所述的多肽”也涉及包含如表IV中所述共有序列或至少一种多肽基序的多肽。
根据本发明方法待降低其活性以造成与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的分子(例如上文表I和/或II的分子)在下文中是“在本发明方法中待降低其活性的”的分子。该分子可以例如是多肽分子或核酸分子。
因而，换句话说，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)降低、阻抑或缺失植物或其部分中以下对象的活性I)至少一种多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO 28、105、191、411、513、674、730、814、924、1026、1084、1386、1419、1465、1552、1594和1651组成的组中的多肽或如表II第7列中所述的、优选如表IIB中所述的其同源物，或包含表IV的共有序列或至少一个多肽基序，或II)核酸分子的至少一种表达产物，所述核酸分子包含选自由SEQ IDNO 27、104、190、410、512、673、729、813、923、1025、1083、1385、1418、1464、1551、1593和1650组成的组中的多核苷酸或如表I第7列中所述的、优选如表IB第5列或第7列中所述的其同源物，III)或者(I)或(II)的功能等同物；和b)产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转化植物并在允许植物发育的条件下培育。在一个实施方案中，本发明涉及用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：a)降低、阻抑或缺失植物或其部分中以下对象的活性I)至少一种多肽，所述多肽包含选自由SEQ ID NO 28、105、191、411、513、674、730、814、924、1026、1084、1386、1419、1465、1552、1594和1651组成的组中的多肽或如表II第7列中所述的、优选如表IIB中所述的其同源物，或包含表IV的共有序列或至少一个多肽基序，或II)核酸分子的至少一种表达产物，所述核酸分子包含选自由SEQ IDNO 27、104、190、410、512、673、729、813、923、1025、1083、1385、1418、1464、1551、1593和1650组成的组中的多核苷酸或如表I第7列中所述的、优选如表IB第5列或第7列中所述的其同源物，III)或者(I)或(II)的功能等同物；和b)产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转化植物并在允许植物发育的条件下培育，c)通过停水施加干旱，d)在未转化的野生型植物显示损伤的视观症状后，选择与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的植物。
令人惊讶地，观察到在拟南芥中敲除赋予下述活性的至少一种基因，其中所述活性选自由以下蛋白质组成的组：1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶，或敲除包含表I第5列中所述核酸序列的基因，引起转化植物中与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1418的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.7日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶由包含核酸序列SEQ ID NO：1418的基因编码，而如实施例中所示在0.6日和2日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1025的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在4.7日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“甲基转移酶”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述甲基转移酶由包含核酸序列SEQ ID NO：1025的基因编码，而如实施例中所示在0.5日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：729的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在1.8日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“转录因子”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述转录因子由包含核酸序列SEQ ID NO：729的基因编码，而如实施例中所示在1.2日和3日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：27的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在3日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)由包含核酸序列SEQ ID NO：27的基因编码，而如实施例中所示在1.8日和3日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：104的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.9日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“金属外肽酶(MAP1C)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述金属外肽酶(MAP1C)由包含核酸序列SEQ ID NO：104的基因编码，而如实施例中所示在1.4日和3日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：190的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.9日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“质子依赖性寡肽转运蛋白”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述质子依赖性寡肽转运蛋白由包含核酸序列SEQ ID NO：190的基因编码，而如实施例中所示在1.3日和2日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：512的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.5日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“氨基酸通透酶(AAP1)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述氨基酸通透酶(AAP1)由包含核酸序列SEQ ID NO：512的基因编码，而如实施例中所示在1日和2日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1464的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.4日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)由包含核酸序列SEQ ID NO：1464的基因编码，而如实施例中所示在1.3日和3日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：813的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.7日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)由包含核酸序列SEQID NO：813的基因编码，而如实施例中所示在1日和3日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：673的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.8日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶由包含核酸序列SEQ ID NO：673的基因编码，而如实施例中所示在1.5日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：27的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.7日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)由包含核酸序列SEQ ID NO：27的基因编码，而如实施例中所示在1.7日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：512的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.9日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“氨基酸通透酶(AAP1)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述氨基酸通透酶(AAP1)由包含核酸序列SEQ ID NO：512的基因编码，而如实施例中所示在1.4日和2日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1385的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.5日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“At5g40590蛋白”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述At5g40590蛋白由包含核酸序列SEQ ID NO：1385的基因编码，而如实施例中所示在0.9日和2日之间的时段不显示任何损伤症状。另外，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1385的基因引起寒冷抗性、尤其低温耐受性提高，其中如实施例中所示，与野生型对照相比较而言在低温条件下提高生物量生产5％至100％或甚至更多、优选10％至50％、15％至40％、更优选20％至30％、22％至25％、23％。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：410的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.7日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“DNA结合蛋白/转录因子”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述DNA结合蛋白/转录因子由包含核酸序列SEQ ID NO：410的基因编码，而如实施例中所示在1.2日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：923的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.5日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“水裂解酶/乌头酸水合酶”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述水裂解酶/乌头酸水合酶由包含核酸序列SEQ ID NO：923的基因编码，而如实施例中所示在1.3日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1593的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在4日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)由包含核酸序列SEQ ID NO：1593的基因编码，而如实施例中所示在0.1日和0.1日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1083的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.2日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白由包含核酸序列SEQ ID NO：1083的基因编码，而如实施例中所示在1日和3日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1551的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在2.3日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“1-磷脂酰肌醇4-激酶”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述1-磷脂酰肌醇4-激酶由包含核酸序列SEQ ID NO：1551的基因编码，而如实施例中所示在0.7日和2日之间的时段不显示任何损伤症状。特别地，观察到在拟南芥中敲除包含核酸序列SEQ ID NO：1650的基因引起干旱抗性提高，通过存活得比野生型对照更长，而如实施例表1中所示在4.5日和5日之间的时段不显示任何损伤症状。还观察到与野生型对照相比，在拟南芥中降低具有“At3g55990蛋白”的活性的基因产物的活性引起生物量生产提高，其中所述At3g55990蛋白由包含核酸序列SEQ ID NO：1650的基因编码，而如实施例中所示在2.2日和4日之间的时段不显示任何损伤症状。因此，根据本发明的方法，与对照或野生型相比，可以在植物细胞、植物或其部分中实现提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1418或多肽SEQ ID NO：1419的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1418或多肽SEQ IDNO：1419各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.7日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在0.6日和2日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1025或多肽SEQ ID NO：1026的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1025或多肽SEQ IDNO：1026各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“甲基转移酶”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在4.7日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在0.5日和5日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：729或多肽SEQ ID NO：730的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：729或多肽SEQ IDNO：730各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“转录因子”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在1.8日和4日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.2日和3日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：27或多肽SEQ ID NO：28的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：27或多肽SEQ ID NO：28各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在3日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.8日和3日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：104或多肽SEQ ID NO：105的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：104或多肽SEQ IDNO：105各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“金属外肽酶(MAP1C)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.9日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.4日和3日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：190或多肽SEQ ID NO：191的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：190或多肽SEQ IDNO：191各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“质子依赖性寡肽转运蛋白”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.9日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.3日和2日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：512或多肽SEQ ID NO：513的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：512或多肽SEQ IDNO：513各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“氨基酸通透酶(AAP1)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.5日和4日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1日和2日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1464或多肽SEQ ID NO：1465的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1464或多肽SEQ IDNO：1465各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.4日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.3日和3日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：813或多肽SEQ ID NO：814的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：813或多肽SEQ IDNO：814各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.7日和4日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1日和3日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：673或多肽SEQ ID NO：674的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：673或多肽SEQ IDNO：674各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.8日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.5日和4日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：27或多肽SEQ ID NO：28的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：27或多肽SEQ ID NO：28各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.7日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.7日和4日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：512或多肽SEQ ID NO：513的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：512或多肽SEQ IDNO：513各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“氨基酸通透酶(AAP1)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.9日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.4日和2日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1385或多肽SEQ ID NO：1386的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1385或多肽SEQ IDNO：1386各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“At5g40590蛋白”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.5日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在0.9日和2日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1385或多肽SEQ ID NO：1386的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1385或多肽SEQ IDNO：1386各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“At5g40590蛋白”的活性，优选地与野生型对照相比引起在低温条件下生物量生产提高5％至100％或甚至更多、优选10％至50％、15％至40％、更优选20％至30％、22％至25％、23％。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：410或多肽SEQ ID NO：411的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：410或多肽SEQ IDNO：411各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“DNA结合蛋白/转录因子”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.7日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.2日和4日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：923或多肽SEQ ID NO：924的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：923或多肽SEQ IDNO：924各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“水裂解酶/乌头酸水合酶”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.5日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1.3日和4日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1593或多肽SEQ ID NO：1594的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1593或多肽SEQ IDNO：1594各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在4日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在0.1日和0.1日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1083或多肽SEQ ID NO：1084的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1083或多肽SEQ IDNO：1084各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.2日和4日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在1日和3日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1551或多肽SEQ ID NO：1552的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1551或多肽SEQ IDNO：1552各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“1-磷脂酰肌醇4-激酶”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在2.3日和4日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在0.7日和2日之间的时间段不显示任何损伤症状。因而，在一个实施方案中，在降低分别包含核酸SEQ ID NO：1650或多肽SEQ ID NO：1651的拟南芥核酸分子或多肽的活性情况下或在降低其他生物中所述核酸分子或多肽的天然同源物的活性情况下，例如如果降低包含如表I、II或IV第7列中与核酸分子SEQ ID NO：1650或多肽SEQ IDNO：1651各自相同的横行中所述核酸或多肽或共有序列或多肽基序的核酸分子或多肽的活性或如果降低植物细胞、植物或其部分中“At3g55990蛋白”的活性，优选地通过存活得比野生型对照更长而引起干旱抗性提高，同时在4.5日和5日之间或更长的时间段不显示任何损伤症状，或与野生型对照相比，引起生物量生产提高，同时在2.2日和4日之间的时间段不显示任何损伤症状。
为了本发明的目的，复数一般意图包括单数并且反之亦然。除非另外说明，术语“多核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本上下文中可互换地使用。除非另外说明，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”在本上下文中可互换地使用。术语“序列”可以涉及多核苷酸、核酸、核酸分子、肽、多肽和蛋白质，这取决于术语“序列”使用的上下文。如本文中使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、”核苷酸序列”或”核酸分子”指任意长度的核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)的聚合形式。所述术语仅指分子的一级结构。如本文中使用的术语“基因”、“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸分子”包括双链和单链DNA和/或RNA。它们也包括已知类型的修饰，例如甲基化、“加帽”、用类似物替换一个或多个天然存在的核苷酸。优选地，DNA序列或RNA序列包含编码本文中所定义多肽的编码序列。“编码序列”是转录成RNA(例如调节性RNA，如miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、RNAi、核酶等)或转录成mRNA的核苷酸序列，其中所述的mRNA在置于适宜调节序列控制下时翻译成多肽。编码序列的边界由在5’-末端的翻译起始密码子和在3’-末端的翻译终止密码子决定。编码序列可以包括但不限于mRNA、cDNA、重组核苷酸序列或基因组DNA，同时在某些情况下也可以存在内含子。如本上下文中所用，核酸分子也可以包括在编码基因区域3’末端和在其5’末端的非翻译序列，例如该编码区的5’末端上游序列的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸和该编码基因区域的3’末端下游序列的至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸。在例如使用反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术的情况下，可以有利地使用编码区以及5’-和/或3’-区域。但是，出于克隆和表达目的，仅选择编码区往往是有利的。“多肽”指氨基酸的聚合物(氨基酸序列)并且不涉及分子的具体长度。因此，在多肽的定义中包括肽和寡肽。该术语还指或包括多肽的翻译后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等。在该定义中包括例如含有一个或多个氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)的多肽、带有取代键和本领域已知的其他修饰的多肽，其是天然存在的和非天然存在的。在本说明书中使用的术语“表I”将用来说明表IA和表IB的内容。在本说明书中使用的术语“表II”将用来说明表IIA和表IIB的内容。在本说明书中使用的术语“表IA”将用来说明表IA的内容。在本说明书中使用的术语“表IB”将用来说明表IB的内容。在本说明书中使用的术语“表IIA”将用来说明表IIA的内容。在本说明书中使用的术语“表IIB”将用来说明表IIB的内容。在一个优选的实施方案中，术语“表I”意指表IB。在一个优选的实施方案中，术语“表II”意指表IIB。在本说明书中使用时，术语“包含”及其语法变化将用来说明存在所述特征、整数、步骤或组分或其组合，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、整数、步骤或组分或其组合。根据本发明，如本文中理解的术语“生物”总是涉及非人生物，尤其涉及植物生物、完整生物、组织、器官或其细胞。
术语“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”涉及在生物、生物的部分如组织、种子、根、块茎、果实、叶、花等中或细胞中属性的相应变化。“属性的变化”理解为基因产物的活性、表达水平或数量或代谢物含量相对于对照、参考或野生型蛋白质的相应容积或数量而言，在蛋白质的具体容积或具体数量方面改变。优选地，如果降低、减少或缺失涉及降低、减少或缺失基因产物的活性，无论是降低、减少或缺失基因产物数量或该基因产物的特定活性或这两者或无论是降低、减少或缺失编码该基因产物的核酸序列或基因的数量、稳定性或翻译效力，则容积中的总体活性降低、减少或缺失。术语“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”包括该属性仅在本发明主题物的部分中的变化，例如，修饰作用可以在细胞的区室如细胞器中，或在包括但不限于组织、种子、根、块茎、果实、叶、花等的植物部分中找到，但是如果检验完整主题物即完整细胞或植物，则是检测不到的。任选地，“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”存在于细胞水平，因此术语“降低、减少或缺失活性”或“降低、减少或缺失代谢物含量”涉及与野生型细胞相比的在细胞水平上降低、减少或缺失。此外，术语“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”包括该属性仅在本发明方法中所用生物的不同生长期期间的变化，例如所述降低、阻抑、减少或缺失仅在种子生长期间或在开花期间发生。另外，所述术语包括短暂降低、减少或缺失，例如原因是所用方法例如反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶没有在生物的基因组中稳定整合，或所述降低、减少、阻抑或缺失处于调节型或诱导型元件(例如化学诱导型或其他诱导型启动子)的控制下并且因而仅具有短暂作用。因此，术语“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”意指基因产物、酶或其他蛋白质或调节性RNA的特定活性以及化合物或代谢物的数量例如多肽、核酸分子或编码性mRNA或DNA的数量可以在特定容积中被降低、减少或缺失。术语“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”包括导致所述“降低”、“阻抑”、“减少”或“缺失”的原因可能是施用至生物或其部分的化学化合物。在本说明书通篇范围内，缺失表达产物(例如表II中所示蛋白质)的活性或其表达意指该活性的完全丧失。术语“降低”、“阻抑”、或“减少”是可互换的。术语“降低”如果不另外说明的话，应当包括术语“阻抑”、“减少”或“缺失”。如本文中使用的术语“降低”、“阻抑”、“减少”或“消除”也包括术语“减低(debasing)”、“耗尽(depleting)”、“削弱(diminishing)”或“降低(bringingdown)”。降低也理解为意指调整如可以表述为例如kcat/Km值的底物特异性。在此上下文中，与对照、参考或野生型相比，功能或活性(例如酶活性或“生物学活性”)降低至少10％，有利地20％、优选30％、特别优选40％、50％或60％、非常特别优选70％、80％、85％或90％或更多、非常特别优选95％、更优选99％或更多。最优选地，活性的降低、减少或缺失基本上达到100％。因此，一个特别有利的实施方案是使化合物例如多肽或核酸分子的功能失活。表达水平或活性的降低、阻抑或缺失导致与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％或200％或更多、优选250％或300％或更多、特别优选350％或400％或更多、最特别优选500％或600％w/w或更多，以脱水和/或不浇水条件下与参考或野生型相比转基因植物存活更长的时间表述和/或与参考或野生型相比以转基因植物显示更高生物量生产的时间表述。术语化合物的“活性”指化合物在生物系统如细胞、器官或生物中的功能。例如，术语化合物的“活性”指化合物的酶功能、调节功能或其作为结合配偶体、运输蛋白、调节蛋白或载体蛋白等的功能。
在一个实施方案中，术语“生物学活性”指根据相应上下文而选自由以下蛋白质组成的组中的活性：1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶。
术语“增强”、“提高”、“减少”、“阻抑”或“降低”或相似术语包括该属性仅在本发明主题物的一个或一些部分以及在其全部部分中的变化和调整。例如，修饰作用可以在细胞的区室如细胞器中，或优选地在植物的部分如组织、种子、根、叶、果实、块茎、花等中找到，但是如果检验完整主题物即完整细胞或植物，则是检测不到的。更优选的是发现在生物、尤其植物的多于一个部分中找到该属性的变化或调整。因此，在一个实施方案中，在根据本发明方法产生的植物的组织、种子、根、果实、块茎、叶和/或花中找到该属性的变化或调整。但是，如本文中使用的术语“增强”、“提高”、“减少”、“阻抑”或“降低”或相似术语也包括该属性在如所提及的完整生物中的变化和调整。
术语“增强”或“提高”意指与相应的非转化野生型植物相比较而言10％、20％、30％、40％或50％或更高、优选至少60％、70％、80％、90％或100％或更高、更优选150％、200％、300％、400％或500％或更高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。在一个实施方案中，如实施例中所示计算所述提高。
如本发明中所用，术语“环境胁迫”指任何次优生长条件并且包括但不限于与干旱、寒冷或盐度或其组合相关的次优条件。在优选的实施方案中，环境胁迫是干旱和低水含量。其中干旱胁迫意指导致植物中水缺乏或对植物的水供应降低的任意环境胁迫。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”涉及提高的水胁迫抗性，其中所述的水胁迫作为继发胁迫由寒冷、盐产生，并且当然在干旱期间作为原发胁迫。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”涉及提高的寒冷抗性。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的寒冷抗性”涉及低温耐受性，包括冰冻耐受性和/或激冷耐受性。另外，改进或增强的″激冷耐受性″或其变化形式指针对低而非冰冻的约10℃温度、优选1至18℃之间、更优选4-14℃并且最优选8至12℃的温度(本文以后称作“激冷温度”)的改进适应性。改进或增强的“冰冻耐受性”或其变化形式指针对接近或低于零的温度、即优选低于4℃、更优选低于3或2℃并且特别优选在0(零)℃或以下或-4℃以下或低至-10℃的甚至极度低温或更低温度(本文以后称作“冰冻温度”)的改进适应性。更一般地，对环境胁迫如低温例如冰冻温度和/或激冷温度的“改进适应性”指与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的生物量生产。因而，出于描述本发明的目的，对植物并优选对作物植物的低温胁迫而言，术语“低温”指如本文中所述的任意低温条件，优选如上文定义的激冷温度和/或冰冻温度，如上下文要求。可以理解技术人员从本发明描述的具体上下文中将能够认识到“低温”所表示的那个温度或温度范围。在本发明中，增强的低温耐受性可以例如并且优选地根据以下方法确定：转化的植物在生长室(例如，York，曼海姆，德国)的花钵中培育。在植物是拟南芥的情况下，将拟南芥的种子播种在营养丰富土壤(GS90，Tantau，Wansdorf，德国)和砂3.5∶1(v/v)混合物的花钵中。植物在标准生长条件下培育。在植物是拟南芥的情况下，所述标准生长条件是：16小时光亮和8小时黑暗的光周期，20℃，60％相对湿度和200μmol/m2s光子流密度。培育和栽培植物。在植物是拟南芥的情况下，每两日给它们浇水。在12至13日后，将所述植物分成单株。播种后14日施加寒冷(激冷于11℃-12℃)直至实验结束。为测量生物量性能，在收获时间(播种后29-30日)通过收割并称重幼枝确定植物鲜重。除了称重外，在不同于野生型对照的植物的情况下添加表型信息。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”涉及提高的盐抗性。在本发明的一个优选的实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”涉及提高的干旱抗性。在本发明的另一优选实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”涉及提高的水胁迫，例如干旱、寒冷和盐抗性。水胁迫涉及少水或脱水条件。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”定义为植物在干旱条件比未转化的野生型植物存活得更长。干旱条件意指在缺水条件下，换句话说，对于拟南芥，在缺水条件下植物存活和生长持续至少10日、优选11、12日、更优选13日或更长时段，而不显示任何损伤症状，如萎蔫和叶褐变和/或卷叶，换句话说，植物在视观上饱满并在颜色上呈健康绿色。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的生物量生产”意指与相应的非转化野生型植物相比较而言，植物从开始停水时表现提高的生长速率。提高的生长速率包括完整植物的生物量生产提高、植物可见部分(例如茎和叶和花)的生物量提高、可见的更高和更大的茎。在一个实施方案中，提高的生物量生产包括更高的种子产量，更高光合作用和/或更高的干物质生产。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的生物量生产”意指与相应的非转化野生型植物相比较而言，植物从开始停水时表现延长的生长。延长的生长包含完整植物在未转化的野生型植物显示视观损伤症状时的时刻上存活和/或继续生长。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的生物量生产”意指与相应的非转化野生型植物相比较而言，植物从开始停水时表现提高的生长速率和延长的生长。在本发明的一个实施方案中，提高的干旱抗性根据以下方法确定并定量：转化的植物在生长室(例如，York 
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GmbH，曼海姆，德国)的花钵中分别地培育。诱导萌发。在植物是拟南芥的情况下，将播种的种子在4℃于黑暗中保持3日以诱导萌发。随后，将条件改变至20℃/6℃白昼/黑夜温度，16/8小时昼夜循环，150μE/m2s，持续3日。随后，植物在标准生长条件下培育。在植物是拟南芥的情况下，所述标准生长条件是：16小时光照和8小时黑暗的光周期，20℃，60％相对湿度和200μE光子流密度。生长和培育植物直到它们发育叶。在植物是拟南芥的情况下，每日给它们浇水直到它们大约3周龄。从这个时间开始，通过停水施加干旱。在未转化的野生型植物显示视观损伤症状后开始评价，并且与野生型和近邻植物连续比较5-6日，对植物就干旱症状和生物量生产进行评分。视观损伤症状指的是一个或者任意结合的两个、三个或多个以下特征：a)萎蔫b)叶褐变c)膨压丧失，这导致叶或针叶、茎和花的低垂d)叶或针叶低垂和/或脱落，e)叶为绿色，但与对照相比，叶略微指向地面，f)叶缘开始向内折叠(卷曲)，g)叶或针叶的早衰，h)叶或针叶中叶绿素丢失和/或变黄。
术语“参考”、“对照”或“野生型”意指这样的生物，该生物不含对核酸分子的表达产物的表达或活性进行前文提及的修饰，其中所述核酸分子包含在表I第5列或第7列中所示的多核苷酸，或不含对具有下述多肽活性的蛋白质的活性进行前文提及的修饰，其中所述多肽包含在表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽，或不含对蛋白质的活性进行前文提及的修饰，其中所述蛋白质由包含表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子编码。换句话说，野生型指(a)携带未改变(通常是“正常”)形式的基因或等位基因的生物；(b)衍生突变体的实验室砧木(stock)。形容词“野生型的”可以指表型或基因型。
“参考”、“对照”或“野生型”尤其是未根据本发明方法产生的细胞、组织、器官、植物或其部分。因而，术语“野生型”、“对照”或“参考”是可交换的并且可以是这样的细胞、或生物的部分如细胞器或组织，或生物，尤其植物，其未经本文中描述的本发明方法修饰或处理。因而，作为野生型、对照或参考使用的细胞、或生物的部分如细胞器或组织，或生物，尤其植物尽可能地对应于所述细胞、生物或其部分，并且除了本发明方法结果的属性之外，在任何其他属性方面与本发明的主题物尽可能地相同。因而，野生型、对照或参考以相同方式或以尽可能相同的方式受到处理，也就是说，仅不影响所测试属性的性质的条件或属性可能是不同的。优选地，任何比较在类似的条件下实施。术语“类似条件”意指全部条件例如培养或培育条件、测试条件(如缓冲液组成、温度、底物、病原株、浓度等)在待比较的实验之间保持一致。“参考”、“对照”或“野生型”优选是这样的主题，例如细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，其未经本文中描述的本发明方法修饰或处理并且在任何其它属性上与本发明的主题物尽可能地相似。该参考、对照或野生型在其基因组、转录组、蛋白质组或代谢组方面与本发明的主题物尽可能地相似。优选地，术语“参考-”、“对照-”或“野生型-”的细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，涉及这样的细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，其在遗传上与本发明的细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，或其部分几乎相同，优选95％，更优选98％、甚至更优选99.00％、尤其99.10％、99.30％、99.50％、99.70％、99.90％、99.99％、99.999％或更多地相同。最优选地，“参考”、“对照”或“野生型”优选地是这样的主题物，例如细胞器、细胞、组织或生物，尤其植物，其中除了核酸分子或由它们编码的基因产物根据本发明的方法进行改变和修饰以外，该主题物在遗传上与根据本发明方法使用的细胞、细胞器相同。在不能提供仅因不作为本发明方法的主题而不同于本发明主题的对照、参考或野生型时，对照、参考或野生型可以是这样的生物，在所述生物中已经恢复或撤除调节活性的原因，其中所述活性以下述方式引起如本文中所述的环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，例如通过弥补导致降低的基因产物，例如通过稳定或瞬时(过量)表达、通过激活活化物或拮抗物、通过失活抑制物或拮抗物、通过添加活性化合物例如激素、通过导入增强子等引起。
因此，优选的参考对象是本发明方法的起始对象。优选地，该参考和本发明的主题物在标准化和归一化，例如对总RNA、总DNA或总蛋白的量或参考基因(如持家基因，例如某些肌动蛋白基因或遍在蛋白基因)的活性或表达标准化和归一化后进行比较。优选地，参考、对照或野生型与本发明主题的区别仅在于在本发明方法中使用的多肽或RNA的细胞活性，例如通过降低、减少或缺失本发明核酸分子的水平或降低、减少或缺失在本发明方法中使用的多肽或RNA的特定活性所致，其中所述的降低、减少或缺失例如因蛋白质或RNA的表达水平或活性，也即通过降低或抑制其生物学活性引起，和/或因其生物化学原因或遗传原因所致。
术语“表达”指编码性基因片段或基因的转录和/或翻译。通常，所得产物是mRNA或蛋白质。但是，表达产物也可以包括功能性RNA，例如反义核酸、tRNA、snRNA、rRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等。表达可以是全身的、局部的或暂时的，例如，限于某些细胞类型、组织、器官或时段。术语“表达”意指基因转录成RNA(例如rRNA、tRNA、miRNA、dsRNA、snRNA、ta-siRNA、siRNA)或信使RNA(mRNA)。因此，术语“表达”意指基因的表达，伴有或不伴有后者随后翻译成蛋白质的过程。在实验上，可以通过熟知方法(例如RNA印迹法、阵列杂交法、qRT PCR、转录运行测定法)检测RNA水平上的表达。另外，在实验上，可以通过熟知方法(例如蛋白质印迹法或其他免疫测定法)检测多肽水平上的表达。
术语如表II第5列或第7列中所示多肽的“功能等同物”是基本上赋予如表II第5列中所示多肽的活性的多肽。术语如表I第5列或第7列中所述核酸分子的“功能等同物”是基本上赋予如表I第5列中所示核酸分子的活性的多核苷酸。
根据本发明，如果降低、阻抑、减少或缺失一种蛋白质或多肽的活性引起与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，则该蛋白质或多肽具有如表II第5列中所示多肽的活性。特别地，如果降低、阻抑、减少或缺失一种蛋白质或多肽的活性引起与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，则该蛋白质或多肽具有如表II第5列中所示多肽的活性。
根据本发明，如果降低、阻抑、减少或缺失一种核酸分子或多核苷酸的表达引起与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，则该核酸分子或多核苷酸具有如表I第5列中所示核酸分子的活性。
这意指例如与相应的非转化野生型植物相比较而言，降低、阻抑或缺失一种表达(如基因产物表达)或一种活性(如酶活性)或多或少涉及提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。在本说明书通篇范围内，降低、阻抑或缺失前文提及的蛋白质或多肽的活性或前文提及的核酸分子或序列的表达产物的活性意指该基因产物或该多肽的翻译、转录或表达水平或活性(例如该多肽的酶活性或生物学活性)与该表达产物的原始内源性表达水平相比或与下述表达产物或多肽的原始内源性表达水平相比降低至少10％、优选20％、30％、40％或50％、特别优选60％、70％或80％、最特别优选90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％，其中所述表达产物或多肽包含如表I第5列或第7列中所述的核酸分子或由该核酸分子编码或者包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽或其内源性同源物或等同物。另外，本领域技术人员可以在互补测定法中确定多肽是否具有“如表II的第5列中所示多肽的活性”。另外，本领域技术人员可以在互补测定法中确定核酸分子是否具有“如表I的第5列中所示核酸分子的活性”。
如本文中所述的用于本发明方法中的多肽或核酸分子的特定活性可以如实施例中或现有技术中所述检验。特别地，确定是否降低、减少或缺失了植物细胞中所讨论多核苷酸或多肽的表达并检测与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产是一项容易实施的试验并且可以如实施例中或现有技术中所述进行。为了检验核酸分子(例如基因)是否作为第5列或第7列中所述、尤其第5列中所述的核酸分子的功能性同源物，可以在微生物或植物中进行互补测定法。例如，缺少该基因的活性的植物(例如其中已经敲除、尤其缺失或打断包含所述核酸分子的核酸分子的拟南芥株系)可以用处在合适启动子控制下(例如在合适载体中)的相应所讨论的核酸分子(基因或同源物)转化。该启动子可以引起组成型或瞬时或组织特异性或发育特异性或诱导型表达。优选地，该启动子可以在空间活性或时间活性方面与已经被敲除、缺失或打断的基因的启动子相似或相同。所讨论的核酸分子(例如待检验的基因或同源物)优选地包含携带或不带内含子的完整编码区。此外，可能优选的是向该序列添加5’和3’UTR或其他特点，旨在增加转录物的稳定性或翻译。对转化的植物分析相应构建体的存在性和所讨论核酸分子(例如基因或同源物)或表达产物的表达。将显示基因或同源物表达的植物与野生型植物比较。与相应的非转化野生型植物相比较而言，包含敲除突变并表达相应基因或同源物的转基因植物在环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的改变方面与野生型对照基本上相同。合适的互补测定法例如在Iba K(1993)Journal of BiologicalChemistry 268(32)第24099-24105页，Bonaventure G等(2003)PlantGrowth.Plant Cell 15第1020-1033页或在Gachotte D等(1995)PlantJournal 8(3)第407-416页中描述。
来自拟南芥的At5g50870的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，NucleicAcids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶”的基因产物或其功能等同物或其同源物的活性，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At5g50870或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g50870相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At5g50870或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g50870相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At4g31120的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为甲基转移酶。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“甲基转移酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At4g31120或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At4g31120相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At4g31120或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At4g31120相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“甲基转移酶”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At3g14230的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic AcidsRes.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为转录因子。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“转录因子”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At3g14230或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At3g14230相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At3g14230或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At3g14230相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“转录因子”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At1g12110的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At1g12110或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g12110相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At1g12110或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g12110相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At1g13270的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为金属外肽酶(MAP1C)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“金属外肽酶(MAP1C)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At1g13270或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g13270相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At1g13270或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g13270相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“金属外肽酶(MAP1C)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At1g27080的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为质子依赖性寡肽转运蛋白。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“质子依赖性寡肽转运蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At1g27080或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g27080相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At1g27080或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g27080相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“质子依赖性寡肽转运蛋白”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的AT1G58360的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic AcidsRes.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为氨基酸通透酶(AAP1)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“氨基酸通透酶(AAP1)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述AT1G58360或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述AT1G58360相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述AT1G58360或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述AT1G58360相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“氨基酸通透酶(AAP1)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At5g60780的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At5g60780或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g60780相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At5g60780或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g60780相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At3g54920的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At3g54920或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At3g54920相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At3g54920或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At3g54920相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的AT2G03670的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic AcidsRes.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述AT2G03670或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述AT2G03670相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述AT2G03670或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述AT2G03670相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At1g12110的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At1g12110或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g12110相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At1g12110或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g12110相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的AT1G58360的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic AcidsRes.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为氨基酸通透酶(AAP1)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“氨基酸通透酶(AAP1)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述AT1G58360或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述AT1G58360相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述AT1G58360或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述AT1G58360相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“氨基酸通透酶(AAP1)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At5g40590的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为At5g40590蛋白。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“At5g40590蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At5g40590或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g40590相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At5g40590或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g40590相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。在本发明的一个实施方案中，术语“提高的环境胁迫耐受性和/或抗性”涉及提高的寒冷抗性，意指低温耐受性，包括冰冻耐受性和/或激冷耐受性。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“At5g40590蛋白”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At1g33760的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic AcidsRes.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为DNA结合蛋白/转录因子。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“DNA结合蛋白/转录因子”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At1g33760或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g33760相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At1g33760或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At1g33760相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“DNA结合蛋白/转录因子”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At4g13430的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为水裂解酶/乌头酸水合酶。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的水裂解酶/乌头酸水合酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At4g13430或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At4g13430相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At4g13430或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At4g13430相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“水裂解酶/乌头酸水合酶”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At5g66160的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nu cleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At5g66160或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g66160相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At5g66160或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g66160相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At5g02330的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At5g02330或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g02330相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At5g02330或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g02330相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At5g64070的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为1-磷脂酰肌醇4-激酶。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“1-磷脂酰肌醇4-激酶”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At5g64070或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g64070相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At5g64070或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At5g64070相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“1-磷脂酰肌醇4-激酶”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。来自拟南芥的At3g55990的序列，例如表I第5列中所示，已经在TAIR数据库http://www.arabidopsis.org(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)中公布，并将其活性描述为At3g55990蛋白。因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括减少如本文中提及的具有来自拟南芥的“At3g55990蛋白”活性的基因产物或其功能等同物或其同源物，例如减少a)基因的基因产物，其中所述基因包含如表I第5列中所示的核酸分子并且在与所述At3g55990或其如表I第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At3g55990相同的相应横行中描述；或b)多肽，该多肽包含如表II第5列或表IV第7列中分别所述的多肽、共有序列或多肽基序，并且在与所述At3g55990或其如表II第7列中所述功能等同物或同源物、优选如表IIB第7列中所述同源物或功能等同物相同的相应横行中描述，并且在与所述At3g55990相同的相应横行中描述，用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是具有描述为“At3g55990蛋白”的活性的基因产物，它优选地是该段落[0024.1.1.1]的项(a)或(b)的分子。
[0025.1.1.1]可以从任意生物衍生本发明基因产物的同源物(Homologue)(＝同源物)、尤其由表I第7列中所示核酸分子编码或包含该核酸分子的基因产物或包含如表II或表IV的第7列中所示多肽、共有序列或多肽基序的多肽的同源物，只要该同源物赋予本文中提及的活性，即它是所述分子的功能等同物。特别地，该同源物在其降低、阻抑和/或缺失后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。另外，根据本发明，术语“同源物”涉及生物的序列，其中所述序列与该生物全部已表达序列的本文中所提及或所列出序列优选地具有最高或基本上最高序列同源性。本领域技术人员知道如何找到、鉴定和证实推定性同源物优选地具有所述的“提高环境胁迫耐受性和/或抗性和/或生物量生产的活性”，例如，如本文中所描述。如果已知的话，则生物中所述生物学功能或活性基本上涉及或对应于如对段落[0024.1.1.1]中提及的基因，例如涉及或对应于表II第5列中所示蛋白质至少之一所描述的活性或功能。因而，在一个实施方案中，该同源物或功能等同物包含由包含表I第7列中所示序列的核酸分子编码的多肽的序列或在表II或表IV的第7列中所示的多肽序列、共有序列或多肽基序，或它是包含表I第7列中所示多核苷酸的核酸分子的表达产物。本文中公开的关于序列、活性、共有序列、多肽基序和试验的信息将本领域技术人员导向生物中相应的同源或功能性等同表达产物。在一个实施方案中，在本说明书通篇范围内，蛋白质或多肽或编码下述蛋白质或多肽的核酸分子或序列的活性，例如选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子或遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性，是根据本发明的相同或相似的活性，如果与如表II第5列或第7列中所示、更优选如表II第5列中所示的蛋白质相比，它具有基本上相同的活性或它具有至少10％的原始酶活性或生物学活性、优选30％或40％、特别优选50％、60％或70％、最特别优选80％、85％、90％、95％或更高的所述活性。在一个实施方案中，表II第5列中所示多肽任一者的同源物从真核生物衍生并且具有至少50％的序列同一性并且优选地具有与[0024.1.1.1]中所述基本上相同或相似的活性，但是，该同源物在生物或其部分中表达或活性的降低、阻抑或缺失分别引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。在一个实施方案中，表II第5列中所示多肽任一者的同源物从植物衍生，其中所述植物植物优选地源于选自由漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科、牻牛儿苗科、禾本科、核桃科、樟科、豆科、亚麻科、多年生牧草、草料作物、蔬菜植物和观赏植物组成的组中的植物，并且具有至少50％的序列同一性并且优选地具有与[0024.1.1.1]中所述基本上相同或相似的活性，但是，至少该同源物表达或活性的降低引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。在一个实施方案中，表II第5列中所示多肽任一者的同源物从作物植物衍生并且具有至少30％的序列同一性并且优选地具有与[0024.1.1.1]中所述基本上相同或相似的活性，但是，至少该同源物表达或活性的降低引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
因而，在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的分子是段落[0024.1.1.1]、[0025.1.1.1]或段落[00027.1.1.1]的(a)或(b)的分子。
因而，如表II第3列或第5列中所示多肽的同源物或功能等同物可以是由包含如表I第7列相同横行中所示多核苷酸的核酸分子编码的多肽，或可以是这样的多肽，其包含在表II第7列中显示的多肽或在表IV第7列中显示的一个或多个多肽基序或在表IV第7列与表II第3列或第5列中所示多肽相同的横行中显示的共有序列。因而，如表I第5列中所示核酸分子的同源物或功能等同物可以是编码包含如表I第7列相同横行中所示多核苷酸的多肽的核酸分子，或编码下述多肽的核酸分子，其中所述多肽包含在表II第7列中显示的多肽或在表IV第7列与表I第3列或第5列中所示核酸分子相同的横行中显示的共有序列或多肽基序。下文描述在本发明方法中待降低其活性的所述多肽的其他同源物或功能等同物。
由于降低、阻抑、减少或缺失翻译、转录和/或表达，例如由于基因、尤其如本文中所述基因(例如包含表I第5列或第7列中所示的核酸分子)的转录降低、阻抑、减少或缺失，出现相关表型性状，如与相应的非转化野生型植物相比较而言增强或提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
在本发明方法中待降低其活性的分子减少、阻抑或降低的活性本身表现为与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
在一个实施方案中，在用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产的本发明方法中，该方法包括降低、阻抑或缺失至少一种核酸分子的表达或活性，所述的核酸分子产生或编码的多肽具有由表I第5列中所述核酸分子编码的至少一种蛋白质的活性，并且其中该核酸分子包含选自由下述核酸分子组成的组中的核酸分子：a)编码如表II第5列或第7列中所述和/或含有如表II第7列中所述共有序列的多肽的分离核酸分子；b)如表I第5列或第7列中所述的分离的核酸分子；c)分离的核酸分子，其能够因遗传密码的简并性而从表II第5列或第7列中所述的多肽序列或从含有如表IV第7列中所述共有序列的多肽衍生；d)分离的核酸分子，其与包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性；e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％同一性，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可以借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体分离，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列相应横行中所述的共有序列或一个或多个多肽基序并且优选地具有由编码如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；h)分离的核酸分子，其包含通过使用如表III第7列中所述的并且在其5’端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸；并且所述分离的核酸分子优选地编码下述多肽，该多肽具有由包含如表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子编码的多肽所代表的活性；i)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；和j)分离的核酸分子，其通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库可获得，其具有与在(a)至(d)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15、17、19、20、21、22、23、24、25个或更多个nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示蛋白质代表的活性；或其包含与之互补的序列；或由所述核酸分子编码的蛋白质。因而，在一个实施方案中，术语“在本发明方法中待降低其活性的分子”指包含该段落所述核酸分子a)至j)至少之一的上文核酸分子。在一个实施方案中，如表I、II或IV的第5列或第7列中所示的核酸分子或多肽是如表IB或表IIB的第7列中所示的新核酸分子或新多肽。
存在一系列机制，其中借助所述机制可以操作在本发明方法中待降低其活性的分子，例如多肽或核酸分子，尤其包含如表I第5列或第7列所述核酸分子的核酸分子或分别包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽或共有序列的多肽或者所述核酸分子或多肽的功能性同源物，以与相应的非转化野生型植物相比较而言，直接或间接地影响环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产。例如，可以降低、减少或缺失在本发明方法中待降低其活性的多肽的分子数或特定活性或由本发明方法中待降低其活性的多肽加工的分子数或由本发明方法中待降低其活性的多肽加工或表达的分子数。但是，本领域技术人员已知降低、减少、阻抑或缺失生物中天然存在的基因的表达可以通过几种方式实现，例如通过修饰对基因的调节作用，或通过降低或减低mRNA的稳定性或由本发明方法中待降低、阻抑、减少或缺失其活性的核酸分子编码的基因产物(例如包含如表I的第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子)的稳定性。术语“降低”生物学功能例如指在其他方面相同的条件(例如，培养条件、植物年龄等)下，与没有对其应用本发明方法的相同属和物种的野生型相比，定量地降低蛋白质与生物、组织、细胞或细胞区室中底物的结合能力或结合强度。可以按照技术人员熟悉的方式(例如通过酵母双杂交系统)鉴定该蛋白质的结合配偶体。
这也类似地适用于组合地降低、阻抑、减少或缺失在表I第5列或第7列中所述核酸分子的基因或基因产物的表达，同时操纵其他活性。
在一个实施方案中，本发明的降低、阻抑、减少、缺失或调节可以通过(例如转基因)表达反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或表达抗体、抑制物或表达其他分子引起，其中前述分子抑制在本发明方法中待降低、减少或缺失其活性的核酸分子的表达产物的表达或活性。例如，所述降低、阻抑、减少、缺失或调节可以通过(例如转基因)表达包含多核苷酸的核酸分子或表达针对本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的抗体引起，其中所述的多核苷酸编码反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶。在又一个实施方案中，本发明的降低、阻抑、减少、缺失或调节可以是针对相应内源基因中的稳定突变，其中所述的内源基因编码在本发明的方法中待降低、减少或缺失的核酸分子，例如包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子。在另一个实施方案中，本发明的降低、阻抑、减少、缺失或调节可以调节基因的表达或其行为，其中所述的基因引起根据本发明方法待降低、减少、阻抑或缺失的多肽表达，例如引起包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽表达。
所述表达可以是组成型的，例如原因在于稳定、永久、全身性、局部或暂时表达，例如，限于某些细胞类型、组织、器官或时段。例如，本发明的降低、阻抑、减少、缺失或调节可以是瞬时的，例如原因在于瞬时转化、瞬时活性启动子或短时添加调节物，如拮抗物、抑制物或诱导物，例如用携带如本文中所述的双链RNA核酸分子(dsRNA)、反义、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体等的诱导型构建体转化后，施加相应的诱导物例如四环素或蜕皮素，其中所述的诱导型构建体例如处在诱导型启动子控制下。
与对照、参考或野生型相比，降低、减少或阻抑根据本发明方法降低其活性的分子的活性优选至少10％、优选至少30％或至少60％、特别优选至少70％、80％、85％、90％或更多、非常特别优选是至少95％、更优选至少99％或更多。最优选地，活性的降低、减少、阻抑或缺失达到100％。
根据本发明包括了用于降低由本发明核酸或核酸序列本身编码的蛋白质的量、表达、活性或功能的多种策略。熟练技术人员会认识到一系列不同方法可用于以想要的方式影响蛋白质的量、活性或功能。
因而，在一个实施方案中，本发明的方法包括一个或多个以下步骤：i)抑制、阻抑、失活或降低合适化合物的翻译或转录，ii)去稳定该化合物的转录物稳定性或多肽稳定性，iii)降低该化合物的聚集，iv)抑制、阻抑、失活或降低该化合物的转录物或多肽的活性，和/或v)降低该化合物的功能性(例如表达的)基因的拷贝数，所述化合物例如是a)一种蛋白质，其导致、介导或控制由本发明方法中待降低其活性的核酸分子编码的蛋白质表达或在本发明方法中降低其活性的多肽表达，例如包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子编码的多肽表达；b)mRNA分子，其导致、介导或控制在本发明方法中待减低或由本发明方法中降低其活性的核酸分子编码的蛋白质的表达，例如导致、介导或控制包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽表达或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子编码的多肽表达；c)RNA分子，其导致、介导或控制了编码在本发明方法中降低其活性的多肽的mRNA的表达，例如编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽的mRNA的表达；或导致、介导或控制了包含在本发明方法中降低其活性的核酸分子的mRNA表达，其中所述的mRNA例如包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸；d)RNA分子，其导致、介导或控制了包含在本发明方法中降低其活性的多核苷酸的核酸分子的表达产物表达，例如包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物表达。e)mRNA，其编码在本发明方法中降低其活性的多核苷酸或多肽；例如包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子，或导致、介导或控制在本发明方法中降低其活性的多肽表达的mRNA，所述多肽在表II或表IV的第5列或第7列中描述；f)编码激活物的基因，所述激活物导致激活或增加编码多肽的核酸分子(所述多肽由本发明方法中降低其活性的核酸分子编码)或在本发明方法中待降低其活性的多肽的表达，例如编码激活物的基因，所述激活物导致激活或增加包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达；或g)内源基因，其编码在本发明方法中降低其活性的多肽或核酸分子，例如内源基因，其编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子；因而，所述i)抑制、阻抑、失活或降低翻译或转录，ii)去稳定转录物稳定性或多肽稳定性，iii)降低聚集，iv)抑制、阻抑、失活或降低转录物或多肽的激活，和/或v)降低功能性(例如表达的)基因的拷贝数，可以例如通过添加或表达反义分子、共抑制分子、抗体、核酶、siRNA、微RNA、ta-siRNA、共抑制分子或RNAi、通过将表现或改善负向表达元件活性的基因序列突变或缺失或通过本领域技术人员已知或本文中提及的其他方法介导。在本发明方法中待降低其活性的多核苷酸或其一个或多个片段可以例如以反义方向表达。在另一个实施方案中，表达发夹RNAi构建体。同时表达在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的有义及反义RNA分子也是有利的。
例如，在本发明的一个实施方案中，本发明涉及一种方法，其中降低了编码本发明多核苷酸或核酸分子的基因的功能性(例如表达的)拷贝的数目。另外，本发明多肽的内源性水平例如可以通过调节该多肽的转录性或翻译性调节作用或效率来降低。在描述部分或在实施例中稍后描述细节。
在一个实施方案中，本发明的方法例如包括一个或多个以下步骤：a)稳定引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少的蛋白质；b)稳定引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少的mRNA或功能性RNA；c)提高或刺激蛋白质的特定活性，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少；d)降低蛋白质的特定活性，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达增加；e)表达编码蛋白质的转基因，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少，f)产生或增加阻抑蛋白质表达的内源性或人造转录因子的表达，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达增加；g)产生或增加介导蛋白质表达的内源性或人造转录因子的表达，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少；h)降低、阻抑或缺失阻抑蛋白质表达的内源性或人造转录因子的表达，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少；i)降低、阻抑或缺失介导蛋白质表达的内源性或人造转录因子的表达，所述蛋白质引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达增加；j)增加基因的功能性拷贝数目或表达，所述的基因引起在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的表达减少，k)提高阻抑蛋白或阻抑RNA的活性；l)提高蛋白质或RNA的活性，所述的蛋白质或RNA导致在本发明方法中降低其活性的蛋白质的显性失活表型；m)表达抗体或适体，所述的抗体或适体与在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或在本发明方法中降低其活性的蛋白质结合并且因而降低、减少或缺失其活性；n)表达阻抑物，所述阻抑物引起由本发明方法中待降低其活性的核酸分子编码的蛋白质或在本发明方法中降低其活性的多肽的表达降低、阻抑、减少或缺失，或增加对本发明多肽的抑制性调节作用；o)通过以下方式降低或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或在本发明方法中降低其活性的多肽的表达，即添加一种或多种外源性阻抑因子如抑制性化学化合物至生物或其培养基或其饲料中，例如添加至该生物的供水中；或p)以如此方式调节生物的生长条件，从而降低、阻抑、减少或缺失了编码在本发明方法中降低其活性的蛋白质的核酸分子或该蛋白质本身的表达或活性。这可以通过例如调节光照和/或营养条件实现，因此调节了在本发明方法中降低其活性的基因或蛋白质的表达。其他策略和改进或上述策略的组合是本领域技术人员熟知的并且也是本发明的实施方案。上文所述可以例如通过添加正向表达元件或移除负向表达元件实现，例如可以使用同源重组来导入正向或负向调节元件如35S增强子至植物启动子，或从调节区移走阻抑物元件。可以使用其他基因转换方法来破坏元件或增强阻抑物元件的活性。阻抑物元件可以通过T-DNA或转座子诱变在植物中随机地导入。可以鉴定到这样的品系，其中阻抑物元件在编码在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的基因附近整合，因而降低、阻抑或缺失所述基因的表达。另外，突变如点突变可以由不同诱变方法随机地导入并且可以通过特定方法如TILLING(综述在Slade和Knauf，Transgenic Res.2005，14(2)，109-115)选择。例如，提高导致在本发明方法中降低其活性的蛋白质的显性失活表型的蛋白质或RNA的活性可以通过表达编码蛋白质的核酸分子实现，其中所述蛋白质丧失其生物学活性，但是与多聚体复合物中的另一种蛋白质结合，因而减少、阻抑或缺失该复合体的活性，或所述蛋白质例如作为转录因子与DNA结合并且因而减少、阻抑或缺失所翻译蛋白质的活性。
通常，mRNA、多核苷酸或核酸分子在生物的细胞或区室中的量与所编码蛋白质的量相关，因而与所编码蛋白质在所述区室中的总体活性相关。所述相关并不总是线性的，在该容积中的活性取决于所述分子的稳定性、对所述分子的降解作用或者活化或抑制性辅因子的存在。另外，酶的产物和离析物抑制作用是熟知的。
由本发明方法中待减少的核酸分子编码的以上所提及蛋白质和/或多肽的活性可以以多种方式降低、阻抑、降低或缺失。例如，生物或其部分如细胞中的活性因降低或减少基因产物数目而降低、阻抑或减少，例如通过降低、阻抑或减低表达速率，如将天然启动子突变成较低活性，或通过降低、阻抑或减少所表达mRNA的稳定性因而降低、阻抑或减低翻译速率，和/或降低、阻抑或减少基因产物的稳定性因而增加蛋白质衰变。另外，可以以实现降低反应速率或调整(降低、阻抑、减少或缺失)对底物的亲和力的方式影响酶或通道蛋白或载体蛋白、转录因子和类似的活性蛋白的活性或周转。
在本发明方法中降低其活性的多肽或核酸分子(例如酶或催化性或调节性RNA)的催化中心中的突变可以调节该酶的周转率，例如敲除关键氨基酸可以导致降低或完全敲除酶的活性，或缺失调节物结合位点可以降低正向调节作用。
可以降低本发明酶的特定活性，从而降低周转率或降低辅因子的结合作用。降低编码性mRNA或蛋白质的稳定性也可以降低基因产物的活性。活性的降低也属于术语“降低、阻抑、降低或缺失活性”的范围。有利地是顺式方式降低活性，例如将包含其他顺式调节元件的启动子或基因的转录部分或编码部分突变，除此之外，也可以反式地实现抑制，例如通过反式因子如嵌合转录因子、核酶、反义RNA、dsRNA或显性失活蛋白质形式，所述反式因子干扰多个表达阶段例如转录、蛋白质或蛋白质复合体本身的翻译或活性。也可以利用外遗传机制如DNA修饰、DNA甲基化或DNA包装作用来失活或下调本发明的核酸或所编码的蛋白质。
因而，在一个实施方案中，通过下述方式实现与相应的非转化野生型植物相比较而言，非人生物中环境胁迫耐受性和/或抗性的提高和生物量生产的提高，即利用RNA干扰(dsRNAi)、导入反义核酸、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或与核酶组合的核酶核酸、编码共抑制蛋白的核酸、编码显性失活蛋白质、DNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸、以所述基因或RNA或蛋白质为靶的抗体、诱导RNA降解的病毒核酸或微RNA分子或其针对本段落中所表征核酸分子的组合。
可以修饰对上文所提及核酸序列的调节作用，从而减少基因表达。这种降低、阻抑、减少或缺失(降低、阻抑、减少、缺失、失活或下调应当在本说明书通篇范围内作为同义词使用)可以通过技术人员已知的全部方法如上文提及那样实现，优选地通过双链RNA干扰(dsRNAi)、导入反义核酸、核酶、与核酶组合的反义核酸、编码共抑制蛋白的核酸、编码显性失活蛋白质、DNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸或者以所述基因或RNA或蛋白质为靶的抗体、诱导RNA降解的病毒核酸和病毒表达系统、用于诱导所述基因同源重组的系统、在所述基因中突变或以上组合。
通常，基因产物在生物或其部分、尤其在植物细胞、植物或植物组织或其部分或在微生物中的活性可以通过减少特定编码性mRNA或相应蛋白质在所述生物或其部分中的量降低。“蛋白质或mRNA的量”理解为意指多肽分子或mRNA分子在生物、组织、细胞或细胞区室中的分子数目。“降低”蛋白质的量意指与野生型、对照或参考相比，定量地减少所述蛋白质在生物、组织、细胞或细胞区室或其部分中的分子数目，例如通过下文描述的方法之一减少。
在此上下文中，“失活”意指所编码多肽的活性在生物或在细胞如在植物或植物细胞内部是基本上不再可检测到的。为了本发明的目的，下调(＝降低)意指与未处理生物的活性相比，所编码多肽的活性(例如其酶活性或生物学活性)部分地或基本上完全地降低。这可以由不同的细胞生物学机制实现。在本上下文中，该活性可以在整个生物中下调，或在多细胞生物的情况下，在该生物的各个部分中，在植物的情况下，例如在组织如种子、叶、根或其他部分中下调。
修饰，即减少，可以由内源性或外源性因子引起。例如，生物或其部分中活性的减少可以通过添加化学化合物如拮抗物至植物的培养基、营养物、土壤或至植物本身引起。
在一个实施方案中，与相应的非转化野生型植物相比较而言，环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高可以通过降低本文中所述内源性核酸分子或内源性多肽的水平，即降低根据本发明方法待降低其活性的核酸分子或多肽的水平，尤其降低如表I或表II第5列或第7列的相应横行中分别描述的多核苷酸或多肽的水平实现。
因而，在本发明方法的又一个他实施方案中，降低、阻抑或缺失由本发明方法中待降低的蛋白质或核酸分子所代表的活性通过至少一个选自以下的步骤实现：a)导入包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸编码能够形成双链核糖核酸分子的核糖核酸序列，从而所述双链核糖核酸分子的至少17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸(nt)或更多个核苷酸、优选25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸(nt)或更多个核苷酸、更优选50、60、70、80、90或100个核苷酸(nt)或更多个核苷酸的片段与根据本发明方法待减少的核酸分子或与编码根据本发明方法待减少的多肽或选自由下述核酸分子组成的组中的核酸分子具有50％或更大的同一性、优选60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99％或最优选100％同一性：(aa)在本发明方法中其活性被降低的核酸分子；(ab)核酸分子，其包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II第5列或第7列中所述多肽的多肽，优选地包含如表I第5列或第7列中所述的核酸分子或编码如表II第5列或第7列中所述的多肽，优选地包含如表IA第5列或第7列中所述的核酸分子或编码如表IIB第5列或第7列中所述的多肽，和(ac)核酸分子，其编码具有表II第5列中所述多肽的活性的多肽或编码包含如表I第5或7列中所述核酸分子的多核苷酸的表达产物；和b)以下段落中所公开的任一步骤：[0050.2.1.1]a)导入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或反义核酸分子，而所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或反义核酸分子包含与根据本发明方法待减少的核酸分子或与编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或与选自由在项(aa)至(ac)中定义的组中的核酸分子具有30％或更多同一性，优选地40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99％或最优选地100％同一性的17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸(nt)或更多个核苷酸、优选25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸(nt)或更多个核苷酸、更优选50、60、70、80、90或100个核苷酸(nt)或更多个核苷酸的片段；b)导入核酶，所述核酶特异性地切割根据本发明方法待减少的核酸分子或切割编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子；c)导入在(a)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体、反义核酸分子和在(b)中表征的核酶；d)导入有义核酸分子，所述的有义核酸分子引起根据本发明方法待减少的核酸分子或编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子表达或引起选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子表达，以诱导对下述核酸分子的内源性表达产物共抑制，其中所述核酸分子是根据本发明方法待减少的核酸分子或编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子；e)导入包含多核苷酸的核酸分子，其中所述多核苷酸赋予下述蛋白质的显性失活突变体表达，所述蛋白质具有根据本发明方法待减少的蛋白质的活性或由根据本发明方法待减少的核酸分子编码或由选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子编码；f)导入包含多核苷酸的核酸分子，所述多核苷酸编码与核酸分子结合的因子，所述核酸分子包含根据本发明方法待减少的核酸分子或包含编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或包含选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子；g)导入引起RNA分子下降的病毒核酸分子，所述RNA分子包含根据本发明方法待减少的核酸分子或包含编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或包含选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子；h)导入能够与内源基因重组并使该内源基因的活性沉默、失活、阻抑或降低的核酸构建体，所述内源基因包含根据本发明方法待减少的核酸分子或包含编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或包含选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子；i)在内源基因中导入非沉默突变，所述内源基因包含根据本发明方法待减少的核酸分子或包含编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或包含选自在项(aa)至(ac)中所定义的核酸分子；和/或j)导入赋予在(a)至(i)任一项中表征的核酸分子表达的表达构建体。
因而，在本发明方法的又一个其他实施方案中，降低或缺失由本发明方法中使用的蛋白质或核酸分子所代表的活性通过至少一个选自以下的步骤实现：a)导入编码核糖核酸分子的核酸分子，所述核糖核酸分子的序列能够形成双链核糖核酸分子，因而该双链核糖核酸分子的有义链与根据本发明方法待减少的核酸分子或编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或与选自以下的核酸分子具有至少30％、优选60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99或100％的同一性：i)核酸分子，其引起包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的蛋白质表达或引起包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子表达；ii)编码蛋白质的核酸分子，所述蛋白质具有根据本发明方法待减少的蛋白质的活性，其中所述待减少的蛋白质例如包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序或引起包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子表达；和iii)核酸分子，其包含与(i)或(ii)的核酸分子具有至少50％、优选60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99或100％同源性的核酸分子的至少17、18、19、20、21、22、23、24或25碱基对的片段；b)导入反义核酸分子，因而该反义核酸分子与下述核酸分子具有至少30％或更多、优选40、50、60、65、70、75、80、85、90、95、97、98、99或100％的同一性，所述核酸分子对根据本发明方法待减少的核酸分子或编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子反义；c)导入核酶，所述核酶特异性地切割赋予蛋白质表达的核酸分子，所述蛋白质具有根据本发明方法待减少的蛋白质的活性，其中所述待减少的蛋白质例如包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序，或特异性地切割核酸分子，其中所述核酸分子引起根据本发明方法待减少的核酸分子或根据本发明方法待减少的多肽表达或引起编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子表达；d)导入在(b)中表征的反义核酸分子和在(c)中表征的核酶；e)导入有义核酸分子，所述的有义核酸分子引起表达根据本发明方法待减少的核酸分子或根据本发明方法待减少的多肽或编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子，以诱导对下述核酸分子的内源性表达产物共抑制，其中所述核酸分子是根据本发明方法待减少的核酸分子或编码根据本发明方法待减少的多肽的核酸分子或选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子；f)导入核酸分子，所述核酸分子引起蛋白质的显性失活突变体表达，其中所述蛋白质具有根据本发明方法待减少的蛋白质的活性，所述待减少的蛋白质例如包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序，或引起多肽的显性失活突变体表达，其中所述多肽由选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码，例如表达所述序列产生了显性失活突变体蛋白，因而降低、减少或缺失在本发明方法中使用的蛋白质的活性；g)导入编码下述因子的核酸分子，其中所述因子与赋予蛋白质表达的核酸分子结合，其中所述蛋白质具有根据本发明方法待减少的多肽的活性，所述多肽例如包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序或由选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码；h)导入引起RNA分子下降的病毒核酸分子，所述RNA分子引起具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性的蛋白质表达，尤其引起多肽的表达，其中所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序或由选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码；i)导入能够与内源基因重组并使其突变的核酸构建体，所述内源基因引起具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性的蛋白质表达，尤其引起多肽的表达，其中所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序或由选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码；j)在内源基因中导入非沉默突变，所述内源基因引起具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性的蛋白质表达，尤其引起多肽的表达，其中所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序或由选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码；k)选择来自本发明方法中所用生物的随机诱变群体的核酸序列中的非沉默突变，其中所述核酸序列编码具有在本发明方法中使用的蛋白质的活性的蛋白质，尤其编码这样的多肽，其中所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽基序或由选自由上文(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码；和/或l)导入表达构建体，该表达构建体引起如(a)至(k)任一项中所表征的核酸分子或多肽表达或引起在(a)至(k)任一项中表征的核酸分子或多肽表达。
在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤；导入在表IV第7列的相同横行中所述共有序列中显示的独特氨基酸的突变至内源性核酸分子，例如至内源基因中，其中所述内源性核酸分子引起包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列的多肽或由选自由上文所提及(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码的多肽表达，因而所述突变在本发明方法中待降低其活性的多肽中、尤其在包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或由选自由上文所提及(i)至(iii)组成的组中的核酸分子编码的多肽中导致非沉默突变。表IV第7列中所述的共有序列指示这样的氨基酸，其中在表II第5列和第7列中所述多肽的序列中发现所述氨基酸极保守。因此，优选通过随机突变法或通过选择性导入突变到这种氨基酸或到几个保守氨基酸的区段中，例如通过应用化学、物理或生物致变物如位点定向诱变或导入同源重组，突变一个或多个所述独特的保守氨基酸(未定义为X或Xaa)。
在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的编码序列，尤其来自段落[0030.1.1.1]的(a)至(i)项下所提及的核酸分子的编码序列、优选地包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的编码序列用于降低、阻抑、减少或缺失根据段落[0052.1.1.1]至[0053.1.1.1]中所提及的不同处理步骤(a)至(l)在本发明方法中待降低其活性的核酸序列，例如Liu Q等(2002)通过发夹RNA介导的转录后基因沉默产生的高硬脂酸和高油酸棉籽油(High-Stearic and High-Oleic Cottonseed Oils Producedby Hairpin RNA-Mediated Post-Transcriptional Gene Silencing).PlantPhysiology 129第1732-1743页中描述。使用所述核酸序列的优选少于1000bp、900bp、800bp或700bp、尤其优选少于600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp的编码区。技术人员知道从本文作为本发明方法中待降低其活性的核酸分子所公开的核酸序列开始，尤其可能降低或缺失本文所公开的分子的直向同源物的活性。特别地，技术人员知道怎样分离完整基因、所述核酸序列的编码区(CDR)、表达区域(例如作为cDNA)或其片段，尤其如表I第5列或第7列中所示分子的所述区域，如果仍未在本文中公开，例如从上文段落[0030.1.1.1]的项(a)至(j)下提及的核酸分子开始，优选从包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子开始。[0053.2.1.1]在一个实施方案中，在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的5’-和/或3’-序列，尤其来自段落[0030.1.1.1]的(a)至(i)项下所提及的核酸分子的5’-和/或3’-序列、优选地包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的5’-和/或3’-序列用于降低、阻抑、减少或缺失根据段落[0052.1.1.1]至[0053.1.1.1]中所提及的不同处理步骤(a)至(j)在本发明方法中待降低其活性的核酸序列，例如Ifuku K等(2003)用短3’-非翻译序列在普通烟草(Nicotiana tabacum)中特异性干扰由多基因家族编码的psbP基因(SpecificInterference in psbP Genes Encoded by a Multigene Family in Nicotianatabacum with Short 3’-Untranslated Sequence).Biosci.Biotechnol.Biochem.，67(1)第107-113页中描述。使用所述核酸序列的优选少于1000bp、900bp、800bp或700bp、尤其优选少于600bp、500bp、400bp、300bp、200bp或100bp的5’-和/或3’-区域。技术人员知道从本文作为本发明方法中待降低其活性的核酸分子所公开的核酸序列开始，可能分离所述分子的UTR。特别地，技术人员知道怎样分离所述核酸序列的5’-和/或3’-区域、尤其如表I第5列或第7列中所示分子的5’-和/或3’-区域，如果仍未在本文中公开，例如从上文段落[0030.1.1.1]的项(a)至(j)下提及的核酸分子开始，优选从包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子开始。5’-和3’-区域可以由不同方法如RACE(Zang和Frohman(1997)使用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得全长cDNA(cDNA末端).Methods MolBiol 1997；69：61-87)或基因组步移PCR技术(Mishra等人，2002，Biotechniques 33(4)：830-832；Spertini等1999，Biotechniques 27(2)，308-314)分离。
降低或缺失由本发明蛋白质代表的生物学活性的前述处理步骤导致与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
降低所述活性或功能优选地通过减少编码本发明方法的蛋白质的基因表达来实现。
在本发明方法的一个优选实施方案中，可以例如使用以下方法实现基因产物的活性或功能的这种降低，其中所述基因产物编码根据本发明方法待减少的核酸分子或多肽，例如由包含在表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子编码的多肽或包含在表II第5列或第7列中或在表IV第7列中所示氨基酸序列、共有序列或多肽基序的多肽或这样的核酸分子，其包含在表I第5列或第7列中所示的核酸分子或编码包含在表II或表IV第5列或第7列中所示氨基酸序列、共有序列或多肽基序的多肽：
a)导入如上文所述的双链RNA核酸序列(dsRNA)或导入表达盒或多于一个表达盒，确保所述表达盒表达；b)导入反义核酸序列或导入表达盒，确保后者表达；包括这些方法，其中该反义核酸序列指向基因(即包括启动子序列的基因组DNA序列)或包括5’和3’非翻译区的基因转录物(即RNA序列)。也包括α-异头核酸序列；c)导入与核酶组合的反义核酸序列或导入确保前者表达的表达盒；d)导入有义核酸序列以诱导共抑制作用或导入确保前者表达的表达盒；e)导入编码显性失活蛋白质的核酸序列或导入确保所述显性失活蛋白质表达的表达盒；f)导入DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子或者针对基因、RNA或蛋白质的抗体或者导入确保后者表达的表达盒；g)导入导致RNA降解的病毒核酸序列和表达构建体，或导入确保前者表达的表达盒；h)导入构建体以在内源基因上诱导同源重组，例如用于产生敲除突变体；i)导入突变至内源基因以产生功能丧失(例如产生终止密码子、移码等)；j)导入已经设计成靶向目的基因的微RNA或微小RNA(miRNA)，以诱导目的基因的mRNA的断裂或翻译抑制并且因而使基因表达沉默或导入确保所述微RNA表达的表达盒；k)导入已经设计成靶向目的基因的ta-siRNA，以诱导目的基因的mRNA的断裂或翻译抑制并且因而使基因表达沉默或导入确保前者表达的表达盒；和/或l)鉴定(例如根据所谓TILLING法)随机诱变群体中的非沉默性突变，例如产生终止密码子、移码、倒位等。
为了本发明的目的，这些方法中的每一种可以导致表达、活性或功能降低。联合使用也是可行的。其他方法是熟练技术人员已知的并且可以包括基因表达的全部可能步骤，如阻碍或防止蛋白质的加工、蛋白质或其mRNA的运输、抑制核糖体结合、抑制RNA剪接、诱导本发明RNA或蛋白质降解的酶和/或抑制翻译延伸或终止。
因而，以下段落优选地涉及阻抑、降低、减少或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990-蛋白、At5g40590-蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性，或由本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽代表、尤其由下述核酸分子代表的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列、优选第5列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列、优选第5列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因此，谈及如本文中所用的表I、表IA、表IB、表II、表IIA、表IIB、表III或表IV的第5列或第7列优选地分别指表I、表IA、表IB、表II、表IIA、表IIB、表III或表IV的第5列或第7列。
下文是对各个优选方法的简要描述。
a)导入双链RNA核酸序列(dsRNA)例如以降低或缺失在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性，尤其降低或缺失下述核酸分子的活性，其中所述核酸包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
借助双链RNA调节基因的方法(“双链RNA干扰”；dsRNAi)已经对动物、酵母、真菌和植物生物如脉孢菌(Neurospora)、斑马鱼(Zebrafish)、果蝇(Drosophila)、小鼠、涡虫(planaria)、人、锥虫(Trypanosoma)、矮牵牛(petunia)或拟南芥进行广泛描述[例如Matzke MA等人(2000)Plant Mol.Biol.43：401-415；Fire A.等人(1998)Nature 391：806-811；WO 99/32619；WO 99/53050；WO 00/68374；WO 00/44914；WO 00/44895；WO 00/49035；WO 00/63364]。另外，例如Tchurikov等人[J.Biol.Chem.，2000.275(34)：26523-26529]还报道RNAi作为有利工具用于阻抑细菌如大肠杆菌中的基因。Fire等人将RNAi现象命名为RNA干扰。公开地参考在以上参考文献中描述的技术和方法。也可以在瞬时表达的情况下或在瞬时转化后观察到高效基因抑制，例如作为生物射弹转化的结果[Schweizer P等人(2000)Plant J 200024：895-903]。dsRNAi方法基于这样的现象，即同时导入基因转录物的互补链和反链引起极高效地抑制所讨论基因的表达。所得表型非常相似于类似敲除突变体的表型(Waterhouse PM等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13959-64)。
Tuschl等人，Gens Dev.，1999，13(24)：3191-3197能够证明RNAi方法的效率是双链体长度、3’突出端长度和这些突出端中序列的函数。
因而，本发明的另一个实施方案是双链RNA分子(dsRNA)，其中在合适生物(例如植物)或其部分中导入或表达后，所述双链RNA分子降低、阻抑、减少或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。[0064.2.1.1]基于Tuschl等人的工作并且假定基本原理在不同物种之间是保守的，对熟练技术人员可以给出以下指南。因而，本发明的或者在本发明方法中使用的dsRNA分子优选地满足至少一种以下原则：●为实现良好结果，通常应当避开所用核酸序列的5’和3’非翻译区和靠近起始密码子的区域，因为所述区域富含调节蛋白质结合位点并且RNAi序列与所述调节蛋白之间的相互作用可能导致不希望的相互作用；●在植物中，所用核酸序列的5’和3’非翻译区和靠近起始密码子、优选距起始密码子上游50至100nt的区域产生良好结果并且因而不应当避开；●优选地选择所用mRNA的下述区域，其在AUG起始密码子下游50至100nt(＝核苷酸或碱基)；●仅来自外显子的dsRNA(＝双链RNA)序列对该方法有用，因为来自内含子的序列无效，●该区域中的G/C含量应当大于30％并小于70％，理想地约50％；●靶mRNA的可能二级结构对于RNAi方法的效果不太重要。
dsRNAi方法可以对于降低在本发明方法中待降低其活性的核酸分子表达，尤其降低下述核酸分子表达是特别有效和有利的，其中所述的核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽和/或其同源物。特别如WO 99/32619中所述，dsRNAi方法明显地优于传统的反义方法。
因而，本发明因此进一步涉及这样的双链RNA分子(dsRNA分子)，当导入生物、有利地导入植物(或从中衍生的细胞、组织、器官或种子)时，所述双链RNA分子导致改变的代谢活性，原因是降低在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽表达，尤其降低下述核酸分子表达，其中所述核酸包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽和/或其同源物。在本发明的双链RNA分子，例如用于降低由本发明方法中待降低其活性的核酸分子编码的蛋白质表达、尤其用于降低包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子和/或其同源物表达的dsRNA中，i)两条RNA链之一与核酸序列的至少部分基本上相同，并且ii)相应的另一条RNA链与核酸序列的互补链的至少部分基本上相同。
术语“基本上相同”指这样的事实，即与靶序列相比，该dsRNA序列也可以包括插入、缺失和各个点突变，但仍引起表达的有效降低。优选地，抑制性dsRNA的“有义”链与本发明核酸序列的部分区段之间或核酸序列的“反义”链与互补链之间如上文定义的同一性分别达到至少30％、优选至少40％、50％、60％、70％或80％、非常特别优选至少90％、最优选100％，其中所述的部分区段包括在本发明的优选实施方案中包括它们的内源性5’-和3’非翻译区。该部分区段达到至少10个碱基、优选至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基、特别优选至少40、50、60、70、80或90个碱基、非常特别优选至少100、200、300或400个碱基、最优选至少500、600、700、800、900或更多个碱基或至少1000或2000个碱基或更多个碱基长度。在本发明的另一个优选实施方案中，该部分区段达到17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基，优选地达到20、21、22、23、24或25个碱基。在动物和植物中优选这些短序列。在非哺乳动物中、优选地在无脊椎动物中，在酵母、真菌或细菌中优选较长的序列，优选在200和800碱基之间，不过这些序列也可用于植物中。在所述生物中长双链RNA被加工成许多siRNA(＝小/短干扰性RNA)，例如由作为双链特异性RNA酶III的蛋白质Dicer加工。作为备选，“基本上相同的”dsRNA也可以定义为这样的核酸序列，它能够与基因转录物的部分杂交(例如在400mM NaCl，40mMPIPES pH6.4，1mM EDTA中，在50℃或70℃，杂交12至16小时)。
dsRNA可以由聚合的核糖核苷酸的一条或多条链组成。还可以存在对糖-磷酸酯主链的修饰和对核苷酸的修饰。例如，天然RNA的磷酸二酯可以按照这样的方式修饰，从而它们包括至少一个氮或硫杂原子。碱基可以按照这样的方式修饰进行修饰，从而限制例如腺苷脱氨酶的活性。在下文用于稳定反义RNA的方法中描述这些修饰和其他修饰。
dsRNA可以按酶法制备；它也可以完全地或部分地以化学方式合成。有效介导RNA干扰的达30bp的短dsRNA可以例如通过使用大肠杆菌核糖核酸酶III(RNA酶III)部分消化长dsRNA模板来高效地产生(Yang，D.，等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，9942)。
可以从单条自我互补链开始或从两条互补链开始形成双链结构。在单条自我互补链中，“有义”序列和“反义”序列可以由一个连接序列(“接头”)连接并形成例如发夹结构。优选地，该连接序列可以采取在dsRNA合成后被剪接出来的内含子形式。编码dsRNA的核酸序列可以含有其他元件，例如转录终止信号或多腺苷酸化信号。如果dsRNA的两条链将在细胞或生物有利地在植物中组合，这可以用多种方式引起：a)用包含两个表达盒的载体转化细胞或转化生物，有利地转化植物；b)用两个载体共转化细胞或共转化生物，有利地共转化植物，所述载体之一包含带有“有义”链的表达盒，而另一个载体包含带有“反义”链的表达盒；c)在已经用包含带有“反义”链的表达盒的载体转化细胞或生物后，用包含带有“有义”链的表达盒的载体超转化细胞或超转化生物，有利地超转化植物；或反之亦然；d)将两种生物、有利地将植物杂合，例如杂交，每一种生物已经用一种载体转化，所述载体之一包含带有“有义”链的表达盒，而另一个载体包含带有“反义”链的表达盒；e)导入包含两个启动子的构建体，所述启动子引起想要的序列从两个方向转录；和/或f)用工程化病毒感染细胞或感染生物，有利地感染植物，所述的工程化病毒能够产生想要的dsRNA分子。
可以在细胞外部或细胞内部启动RNA双链体的形成。如果dsRNA在靶细胞外部或生物外部合成，它可以通过注射、微量注射、电穿孔、高速粒子、通过激光束导入或由化学化合物(DEAE葡聚糖、磷酸钙、脂质体)介导到该生物或该生物的细胞中，或在动物的情况下，还可能向该动物饲喂被改造来表达双链RNAi的细菌如大肠杆菌菌株。[0071.2.1.1]因而，在一个实施方案中，本发明涉及dsRNA，其中所述双链RNA核酸分子的有义链与下述核酸分子具有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％、优选65％、70％、75％或80％、更优选85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更优选95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述的核酸分子或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述多肽的多肽。本发明的另一个实施方案是这样的dsRNA分子，其包含下述核酸分子的至少10碱基对(＝个碱基、nt、核苷酸)、优选至少17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50、特别优选至少55、60、70、80或90碱基对、非常特别优选至少100、200、300或400碱基对、最优选至少500、600、700、800、900或更多碱基对或至少1000或2000碱基对的片段，其中所述核酸分子与如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述的核酸分子或与编码蛋白质的核酸分子具有至少50％、60％、70％、80％或90％、优选95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性，其中所述蛋白质包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的多肽。在本发明的另一个优选实施方案中，dsRNA分子的编码区序列或其部分区段达到17、18、19、20、21、22、23、24、25、26或27个碱基，优选地达到20、21、22、23、24或25个碱基，因而所述序列的同一性基本上是95％、96％、97％、98％，或优选是99％或100％。与相应的非转化野生型植物相比较而言，本发明dsRNA分子的表达引起生物或其部分中环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。[0071.3.1.1]在本发明的一个优选实施方案中，该双链RNA的有义链和反义链共价地相互结合或通过其他键如弱化学键如氢键相互连接，并且反义链基本上是有义RNA链的互补物。
如WO 99/53050中所示，dsRNA也可以包含通过“接头”(例如内含子)连接“有义”链和“反义”链所形成的发夹结构，所述专利通过引用方式并入本文作为参考。优选自我互补性dsRNA结构，因为它们仅需要构建体的表达并且总是以等摩尔比包含互补的链。
使用下文描述的方法(例如使用选择标记)，将编码dsRNA的“反义”链或“有义”链或该dsRNA的自我互补链的表达盒优选地插入载体并且稳定地插入植物的基因组，以确保所述dsRNA的永久表达。用细菌载体或病毒载体瞬时表达是类似有用的。
使用可能引起每细胞至少一个拷贝的量导入dsRNA。较大的量(例如每细胞至少5、10、100、500或1000个拷贝)可以导致更高效的降低。
如已经描述，实际上不要求dsRNA与根据本发明方法待减少的核酸分子的基因转录物之间的100％序列同一性以引起表达的有效降低，其中所述基因转录物例如是下述分子之一的基因转录物，所述分子包含如表I第5列或第7列中所述的分子或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或其同源物。因而，优势是该方法容忍因遗传突变、多态性或进化多样性而可能存在的序列偏差。因此，例如，利用已经从根据本发明方法待减少的核酸分子(例如一种生物的包含如表I第5列或第7列中所述分子或编码包含如表II或表IV第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽的诸分子或其同源物之一)开始而产生的dsRNA可以用来在另一种生物中抑制相应表达。
来自多种生物(例如植物)的根据本发明方法待减少的核酸分子(例如这样的分子之一，其中所述分子包含如表I的、优选表IB的第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的、优选表IIB的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽)之间的高度序列同源性或同一性引出这样的结论，即这些蛋白质或许是在进化中高度保守的，例如或许也是在其他植物中高度保守的，并且因而表达下述dsRNA也应当在其他植物物种中具有有利效果，这是任选可能的，其中所述dsRNA衍生自根据本发明方法待减少的所公开核酸分子之一、例如包含如表I第5列或第7列中所述分子或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或其同源物的分子之一。
该dsRNA可以体内或体外地合成。为此目的，可以将编码dsRNA的DNA序列导入表达盒中处于至少一个遗传控制元件(例如启动子、增强子、沉默子、剪接供体或剪接受体或多腺苷酸化信号)的控制下。下文描述合适的有利构建体。不要求聚腺苷酸化，用于启动翻译的元件也并非必须存在。
dsRNA可以化学地或酶学地合成。细胞RNA聚合酶或噬菌体RNA聚合酶(如例如T3、T7或SP6RNA聚合酶)可以用于此目的。描述了用于体外表达RNA的合适方法(WO 97/32016；US 5,593,874；US 5,698,425、US 5,712,135、US 5,789,214、US 5,804,693)。在导入细胞、组织或生物之前，可以例如通过提取法、沉淀法、电泳法、色谱法或这些方法的组合，将已经以化学或酶学方式体外合成的dsRNA从反应混合物中分离至更高或更低的程度。该dsRNA可以直接导入细胞或也可以以细胞外方式施加(例如施加至胞间隙)。在本发明的一个实施方案中，所述RNAi方法仅引起基因功能部分丧失并且使熟练技术人员能够研究预期生物中的基因剂量效应并且微调本发明的方法。在另一个优选的实施方案中，该方法也引起功能全部丧失并且与相应的非转化野生型植物相比较而言因而提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。另外，该RNAi方法使本领域技术人员能够研究基因的多种功能。
但是，优选用引起所述dsRNA表达的表达构建体稳定地转化植物。下文描述合适的方法。
b)导入反义核酸序列例如以降低、阻抑或缺失在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽，尤其降低、阻抑或缺失下述核酸分子，其中所述核酸包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
可以广泛地使用借助“反义”技术防止特定蛋白质的mRNA积累而抑制该蛋白质的方法，并且已经广泛地描述了该方法，包括对植物描述了该方法；Sheehy等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：8805-8809；US 4,801,34100；Mol JN等人(1990)FEBS Lett 268(2)：427-430。反义核酸分子与编码待抑制的靶蛋白的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或与之结合。该过程抑制该靶蛋白的转录和/或翻译。杂交可以按照常规方式通过形成稳定双链体引起，或在基因组DNA的情况下，通过反义核酸分子借助在DNA螺旋大沟中的特异性相互作用结合至基因组DNA的双链体而引起。
在一个实施方案中，“反义”核酸分子包含与编码蛋白质的“有义”核酸分子互补的，例如与双链cDNA分子的编码链互补或与编码性mRNA序列互补的核苷酸序列。因而，反义核酸分子可以通过氢键与有义核酸分子结合。该反义核酸分子可以与下述核酸分子的完整编码链或仅与其一部分互补，所述核酸分子引起在本发明方法中待降低的多肽表达或包含在本发明方法中待降低其活性的核酸分子。因而，反义核酸分子可以与本发明核酸分子的核苷酸序列的编码链的“编码区”反义。术语“编码区”指包含被翻译成氨基酸残基的密码子的核苷酸序列的区域。在另一个实施方案中，反义核酸分子与分布在核苷酸序列的编码区侧翼的mRNA的“非编码区”反义。术语“非编码区”指分布在不翻译成多肽的编码区侧翼的5’和3’序列，即也称作5’和3’非翻译区(5’-UTR或3’-UTR)。有利地，该非编码区位于距离编码区的上游和/或下游50bp、100bp、200bp或300bp、优选地400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp或1000bp的非编码区域内。
假定所述编码链序列编码在本发明的方法中待降低的多肽或核酸分子，例如具有上文提及的活性，例如下述多肽的活性，其中所述多肽具有在本发明方法中如本文中所公开待降低其活性的蛋白质的活性，则可以根据Watson和Crick碱基对规则设计反义核酸分子。[0083.2.1.1]因而，本发明的又一个实施方案是反义核酸分子，其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述反义核酸分子降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。因而，在另一个实施方案中，本发明涉及反义核酸分子，其中该反义核酸分子与下述核酸分子具有至少30％同一性，其中所述核酸分子反义于编码如表II第5列或第7列中所示、优选如表IIB中所述的蛋白质或编码下述蛋白质的核酸分子，其中所述蛋白质包含如表IV中所述的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码，并且所述核酸分子在其表达后分别引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。因此，在另一个实施方案中，本发明的反义核酸分子包含核酸分子的至少15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45或50、特别优选至少60、70、80或90碱基对、非常特别优选至少100、200、300或400碱基对、最优选至少500、600、700、800、900或更多碱基对的片段或至少该核酸分子的完整序列，其中所述核酸分子与下述反义核酸分子具有至少50％、60％、70％、80％或90％、优选100％同一性，所述反义核酸分子针对这样的核酸分子，该核酸分子引起如表II第5列或第7列中所示、优选如表IIB中所述的蛋白质表达或编述蛋白质，所述蛋白质包含如表IV中所述的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码，并且所述核酸分子在其表达后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
适于降低蛋白质活性的反义核酸序列可以通过应用Watson和Crick碱基配对原则，使用编码该蛋白质的核酸序列加以推导，所述核酸序列例如是在本发明方法中待降低其活性的核酸序列，例如包含如表I第5列或第7列中所述的核酸分子或编码多肽的核酸分子，所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽(或其同源物、类似物、旁系同源物、直向同源物)。该反义核酸序列可以与该蛋白质的全部已转录mRNA互补，它可以限定于编码区，或它可以仅由互补于该mRNA的编码或非编码序列的部分的一个寡核苷酸组成。因而，例如，该寡核苷酸可以与包括此蛋白质翻译起点的核酸区域互补。反义核酸序列可以具有例如5、10、15、20、25、30、35、40、45或50个核苷酸的有利长度，不过它们也可以更长并且包括至少100、200、500、1000、2000或5000个核苷酸。特别优选的长度是在15和30个核苷酸之间如15、20、25或30个核苷酸。反义核酸序列可以使用熟练技术人员已知的方法重组地表达或以化学或酶方式合成。例如，反义核酸分子(例如反义寡核苷酸)可以使用天然存在的核苷酸或多种修饰的核苷酸化学地合成，其中设计所述的修饰核苷酸旨在提高分子的生物学稳定性或提高反义核酸与有义核酸之间所形成双链体的物理稳定性，例如，可以使用硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸。可以使用的物质的实例是硫代磷酸酯衍生物和吖啶取代的核苷酸如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰胞嘧啶、5-(羧基羟甲基)尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-半乳糖基queosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧氨基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基queosine、5’-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-羟基乙酸、假尿嘧啶、queosine、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-羟基乙酸甲酯、尿嘧啶-5-羟基乙酸、5-甲基-2-硫尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧丙基)尿嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。或者，所述反义核酸可以使用表达载体以生物学方式产生，其中将一种核酸分子以反义方向亚克隆(即从所插入核酸转录出的RNA将与目的靶核酸呈反义方向)至所述表达载体。
在又一个优选的实施方案中，可以通过与基因的调节区(例如启动子和/或增强子)互补并且可以与该区域内的DNA双螺旋形成三螺旋结构，以至降低该基因转录的核苷酸序列而抑制在本发明方法中待降低其活性的蛋白质表达，所述的蛋白质例如由包含如表I第5列或第7列中所述的核酸分子编码，或抑制下述多肽的表达，所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或多肽(或其同源物、类似物、旁系同源物、直向同源物)。已经描述了此类方法(Helene C(1991)Anticancer Drug Res.6(6)：569-84；Helene C等人(1992)Ann.NY Acad.Sci.660：27-36；Maher LJ(1992)Bioassays 14(12)：807-815)。
在又一个实施方案中，反义核酸分子可以是α-异头核酸。这种α-异头核酸分子与互补性RNA形成特定的双链杂交体，在该双链杂交体中与常见b-核酸相反，所述两条链彼此平行(Gaultier等(1987)NucleicAcids Res 15：6625-6641)。另外，反义核酸分子也可以包含2’-O-甲基核糖核苷酸(Inoue等(1987)Nucleic Acids Res.15，6131-6148)或嵌合RNA-DNA类似物(Inoue等(1987)FEBS Lett.215，327-330)。
本发明的反义核酸分子一般施用至细胞或原位地产生，从而它们与编码多肽(其具有在本发明方法中待降低其活性的蛋白质的活性)或编码核酸分子(其具有在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的活性)的细胞mRNA和/或基因组DNA杂交或结合并且因而(例如通过抑制转录和/或翻译)抑制蛋白质的表达并引起与相应的非转化野生型植物相比较而言前述的环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
本发明的反义分子也包含这样的核酸分子，其包含与编码本发明的天然存在多肽(例如序列表中所示的或根据本文中所述方法鉴定的多肽序列)的核苷酸序列的调节区(例如其启动子和/或增强子)互补的核苷酸序列，例如旨在形成防止该基因在靶细胞中表达的三股螺旋结构。一般见Helene，C.(1991)Anticancer Drug Des.6(6)：569-84；Helene，C.等人(1992)Ann.N.Y.Acad.Sci.660：27-36和Maher，L.J.(1992)Bioassays14(12)：807-15。
c)导入与核酶组合的反义核酸序列例如以降低或缺失在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽，尤其降低或缺失下述核酸分子，其中所述核酸包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽的多肽。本发明的又一个实施方案是核酶，其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述核酶降低、阻抑、减少或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。因而，在又一个实施方案中，本发明涉及特异性切割核酸分子的核酶，其中所述核酸分子引起下述蛋白质表达，所述的蛋白质如表II第5列或第7列中描述、优选如表IIB中所描述或包含如表IV中所述的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码，并且所述核酶在其表达后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
有利的是将上述反义策略与核酶方法组合。催化性RNA分子或核酶可以适应于任意靶RNA并切割特定位置处的磷酸二酯主链，因而功能性地失活该靶RNA(Tanner NK(1999)FEMS Microbiol.Rev.23(3)：257-275)。核酶本身因而不被修饰，但是能够以类似方式切割其他靶RNA分子，因而获得酶的属性。将核酶序列并入“反义”RNA赋予这种酶样RNA切割属性以精确地切割这些“反义”RNA并且因而在失活靶RNA时提高反义RNA的效率。描述了合适核酶“反义”RNA分子的制备和用途，例如由Haseloff等人(1988)Nature 33410：585-591描述。
另外，本发明的反义核酸分子也可以是核酶。核酶是具有核糖核酸酶活性的催化性RNA分子，能够切割与其具有互补区域的单链核酸，如mRNA。以这种方式，核酶[例如锤头状核酶；Haselhoff和Gerlach(1988)Nature 334，585-591]可以用来催化性地切割待抑制的酶的mRNA并且阻止翻译。核酶技术可以提高反义策略的效力。用于表达核酶以减少特定蛋白质的方法在(EP 0 291 533、EP 0 321 201、EP 0 360 257)中描述。还已经对植物细胞描述了核酶表达[Steinecke P等人(1992)EMBO J 11(4)：1525-1530；de Feyter R等人(1996)Mol.Gen.Genet.250(3)：329-338]。如Steinecke P，Ribozymes，Methods in Cell Biology 50，Galbraith等人编辑，Academic Press，Inc.(1995)，第449-460页所述，合适的靶序列和核酶可以例如通过计算核酶RNA和靶RNA的二级结构并通过它们的相互作用[Bayley CC等人(1992)Plant Mol.Biol.18(2)：353-361；Lloyd AM和Davis RW等人(1994)Mol.Gen.Genet.242(6)：653-657]鉴定。例如，可以构建四膜虫L-19IVS RNA的衍生物，其具有与待抑制的蛋白质的mRNA互补的区域(也见US 4,987,071和US 5,116,742)。作为备选，也可以通过选择方法[Bartel D和Szostak JW(1993)Science 261：1411-1418]从多种核酶的文库中鉴定出此类核酶。
d)导入(有义)核酸序列以诱导共抑制作用，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是共表达构建体，其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述共表达构建体降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是这样的共表达构建体，其引起下述分子下降或失活，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述分子引起下述蛋白质表达，所述的蛋白质如表II第5列或第7列中显示、优选如表IIB中描述或包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。
核酸序列在有义方向上的表达可以导致共抑制相应的同源性内源基因。表达与内源基因具有同源性的有义RNA可以按照如已经对以下反义方法：Jorgensen等人(1996)Plant Mol.Biol.31(5)：957-973、Goring等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：1770-1774、Smith等人(1990)Mol.Gen.Genet.224：447-481、Napoli等人(1990)Plant Cell 2：279-289或Van der Krol等人(1990)Plant Cell 2：291-99描述的相似方式降低或实际上消除内源基因的表达。在本上下文中，导入的构建体可以代表待完全或仅部分降低的同源性基因。这项技术对植物的应用已经例如由Napoli等人(1990)The Plant Cell 2：279-289和在US 5,03410,323中描述。另外，上文所述的共抑制策略可以有利地与如Brummell等人，2003，PlantJ.33，第793-800页所述的RNAi方法组合。至少在植物中，有利的是在共抑制法中使用强启动子或非常强的启动子。最近工作例如Schubert等人，(Plant Journal 2004，16，2561-2572)的工作已经显示共抑制作用取决于基因特异性阈值水平，高于该水平，则共抑制作用发生。
e)导入编码显性失活蛋白质的核酸序列，例如用于降低或缺失在本发明方法中待降低其活性的多肽、尤其由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子编码的多肽，或包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是显性失活突变体，其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述显性失活突变体降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是这样的显性失活突变体，其引起下述多肽下降或失活，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述多肽引起如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的蛋白质表达，或所述多肽包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。
蛋白质的功能或活性也可以高效地通过表达所述蛋白质的显性失活变体减少。熟练技术人员熟悉借助共表达显性失活形式的蛋白质用于减少其功能或活性的方法[Lagna G和Hemmati-Brivanlou A(1998)Current Topics in Developmental Biology 36：75-98；Perlmutter RM和Alberola-Ila J(1996)Current Opinion in Immunology 8(2)：285-90；Sheppard D(1994)American Journal of Respiratory Cell & MolecularBiology 11(1)：1-6；Herskowitz I(1987)Nature 329(6136)：219-22]。
可以实现显性失活变体，例如通过改变由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子编码的多肽的氨基酸，或改变下述多肽或其同源物的的氨基酸，所述多肽包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽或共有序列或多肽基序。这种改变可以例如通过计算机辅助比较法(“比对”)确定。用于产生显性失活变体的这些突变优选地在核酸序列的水平上实施。可以进行相应突变，例如通过使用合适寡核苷酸引物的PCR-介导体外诱变法进行，其中借助寡核苷酸引物导入希望的突变。为此目的，使用熟练技术人员熟悉的方法。例如，“LA PCR体外诱变试剂盒”(Takara Shuzo，Kyoto)可以用于此目的。还可能并且本领域技术人员已知的是缺失或改变功能性结构域，例如可结合但不激活的TF或其他信号作用组分可以实现蛋白质活性的降低。
f)导入针对基因RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽或共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是针对基因RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子，其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述DNA结合因子或蛋白质结合因子降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是这样的针对基因RNA或蛋白质的DNA结合因子或蛋白质结合因子，所述结合因子引起下述分子下降或失活，其中所述分子引起如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的蛋白质表达，或引起下述多肽下降或失活，其中所述多肽包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码，例如所述结合因子引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
也可以用特异的DNA结合因子(例如锌指转录因子型的因子)实现基因表达的降低，其中所述基因编码在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽，尤其包含下述核酸分子，该核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或本发明的其同源物。这些因子结合至内源靶基因的基因组序列，优选地在调节区中结合，并且导致该内源基因的阻抑。这种方法的使用有可能降低内源基因的表达，而不需要重组地操作该基因的序列。在Dreier B等人(2001)J.Biol.Chem.276(31)：29466-78和(2000)J.Mol.Biol.303(4)：489-502，Beerli RR等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(25)：14628-14633；(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(4)：1495-1500和(2000)J.Biol.Chem.275(42)：32617-32627)，SegalDJ和Barbas CF，3版(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4(1)：3410-39，KangJS和Kim JS(2000)J.Biol.Chem.275(12)：8742-8748，Kim JS等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94(8)：3616-3620，Klug A(1999)J.Mol.Biol.293(2)：215-218，Tsai SY等人(1998)Adv.Drug Deliv.Rev.30(1-3)：23-31，Mapp AK等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(8)：3930-3935，Sharrocks AD等人(1997)Int.J.Biochem.Cell Biol.29(12)：1371-1387和Zhang L等人(2000)J.Biol.Chem.275(43)：33850-33860中描述用于制备相关因子的此类方法。在植物中应用本项技术的例子已经在WO 01/52620、Ordiz MI等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第20期.13290-13295，2002)或Guan等人(Proe.Natl.Acad.Sci.USA，第99卷，第20期.13296-13301，2002)中描述。
可以使用基因的任意部分选择这些因子。该区段优选地位于启动子区域中。为了基因抑制的目的，该区段也可以位于编码性外显子或内含子的区域内。熟练技术人员可以通过数据库搜索从Genbank或通过筛选基因组文库的相应基因组克隆从其基因在Genbank中不存在的cDNA开始而获得相关区段。
还可能首先鉴定目标作物中这样的序列，其包含编码在本发明方法中降低其活性的多肽的核酸分子、尤其下述核酸分子，该核酸分子包含如表IB的第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表IIB的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或本发明的其同源物，随后找到启动子并通过使用上述因子降低表达。
熟练技术人员熟悉这样做所需要的方法。
另外，导入细胞的因子也可以是本身抑制靶蛋白的那些因子。蛋白质结合因子可以例如是适体[Famulok M和Mayer G(1999)Curr.Top Microbiol.Immunol.243：123-36]或抗体或抗体片段或单链抗体。已经描述了获得这些因子，并且熟练技术人员对此熟悉。例如，胞浆scFv抗体已经用于调节遗传修饰的烟草植物中植物光敏素A蛋白的活性[OwenM等人(1992)Biotechnology(NY)10(7)：790-794；Franken E等人(1997)Curr.Opin.Biotechnol.8(4)：411-416；Whitelam(1996)Trend Plant Sci.1：286-272]。
基因表达也可以通过定制的低分子量(例如聚酰胺类型)人工化合物抑制，Dervan PB和Bürli RW(1999)Current Opinion inChemical Biology 3：688-693；Gottesfeld JM等人(2000)Gene Expr.9(1-2)：77-91。这些寡聚物由单元3-(二甲基氨基)丙胺、N-甲基-3-羟吡咯、N-甲基-咪唑和N-甲基吡咯组成；它们可以在这样的方式下适用于双链DNA的每个部分，从而它们序列特异性地结合至大沟并阻断处于该位置内的基因序列表达。合适方法已经在RE等人[(2001)Bioorg.Med.Chem.9(8)：2093-103]、Ansari AZ等人[(2001)Chem.Biol.8(6)：583-92]、Gottesfeld JM等人[(2001)J.Mol.Biol.309(3)：615-29]、Wurtz NR等人[(2001)Org.Lett 3(8)：1201-3]、Wang CC等人[(2001)Bioorg.Med.Chem.9(3)：653-7]、Urbach AR和Dervan PB[(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98(8)：434103-8]和Chiang SY等人[(2000)J.Biol.Chem.275(32)：24246-54]等人中描述。
g)导入引起RNA降解的病毒核酸序列和表达构建体，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是病毒核酸分子，其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述病毒核酸分子降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。在又一个实施方案中，本发明涉及引起下述RNA分子下降或失活的病毒核酸分子，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述RNA分子引起如表II第5列或第7列中显示、优选如表IIB中所述蛋白质或下述多肽的表达，其中所述多肽包含表IV的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。
失活或下调也可以通过由生物，有利地在植物中，借助病毒表达系统(Amplikon)(Angell，SM等人(1999)Plant J.20(3)：357-362)诱导特定RNA降解而高效地引起。与待抑制的转录物具有同源性的核酸序列通过这些系统导入植物又称作借助病毒载体的“VIGS”(病毒诱导的基因沉默)。随后，关闭转录，这可能由植物抗病毒防御机制介导。合适的技术和方法在Ratcliff F等人(2001)Plant J.25(2)：237-45，Fagard M和Vaucheret H(2000)Plant Mol.Biol.43(2-3)：285-93，Anandalakshmi R等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(22)：13079-84和Ruiz MT(1998)Plant Cell 10(6)：937-46中描述。
h)导入用于在内源基因上诱导同源重组的构建体，例如用于产生敲除突变体，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是用于在内源基因上诱导同源重组的构建体，其中在合适生物例如植物或其部分中导入后，所述构建体降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是这样的用于在内源基因上诱导同源重组的构建体，其引起下述分子下降或失活，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述分子引起如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的蛋白质或下述多肽表达，其中所述多肽包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。
为了产生具有降低活性的同源重组生物，使用例如包含内源基因的至少部分的核酸构建体，所述的内源基因通过以这样的方式缺失、添加或置换至少一个核苷酸进行修饰，所述方式降低或完全消除功能性。所述修饰也可以影响该基因的调节元件(例如启动子)，从而编码序列仍未受修饰，但表达(转录和/或翻译)不发生或降低。
在常规同源重组的情况下，修饰的区域在其5’和3’末端侧翼分布有必须足够长以允许重组的其他核酸序列。它们的长度通常在1百个碱基至多到几千个碱基范围内[Thomas KR和Capecchi MR(1987)Cell51：503；Strepp等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95(8)：4368-4373]。在同源重组的情况下，使用下文描述的方法，用重组构建体转化宿主生物例如植物，并且使用例如针对抗生素或除草剂的抗性选择已经成功发生重组的克隆。使用共转化技术，随后可以通过进行杂交而有利地再次消除针对抗生素或除草剂的抗性。植物中高效同源重组系统的例子已经在Nat.Biotechnol.2002Oct；20(10)：1030-4，Terada R等人：稻中通过同源重组的高效基因打靶(Efficient gene targeting by homologous recombination inrice)中发表。
同源重组在高等真核生物中、尤其在植物中是相对稀有的事件。随机整合到宿主基因组中占据优势。除去随机整合序列并且因而增加携带正确同源重组的细胞克隆数目的一种可能性是使用如US 6,110.736中描述的序列特异性重组系统，借助该系统，可以再次消除非特异性整合的序列，这简化了对已经通过同源重组成功整合的事件的选择。可以使用多个序列特异性重组系统，可以提及的例子是噬菌体P1的Cre/lox系统、来自酵母的FLP/FRT系统、Mu噬菌体的Gin重组酶、来自大肠杆菌的Pin重组酶和pSR1质粒的R/RS系统。优选噬菌体P1的Cre/lox系统和酵母FLP/FRT系统。FLP/FRT和cre/lox重组酶系统已经应用于植物系统[Odell等人(1990)Mol.Gen.Genet.223：369-378]。
i)导入突变至内源基因以引起功能丧失(例如产生终止密码子、移码等)，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是在本发明方法中降低其活性的核酸分子的突变同源物，并且其中在合适生物(例如植物)或其部分中表达后，所述突变同源物降低、阻抑、减少或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。
用于降低活性的其他合适方法是导入无义、缺失或整合突变至内源基因中，例如通过导入RNA/DNA寡核苷酸至植物[Zhu等人(2000)Nat.Biotechnol.18(5)：555-558]，和借助例如T-DNA诱变法[Koncz等人(1992)Plant Mol.Biol.20(5)：963-976]、ENU-(N-乙基-N-亚硝基脲)诱变法或同源重组[Hohn B和Puchta(1999)H.Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：8321-8323]产生敲除突变体。也可以通过DNA-RNA杂化物(又称作“嵌合修复术(chimeraplasty)”)[Cole-Strauss等人(1999)Nucl.Acids Res.27(5)：1323-1330；Kmiec(1999)GeneTherapy American Scientist 87(3)：240-247]产生点突变。可以特异地靶向或随机地选择突变位点。如果已经随机产生突变，例如通过转座子-标签法或化学诱变，则熟练技术人员能够专门地富集本发明核酸中已选择的突变事件，尤其通过本领域技术人员已知的不同PCR方法。也可以通过导入所谓归巢核酸内切酶而导入，其中所述归巢核酸内切酶可以设计成在基因组的特定序列内产生双链断口。修饰所述双链断口经常引起想要的非功能性突变。[Arnould等(2006)工程化在新DNA靶上诱导重组的庞大数目高度特异性归巢核酸内切酶(Engineering of large numbers of highly specific homing endonucleasesthat induce recom bination on novel DNA targets).Journal ot MolecularBiology 355(3)：443-458]。[0111.2.1.1]j)导入微RNA(或微小RNA(miRNA)，其中所述的微RNA已经设计成靶向目的基因以诱导目的基因的mRNA的断裂或翻译抑制并且因而使基因表达沉默，或导入确保所述微RNA表达的表达盒，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是miRNA分子，其中在合适生物例如植物或其部分中导入或表达后，所述miRNA分子降低、阻抑、减少或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是这样的miRNA分子，其引起下述分子下降或失活，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述分子引起如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的蛋白质或下述多肽表达，其中所述多肽包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。[0111.3.1.1]微RNA(miRNAs)作为植物和动物中进化保守的基于RNA的基因表达调节物出现。miRNA(约21至25nt)从转录自不编码蛋白质的基因的带茎环结构的较大前体产生。miRNA靶向特定mRNA以在转录后水平(即降解mRNA)或翻译水平(即抑制蛋白质合成)抑制基因表达(BartelD 2004，Cell 116，281-297)。miRNA可以高效地设计成特异性靶向并下调所选择的基因。靶向选择天然植物miRNA的决定因素已经由Schwab和合作者(Schwab等人2005，.2005Dev.Cell 8，517-527)分析。该项工作已经延伸至设计和使用人工miRNAs(amiRNAs)以高效下调靶基因，从而形成设计有效amiRNA用于定向基因沉默的概念和规则[拟南芥中通过微RNA引起的高度特异性基因沉默，Schwab等人，Plant Cel 200618(4)]和用于高效amiRNA设计的基于网站的工具(http://wmd.weigelworld.org)。[0111.4.1.1]k)导入反式作用的小干扰性RNA(ta-siRNA)或导入确保前者表达的表达盒，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是ta-siRNA，其中在合适生物例如植物或其部分中表达后，所述ta-siRNA降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是这样的ta-siRNA，其引起下述分子下降或失活，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述分子引起如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的蛋白质或下述多肽表达，其中所述多肽包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。反式作用的小干扰性RNA(ta-siRNA)可以设计成靶向目的基因以诱导目的基因的mRNA的断裂并因而沉默基因表达。在US 60/672,976和60/718,645中描述了应用ta-siRNA的方法，其中所述ta-siRNA用于阻抑或失活根据本发明方法的基因产物。
如项B)至K)中所述的核酸序列通过转化或转染细胞或生物而在该细胞或生物中表达，或通过已知方法(例如项A)中公开的方法)导入细胞或生物中。
l)根据不同方法如逆向筛选法或所谓TILLING法(靶向基因组中诱导的局部损伤)鉴定随机诱变群体中的非沉默性突变，例如终止密码子、移码、整合、倒位等的产生，例如用于降低、阻抑或缺失在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的活性、尤其下述核酸分子的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，本发明的又一个实施方案是突变的DNA与野生型DNA之间的TILLING或逆向筛选引物或异源双链体，其中在合适生物例如植物或其部分中表达后，所述引物或异源双链体降低、阻抑或缺失选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组中的活性。本发明的又一个实施方案是用于鉴定突变的TILLING或逆向筛选引物，所述突变引起下述分子下降或失活，例如引起本发明的核酸分子或多肽下降或失活，结果是与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，其中所述分子引起如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的蛋白质或下述多肽表达，其中所述多肽包含如表IV中所示的共有序列或多肽基序或由包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码。特别优选用于鉴定下述核酸分子中突变的TILLING或逆向筛选引物，其中所述核酸分子是如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述核酸分子(如包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述核酸分子的核酸分子)的同源物，不过在一个或多个核苷酸中突变。在一个实施方案中，TILLING或逆向筛选引物包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述的核酸分子的至少17个核苷酸(nt)、优选18、19、20、21、22、23、24、25、27、30nt的片段。在一个实施方案中，TILLING或逆向筛选引物包含具有至少17个核苷酸(nt)、优选18、19、20、21、22、23、24、25、27、30nt并且与如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述的核酸分子至少70％、75％、80％、90％、更优选至少95％、最优选100％同源的片段。对于TILLING，通过用化学致变物(EMS)处理诱导突变。从个体中制备DNA并在用于初始筛选的汇集物中进行分析。使用扩增目的区域的引物，这些汇集物变成PCR的模板。异源双链体在汇集物中在野生型与突变片段之间通过PCR产物变性和复性形成。这些异源双链体是核酸酶CELI切割的底物。在消化后，使用标准荧光测序平板凝胶电泳观察所得产物。随后将阳性汇集物再筛选为各个DNA，因而鉴定出突变植物以及突变沿序列上的大致位置。该位置信息提高序列分析效率，因为杂合突变否则可能难以鉴定。高通量TILLING例如在Colbert等人(2001)Plant Physiology 126：480-484中描述并且近来已经应用于作物[综述，见Slade和Knauf，Transgenic Res.2005年4月；14(2)：109-15]。已经数次描述旨在鉴定群体中因随机整合核酸(如转座子或T-DNA)而突变的个体的其他逆向筛选方法，例如Krysan等人，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等人，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等人，2001，(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等人，2000(Plant J.2000.24，253-263)；Jeon等人，2000(Plant J.2000.22，561-570)；Tissier等人，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等人，1999(Plant Cell1999，11，1853-1866)。[0113.2.1.1]在本发明方法的一个其他实施方案中，使用这样的生物，在所述生物中以如此方式突变以上所提及基因之一或以上所提及核酸之一，从而与未突变的蛋白质相比，所编码基因产物的活性受细胞因子影响的程度比在参考生物中更大。该类型的突变可能导致生物代谢活性方面的改变，这随后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言更高的环境胁迫耐受性和/或抗性和更高的生物量生产。这种更高生产力的原因可以归咎于酶活性调节机制(如底物抑制或反馈调节)的改变。在本发明方法的又一个实施方案中，生物在这样的条件下培育，从而本发明核酸的表达被降低或阻抑，导致与本发明的相应的非转化野生型植物相比增强的环境胁迫耐受性和/或抗性和更高的生物量生产。[0113.3.1.1]在一个实施方案中，与相应的非转化野生型植物相比较而言，生物或其部分中环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产可以因内源基因的定向或随机诱变提高，其中所述内源基因包含或编码在本发明方法中待降低其活性的分子，例如包含表I第5列或第7列中所述的多核苷酸如表I第5列或第7列中所述的或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。[0113.4.1.1]例如，同源重组可以用来导入负向调节元件或用来除去、打断或缺失增强子元件形式的调节区。此外，可以修改基因转变法如Kochevenko和Willmitzer(Plant Physiol.2003 May；132(1)：174-84)和其中引文描述的方法以破坏增强子元件或增强负向调节元件的活性。另外，可以通过T-DNA或转座子诱变将突变元件或阻抑元件随机导入(植物)基因组并且可以筛选这样的品系，其中阻抑性或破坏性元件已经在在本发明基因附近整合，因而阻抑、降低或缺失该基因的表达。已经描述了通过随机整合增强子元件使植物基因失活。已经对多种情况描述了鉴定目的基因附近的插入(其最终携带失活元件)的反向遗传策略，例如Krysan等人，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等人，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等人，2001，(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等人，2000(Plant J.2000.24，253-263)；Jeon等人，2000(Plant J.2000.22，561-570)；Tissier等人，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等人，1999(Plant Cell1999，11，1853-1866)。也可以通过常见诱变技术实现对负向调节元件的增强或对增强元件或激活调节元件的破坏或弱化：产生化学或放射突变的群体是一项常见技术并且是熟练技术人员已知的。因而，如果通过诱变方法借助同源重组修饰并任选通过TILLING或其他逆向筛选法或基因转变法鉴定到编码赋予本文中所述活性的多肽或核酸分子的内源基因、尤其包含本发明核酸分子的基因，则可以提高表达水平。[0113.5.1.1]在本发明的一个实施方案中，可以例如通过用化学品随机诱变、辐射或紫外线或位点定向诱变以这样的方式实现对本文所述用于本发明方法中的核酸分子的适用修饰，即降低、阻抑或缺失该核酸分子的活性和由宿主生物编码的该核酸分子本身，从而与相应的非转化野生型植物相比较而言，环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产提高。本发明的这个实施方案就本发明的意义而言应当视为转基因性的。使用本文中提及的克隆载体和转化法，如在Plant Molecular Biologyand Biotechnology(CRC Press，Boca Raton，Florida)，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，Vectors for Gene Transfer in Higher Plants；在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press，1993，15-38；B.J enes等人，Techniques for GeneTransfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-143；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225))中公开并提及和在下文进一步提及的那些，如本文中所述的从本文中所述用于本发明方法中的多核苷酸衍生的核酸分子可以用于重组修饰类型广泛的生物，尤其植物，从而它们变得更好和更高效，原因是根据本发明的方法消除或降低了包含本发明核酸分子的基因的活性或所述基因的表达产物的活性。与相应的非转化野生型植物相比较而言，改善的环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产可以因所述操作的直接作用或这种操作的间接作用引起。
为了改善核酸分子导入，其中所述核酸分子用于生物中降低、阻抑、减少或缺失在本发明方法中待减少的分子的表达或活性，可以将本文中公开的或从其中衍生的核酸分子以如此方式并入核酸构建体和/或载体，从而将它们导入生物(例如细胞)引起内源活性或细胞活性在核酸序列表达水平上或在所述序列编码的多肽的水平上降低或缺失。因而，为了改善核酸分子的导入并且为了引起或改善在本发明方法中待减少的分子的表达或活性，例如在转基因植物或微生物中，可以将下述核酸分子并入核酸构建体和/或载体，其中所述核酸分子编码如本文中公开的反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或其他分子，从而抑制在本发明方法中待降低、阻抑或缺失的核酸分子的表达产物的表达或活性。
在上述降低、阻抑、减少或缺失(其如上文所定义还包括在生物中产生活性，即从头(de novo)活性)后，例如在导入和表达如本发明方法中所述的抑制表达或活性的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或反义分子或核酶或其他分子后，培育并且随后收获本发明的生物，有利地是植物、植物组织或植物细胞。例子可以是转基因或非转基因的植物、细胞或其原生质体。在以下段落中描述优选的合适生物的例子。
用于产生根据本发明使用或在本发明方法中使用的核酸分子的合适宿主生物(转基因生物)，其中所述宿主生物例如待用本发明的核酸构建体或载体(二者如下文所述)转化，例如引起抑制RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、核酶或反义分子或核酶或其他分子的表达或活性，原则上是适于阻抑、降低或缺失基因、尤其下述核酸分子的全部植物，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。
在该(转基因)宿主生物是植物、植物组织或植物细胞的情况下，例如选自由漆树科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、番木瓜科、大麻科、旋花科、藜科、葫芦科、胡颓子科、杜鹃花科、大戟科、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科、禾本科、核桃科、樟科、豆科(Leguminosae)、亚麻科或多年生牧草、草料作物、蔬菜植物、观赏植物和拟南芥组成的组中的植物时，这种植物例如在固体培养基上培育，或作为细胞，在例如熟练技术人员已知并且适合该生物的液体培养基中培养。另外，此类植物可以在土壤或类似基质中培育。在一个实施方案中，在本发明的方法中使用的核酸分子、尤其本发明的核酸分子或生产或源头生物是或源自这样的植物，如植物选自槭树科(Aceraceae)、漆树科、伞形科、菊科、十字花科、仙人掌科(Cactaceae)、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科(Malvaceae)、睡莲科(Nymphaeaceae)、罂粟科(Papaveraceae)、蔷薇科(Rosaceae)、杨柳科(Salicaceae)、茄科(Solanaceae)、棕榈科(Arecaceae)、凤梨科、莎草科(Cyperaceae)、鸢尾科(Iridaceae)、百合科(Liliaceae)、兰科(Orchidaceae)、龙胆科(Gentianaceae)、唇形科(Labiaceae)、木兰科(Magnoliaceae)、毛莨科(Ranunculaceae)、忍冬科(Carifolaceae)、茜草科(Ru biaceae)、玄参科(Scrophulariaceae)、石竹科(Caryophyllaceae)、杜鹃花科、蓼科、堇菜科(Violaceae)、灯心草科(Juncaceae)或禾本科(Poaceae)并且优选地源于选自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科的植物。
优选的植物选自由以下植物组成的组：漆树科如黄连木属(Pistacia)、芒果属(Mangifera)、腰果属(Anacardium)例如物种阿月混子(Pistacia vera)[pistachios、Pistazie]、芒果(Mangifer indica)[Mango]或腰果(Anacardium occidentale)[Cashew]；菊科如金盏花属(Calendula)、红蓝花属(Carthamus)、矢车菊属(Centaurea)、菊苣属(Cichorium)、菜蓟属(Cynara)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、新缬草属(Locusta)、万寿菊属、缬草属(Valeriana)例如物种金盏花(Calendulaofficinalis)[Marigold]、红花(Carthamus tinctorius)[safflower]、矢车菊(Centaurea cyanus)[cornflower]、菊苣(Cichorium intybus)[蓝费利菊(bluedaisy)]、洋蓟(Cynara scolymus)[Artichoke]、向日葵(Helianthus annus)[向日葵]、莴苣(Lactuca sativa)、皱叶莴苣(Lactuca crispa)、Lactuca esculenta、毒莴苣栽培种(Lactuca scariola L.ssp.sativa)、Lactuca scariola L.var.integrata、毒莴苣全缘叶变种(Lactuca scariola L.var.integrifolia)、生菜(Lactuca sativa subsp.romana)、Locusta communis、莴苣缬草(Valerianalocusta)[lettuce]、香叶万寿菊(Tagetes lucida)、万寿菊(Tagetes erecta)或细叶万寿菊(Tagetes tenuifolia)[Marigold]；伞形科如胡萝卜属(Daucus)例如物种胡萝卜(Daucus carota)[carrot]；桦木科(Betulaceae)如榛属(Corylus)例如物种欧洲榛(Corylus avellana)或土耳其榛(Coryluscolurna)[hazelnut]；紫草科(Boraginaceae)如琉璃苣属(Borago)例如物种琉璃苣(Borago officinalis)[琉璃苣]；十字花科如芸苔属(Brassica)、黑芥属(Melanosinapis)、白芥属(Sinapis)、拟南芥属(Arabidopsis)例如物种欧洲油菜(Brassica napus)、芜青物种(Brassica rapa ssp)[卡诺拉油菜、欧洲油菜、甘蓝型油菜]、野欧白芥(Sinapis arvensis)、芥菜(Brassica juncea)、芥菜(原变种)(Brassica juncea，Brassica juncea var.juncea)、皱叶芥菜(Brassicajuncea var.crispifolia)、大叶芥菜(Brassica juncea var.foliosa)、黑芥(Brassica nigra)、黑芥(Brassica sinapioides)、黑芥(Melanosinapiscommunis)[mustard]、甘蓝(Brassica oleracea)[fodder beet]或拟南芥；凤梨科如凤梨属(Anana)、Bromelia例如物种凤梨(Anana comosus)、Ananasananas或Bromelia comosa[菠萝]；番木瓜科如番木瓜属(Carica)例如物种番木瓜(Carica papaya)[papaya]；大麻科如大麻属(Cannabis)例如物种大麻(Cannabis sative)[hemp]；旋花科如番薯属(Ipomea)、旋花属(Convolvulus)例如物种甘薯(Ipomoea batatus)、提琴叶牵牛花(Ipomoea pandurata)、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯(lpomoea fastigiata)、lpomoea tiliacea、三裂叶薯(pomoea triloba)或Convolvulus panduratus[甜马铃薯、Man of the Earth、野马铃薯]；藜科如甜菜属(Beta)即物种甜菜(Beta vulgaris)、甜萝卜(Beta vulgaris var.altissima)、甜菜(原变种)(Betavulgaris var.Vulgaris)、沿海甜菜(Beta maritima)、宿生甜菜(Beta vulgarisvar.perennis)、红甜菜(Beta vulgaris var.conditiva)或Beta vulgaris var.esculenta[甜菜(sugar beet)]；葫芦科如南瓜属(Cucurbita)例如物种笋瓜(Cucurbita maxima)、灰籽南瓜(Cucurbita mixta)、西葫芦(Cucurbita pepo)或南瓜(Cucurbita moschata)[pumpkin、squash]；胡颓子科(Elaeagnaceae)如胡颓子属(Elaeagnus)例如物种油橄榄(Olea europaea)[olive]；杜鹃花科如山月桂属(Kalmia)例如物种宽叶山月桂(Kalmia latifolia)、窄叶山月桂(Kalmia angustifolia)、小叶山月桂(Kalmia microphylla)、沼泽山月桂(Kalmia polifolia)、Kalmia occidentalis、Cistus chamaerhodendros或Kalmia lucida[American laurel、阔叶月桂、calico bush、spoon wood、sheeplaurel、alpine laurel、bog laurel、western bog-laurel、swamp-laurel]；大戟科如木薯属(Maniho)、Janipha、麻疯树属(Jatropha)、蓖麻属(Ricinus)，例如物种木薯(Manihot utilissima)、Janipha manihot、Jatropha manihot、Manihot aipil、manihot dulcis、Manihot manihot、Manihot melanobasis、Manihot esculenta[木薯、竹芋(arrowroot)、tapioca、cassava]或蓖麻[castorbean、Castor Oil Bush、Castor Oil plant、Palma Christi、Wonder Tree]；豆科如豌豆属(Pisum)、合欢属(Albizia)、Cathormion、Feuillea、因加属(Inga)、围涎树属(Pithecolobium)、金合欢属(Acacia)、含羞草属(Mimosa)、苜蓿属(Medicago)、大豆属(Glycine)、扁豆属(Dolichos)、菜豆属(Phaseolus)、野大豆亚属(Soja)例如物种豌豆(Pisum sativum)、饲料豌豆(Pisumarvense)、早生矮豌豆(Pisum humile)[豌豆]、Albizia berteriana、合欢(Albizia julibrissin)、大叶合欢(Albizia lebbeck)、Acacia berteriana、Acacialittoralis、Albizia berteriana、Albizzia berteriana、Cathormion berteriana、Feuillea berteriana、Inga fragrans、Pithecellobium berterianum、Pithecellobium fragrans、Pithecolobium berterianum、Pseudalbizziaberteriana、Acacia julibrissin、Acacia nemu、Albizia nemu、Feuilleeajulibrissin、Mimosa julibrissin、Mimosa speciosa、Sericanrda julibrissin、Acacia lebbeck、Acacia macrohylla、Albizia lebbek、Feuilleea lebbeck、Mimosa lebbeck、Mimosa speciosa[bastard logwood、silk tree、East IndianWalnut]、紫花苜蓿(Medicago sativa)、野苜蓿(Medicago falcata)、杂交苜蓿(Medicago varia)[苜蓿]、大豆(Glycine max)、Dolichos soja、宽叶蔓豆(Glycine gracilis)、Glycine hispida、Phaseolus max、Soja hispida或Sojamax[大豆]；牻牛儿苗科如天竺葵属(Pelargonium)、椰子属(Cocos)、Oleum例如物种椰子(Cocos nucifera)、椰香天竺葵(Pelargonium grossularioides)或Oleum cocois[椰子]；禾本科如甘蔗属(Saccharum)例如物种甘蔗(Saccharum officinarum)；核桃科(Juglandaceae)如核桃属、Wallia例如物种核桃(Juglans regia)、Juglans ailanthifolia、山核桃(Juglans sieboldiana)、灰核桃(Juglans cinerea)、Wallia cinerea、Juglans bixbyi、加州黑核桃(Juglans californica)、印度黑核桃(Juglans hindsii)、Juglans intermedia、Juglans jamaicensis、大核桃(Juglans major)、Juglans microcarpa、黑核桃(Juglans nigra)或Wallia nigra[walnut、black walnut、common walnut、Persian walnut、white walnut、butternut、black walnut]；樟科如鳄梨属(Persea)、月桂属(Laurus)例如物种月桂(Laurus nobilis)[bay、laurel、baylaurel、sweet bay]、鳄梨(Persea americana、Persea gratissima或Perseapersea)[鳄梨(avocado)]；豆科如落花生属(Arachis)例如物种花生(Arachishypogaea)[落花生]；亚麻科(Linaceae)如亚麻属(Linum)、Adenolinum例如物种亚麻(linum usitatissimum)、linum humile、奥地利亚麻(linumaustriacum)、linum bienne、窄叶亚麻(linum angustifolium)、泻亚麻(linumcatharticum)、金黄亚麻(linum flavum)、大花亚麻(linum grandiflorum、Adenolinum grandiflorum)、刘易斯亚麻(linum lewisii)、那旁亚麻(linumnarbonense)、宿根亚麻(linum perenne)、刘易斯宿根亚麻(linum perennevar.lewisii)、linum pratense、linum trigynum[亚麻(flax、linseed)]；千屈菜科(Lythrarieae)如石榴属(Punica)例如物种石榴(Punicagranatum)[pomegranate]；锦葵科如棉属(Gossypium)例如物种陆地棉(Gossypium hirsutum)、树棉(Gossypium arboreum)、海岛棉(Gossypiumbarbadense)、草棉(Gossypium herbaceum)或瑟伯氏棉(Gossypiumthurberi)[棉花]；芭蕉科(Musaceae)如芭蕉属(Musa)例如物种香蕉、小果野蕉(Musa nana)、大蕉(Musa acuminata)、芭蕉物种(Musa spp.)[banana]；柳叶菜科(Onagraceae)如Camissonia、月见草属(Oenothera)例如物种月见草(Oenothera biennis)或Camissonia brevipes[primose、evening primose]；棕榈科(Palmae)如油棕属(Elacis)例如物种油棕(Elaeis guineensis)[oilplam]；罂粟科如罂粟属(Papaver)例如物种东方罂粟(Papaver orientale)、虞美人(Papaver rhoeas)、长果罂粟(Papaver dubium)[poppy、orientalpoppy、corn poppy、field poppy、shirley poppies、field poppy、long-headedpoppy、long-pod poppy]；胡麻科(Pedaliaceae)如胡麻属(Sesamum)例如物种芝麻(Sesamum indicum)[sesame]；胡椒科(Piperaceae)如胡椒属(Piper)、Artanthe、草胡椒属(Peperomia)、Steffensia例如物种树胡椒(Piperaduncum)、Piper amalago)、狭叶胡椒(Piper angustifolium)、Piper auritum、萎叶(Piper betel)、毕澄茄(Piper cubeba)、荜菝(Piper longum)、胡椒(Pipernigrum)、假荜菝(Piper elongatu)、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piper elongatum、Steffensia elongata[Cayennepepper、野胡椒(wild pepper)]；禾本科如大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、燕麦属(Avena)、高粱属(Sorghum)、须芒草属(Andropogon)、绒毛草属(Holcus)、黍属(Panicum)、稻属(Oryza)、玉米属(Zea)、小麦属(Triticum)例如物种大麦(Hordeum vulgare)、芒颖大麦草(Hordeumjubatum)、鼠大麦(Hordeum murinum)、黑麦状大麦草(Hordeumsecalinum)、栽培二棱大麦(Hordeum distichon)、三叉大麦(Hordeumaegiceras)、栽培六棱大麦(Hordeum hexastichon)、栽培六棱大麦(Hordeumhexastichum)、不规则型大麦(Hordeum irregulare)、大麦(Hordeumsativum)、黑麦状大麦草[大麦、薏米(pearl barley)、狐尾大麦(foxtailbarley)、wall barley、草地大麦(meadow barley)]、黑麦(Secale cereale)[黑麦]、燕麦(Avena sativa)、野燕麦(Avena fatua)、比赞燕麦(Avena byzantina)、野燕麦原变种(Avena fatua var.sativa)、杂种野燕麦(Avena hybrida)、两色蜀黍(Sorghum bicolor)、石茅高粱(Sorghum halepense)、甜高粱(Sorghumsaccharatum)、高粱(Sorghum vulgare)、Andropogon drummondii、Holcusbicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghum arundinaceum、卡佛尔高粱(Sorghum caffrorum)、垂穗高粱草(Sorghum cernuum)、甜高粱(Sorghum dochna)、Sorghum drummondii、硬高粱草(Sorghum durra)、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草(Sorghumnervosum)、甜高粱(Sorghum saccharatum)、Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱(Sorghum vulgare)、石茅高粱(Holcushalepensis)、黍(Sorghum miliaceum millet)、稷(Panicummilitaceum)[Sorghum、谷子(millet)]、稻(Oryza sativa)、阔叶野生稻(Oryzalatifolia)[稻]、玉米(Zea mays)[corn、玉米]、普通小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、圆柱小麦(Triticum turgidum)、Triticumhybernum、马卡小麦(riticum macha)、普通小麦(Triticum sativum)或普通小麦(Triticum vulgare)[小麦、面包小麦(bread wheat)、common wheat]、山龙眼科(Proteaceae)如澳洲坚果黍(Macadamia)例如物种澳洲坚果(Macadamia intergrifolia)[macadamia]；茜草科如咖啡属(Coffea)例如咖啡物种(Cofea spp.)、小果咖啡(Coffea arabica)、中果咖啡(Coffea canephora)或大果咖啡(Coffea liberica)[咖啡]；玄参科如毛蕊花属(Verbascum)例如物种毛瓣毛蕊花(Verbascum blattaria)、南欧毛蕊花(Verbascum chaixii)、密花毛蕊花(Verbascum densiflorum)、Verbascum lagurus、长叶毛蕊花(Verbascum longifolium)、Verbascum lychnitis、黑毛蕊花(Verbascumnigrum)、奥林匹克毛蕊花(Verbascum olympicum)、抱茎毛蕊花(Verbascum phlomoides)、紫花毛蕊花(Verbascum phoenicum)、Verbascum pulverulentum或毛蕊花(Verbascum thapsus)[mullein、whitemoth mullein、nettle-leaved mullein、密花毛蕊花(dense-flowered mullein)、silver mullein、长叶毛蕊花、white mullein、dark mullein、希腊毛蕊花(greekmullein)、橙色毛蕊花(orange mullein)、紫花毛蕊花(purple mullein)、hoarymullein、great mullein]；茄科如辣椒属(Capsicum)、烟草属(Nicotiana)、茄属(Solanum)、番茄属(Lycopersicon)例如物种辣椒(Capsicum annuum)、朝天椒(Capsicum annuum var.glabriusculum)、小米椒(Capsicumfrutescens)[辣椒]、辣椒[红辣椒(paprika)]、普通烟、花烟草(Nicotianaalata)、渐狭叶烟草(Nicotiana attenuate)、光烟草(Nicotiana glauca)、郎氏烟草(Nicotiana langsdorffii)、Nicotiana obtusifolia、裂叶烟草(Nicotianaquadrivalvis)、浅波烟草(Nicotiana repanda)、黄花烟草(Nicotiana rustica)、林烟草(Nicotiana sylvestris)[烟草]、马铃薯[马铃薯]、茄子[egg-plant]、番茄(Lycopersicon esculentum)、番茄(Lycopersicon lycopersicum)、梨形番茄(Lycopersicon pyriforme)、红茄(Solanum integrifolium)或番茄(Solanumlycopersicum)[番茄]；梧桐科(Sterculiaceae)如可可属(Theobroma)例如物种可可树(Theobroma cacao)[可可]；山茶科(Theaceae)如山茶属(Camellia)例如物种大叶茶(Camellia sinensis)[茶]。以上提及的全部宿主生物也可用作在本发明的方法中使用的核酸分子，例如本发明的核酸分子的源头生物。
优选作物植物并且尤其是在本文中提到作为宿主的植物，上文提及的科和属，例如以下物种：腰果、金盏花、红花、菊苣、洋蓟、向日葵、香叶万寿菊、万寿菊、细叶万寿菊；胡萝卜；欧洲榛、土耳其榛、琉璃苣；欧洲油菜、芜青物种、野欧白芥、芥菜、芥菜原变种、皱叶芥菜、大叶芥菜、黑芥、黑芥、黑芥、甘蓝、拟南芥、凤梨、凤梨、凤梨、番木瓜、大麻、甘薯、提琴叶牵牛花、Convolvulus batatas、Convolvulus tiliaceus、甘薯、Ipomoea tiliacea、三裂叶薯、Convolvulus panduratus，甜菜、甜萝卜、甜菜原变种，沿海甜菜、宿生甜菜、红甜菜、Beta vulgaris var.esculenta、笋瓜、灰籽南瓜、西葫芦、南瓜、油橄榄、油橄榄、Janipha manihot、Jatrophamanihot、Manihot aipil、Manihot dulcis、Manihot manihot、Manihotmelanobasis、Manihot esculenta、蓖麻、豌豆、饲料豌豆、早生矮豌豆、紫花苜蓿、野苜蓿、杂交苜蓿、大豆、Dolichos soja、Glycine gracilis、宽叶蔓豆、Phaseolus max、Soja hispida、Soja max、椰子、椰香天竺葵、Oleumcocoas、月桂、鳄梨、亚麻、Linum humile、奥地利亚麻、Linum bienne、窄叶亚麻、泻亚麻、金黄亚麻、大花亚麻、大花亚麻、刘易斯亚麻、那旁亚麻、宿根亚麻、刘易斯宿根亚麻、Linum pratense、Linum trigynum、石榴、陆地棉，树棉、海岛棉、草棉、瑟伯氏棉、香蕉、小果野蕉、大蕉、芭蕉物种、油棕、东方罂粟、虞美人、Papaver dubium、芝麻、树胡椒、Piperamalago、狭叶胡椒、Piper auritum、萎叶、毕澄茄、荜菝、胡椒、假荜菝、Artanthe adunca、Artanthe elongata、Peperomia elongata、Piperelongatum、Steffensia elongata、大麦、芒颖大麦草、鼠大麦、黑麦状大麦草、栽培二棱大麦、三叉大麦、栽培六棱大麦、栽培六棱大麦、不规则型大麦、大麦、黑麦状大麦草、燕麦、野燕麦、比赞燕麦、野燕麦原变种、杂种野燕麦、两色蜀黍、石茅高粱、甜高粱、高粱、Andropogon drummondii、Holcus bicolor、Holcus sorghum、Sorghum aethiopicum、Sorghumarundinaceum、卡佛尔高粱、垂穗高粱草、甜高粱、Sorghum drummondii、硬高粱草、Sorghum guineense、Sorghum lanceolatum、多脉高粱草、甜高粱(Sorghum subglabrescens、Sorghum verticilliflorum、高粱、石茅高粱)、黍(谷子(millet)、稷、玉米、普通小麦、硬粒小麦、圆柱小麦、Triticumhybernum、马卡小麦、普通小麦或普通小麦、咖啡、小果咖啡、中果咖啡、大果咖啡、辣椒、朝天椒、小米椒、红辣椒、普通烟、马铃薯、茄子、番茄、番茄、梨形番茄、红茄(Solanum integrifolium)、番茄、可可树或大叶茶。
特别优选的植物是选自由以下植物组成的组中的植物：玉米、大豆(soja)、卡诺拉油菜、小麦、大麦、小黑麦、稻、亚麻籽、向日葵、大麻、琉璃苣(borage)、油棕、椰子、月见草、落花生、向日葵、马铃薯和拟南芥属植物。其他优选的植物是选自由以下植物组成的组中的非转化植物：黑麦、燕麦、大豆(soybean)、棉属植物、油菜籽(rapeseed)、木薯、辣椒、向日葵、亚麻(flax)、红花、报春花、油菜籽、芜菁、万寿菊、茄科植物、烟草、茄子、番茄、蚕豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属(Salix)物种、多年生牧草和饲草作物。更优选的植物是未转化的亚麻属植物细胞、优选地是亚麻，更优选Brigitta、Golda、Gold Merchant、Helle、Juliel、Olpina、Livia、Marlin、Maedgold、Sporpion、Serenade、Linus、Taunus、Lifax或Liviola品种、未转化的向日葵属植物细胞、优选向日葵(Heliantus annuus)、更优选Aurasol、Capella、Flavia、Flores、Jazzy、Palulo、Pegasol、PIR64A54、Rigasol、Sariuca、Sideral、Sunny、Alenka、Candisol或Floyd品种，或未转化的芸苔属植物细胞、优选欧洲油菜(Brassica napus)、更优选Dorothy、Evita、Heros、Hyola、Kimbar、Lambada、Licolly、Liconira、Licosmos、Lisonne、Mistral、Passat、Serator、Siapula、Sponsor、Star、Caviar、Hybridol、Baical、Olga、Lara、Doublol、Karola、Falcon、Spirit、Olymp、Zeus、Libero、Kyola、Licord、Lion、Lirajet、Lisbeth、Magnum、Maja、Mendel、Mica、Mohican、Olpop、Ontarion、Panthar、Prinoe、Pronio、Susanna、Talani、Titan、Transfer、Wiking、Woltan、Zeniah、Artus、Contact或Smart品种。在本发明的一个实施方案中，转基因植物自玉米、大豆、油籽油菜(包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜(winter oil seed reap)、棉属植物、小麦和稻。
以上提及的全部宿主生物也可用作分离或鉴定在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或其功能等同物的源头生物。玉米、大豆(soja)、卡诺拉油菜、大麻、琉璃苣、油棕、椰子、月见草、落花生、红花、小麦、大麦、小黑麦、稻、亚麻籽、向日葵、马铃薯和拟南芥属植物是优选的源头植物。
与野生型、对照或参考相比，在本发明方法所用植物中与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性的提高和生物量生产的提高可以根据本发明方法提高至少1.1倍、优选至少1.5、2或5倍，特别优选至少10或30倍，非常特别优选至少50倍。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的方法，所述方法包括降低、阻抑、减少或缺失核酸分子或其同源物的活性，所述核酸分子包含具有如表I第5列或第7列中所述核苷酸序列的多核苷酸，或包括降低、阻抑、减少或缺失多肽或其如本文中所述同源物的活性，所述多肽包含具有如表II第5列或第7列中所述氨基酸序列或包含如表IV第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽。因而，在另一个优选的实施方案中，本发明涉及用于与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的方法，所述方法包括降低、阻抑、减少或缺失至少一种核酸分子的活性或表达，所述核酸分子包含选自以下的核酸分子：a)编码如表II第5列或第7列中所述的多肽或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的分离核酸分子；b)如表I第5列或第7列中所述的分离的核酸分子；c)分离的核酸分子，其能够因遗传密码的简并性而从表II第5列或第7列中所述的多肽序列或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽序列衍生；d)分离的核酸分子，其与包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可以借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体分离，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；g)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽包含如表IV第7列中所述的共有序列或多肽基序并且优选地具有如表II第5列中所述蛋白质代表的生物学活性；h)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；i)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加由核酸分子(a)至(c)编码的多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生；j)分离的核酸分子，通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库(从cDNA或基因组文库衍生的文库)可获得，其具有与在(a)至(d)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示蛋白质代表的活性；和或其包含与之互补的序列；降低、阻抑、减少或缺失包含如(a)至(j)中所述核酸分子的核酸分子的表达产物，例如包含如表II第5列或第7列中所述或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽；并且因而在一个优选的实施方案中，所述核酸分子或多肽赋予至少一种在[0024.1.1.1]中所示的活性。在一个实施方案中，在该方法中使用的核酸分子与如表IA或B的第5列或第7列中所述的序列至少一个或多个核苷酸不同或不由如表IA或B的第5列或第7列中所述的序列组成。在一个实施方案中，本发明的核酸分子与如表IA或B的第5列或第7列中所述序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。在另一个实施方案中，该核酸分子不由如表IA或B的第5列或第7列中所述的序列组成。
可以从通常可登陆的数据库确定这样的核酸分子，所述核酸分子有利于本发明方法并且编码具有下述活性的核酸分子，所述活性由包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子的表达产物代表，优选由如表IB第5列或第7列中所示的蛋白质代表，更优选由下述蛋白质代表，所述蛋白质如表IB第5列中显示并且在降低或缺失它们的活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。同样地，可以从通常可登陆的数据库确定这样的核酸分子，所述核酸分子有利于本发明方法并且编码具有如此活性的多肽，所述活性由包含如表II第5列或第7列中所示多肽或如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的蛋白质代表，优选由如表IIB第5列或第7列中所示或包含如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的蛋白质代表，更优选下述蛋白质代表，所述蛋白质如表IIB第5列中显示并且引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。尤其在本上下文中必须提及的那些数据库是通用基因数据库，如EMBL数据库(Stoesser G.等人，Nucleic Acids Res 2001，第29卷，17-21)、GenBank数据库(Benson D.A.等人，Nucleic Acids Res 2000.第28卷，15-18)或PIR数据库(Barker W.C.等人，Nucleic Acids Res.1999，第27卷，39-43)。还可能使用生物特异的基因数据库以确定有利序列，在酵母的情况下例如有利地使用SGD数据库(Cherry J.M.等人，Nucleic Acids Res.1998，第26卷，73-80)或MIPS数据库(Mewes H.W.等人，Nucleic AcidsRes.1999，第27卷，44-48)，在大肠杆菌的情况下有利地使用GenProtEC数据库(http://web.bham.ac.uk/bcm4ght6/res.html)并且在拟南芥有利地使用TAIR-数据库(Huala，E.等人，Nucleic Acids Res.2001第29卷(1)，102-5)或MIPS数据库。
另外，在本发明的另一个实施方案，在本发明方法中待减少的分子是新的。因此，本发明也涉及新核酸分子、“本发明的核酸分子”或“本发明的多核苷酸”。
在本发明的方法中使用的核酸分子采取分离的核酸序列形式，所述分离的核酸序列编码这样的多肽，所述多肽具有如表IIA或B的第5列或第7列中所示的、优选由如表IIB第7列中所示新蛋白质代表的蛋白质的活性，并且通过降低、阻抑、减少或缺失它们的活性而能够与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和提高生物量生产。
因而，在一个实施方案中，本发明涉及引起产物表达的分离的核酸分子，其中降低、阻抑或缺失所述分离的核酸分子引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，并且所述分离的核酸分子包含选自以下的核酸分子：a)编码如表II、优选表IIB的第5列或第7列中所述多肽和/或包含如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽的分离核酸分子；b)如表I、优选表IB的第5列或第7列中所述的分离核酸分子；c)分离的核酸分子，其能够因遗传密码的简并性而从表II、优选表IIB的第5列或第7列中所述的多肽序列或从包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽衍生；d)分离的核酸分子，其与包含如表I、优选表IB的第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；e)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；f)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽可以借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体分离，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；g)编码包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的分离核酸分子；h)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；i)分离的核酸分子，其包含通过使用如表III第7列中所述的在5’引发端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸；j)编码多肽的分离的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加由核酸分子(a)至(c)编码的多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生；和k)分离的核酸分子，通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库可获得，其具有与在(a)至(d)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示蛋白质代表的活性；或其包含与之互补的序列；因而根据(a)至(k)的核酸分子与如表IA第5列或第7列中所述和/或编码下述蛋白质的序列在至少1、5、10、20、50、100个或更多个核苷酸方面不同，其中所述蛋白质与如表IIA第5列或第7列中描述的多肽序列在至少1、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸方面不同。因此，在另一个实施方案中，本发明的核酸分子不由如表IA的第5列或第7列中所述的序列组成。在又一个实施方案中，本发明的核酸分子与表I A或B第5列或第7列中所述核酸序列至少30％同一，并且与表IA第5列或第7列中所述序列的同一性小于100％、优选小于99.999％、99.99％或99.9％、更优选小于99％、98％、97％、96％或95％。如本发明中所用，术语“本发明的核酸分子”指如本段落中描述的核酸分子。
在一个实施方案中，本发明也涉及新多肽，因此涉及“本发明的多肽”或“本发明的蛋白质”。优选地，所述多肽不包含如表IIA第5列或第7列中所示的多肽。优选地，本发明的多肽与如表IIA第5列或第7列中所示的多肽序列在至少1、5、10、20、30、50个或更多个氨基酸方面不同。在又一个实施方案中，本发明的多肽与表IIA或B第5列或第7列中所述蛋白质核序列至少30％同一，并且与表IIA第5列或第7列中所述序列的同一性小于100％、优选小于99.999％、99.99％或99.9％、更优选小于99％、98％、97％、96％或95％。
如本发明中所用，术语“在本发明方法中待减少的分子”、“在本发明方法中待减少的核酸分子”或“在本发明方法中待减少的多肽”分别包括术语“本发明的核酸分子”或“本发明的多肽”。
在一个实施方案中，核酸分子有利地源自植物。如所提及，在一个实施方案中，优选作物植物，例如上述宿主植物。
但是也有可能使用与生物中存在的核酸序列在一个或多个碱基方面不同或与生物中存在的多肽序列在一个或多个氨基酸分子方面不同的人工序列来实施本发明，例如阻抑、失活或下调选自由蛋白质组成的组中的活性：1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990-蛋白、At5g40590-蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶，例如旨在阻抑、失活或下调核酸分子或多肽的活性，所述核酸分子或多肽赋予上文提及的活性，例如在降低、阻抑、减少或缺失其表达或活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
在本发明的方法中，可以使用根据需要含有合成的天然或修饰核苷酸碱基的核酸分子，其中所述核苷酸碱基可以掺入DNA或RNA。这种合成的非天然或修饰的碱基可以例如提高核酸分子在细胞外部或内部的稳定性。本发明方法中使用的核酸分子可以含有如前述相同的修饰。
如本上下文中所用，该核酸分子也可以包括在编码基因区域3’末端和在其5’末端的非翻译序列，例如该编码区的5’末端上游序列的至少500个、优选200个、特别优选100个核苷酸和该编码基因区域的3’末端下游序列的至少100个、优选50个、特别优选20个核苷酸。例如在使用RNAi技术或反义技术的情况下，也可以有利地使用5’-和/或3’-区。在一个实施方案中，有利的是选择编码区用于克隆和表达阻抑构建体，如反义RNAi oder共抑制构建体，旨在靶向几种或全部直向同源基因，否则它们可能相互补偿。在另一个实施方案中，有利的是使用源自3’或5’引发区域的基因非常特异性序列以构建阻抑构建体，其目的是特异性地降低仅靶基因的活性或表达水平，因而避免因阻抑其他非靶基因所致的副作用(所谓脱靶)。本领域技术人员熟悉分析其靶生物中的实际基因组位置。必要信息可以通过在相关中搜索或行基因组DNA印迹获得，从而揭示靶生物的基因组结构并且逐步将这些结果与有关本文中公开的靶基因表达水平信息组合，其中所述的靶基因表达水平信息例如通过阵列实验、RNA印迹或RTqPCR实验获得。
优选地，在本发明的方法中使用的核酸分子或本发明的核酸分子是分离的核酸分子。
“分离的”多核苷酸或核酸分子是与该核酸天然来源中存在的其他多核苷酸或核酸分子分开的。分离的核酸分子可以是几kb的染色体片段，或优选地是仅包含基因编码区的分子。因此，分离的核酸分子可以包含染色体区，其中所述染色体区靠近5’和3’端或其他相邻染色体区，但是优选地不包含这样的序列，其中所述序列在该核酸分子来源的生物中天然分布在基因组或染色体环境下的此核酸分子序列侧翼(例如靠近编码该核酸分子的5’-和3’-UTR的序列)。在多个实施方案中，在本发明的方法中使用的分离的核酸分子可以例如包含在该核酸分子来源的细胞的基因组DNA中天然分布此核酸分子侧翼的小于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb核苷酸序列。
可以使用分子生物学标准技术和本文中提供的序列信息分离在该方法中使用的核酸分子或其部分。另外，例如可以借助比较算法在DNA水平或氨基酸水平鉴定同源序列或同源保守序列区。同源序列可以作为杂交探针在标准杂交技术(例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：ALaboratory Manual.2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)中描述的那些杂交技术，用于分离在本方法中有用的其他核酸序列)下使用。
使用基于本发明方法中待降低其活性(例如表I第5列或第7列中所公开)的分子的完整序列或基于其部分的寡核苷酸引物，可以通过聚合酶链反应额外地分离包括所述完整序列的核酸分子或其部分。例如，可以通过聚合酶链反应，使用已经基于已公开的序列所产生的寡核苷酸引物分离包含所述完整序列或其部分的核酸分子。例如，mRNA可以从细胞分离，例如借助Chirgwin等人(1979)Biochemistry 18：5294-5299的硫氰酸胍提取法，并且可以借助逆转录酶(例如可从Gibco/BRL，Bethesda，MD获得的Moloney MLV逆转录酶，或可从Seikagaku America，Inc.，St.Petersburg，FL获得的AMV逆转录酶)产生cDNA。
用于借助聚合酶链反应扩增的合成性寡核苷酸引物可以基于本文中所示的序列(例如从包含如表I第5列或第7列中所述分子的分子)产生或从如表I或表II第5列或第7列中所述的分子衍生。此类引物可以用来(例如从cDNA文库或从基因组文库)扩增核酸序列并鉴定在本发明方法中有用的核酸分子。例如，使用如表III第7列中所示的引物，该引物在其5’引物末端不以核苷酸ATA开始。
此外，可能通过使用根据本发明方法待减少的核酸分子所编码的多肽、尤其使用如表II第5列或第7列中所示核酸分子所编码的序列实施蛋白质序列比对来鉴定源自多种生物的保守区，从所述序列可以衍生保守区并因而衍生出简并引物。保守区是在不同来源的几种同源物的一个特定位置中显示极少氨基酸变异的那些区域。如表IV第7列中所示的共有序列和多肽基序从所述比对结果衍生。此外，可能通过使用根据本发明方法待减少的核酸分子所编码的多肽、尤其使用如表II第5列或第7列中所示多肽分子所编码的序列实施蛋白质序列比对来鉴定源自多种生物的保守区，从所述序列可以衍生保守区并因而衍生出简并引物。保守区是在不同来源的几种同源物的一个特定位置中显示极少氨基酸变异的那些区域。如表IV第7列中所示的共有序列和多肽基序从所述比对结果衍生。在一个有利的实施方案中，在本发明方法中降低了包含或由如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序组成的多肽的活性，并且在另一个实施方案中，本发明涉及包含或由如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序组成的多肽，因而可以由任意氨基酸替代20个或更少、优选15或10个、优选9、8、7或6个、更优选5或4个、甚至更优选3个、甚至更优选2个、甚至更优选1个、最优选0个所示氨基酸位置。在一个实施方案中，不超过15％、优选10％、甚至更优选5％、4％、3％或2％、最优选1％或0％由一个字母所示的氨基酸位置由另一个氨基酸替代。在另一个实施方案中，将20个或更少、优选15或10个、优选9、8、7或6个、更优选5或4个、甚至更优选3个、甚至更优选2个、甚至更优选1个、最优选0个氨基酸插入共有序列或蛋白质基序。该共有序列从如表II中所列序列的多重比对结果衍生。字母代表单字母氨基酸代码并且表示所述氨基酸是在至少80％所比对的蛋白质中保守的。字母X代表在至少80％所比对的序列中不保守的氨基酸。共有序列始以比对结果中首个保守氨基酸开始并以所研究序列的比对结果中的最末保守氨基酸终结。给定X的数字表示保守氨基酸残基之间的距离，例如Y-x(21，23)-F意指保守酪氨酸和苯丙氨酸残基在所研究的序列中彼此由最少21个氨基酸残基和最多23氨基酸残基隔开。从全部序列中鉴定到并且使用标准Prosite概念子集描述保守结构域，例如模式Y-x(21，23)-[FW]意指一个保守酪氨酸由最少21个氨基酸残基和最多23氨基酸残基与苯丙氨酸或色氨酸隔开。模式应当匹配至少80％的所研究蛋白质。保守模式用软件MEME版本3.5.1或手工鉴定。MEME由美国加利福尼亚州圣迭哥市加利福尼亚大学计算机科学与工程系的Timothy L.Bailey和Charles Elkan开发并且由Timothy L.Bailey和Charles Elkan描述[通过预期最大化拟合混合模型以发现生物聚合物的中基序(Fitting amixture model by expectation maximization to discover motifs inbiopolymers)，第二届国际分子生物学人工智能系统大会论文集(Proceedings of the Second International Conference on IntelligentSystems for Molecular Biology)，第28-36页，AAAI Press，Menlo Park，California，1994]。独立程序的源代码是公众从圣迭哥超级计算中心可获得的(http://meme.sdsc.edu)。为用软件MEME鉴定全部序列中的共同基序，使用以下设置：-最大尺度500000，-基序数目15，-evt 0.001，-maxw 60，-距离1e-3，-用于分析的序列的最少位点数目。MEME的输入序列是Fasta格式下未比对的序列。其他参数以该软件版本的默认设置使用。用软件Pratt版本2.1或手工产生保守结构域的Prosite模式。Pratt由挪威卑尔根大学信息学系Inge Jonassen开发并且由Jonassen等人描述[I.Jonassen，J.F.Collins和D.G.Higgins，发现未比对蛋白质序列中的柔性模式(Finding flexible patterns in unaligned protein sequences)，ProteinScience 4(1995)，第1587-1595页；I.Jonassen，使用模式图形高效发现保守模式(Efficient discovery of conserved patterns using a pattern graph)，1997年2月提交至CABIOS]。独立程序的源代码(ANSI C)是公众例如在已建立的生物信息学中心如EBI(欧洲生物信息学研究所)可获得的。为用软件工具Pratt产生模式，使用以下设置：PL(最大模式长度)：100，PN(模式符号的最大数目)：100，PN(连续x′s的最大数目)：30，PN(柔性间隔区的最大数目)：5，FL(最大柔性)：30，FP(最大Flex.产物)：10，ON(模式的最大数目)：50.Pratt的输入序列是蛋白质序列的独特区域，其展示与软件MEME所鉴定的高度相似性。应当与所产生模式匹配的序列的最小数目(CM，匹配序列的最小数目)设置成所提供序列的至少80％。这里未提及的参数以其默认设置使用。保守结构域的Prosite模式可以用来搜索匹配该模式的蛋白质序列。多个已建立的生物信息学中心提供了用于数据搜索中使用这些模式的公众互联网接口(例如PIR[位于乔治城大学医学中心的蛋白质信息资源(Protein Information Resource)]或ExPASy[蛋白质分析专家系统(ExpertProtein Analysis System)])。备选地，可获得独立软件，如作为EMBOSS软件包组成部分的程序Fuzzpro。例如，程序Fuzzpro不仅允许搜索精确模式蛋白质匹配，还允许在执行的搜索中设置各种模糊性。比对用软件ClustalW(1.83版本)执行并且由Thompson等人[Thompson，J.D.，Higgins，D.G.和Gibson，T.J.(1994)CLUSTAL W：借助序列加权、位置特异性空位罚分和加权矩阵选择作用改善累进多重序列比对的灵敏度.Nucleic Acids Research，22：4673-4680]描述。独立程序的源代码是公众从德国海德堡欧洲分子生物学实验室可获得的。使用ClustalWv1.83的默认参数(空位开口罚分：10.0；空位延伸罚分：0.2；蛋白质矩阵：Gonnet；蛋白质/DNA末端空位：-1；蛋白质/DNA空位距离：4)执行分析。
如上文所述设计的简并引物随后可以由PCR使用以扩增编码蛋白质的新编码区的片段，其中所述的蛋白质具有上文提及的活性，例如在降低、阻抑、减少或缺失相应核酸序列和由该序列编码的蛋白质(例如具有下述蛋白质或其他功能等同物或来自其他生物的同源物的活性，其中所述蛋白质由本发明方法中待降低或缺失其活性的核酸编码)的表达或活性后，引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产提高。
这些片段随后可以作为杂交探针用于分离完整基因序列。作为备选，失去的5’和3’序列可以借助RACE-PCR分离。可以使用cDNA或作为备选，使用基因组DNA作为模板，并使用合适的寡核苷酸引物，按照标准PCR扩增技术扩增本发明的核酸分子。如此扩增的核酸分子可以克隆至合适的载体并借助DNA序列分析进行表征。与本方法中所用核酸分子之一相应的寡核苷酸可以通过标准合成方法产生，例如使用自动DNA合成仪产生。
有利于本发明方法的核酸分子可以基于它们与本文中所公开核酸分子的同源性，使用所述序列或其部分作为杂交探针并按照标准杂交技术在严格杂交条件下予以分离。
在本上下文中，可以使用例如，长度至少15、20、25、30、35、40、50、60或更多个核苷酸、优选至少15、20或25个核苷酸的在严格条件下与上述核酸分子杂交、尤其与如表I第5列或第7列中所述核苷酸序列的那些核酸分子杂交的分离核酸分子。也可以使用具有30、50、100、250或更多个核苷酸的核酸分子。
术语“同源性”意指相应核酸分子或所编码的蛋白质是功能上和/或结构上同等的。与上文所述核酸分子同源并且是所述核酸分子的衍生物的核酸分子例如是所述核酸分子的变体，该变体代表具有相同生物学功能的，尤其代表编码具有相同或基本上相同生物学功能的蛋白质的变体。它们可以是天然存在的变体(如来自其他植物品种或物种的序列)或突变体。这些突变体可以天然地存在或可以通过诱变技术获得。等位变体可以是天然存在的等位变体以及人工产生或基因改造的变体。结构性等同物可以例如通过检验所述多肽对抗体的结合作用或基于计算机的预测进行鉴定。结构性等同物具有相似的免疫学特征，例如包含相似表位。
就“杂交”而言，它意指此类核酸分子在常规杂交条件下、优选在例如由Sambrook(Molecular Cloning；A Laboratory Manual，2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989))或在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述的严格条件下杂交。
根据本发明，本发明核酸的DNA分子以及RNA分子可以作为探针使用。另外，作为用于鉴定功能性同源物的模板，可以进行RNA印迹分析以及DNA印迹分析。RNA印迹分析有利地提供关于已表达基因产物的其他信息：例如表达模式、加工步骤(如剪接和加帽等)的发生。DNA印迹分析提供关于编码本发明核酸分子的基因的染色体定位和组织的额外信息。
严格DNA印迹杂交条件的优选的非限制性实例是在大约45℃于6×氯化钠/柠檬酸钠(＝SSC)中杂交，随后在50至65℃例如在50℃、55℃或60℃于0.2×SSC、0.1％SDS中的一个或多个洗涤步骤。技术人员知道这些杂交条件作为核酸类型的函数，并且在例如有机溶剂存在时在温度和缓冲液浓度方面不同。在“标准杂交条件”下的温度例如作为核酸类型的函数在42℃和58℃间、优选在45℃和50℃间，在浓度0.1×、0.5×、1×、2×、3×、4×或5×SSC(pH7.2)的缓冲水溶液中不同。如果有机溶剂在上文提及的缓冲液中存在，例如50％甲酰胺，则标准条件下的温度是大约40℃、42℃或45℃。DNA:DNA杂交体的杂交条件优选地是例如0.1×SSC和20℃、25℃、30℃、35℃、40℃或45℃，优选在30℃和45℃间。DNA:RNA杂交体的杂交条件优选地是例如0.1×SSC和30℃、35℃、40℃、45℃、50℃或55℃，优选在45℃和55℃之间。以上提及的杂交温度是例如对长度大约100bp(碱基对)及G+C含量50％的核酸在甲酰胺不存在下所确定的。借助教材例如以上所提及的那些教材或下列教材：Sambrook，“MolecularCloning”，Cold Spring Harbor Laboratory，1989；Hames和Higgins(编辑)1985，“Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach”，IRL Pressat Oxford University Press，Oxford；Brown(编辑)1991，“EssentialMolecular Biology：A Practical Approach”，IRL Press at OxfordUniversity Press，Oxford或“Current Protocols in Molecular Biology”，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，熟练技术人员知道确定所需的杂交条件。
这样一个严格杂交条件的又一实例是在65℃，4×SSC杂交，随后在65℃于0.1×SSC中洗涤1小时。备选地，示例性严格杂交条件是在42℃于50％甲酰胺、4×SSC中。另外，洗涤步骤期间的条件可以选自不受低严格条件(在50℃大约2×SSC)和高严格条件(在50℃、优选在65℃大约0.2×SSC)限制(20×SSC：0.3M柠檬酸钠，3M NaCl，pH7.0)的条件范围。另外，洗涤步骤期间的温度可以从室温(约22℃)的低严格条件升高至约65℃的较高严格条件。
盐浓度和温度这两个参数可以同时变化，或这两个参数之一可以保持恒定而另一个参数变化。变性剂，例如甲酰胺或SDS，也可以在杂交期间使用。在50％甲酰胺存在下，杂交优选地在42℃进行。可以逐个组合相关因素如i)处理的长度、ii)盐条件、iii)去污剂条件、iv)竞争性DNA、v)温度和vi)探针选择，因此本文不可能提到全部的可能组合。
下文显示用于DNA杂交(DNA印迹分析)和洗涤步骤的条件的一些实例：(1)杂交条件可以选自例如以下条件：a)4×SSC在65℃，b)6×SSC在45℃，c)6×SSC，100mg/ml变性片段化鱼精DNA，在68℃，d)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性鲑精DNA，在68℃，e)6×SSC，0.5％SDS，100mg/ml变性片段化鲑精DNA，50％甲酰胺，在42℃，f)50％甲酰胺，4×SSC，在42℃，g)50％(vol/vol)甲酰胺，0.1％牛血清白蛋白，0.1％Ficoll，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，750mM NaCl，75mM柠檬酸钠，在42℃，h)2×或4×SSC，在50℃(低严格条件)，或i)30-40％甲酰胺，2×或4×SSC，在42℃(低严格条件)。(2)洗涤步骤件可以选自例如以下条件：a)0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％SDS，在50℃。b)0.1×SSC，在65℃。c)0.1×SSC，0.5％SDS，在68℃。d)0.1×SSC，0.5％SDS，50％甲酰胺，在42℃。e)0.2×SSC，0.1％SDS，在42℃。f)2×SSC，在65℃(低严格条件)。g)0.2×SSC，0.1％SDS，在60℃(中等-高严格条件)，或h)0.1×SSC，0.1％SDS，在60℃(中等-高严格条件)，或i)0.2×SSC，0.1％SDS，在65℃(高严格条件)，或j)0.1×SSC，0.1％SDS，在65℃(高严格条件)。
从其他生物衍生的具有上文所提及活性、例如引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的多肽或核酸分子可以由其他DNA分子编码，其中所述其他DNA分子在不严格的杂交条件下与如表I第5列或第7列中所示分子或包含该分子的分子杂交并且在表达时编码需要降低或缺失其活性以引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产提高的肽或核酸。优选地，所述多肽或多核苷酸还具有包含分别如表I、II或IV的第5列或第7列中所示分子的蛋白质或核酸分子的生物学活性。不严格的杂交条件可以例如用在DNA印迹实验中。
一些应用必须在低严格杂交条件下进行，同时对杂交的特异性无任何影响。例如，总DNA的DNA印迹分析可以用本发明的核酸分子探测并在低严格条件(55℃在2×SSPE、0.1％SDS中)洗涤。该杂交分析能揭示仅编码(例如具有本文中所提及活性的)本发明多肽的基因的简单模式。此类低严格杂交条件的又一实例是4×SSC在50℃或伴有30-40％甲酰胺在42℃杂交。此类分子包括这样的分子，它们是本发明方法中待减少的或编码在本发明方法中待减少多肽的核酸分子的片段、类似物或衍生物并且例如因单独或组合的氨基酸和/或核苷酸缺失、插入、置换、添加和/或重组或本领域已知的任何其它修饰与上述氨基酸序列或所述(作为基础的)核苷酸序列不同。但是，优选使用高严格杂交条件。
杂交应当有利地用至少5、10、15、20、25、30、35或40bp、有利地至少50、60、70或80bp、优选至少90、100或110bp的片段进行。最优选地是至少15、20、25或30bp的片段。也优选地用长度至少100或200bp、非常特别优选至少400bp的片段进行杂交。在一个特别优选的实施方案中，该杂交应当用完整核酸序列以如上所述条件进行。
术语“片段”、“序列的片段”或“序列的部分”意指所指初始序列的截短序列。截短序列(核酸或蛋白质序列)可以在长度方面大幅度地变化；最小大小是这样的序列大小，其足以提供长度至少15、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30bp的序列或序列片段，所述的序列或序列片段与本发明方法中使用的本文所述核酸分子的片段(例如在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的片段)具有至少90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％同一性、优选100％同一性。如所述，所述截短序列可以在从15bp至2kb或更长的长度方面大幅度地变化，所述序列有利地具有15、20、25、30、35或40bp的最小长度，而最大大小并非重要。可以使用100、200、300、400、500或更长碱基对的片段。在一些应用中，最大大小通常基本上不大于产生核酸序列的完整基因功能所需要的大小。此类序列可以有利地通过例如反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶等技术用于阻抑、降低、减少或缺失在本发明的方法中待降低的活性。为了降低、减少或缺失包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子和/或包含如表II第5列或第7列中所示多肽或如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽的活性，也可以使用所公开核酸序列的启动子区。熟练技术人员知道如何克隆所述启动子区。
一般地，截短的氨基酸分子具有从约5个至约310个氨基酸长度范围。但是，更一般地，该序列将具有约250个氨基酸的最大长度，优选约200或100个氨基酸的最大长度。通常希望的是选择至少约10、12或15个氨基酸、至最大约20或25个氨基酸的序列。
术语“一个或几个氨基酸”涉及至少一个氨基酸，但是不超过将会产生低于50％同一性的同源性的那个氨基酸数目。优选地，同一性大于70％或80％，更优选的是85％、90％、91％、92％、93％、94％或95％、甚至更优选的是96％、97％、98％或99％同一性。
另外，在本发明方法中使用的核酸分子包含作为上文所提及核酸分子的核苷酸序列之一的互补物或其部分的核酸分子。与如表I第5列或第7列中所述核苷酸序之一互补的核酸分子或包含所述序列的核酸分子是这样的核酸分子，其与所述的核苷酸序列充分互补，从而它可以与所述核苷酸序列杂交，因而形成稳定双链体。
优选地，杂交在严格杂交条件下进行。但是，根据技术人员熟知的核酸分子的碱基配对作用，本文中所公开序列之一的互补物优选地是与所公开序列互补的序列。例如，碱基A和G分别与碱基T和U或C进行碱基配对，反之亦然。碱基的修饰可能影响碱基配对的对应物。
在本发明方法中待降低其活性的核酸分子、尤其本发明核酸分子，包含这样的核苷酸序列，其与包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子或其部分的核苷酸序列至少约30％、35％、40％或45％、优选至少约50％、55％、60％或65％、更优选至少约70％、80％或90％并且甚至更优选至少约95％、97％、98％、99％或更多同源性和/或具有表II第5列的相同横行中所示蛋白质或编码该蛋白质的核酸分子的活性。
在本发明方法中待降低其活性的核酸分子例如本发明的核酸分子包含这样的核苷酸序列，其杂交至、优选地在本文中定义的严格条件下杂交至如表I第5列或第7列中所示核苷酸序列之一或其部分并且编码这样的蛋白质，该蛋白具有前述活性，例如降低或缺失其活性(并例如降低或缺失该蛋白质的活性)时引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
此外，在本发明方法中待降低其活性的核酸分子，尤其本发明核酸分子，可以仅包含如表I第5列或第7列中所述序列之一的编码区的一部分，例如可以用作探针或引物的片段或编码在本发明方法中待减少的核酸分子或多肽的生物活性部分的片段或这样的片段，该片段编码在本发明方法中降低其活性的核酸分子或多肽的非活性部分，不过在降低或缺失其活性时引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。由克隆编码在本发明方法中降低其活性的分子的基因而测定的核苷酸序列导致产生下述探针和引物，其中设计所述探针或引物用于鉴定和/或克隆其他细胞类型或生物中该基因的同源物。该探针/引物一般包含基本上纯化的寡核苷酸。寡核苷酸一般包含这样的核苷酸序列区，其在严格条件下与本发明方法中使用的所述序列之一的有义链的至少约12、15个、优选约20或25个、更优选约40、50或75个连续核苷酸杂交，例如所述序列包含如表I第5列或第7列中所述的分子、所述序列之一的反义序列或其天然存在突变体。基于本发明核苷酸的引物可以在PCR反应中使用以克隆根据本发明方法待降低其活性的核酸分子的同源物，例如作为本发明实例中描述的引物对，例如，如表III第7列中所述的引物，它们在其5’引发末端不以核苷酸ATA开始。作为在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的同源物或本发明核酸分子本身，所述核酸分子可以用来降低、减少或缺失根据本发明方法待降低的活性。
引物集合是可相互交换的。本领域技术人员知道组合所述的引物以(例如在全长克隆或部分序列中)产生想要的产物。基于本发明方法中所用核酸分子之序列的探针可以用来检测编码相同或同源蛋白质的转录物或基因组序列。该探针可以还包含与其结合的标记基团，例如此标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅因子。此类探针可以用作基因组标记检测试剂盒的一部分用于鉴定含有或表达或不含有或不表达在本发明方法中降低其活性的核酸分子的细胞，如通过测量胞样品中编码性核酸分子的水平(例如检测mRNA水平)或确定包含所述多核苷酸序列的基因组基因是否已经被突变或缺失进行鉴定。
在一个实施方案中，在本发明的方法中使用的核酸分子、优选本发明的多核苷酸，编码包括下述氨基酸序列的多肽或其部分，其中所述氨基酸序列与如表II第5列或第7列中所述的氨基酸序列充分同源或与包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽充分同源。
如本发明中所用，语言“充分同源”指与本发明方法中降低其活性的多肽的氨基酸序列相比，具有下述氨基酸序列的多肽或其部分，所述氨基酸序列包含最小数目的相同或等同氨基酸残基(例如具有与作为比较对象的氨基酸残基相似侧链的氨基酸残基)，特别地，该多肽与包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或例如与其功能等同物充分同源。前述氨基酸序列的部分具有至少3、5、10、20、30、40、50或更多个氨基酸长度。
在一个实施方案中，在本发明方法中使用的核酸分子包含这样的核酸分子或其同源物，该核酸分子编码在本发明方法中降低其活性的多肽(例如，如表IIA或B第5列或第7列中所述多肽)的至少一部分。
在又一个实施方案中，在本发明方法中降低其活性的多肽，尤其本发明多肽，与下述多肽的完整氨基酸序列至少约30％、35％、40％、45％或50％、优选至少约55％、60％、65％或70％和更优选至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％和最优选至少约95％、97％、98％、99％或更多同源，其中所述多肽为如表II第5列或第7列中所述多肽或为包含如表IV的第7列中所示的共有序列或多肽基序和具有上文提及的活性的多肽，其中所述活性为例如在已经降低、阻抑或缺失其活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
所述蛋白质的部分优选地以如下方式展示生物活性，从而它们因其活性降低、阻抑、降低或缺失而与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产。
如本文中提及，术语“生物活性部分”意图包括这样的部分，例如结构域/基序或表位，所述部分因将该部分或编码性多核苷酸导入生物或其部分、尤其导入细胞而显示出与其如表II或表IV的第5列或第7列中所述同源物相同的活性。在一个实施方案中，多肽的所述部分如果能够弥补如本文中所述的敲除突变，则所述部分具有作为如表II第5列或第7列中所述同源物的多肽的活性。
本发明也涉及这样的核酸分子，该核酸分子因遗传密码的简并性可以从如表II第5列或第7列中所述的多肽衍生或从包含如表IV的第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽衍生并且因而编码在本发明的方法中待减少的多肽，尤其通过降低、阻抑、减少或缺失其活性而引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的多肽。有利地，在本发明方法中降低其活性的核酸分子包含或具有编码蛋白质的核苷酸序列，其中所述蛋白质包含或具有如表II或表IV第5列或第7列中所述的氨基酸分子、共有序列或多肽基序，并且与如表IIA第5列或第7列中所述的氨基酸分子的序列不同，优选至少一个或多个氨基酸不同。
上文所述核酸分子，例如因遗传密码的简并性可以从所述多肽序列衍生的核酸分子，可以用于产生如本文中所述的在本发明的方法中使用的核酸分子，例如反义分子、tRNA、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶分子或病毒核酸分子或另一种抑制性或降低活性的分子，例如用于阻抑、减少或缺失在根据本文公开内容的本发明方法中使用的多肽或核酸分子的活性。
另外，本领域技术人员将知道引起氨基酸序列改变的DNA序列多态性可以存在于群体中。基因(例如例如编码本发明多肽或包含本发明核酸分子的基因)中的这种遗传多态性可以因天然变异而存在于群体中的个体之间。
如本发明中所用，术语“基因”和“重组基因”指包含编码多肽的可读框的核酸分子，其中所述多肽包含在本发明方法降低其活性的多肽，或指编码在本发明方法中降低其活性的多肽分子的核酸分子。例如，该基因包含可读框，所述可读框编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽(如本发明的多肽)或编码包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子(如本发明的核酸分子)并且优选地从作物植物衍生。该基因也可以是所述基因的天然变异。此类天然变异一般可以在本发明方法中使用的基因的核苷酸序列中产生1-5％差异。
与包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子(如本发明的核酸分子)的天然变体同源物相对应并且也可以是cDNA的核酸分子可以基于它们与本文中所公开核酸分子的同源性，使用如表I第5列或第7列中所述核酸分子(例如本发明的核酸分子)或其片段作为杂交探针，根据标准杂交技术在严格杂交条件下分离。
因而，在另一个实施方案中，在本发明方法中降低其活性的核酸分子(例如本发明的核酸分子)是至少15、20、25或30个核苷酸长度。优选地，该核酸分子在严格条件下与包含本发明核酸分子的核苷酸序列(例如包含如表I第5列或第7列中所述序列)的核酸分子杂交。该核酸分子优选地是至少20、30、50、100、250或更多个核苷酸长度。
术语“在严格条件下杂交”在上文定义。在一个实施方案中，术语“在严格条件下杂交”意图描述杂交和洗涤条件，在所述条件下彼此至少30％、40％、50％或65％同一的核苷酸序列一般仍保持相互杂交。优选地，所述条件是这样的条件，所述条件使得彼此至少约70％、更优选至少约75％或80％并且甚至更优选至少约85％、90％或95％或更多同一的序列一般仍保持相互杂交。
在一个实施方案中，本发明的核酸分子在严格条件下与表1B第7列的序列杂交并且与天然存在的核酸分子相对应。如本文中所用，“天然存在的”核酸分子指具有自然界中存在(例如编码天然蛋白质)的序列的RNA或DNA分子。优选地，该核酸分子编码在降低、减少或缺失其表达或活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的天然蛋白质。
除了群体中可能存在的核酸或蛋白质序列的天然存在变体之外，技术人员还将认识到可以通过在编码所述多肽的核酸分子的核苷酸序列中突变而导入改变，从而引起所编码多肽的氨基酸序列改变并且因而改变该多肽的功能性能力，优选地意指降低、减少或缺失所述活性。例如，在“必需”氨基酸残基处引起氨基酸置换的核苷酸置换可以在本发明方法中待减少(例如包含如表I第5列或第7列中所述相应核酸分子)的核酸分子的序列中产生。“必需”氨基酸残基是从多肽之一的野生型序列中改动时引起该多肽活性改变的残基，而“非必需”氨基酸残基对于该蛋白质的活性(例如作为酶的活性)不是必要的。“必需”残基的改动往往导致降低、减少或缺失所述多肽的活性。优选地，以如此方式改变该多肽的氨基酸，从而降低、减少或缺失所述活性，即优选地改变必需氨基酸残基和/或多个非必需残基并且因而降低所述活性，这如上提及在减少该多肽的表达或活性后引起植物中与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。但是，其他氨基酸残基(例如在具有所述活性的结构域中不保守或仅半保守的那些氨基酸残基)可能对活性并非必需并且因而可能是可改变的，而没有改变所述活性是较不优选的。本发明的又一实施方案涉及在核酸序列中专门搜索或选择在群体中(例如天然群体或人工产生的群体中)引起活性降低、阻抑或缺失的改变。在群体中搜索与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的过程往往是复杂而昂贵的，例如因复杂的分析流程所致。可以因而有利的是在核酸序列中搜索引起所述群体中表达产物的活性降低、阻抑或缺失的改变，因而鉴定与相应的非转化野生型植物环境相比引起想要的环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的候选改变。下调而引起所需性状的天然基因的典型例子是mlo基因座(Pifanelli等人，Nature 2004年8月19日；430(7002)：887-91。携带Mlo基因座的丧失功能的等位基因(mlo)的大麦植物抵抗广泛传播的白粉病真菌的全部已知分离株。迄今从天然栖息地再生的唯一mlo抗性等位基因mlo-11最初从埃塞尔比亚landraces取得并且如今控制大部分栽培欧洲春大麦原种品种中的白粉病抗性。因此，可以搜索引起核酸分子功能所需的降低、阻抑、缺失或减少的天然等位基因并且可以通过杂交和标记辅助选择法或相关方法将此类等位基因导入农艺重要的作物品种。
另外，本领域技术人员知道生物之间的密码子选择可以不同。因而，可以调整本发明核酸分子的密码子选择为其中表达所述多核苷酸或多肽的生物的密码子选择，从而该核酸分子或所编码蛋白质的表达更有可能降低。
因而，本发明涉及核酸分子的同源核酸分子，在被降低、减少、阻抑或缺失后，所述核酸分子在植物或其部分中编码具有上文所提及活性的多肽，所述多肽在对其活性是必需的氨基酸残基中含有改变并因而降低、减少、阻抑或缺失该多肽的活性。此类多肽在氨基酸序列上也与如表II中第5列或第7列所述或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列不同并且引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产提高。该核酸分子可以包含编码多肽的核苷酸序列，其中所述多肽包含与如表II中第5列或第7列所述或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的氨基酸序列至少约50％同一的氨基酸序列并且能够在降低其表达或其生物学功能后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。优选地，由该核酸分子编码的蛋白质与表II第5列或第7列中的序列或与包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列至少约60％、70％或80％同一、更优选与表II第5列或第7列中的序列之一或与包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列至少约85％同一、甚至更优选与表II第5列或第7列中的序列或与包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％同源并且最优选与表II第5列或第7列中的序列或与包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列至少约96％、97％、98％或99％同一。
为确定(例如表II第7列的)两个氨基酸序列或(例如表I第5列的)两个核酸分子的同源性(＝同一性)百分数，将所述序列中一条序列在另一条序列下书写用于优化比较。可以将空位插入蛋白质的序列或核酸分子的序列，旨在与另一种蛋白质或另一种核酸产生最佳比对结果。随后比较两个聚合物之间在氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当一个序列中的位置由与另一个序列的对应位置中的相同氨基酸残基或相同核苷酸占据时，则所述分子在这个位置上是相同的。如本上下文中所用的氨基酸或核苷酸“同一性”对应于氨基酸或核酸“同源性”。通常，这两个序列之间的同一性百分数是所述序列共有的相同位置的函数(即同一性百分数＝相同位置数/位置总数×100)。对本说明书而言，术语“同源性”和“同一性”因而视为同义词。
为确定两个或多个氨基酸序列或两个或多个核苷酸序列的同源性(＝同一性)百分数，已经开发了计算机软件程序。两个或更多序列的同源性可以用例如软件fasta计算，所述软件fasta现在已经以fasta 3版本使用(W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)，改良的生物信息学比较工具(Improved Tools for Biological Sequence Comparison).PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)采用FASTP和FASTA的迅速和敏感序列比较(Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP andFASTA)，Methods in Enzymology 183：63-98；W.R.Pearson和D.J.Lipman(1988)改良的生物信息学比较工具(Improved Tools for BiologicalSequence Comparison).PNAS 85：2444-2448；W.R.Pearson(1990)；采用FASTP和FASTA的迅速和敏感序列比较(Rapid and Sensitive SequenceComparison with FASTP and FASTA)，Methods in Enzymology 183：63-98)。用于计算不同序列的同源性的另一种有用程序是标准blast程序，其中该程序在Biomax pedant软件(联邦德国慕尼黑Biomax)中包括。这有时不幸地产生次优结果，因为blast不总是包含主题和查询对象的完整序列。但是，由于该程序很高效，因而它可以用于比较巨大数目的序列。以下设置一般用于这样的序列比较：-p程序名称[字符串]；-d数据库[字符串]；默认＝nr；-i查询文件[File In]；默认＝stdin；-e期望值(E)[Real]；默认＝10.0；-m比对显示选项：0＝配对；1＝查询-比上区域，显示同一性；2＝查询-比上区域，无同一性；3＝询-比上区域的屏文形式，显示同一性；4＝查询-比上区域的屏文形式，无同一性；5＝查询-比上区域，无同一性和突然结束；6＝查询-比上区域的屏文形，无同一性和突然结束；7＝XML Blast输出；8＝TAB格式输出；9带注释行的TAB格式输出[整数]；默认＝0；-o BLAST报告输出文件[File Out]任选；默认＝stdout；-F过滤软件查询序列(DUST用blastn，SEG用其他方法)[字符串]；默认＝T；-G空位开口成本(零激发默认行为)[整数]；默认＝0；-E开口延伸成本(零激发默认行为)[整数]；默认＝0；-X X空位比对的下降值(比特)(零激发默认行为)；blastn 30，megablast 20，tblastx 0，全部其他方法15[整数]；默认＝0；-I在定义行中显示GI′[T/F]；默认＝F；-q核苷酸错配罚分(仅blastn)[整数]；默认＝-3；-r核苷酸匹配回报(仅blastn)[整数]；默认＝1；-v显示对(V)的单-线描述的数据库序列数目[整数]；默认＝500；-b显示对(B)的比对的数据库序列数目[整数]；默认＝250；-f延伸命中的阈值，如果为零，则默认；blastp 11，blastn 0，blastx 12，tblastn 13；tblastx 13，megablast 0[整数]；默认＝0；-g执行空位比对(对tblastx不可用)[T/F]；默认＝T；-Q查询使用的遗传密码[整数]；默认＝1；-D DB遗传密码子(仅用于tblast[nx])[整数]；默认＝1；-a使用的处理器数目[整数]；默认＝1；-O SeqAlign文件[File Out]任选；-J相信查询定义行[T/F]；默认＝F；-M矩阵[字符串]；默认＝BLOSUM62；-W字大小，如果为零，则默认(blastn 11，megablast 28，全部其他方法3)[整数]；默认＝0；-z数据库的有效长度(对于真实大小，使用零)[Real]；默认＝0；-K来自保持区域的最佳命中数(默认关闭，如果使用，推荐值100)[整数]；默认＝0；-P 0用于多重命中；1用于单一命中[整数]；默认＝0；-Y搜索空间的有效长度(对真实大小，使用零)[Real]；默认＝0；-S针对数据库搜索的查询链(对于blast，[nx]和tblastx)；3用于两者，1是顶端，2是底部[整数]；默认＝3；-T产生HTML输出结果[T/F]；默认＝F；-l限制数据库搜索至GI′s列表[字符串]任选；-U使用FASTA序列的较低事件过滤作用[T/F]任选；默认＝F；-y无空位延伸的X下降值(比特)(0.0激发默认行为)；blastn 20，megablast 10，全部其他方法7[Real]；默认＝0.0；-Z最终空位比对的X下降值(比特)(0.0激发默认行为)；blastn/megablast 50，tblastx 0，全部其他方法25[整数]；默认＝0；-R PSI-TBLASTN检查点文件[File In]任选；-n MegaBlast搜索[T/F]；默认＝F；-L查询序列上的位置[字符串]任选；-A多重命中窗口大小，如果为零，则默认(blastn/megablast 0，全部其他方法40[整数]；默认＝0；-w移码罚分(OOF算法用于blastx)[整数]；默认＝0；-t允许tblastn中用于联系HSP的最大内含子的长度(0取消连接联系)[整数]；默认＝0。
通过使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法获得高质量的结果。因而，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351(1987)，Higgins等人，CABIOS 5，151(1989))或优选用二者均基于Needleman与Wunsch算法(J.Mol.Biol.48；443(1970))的程序“Gap”和“Needle”和基于Smith与Waterman算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))的“BestFit”进行。“Gap”和“BestFit”是软件包GCG(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等人，(Nucleic Acids Res.25，3389(1997))的组成部分，“Needle”是欧洲分子生物学开放软件包(EMBOSS)(Trends in Genetics 16(6)，276(2000))的组成部分。因而，确定序列同源性百分数的计算优选地用程序“Gap”或“Needle”在序列的全部范围内进行。为比较核酸序列，以下标准调整用于“Needle”：矩阵：EDNAFULL，空位罚分：10.0，延伸罚分：0.5。为比较核酸序列，以下标准调整用于“Gap”：空位权重：50，长度权重：3，平均匹配：10.000，平均错配：0.000。
例如，与SEQ ID NO：1025中所述序列在核酸水平具有80％同源性的序列理解为意指由上文Gap程序算法以上文参数设置与序列SEQ ID NO：1025比较时具有80％同源性的序列。
两个多肽之间的同源性理解为意指在每种情况下在整个序列长度范围内氨基酸序列的同一性，其中借助程序算法“Needle”，使用矩阵：EBLOSUM62，空位罚分：8.0，延伸罚分：2.0，通过比较来计算所述同一性。
例如，与序列SEQ ID NO：1026在蛋白质水平具有80％同源性的序列理解为意指由上文程序Needley以上文参数设置与序列SEQID NO：1026比较时具有80％同源性的序列。
通过置换、插入或缺失从如表II第5列或第7列中所述或包含如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的本发明多肽之一衍生的功能等同物与本发明如表II第5列或第7列中所述的多肽之一或与包含如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％、优选至少55％、60％、65％或70％、优选至少80％、特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％、非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且因基本上与表II第5列或第7列中所示多肽、优选与所述拟南芥多肽相同的特性而引人注目。
通过置换、插入或缺失从如表I第5列或第7列中所述的本发明核酸序列衍生的功能等同物与如表I第5列或第7列中所述的本发明核酸之一具有至少30％、35％、40％、45％或50％、优选至少55％、60％、65％或70％、优选至少80％、特别优选至少85％或90％、91％、92％、93％或94％、非常特别优选至少95％、97％、98％或99％同源性，并且编码与如表II第5列中所述多肽具有基本上相同特性的多肽。
功能等同物的“基本上相同特性”尤其理解为意指该功能等同物具有上文提及的活性，例如在生物(例如植物)或在植物组织、植物细胞或其部分中减少蛋白质的量、所述功能等同物的活性或功能时，引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高或生物量生产提高。
可以通过将一个或多个核苷酸置换、添加或缺失导入包含如表I第5列或第7列中所示核酸分子的核酸分子的核苷酸序列中产生编码与本文中所示蛋白质序列同源的核酸分子，从而将一个或多个氨基酸置换置换、添加或缺失导入所编码的蛋白质。可以通过标准技术如位点定向诱变和PCR介导诱变法，将突变导入序列，例如表I第5列或第7列中所示的序列。
优选地，在一个或多个预测的非必需或优选地必需氨基酸残基处进行非保守性氨基酸置换并且因而降低、减少或缺失相应蛋白质的活性。“保守性氨基酸残基置换”是其中氨基酸残基替换为具有相似侧链的氨基酸残基的氨基酸残基置换。具有相似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支的侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)，以及具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。
因而，在本发明方法或在本发明多肽中所用多肽中预测的必需氨基酸残基优选地以来自另一个家族的另一个氨基酸替换。备选地，在另一个实施方案中，可以沿编码在本发明方法中所用多肽的核酸分子或本发明多核苷的全部或部分编码序列随机导入突变，如通过饱和诱变导入，并且可以对所得突变体筛选本文描述的活性以鉴定丧失活性或具有降低的活性并引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的突变体。
在诱变表I第5列或第7列的序列之一后，可以重组地表达所编码蛋白质并且可以使用例如本文中描述的测定法测定该蛋白质的活性。
通过BlastP数据库搜索法以相应的多肽序列找到本文中所示用于本发明方法和在表I第5列中所示的核酸分子的基本上同源的多核苷酸。表I第5列中所示核酸分子的所发现同源序列的SEQ ID NO：在表I第7列的相应横行中显示。表II第5列中所示蛋白质分子的所发现同源序列的SEQ ID NO：在表II第7列的相应横行中显示。使用BlastP工具，将表I第5列中所述核酸分子的蛋白质序列用来搜索蛋白质数据库。根据其与查询蛋白质序列的相似性手工选择同源蛋白质序列。在大多数情况下在蛋白质数据库条目的标题部分中详细说明并且使用(如果存在的话)与所选蛋白质序列相应的核苷酸序列。如果蛋白质数据库不提供相应核苷酸数据库条目的直接交互参照，则使用序列搜索程序TBlastN来鉴定编码完全相同蛋白质(100％同一性)的源自相同生物的核苷酸数据库条目。在TBlastN中期望值设置成0.001并且使用blosum62矩阵；全部其他参数以默认设置使用。另外，对表II第5列和第7列中所述蛋白质序列定义的蛋白质模式用来搜索蛋白质数据库。展示表IV第7列中所述全部蛋白质模式的蛋白质序列与表II第5列和7的各自相应横行中所述的蛋白质序列进行比对并且如果观察到明显相似性，则被选为同源蛋白质。
具有如表I第5列或第7列中所述序列或从其中衍生的所用核酸序列的同源物或从如表II第5列或第7列中所示序列或包含如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的序列衍生的核酸序列的同源物也包括与所示核苷酸序列或前述提及的衍生核酸序列或它们的同源物、衍生物或类似物或其部分之一具有至少大约30％、35％、40％或45％同源性、优选至少大约50％、60％或70％、更优选至少大约90％、91％、92％、93％、94％或95％并且甚至更优选至少大约96％、97％、98％、99％或更多同源性的等位变体。等位变体尤其包括可以从所示或本发明方法中所用序列、优选如表I第5列或第7列中所示或来自衍生的核酸序列的序列通过缺失、插入或置换核苷酸获得的功能性变体。但是，在一个实施方案中，酶活性或合成所得蛋白质的活性有利地丧失或降低，例如通过突变如本文中所述的序列或通过应用降低或抑制或使如本文中所述生物学活性丧失的方法。
在本发明的一个实施方案中，在本发明方法中使用的核酸分子或本发明的核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的序列或其互补序列。可以优选与如表I第5列或第7列中所述序列或其互补序列相比，如表I第5列或第7列中所述核酸分子的同源物包含尽可能少的其他核苷酸。在一个实施方案中，该核酸分子包含少于500、400、300、200、100、90、80、70、60、50或40个另外或其他核苷酸。在又一个实施方案中，该核酸分子包含少于30、20或10个另外或其他核苷酸。在一个实施方案中，本发明方法中使用的核酸分子与如表I第5列或第7列中所述的序列或其互补序列相同。
还优选的时在本发明方法中使用的核酸分子编码包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述序列、共有序列或多肽基序的多肽。在一个实施方案中，该核酸分子编码少于150、130、100、80、60、50、40或30个另外或其他氨基酸。在又一个实施方案中，所编码的多肽包含少于20、15、10、9、8、7、6或5个另外或其他氨基酸。在本发明方法中使用的一个实施方案中，编码的多肽与如表II第5列或第7列中所示的序列相同。
在一个实施方案中，在本发明方法中使用的编码包含如表II或表IV内第5列或第7列中所述序列、共有序列或多肽基序的多肽的核酸分子包含不同于表I第5列或第7列中所述序列的少于100个另外或其他核苷酸。在又一个实施方案中，该核酸分子包含不同于表I第5列或第7列中所述序列的少于30个另外或其他核苷酸。在一个实施方案中，该核酸分子与如表I第5列或第7列中所述序列的编码序列相同。
如表I第5列或第7列中所述序列的同源物或来自如表II第5列或第7列中所述序列或来自包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列的衍生序列的同源物也意指编码性和非编码性DNA序列的截短序列、cDNA、单链DNA或RNA。如表I第5列或第7列中所述序列或如表II第5列或第7列中所述或来自包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的序列的衍生序列的同源物也理解为意指包含非编码区例如UTR、终止子、增强子或启动子变体的衍生物。
在所述核苷酸序列上游或下游的调节序列可以通过一个或多个核苷酸置换、插入和/或缺失进行修饰，然而优选地干扰启动子、可读框(＝ORF)的功能性或活性或干扰3’调节区如终止子或远离该ORF存在的其他3’调节区。还可能通过修饰启动子的序列或其调节作用来降低启动子的活性或它们由活性更低的启动子完全替换，并且因而降低或缺失表达的核酸序列的活性，甚至可以使用来自异源生物的启动子。适宜启动子是本领域技术人员已知的并且在本文以下提及。修饰调节序列可能在这些情况下是尤其有利的，其中彻底消除本发明核酸的表达具有不利的副作用，如生长或产量降低。本领域技术人员能够以如此方式修饰本发明核酸的调节序列，从而所述降低足以引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，而不引起不想要的副作用。在这种情况下，可能更有利的是以如此方式修饰调节序列，从而表达的降低以空间或时间方式发生。例如，可能有用的是仅在植物的成熟状态下抑制、下调或阻抑本发明的核酸或多肽，以实现与相应的非转化野生型植物相比较而言希望的环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，同时不干扰该生物的生长或成熟。存在其他方法来调节本发明基因的启动子，例如通过修饰与该启动子结合并影响其活性的反式作用因子(即天然或人造转录因子)的活性。另外，还可能通过修饰参与目的启动子调节的上游信号组分如受体或激酶而影响目的启动子。
在又一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤；a)选择生物或其部分，其中所述生物或其部分表达在本发明方法中降低其活性的多肽或核酸分子，例如，包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽或包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的核酸分子；b)诱变所选择的生物或其部分；c)将诱变生物或其部分中所述多肽或核酸分子的活性或表达水平与所选择的生物或其部分中所述多肽的活性或表达比较；d)选择与所选择的生物或其部分相比，包含所述多肽的降低活性或表达水平的诱变生物或其部分；e)任选地，培育和栽培所述生物或其部分；和f)与相应的非转化野生型植物如未诱变的源株或原始株相比较，测试所述生物或其部分是否具有提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
有利地，根据本发明诱变选择的生物。根据本发明的诱变是生物的基因组中遗传信息的任何变化，这意指生物的核酸优选DNA不因正常分离或遗传重组过程基因引起的任何结构或组成变化。此类突变可以自发出现，或可以通过如下文所述的致变物诱导。可以随机或选择性地诱导此类变化。在这两种情况下，修饰了生物的遗传信息。通常，这引起以下情况，即降低或阻抑在细胞内部或生物内部相关基因的基因产物的活性。
在特异性或所谓位点定向诱变情况下，将特定基因突变并且因而阻抑、降低、减少或缺失其活性和/或编码的基因产物的活性。在随机诱变情况下，随机地突变一个或多个基因并且阻抑、降低、减少或缺失、优选降低或缺失它们的活性和/或其基因产物的活性。但是，可以通过本领域技术人员已知的多种方法选择在目的基因中的突变。
为了诱变生物的庞大群体，该群体可以使用用于抑制尽可能多的生物基因、优选抑制全部基因的DNA群体或DNA库或构建体或元件转化。采用这种方法，可能通过整合有利鉴定的DNA片段而统计地诱变生物的几乎全部基因。毕竟，熟练技术人员可以容易地鉴定敲除事件。对于诱变植物，优选EMS、T-DNA和/或转座子诱变法。
在随机诱变的情况下，用致变剂处理庞大数目的生物。以如此方式选择所述致变剂的量和处理强度，从而统计地突变了几乎每个基因。用于随机诱变的方法和相应致变剂是技术人员熟知的。此类方法例如由A.M.van Harten[(1998)，“Mutation breeding：theory and practicalapplications”，Cambridge University Press，Cambridge，UK]，E Friedberg，GWalker，W Siede[(1995)，“DNA Repair and Mutagenesis”，BlackwellPublishing]或K.Sankaranarayanan，J.M.Gentile，L.R.Ferguson[(2000)“Protocols in Mutagenesis”，Elsevier Health Sciences]公开。如熟练技术人员知道生物细胞中的自发突变率极低并且庞大数目的化学、物理或生物物质可用于诱变生物。这些物质称作致变物或致变剂。如前提及，三种不同类型的致变物即化学、物理或生物物质是可用的。
存在不同类别的化学致变物，它们可以按照其作用模式划分。例如，碱基类似物如5-溴-尿嘧啶，2-氨基嘌呤。其他化学致变物与DNA相互作用如硫酸、亚硝酸、羟胺；或其他烷基化剂如单功能剂如甲磺酸乙酯(＝EMS)、硫酸二甲酯、甲磺酸甲酯、双功能剂如二氯乙硫醚、丝裂霉素、亚硝基胍-二烷基亚硝胺、N-亚硝基胍衍生物、N-烷基-N-硝基-N-亚硝基胍、嵌入型染料如吖啶、溴化乙啶。
物理致变物例如是电离辐射(X射线)、UV辐射。不同形式的辐射是可用的并且它们是强烈致变物。可以分成两种主要类型的辐射：a)非电离辐射如紫外线或电离辐射如X射线。生物致变物例如是转座元件例如IS元件如IS100，转座子如Tn5、Tn10、Tn903、Tn916或Tn1000或噬菌体如Muamplac、P1、T5、λplac等。用于将这种噬菌体DNA导入适宜微生物的方法是熟练技术人员熟知的(见，Microbiology，3版，Eds.Davis，B.D.，Dulbecco，R.，Eisen，H.N.和Ginsberg，H.S.，Harper InternationalEdition，1980)。转座子诱变的常用方法是将转座元件插在基因内部或附近例如插在启动子或终止子区域内并且因而导致基因功能丧失。确定转座子在生物基因组内部位置的方法是本领域技术人员熟知的。对于植物中的转座子诱变，玉米转座子系统即激活物-解离(Ac/Ds)和增强子-抑制物突变体(En/Spm)是本领域技术人员已知的，不过其他转座子系统可能类似地有用。可以通过可用于植物转化的不同标准技术使转座子进入植物基因组。在植物中生物诱变的另一种类型包括T-DNA诱变，即随机整合T-DNA序列至植物基因组[Feldmann，K.A.(1991)拟南芥中的T-DNA插入诱变：诱变谱(T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis：Mutationalspectrum).Plant J.1，71-82]。随后可以通过PCR技术或其他高通量技术检索其中目的基因被突变的事件[Krysan等人，(1999)拟南芥中作为插入性致变物的T_DNA(T_DNA as an insertional mutagen in Arabidopsis)，PlantCell，11，2283-2290]。
生物学方法由Spee等人公开(Nucleic Acids Research，第21卷，第3期，1993：777-778)。Spee等人教授了使用dITP的PCR方法用于随机诱变。由Spee等人描述的这种方法由Rellos等人进一步改进(Protein Expr.Purif.，5，1994：270-277)。体外重组技术用于分子诱变的用途由Stemmer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，第91卷，1994：10747-10751)描述。Moore等人(Nature Biotechnology第14卷，1996：458-467)描述了用于提高针对对硝基苄酯的酯酶酶活性的PCR和重组方法的组合。酶诱变的另一种途径由Greener等人在Methods in Molecular Biology(第57卷，1996：375-385)中描述。Greener等人使用特定大肠杆菌菌株XL1-Red以产生具有提高的抗生素抗性的大肠杆菌突变体。
优选地，将化学方法或生物化学方法用于生物的诱变。优选的化学方法是用N-甲基-N-硝基-亚硝基胍诱变。
其他方法是例如借助病毒或噬菌体如P1、P22、T2、T3、T5、T7、Muamplac、Mu、Mu1、MuX、miniMu、λ、λplac或插入性元件如IS3、IS 100、IS900等导入突变。再次随机诱变细菌的完整基因组。可以容易地鉴定突变体。
可以通过同源重组以轻微改变的本发明核酸序列实现破坏在本发明方法中使用的核酸序列并因而降低、减少或缺失所编码多肽的活性的另一种方法，其中所述轻微改变的核酸序列在本文中描述为用于本发明的方法，例如从表I第5列或第7列中所示的序列衍生。例如，在本发明方法中使用的核酸序列因而可以通过一个或多个点突变、缺失、插入或倒位进行改变。在本发明的另一个实施方案中，可以(例如通过缺失、截短、倒位、插入或点突变)改变编码本发明蛋白质的基因的一个或多个调节区(例如启动子、阻抑物、UTR、增强子或诱导物)，从而调节即降低、减少或缺失相应基因的表达。
因而，在一个实施方案中，本发明涉及分离的核酸分子，其编码本发明的反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子、显性失活突变体或本发明的抗体或者本发明用于重组的核酸分子、尤其用于同源重组的核酸分子，所述分离的核酸分子至少包含下述核酸分子的15、16、17、18、19、20、21、25、30、35、40、50、70、100、200、300、500、1000、2000或更多个核苷酸的片段，所述核酸分子选自由以下核酸分子组成的组：a)编码如表II、优选表IIB的第5列或第7列中所述多肽和/或包含如表IV第7列中所示共有序列或多肽基序的多肽的核酸分子；b)如表I、优选表IB的第5列或第7列中所述的核酸分子；c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从如表II、优选表IIB的第5列或第7列中所述的多肽序列衍生；d)核酸分子，其与包含如表I、优选表IB的第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性；e)编码多肽的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；f)编码多肽的核酸分子，所述多肽可以借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体分离，并且具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；g)编码包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的核酸分子；h)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有如表II第5列中所述蛋白质代表的活性；i)核酸分子，其包含通过使用如表III第7列中所述的在5’引发端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸；j)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加由核酸分子(a)至(d)编码的多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生；和k)核酸分子，通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库可获得，其具有与在(a)至(d)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含如表II第5列中所示蛋白质代表的活性；或其包含与之互补的序列；或其包含与之互补的序列；从而所述反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶核酸分子与如表IA第5列或第7列中所述的序列至少在1、5、10、20、50、100个或更多个核苷酸方面不同。
在一个优选的实施方案中，如本文中使用的术语“在本发明方法中使用的核酸分子”涉及其表达引起降低、阻抑或缺失下述活性的核酸分子，其中所述活性选自1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组。
在一个更优选的实施方案中，如本文中使用的术语“在本发明方法中使用的核酸分子”涉及其表达引起降低、阻抑或缺失下述活性的核酸分子，其中所述活性由包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的核酸分子代表或由包含如表II或表IV的第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的多肽代表。
在一个甚至更优选的实施方案中，如本文中使用的术语“在本发明方法中使用的核酸分子”涉及本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或者本发明抗体或者本发明用于重组的核酸分子、尤其用于产生同源重组事件的核酸分子。
在所述方法中使用的核酸序列有利地被导入引起所述核酸分子在生物、有利地在植物或微生物中减少、阻抑等的核酸构建体，优选表达盒中。
因而，本发明也涉及核酸构建体，优选地涉及表达构建体，其包含功能性地与一个或多个调节元件或信号连接的在本发明方法中使用的核酸分子或其片段。另外，本发明也涉及用于产生同源重组事件的核酸构建体，其包含在本发明方法中使用的核酸分子或其片段。
如本文中所述的，该核酸构建体也可以包含待导入生物或细胞的其他基因。还可能并且有利的是导入并在宿主生物中表达调节基因如诱导物、阻抑物或酶的基因，其中所述基因因其酶活性而参与调节生物合成途径的一个或多个基因。这些基因可以是异源的或同源的。此外，其他生物基因可以有利地存在或这些基因也可以位于一个或多个其他核酸构建体上。
如本文中所述，调节物序列或因子可以优选地正向影响所导入构建体的表达，因而提高其表达。因而，调节物元件的增强作用可以因使用强转录信号如启动子和/或增强子而有利在转录水平上发生。然而另外，也可能增强翻译，例如通过增加RNA稳定性。另外一方面，降低、减少或缺失根据本发明方法待减少的本文所述核酸分子和基因产物以与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产。
原则上，该核酸构建体可以包含对于降低根据本发明方法待减少的核酸分子表达和另一方面对于表达该构建体中额外基因重要的本文所述调节物序列和其他序列。因而，本发明的核酸构建体可以用作表达盒并且因而可以直接用于导入植物，或它们可以被导入载体。因此在一个实施方案中，核酸构建体是包含微生物启动子或微生物终止子或这二者的表达盒。在另一个实施方案中，该表达盒包含植物启动子或植物终止子或这二者。
因此在一个实施方案中，本发明的方法包括以下步骤：在细胞或生物或其部分、优选在植物或植物细胞中a)导入包含在本发明方法中使用的核酸分子的核酸构建体，例如所述核酸分子编码本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或本发明的编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子、显性失活突变体或本发明的抗体，或者其适用于重组、尤其同源重组；或者b)导入包括调节序列或因子的核酸分子，其表达提高(a)的表达，和c)通过在(a)或(b)下提及的核酸构建体或核酸分子，阻抑、降低或缺失细胞或生物中在本发明方法中待降低的活性。
在导入和表达核酸构建体后，有利地培育并随后收获转基因生物或细胞。转基因生物或细胞可以是真核生物如植物、植物细胞、植物组织，优选作物植物，或其部分。
为了导入用于降低或阻抑包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子或其同源物的多核苷酸或基因或者所述多核苷酸的基因产物的核酸分子至核酸构建体(该核酸构建体例如作为引起相应基因活性和/或表达降低的表达盒的部分)，其中所述核酸分子例如编码本发明的反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子、显性失活突变体或者本发明抗体或者适用于重组、尤其同源重组的核酸分子或者诱变的核酸序列，编码性基因区段或非翻译区有利地以技术人员已知的方式进行扩增和连接反应。优选按照与用于Pfu DNA聚合酶或Pfu/Taq DNA聚合酶混合物的方案相似的方法。根据待扩增的序列选择引物。本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体或核酶分子或者本发明的共抑制构建体或病毒的降解构建体或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的构建体、显性失活突变体的构建体或本发明抗体的具体克隆过程或者适用于重组、尤其同源重组的构建体的具体克隆过程是本领域技术人员已知的。合适的克隆载体通常是熟练技术人员已知的[CloningVectors(编者Pouwels P.H.等人Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)]并且已经发表，例如Earley等人，Plant J.2006年2月；45(4)：616-629；Lu等人，Nucleic Acids Res.2004年12月2日；32(21)：e171；Tao和Xhou，Plant J.2004年6月；38(5)：850-860；Miki和Shimamoto Plant Cell.2004年4月；45(4)：490-495；Akashi等人，Methods Mol Biol.2004；252：533-43；Wesley等人，Plant J.2001年9月；27(6)：581-590。
它们尤其包括能够轻易复制以操控克隆系统(如基于细菌、酵母或昆虫细胞(例如杆状病毒表达)的系统)的载体，也就是说，尤其包括确保在大肠杆菌中高效克隆并可能稳定转化植物的载体。必须提及的载体尤其是适用于T-DNA介导转化的多种双元载体系统和共整合载体系统。此类载体系统通常以它们至少含有T-DNA介导转化所需要的vir基因和T-DNA边界序列为特征。
通常，载体系统优选地也包含其他顺式调节区如启动子和终止子和/或选择标记，其中借助所述选择标记可以鉴定适宜转化的生物。在共整合载体系统的情况下vir基因和T-DNA序列位于相同载体上，而双元系统基于至少两个载体，其中之一携带vir基因，但无T-DNA，而第二个载体携带T-DNA，但无vir基因。鉴于这样的事实，后提及的载体相对较小，容易操作并能够在大肠杆菌和在农杆菌中复制。这些双元载体包括来自pBIB-HYG、pPZP、pBecks、pGreen系列的载体。根据本发明优选使用的那些双元载体是Bin19、pBI101、pBinAR、pSun、pGPTV和pCAMBIA。对双元载体及其用途的综述由Hellens等人Trends in PlantScience(2000)5，446-451给出。
对于构建体制备，可以首先使用限制性核酸内切酶线性化并随后以合适方式酶学地修饰载体。此后，纯化载体，并且将等分样用于克隆步骤中。在克隆步骤中，使用连接酶，将酶切且根据需要纯化的扩增物与类似制备的载体片段克隆在一起。或者，构建体可以用本领域技术人员已知的不依赖于重组或连接的克隆方法制备。通常，特定核酸构建体或载体或质粒构建体可以具有一个或多个核酸片段区段。这些构建体中的核酸片段优选地与调节序列有效连接。调节序列尤其包括植物序列如上述启动子和终止子。所述构建体可以有利地在微生物、尤其大肠杆菌和/或根癌农杆菌中，在选择性条件下稳定增殖并且能够使异源DNA转移至植物或其他微生物中。根据一个具体实施方案，所述构建体基于双元载体(双元载体的综述：见Hellens等人，2000)。通常，所述构建体含有用于微生物如大肠杆菌和根癌农杆菌中增殖的原核调节序列，如复制起点和选择标记。载体还可以含有用于转移DNA至植物基因组的农杆菌T-DNA序列或用于转移至其他真核细胞例如酵母属物种(Saccharomyces sp)的其他真核调节序列或用于转移至其他原核细胞例如棒状杆菌物种(Corynebacterium sp)或芽孢杆菌属物种(Bacillus sp)的其他原核调节序列。对于植物的转化，至少需要完整农杆菌T-DNA序列的包含大约25碱基对的右边界序列。通常，本发明的植物转化载体构建体含有来自右边界区域和来自左边界区域的T-DNA序列，所述T-DNA序列含有用于位点特异性作用酶的适宜识别位点，其中所述酶又由一些vir基因编码。不同类型的阻抑构建体，例如反义、共抑制、RNAi、miRNA等需要如本文中所述的不同克隆策略。
植物宿主生物是根据本发明有利优选的。优选的植物选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、伞形科、桦木科、紫草科、十字花科、凤梨科、仙人掌科、番木瓜科、石竹科、大麻科、旋花科、藜科、胡颓子科、牻牛儿苗科、禾本科、核桃科、樟科、豆科(Leguminosae)、亚麻科、葫芦科、莎草科、大戟科、豆科、锦葵科)、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、忍冬科、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科、多年生牧草、饲草作物、蔬菜和观赏植物。
特别优选的是选自以下组中的植物：伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科。尤其特别优选作物植物。因而，有利的植物优选属于以下植物所在的属：落花生、油菜籽、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、扁桃、鳄梨、月桂、南瓜、亚麻、大豆、阿月浑子、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱和谷子、小黑麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、饲用甜菜、茄子和多年生牧草和饲料植物、油棕、蔬菜(芥菜、根用蔬菜、块茎类蔬菜、荚果蔬菜、果实类蔬菜、葱蒜类蔬菜、叶用蔬菜和茎用蔬菜)、荞麦、菊芋、蚕豆、野豌豆、兵豆、苜蓿、四季豆、羽扇豆、车轴草和紫花苜蓿。在本发明的一个实施方案中，宿主植物选自玉米、大豆、油籽油菜(包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜(winter oil seed reap)、棉属植物、小麦和稻。其他优选植物在本文提及。
为了根据本发明方法通过导入在本发明方法中使用的核酸分子至植物中来降低或阻抑基因产物的活性，例如，有利地将分离的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或重组核酸分子或诱变的核酸序列首先转移至中间宿主，例如细菌或真核单细胞生物细胞。可以按照本身已知的方式(例如通过热休克或电穿孔)实施的转化至大肠杆菌已经证明其本身在这种情况下是适宜的。
任选地经验证的核酸构建体随后用于植物的转化。为此目的，首先可能需要从中间宿主获得所述构建体。例如，可以通过与常规质粒分离法相似的方法从细菌宿主获得作为质粒的所述构建体。
可以通过瞬时转化技术(即核酸优选地不整合到植物基因组中)有利地实现植物中的基因沉默作用。用于瞬时植物转化的合适系统是例如基于农杆菌和基于植物病毒的系统。有关基于病毒的瞬时系统及其在植物中用于基因沉默的细节已经在Lu等人在Methods 2003，30(4)296-303中描述。农杆菌用于瞬时表达植物中核酸的用途已经由例如Fuentes等人，2003在Biotechnol Appl Biochem.2003年11月21日在线：doi：10.1042/BA20030192)描述。
已知用于转化植物的许多方法。根据本发明，既然异源DNA稳定整合至植物基因组是有利的，故而T-DNA介导转化法尤其已经证明是便利的。为此目的，首先需要用包含待转化核酸分子的基因区段或相应质粒构建体转化合适的运载体，尤其农杆菌，其中所述的待转化核酸分子例如是适用于本发明方法的核酸分子，例如是如本文中所述的核酸分子，例如是能够降低或阻抑如表II第5列或第7列中或如表I第5列或第7列中中所述基因产物或其同源物表达的分离的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或重组核酸分子或其他多核苷酸。这可以按照本身已知的方式实施。例如，可以通过电穿孔或热休克法，将已经根据上文详述产生的本发明所述核酸构建体或所述表达构建体或所述质粒构建体转化至感受态农杆菌中。原则上，必须区分共整合载体的形成与双元载体的转化。在第一种备选情况下，包含编码性基因区段或根据本发明方法所用核酸分子的构建体不含T-DNA序列，但是共整合载体或构建体的形成在农杆菌中通过该构建体与T-DNA同源重组而产生。T-DNA在农杆菌中以其中外源DNA已经适宜地替换癌基因的Ti或Ri质粒形式存在。如果使用双元载体，则它们可以通过细菌接合或通过直接转移法转移至农杆菌。这些农杆菌已经适当地包含携带vir基因的载体(当前称作辅助Ti(Ri)质粒)。
此外，质体的稳定转化可能在一些情况下是有利的，因为质体在大部分作物中母系地遗传，这降低或缺失了经过花粉的转基因流动风险。转化叶绿体基因组的方法一般通过Klaus等，2004，NatureBiotechnology 22(2)，225-229中已示意性展示的方法实现。质体转化可能特别有利于阻抑质体编码的本发明核酸。
简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至与叶绿体基因组同源的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导至原质体的位点特异性整合。质体转化已经对许多不同植物物种进行描述并且综述可以取自Bock等人(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenic plastids in basic research and plant biotechnology).J Mol Biol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P，质体转化技术商业化进展(Progress towards commercialization of plastid transformationtechnology)，Trends Biotechnol.21，20-28(2003)。其他生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式报道，其中所述的无标记质体转化体可以通过瞬时共整合的标记基因产生(Klaus等，2004，Nature Biotechnology22(2)，225-229)。
一个或多个标记也可以适当地与核酸构建体或载体一起使用，并且如果植物或植物细胞应当用T-DNA一起转化，其中借助所述T-DNA，可能分离或选择转化的生物(如农杆菌)或转化的植物细胞。这些标记基因能够通过一系列不同原理鉴定本发明核酸分子的成功转移，例如借助荧光、发光或在人眼可感知的光波长范围内通过目视鉴定、通过除草剂抗性或抗生素抗性，通过称作营养标记(自养性标记)或抗营养标记、通过酶测定或通过植物激素。可以提及的此类标记的例子是GFP(＝绿色荧光蛋白)；萤光素/萤光素酶系统、β-半乳糖苷酶及其有色底物例如X-Gal，除草剂抗性(针对例如咪唑啉酮、草甘膦、草胺膦或磺脲)、抗生素抗性(针对例如博来霉素、潮霉素、链霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素，仅提到几种)、营养标记如利用甘露糖或木糖，或抗营养标记如针对2-脱氧葡萄糖或D-氨基酸的抗性(Erikson等人，2004，Nature Biotech 22(4)，455-458)。这个名单是少数的可能标记。技术人员非常熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
原则上，希望植物核酸构建体在基因区段的一侧或两侧分布有T-DNA。当根癌农杆菌或发根农杆菌物种的细菌用于转化时，这是特别有用的。根据本发明优选的方法是借助根癌农杆菌转化。但是，生物射弹法也可以有利地用于导入本发明方法中的序列，并且也可以借助PEG导入。转化的农杆菌可以按照本身已知的方式培育并且因此可用于便利地转化植物。以惯用方式培育或提供待转化的植物或植物部分。随后使转化的农杆菌作用于植物或植物部分直至达到足够的转化率。使所述农杆菌作用于植物或植物部分可以采用不同形式。例如，可以使用形态发生的植物细胞或组织的培养。在T-DNA转移后，通常用抗生素消灭该细菌，并且诱导植物组织的再生。尤其使用合适的植物激素做到这一点，旨在首先诱导愈伤组织形成并随后促进苗发育。
外来基因转移至植物基因组的过程称作转化。在进行转化时，描述的用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法用于瞬时转化或稳定转化。有利的转化方法是植物原位(in planta)转化法。为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明将转化农杆菌的混悬液作用于完整植物或至少作用于花原基是特别有利的。随后继续培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，Plant J.(1998)16，735-743)。为了选择转化的植物，在转化中获得的植物材料原则上接受选择性条件处理，从而转化的植物可以区分于非转化的植物。例如，以上述方式获得的种子可以播种，并且在初始培育时间后，通过喷洒接受合适的选择。另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以生长成植物。其他有利的转化方法，尤其用于植物的转化方法，是熟练技术人员已知的并且在下文描述。
其他有利的合适方法是借助聚(乙二醇)诱导DNA摄取的原生质体转化法、使用基因枪的“生物射弹法”-称作粒子轰击法、电穿孔法、干燥胚在DNA溶液中温育法、微量注射法和通过农杆菌介导的基因转移法。所述方法例如在B.Jenes等，Techniques for Gene，在：TransgenicPlants，第1卷，Engineering and Utilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press(1993)128-143及在Potrykus Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)205-225)中描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，尤其转化作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过在农杆菌溶液中浸泡擦伤的叶或切下的叶并随后在合适培养基中培育它们。借助根癌农杆菌转化植物例如由
Figure GPA00001008527701571
和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，Vectors for Gene Transferin Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
上文提及的核酸分子可以克隆到本发明的核酸构建体或载体中与其他基因组合在一起，或通过将几种核酸构建体或载体(包括质粒)转化至宿主细胞、有利地转化至植物细胞而导入不同基因。
在一个实施方案中，在本发明的方法中，在本发明的方法中使用的核酸序列可以有利地与一种或多种调节信号有效连接，旨在提高基因表达，例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或本发明抗体。这些调节序列意图能够使核酸分子(例如基因或基因片段)特异性表达或使在本发明方法中使用的基因产物或核酸特异性表达。取决于宿主生物例如植物或微生物，这可以意味着例如基因或基因片段或抑制构建体仅在诱导后才表达和/或过量表达，或它组成型地表达和/或过量表达。这些控制序列是例如与诱导物或阻抑物结合并且因而调节核酸表达的序列。另外，基因构建体也可以有利地包含与启动子有效连接的一个或多个所谓增强子序列，并且这些增强子序列能够提高核酸序列表达。还有可能在DNA序列的3’端插入额外的有利序列，例如其他调节元件或终止子。
编码本发明蛋白质的核酸分子和编码其他多肽的核酸分子可以存在于一个核酸构建体或载体中或几个核酸构建体或载体中。在一个实施方案中，仅一个拷贝在本发明方法中使用的核酸分子或其编码性基因存在于核酸构建体或载体中。可以在宿主生物中一起表达几种载体或核酸构建体或载体。本发明的核酸分子或核酸构建体或载体可以插在载体中并且在细胞中以游离形式存在。如果优选稳定转化，则使用这样的载体，该载体经几个世代稳定复制或该载体的一部分还插入基因组中。在植物的情况下，可能进行整合到质体基因组或尤其整合到核基因组中。对于宿主基因组中插入多于一个构建体，待表达的构建体可能一起存在于一个载体中，例如在携带多个构建体的上述载体中。
通常，用于构建体(例如抑制构建体如RNAi、miRNA、反义、共抑制构建体)表达速率的调节序列位于待调节核酸分子的序列上游(5’)、内部和/或下游(3’)。它们尤其控制转录和/或翻译和/或转录物稳定性。表达水平取决于同其他细胞调节系统，如细胞的蛋白质生物合成和降解系统的衔接。
调节序列包括转录和翻译调节序列或信号，例如位于上游(5’)的序列，所述序列尤其涉及调节转录或翻译起始过程，如启动子或起始密码子，和位于下游(3’)的序列，所述序列尤其涉及调节转录或翻译终止过程和转录物稳定性，如多腺苷酸化信号或终止密码子。调节序列也可以存在于转录的编码区内以及转录的非编码区中，例如在内含子中，例如剪接位点中。
用于在细胞中调节本发明核酸分子表达并且可以使用的启动子原则上是全部这启动子，其中如果所述这启动子替换内源性启动子时，能够降低核酸分子的转录，或可以刺激抑制性构建体(例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或本发明抗体)的转录。在这些生物中有功能的合适启动子一般是已知的。它们可以采取组成型或诱导型启动子的形式。合适的启动子可以能够在多细胞真核生物中进行发育特异性和/或组织特异性表达；因而，可以有利地在植物中使用叶-、根-、花-、种子-、气孔-、块茎-或果实-特异性启动子。
原则上，有可能将天然启动子连同它们的调节序列(如上文提及的那些调节序列)用于新方法。额外或单独地使用人造启动子也有可能有利，尤其当这些启动子介导种子特异性表达，如在例如WO 99/16890所述。
可以希望单独或与其他基因或核酸组合下表达在所述方法中使用的核酸分子。根据待达到的目标，通过同时转化几个独立的合适核酸构建体即表达构建体或优选地通过将几个表达盒组合在一个构建体上，可以导入引起其他有利基因阻抑或表达的多种核酸分子。也用可能转化几个载体，在每种情况下逐步将几个表达盒转化到受体生物中。
如上所述，除所导入核酸分子之外待表达的基因或所导入基因的转录可以有利地由所导入的生物合成基因的合适终止子在3’末端处(终止密码子之后)终止。可以用于此目的的终止子是例如OCS1终止子、nos3终止子或35S终止子。如同启动子那样，可以对每个基因使用不同的终止子。在微生物中有用的终止子是例如fimA终止子、txn终止子或trp终止子。此类终止子可以是rho依赖性或rho非依赖性的。
不同的植物启动子例如USP、LegB4-、DC3启动子或来自欧芹的遍在蛋白启动子或本文中提及的其他启动子和不同终止子可以有利地在用于减少本文中所提及的在表I第5列或第7列中所示核酸分子或其同源物的核酸构建体中使用。其他有用的植物启动子是例如玉米遍在蛋白启动子、ScBV(甘蔗杆状病毒)启动子、来自大麦的lpt2或lpt1-基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)或WO 99/16890中描述的那些启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因的启动子)。
为了确保与其他生物合成基因组合的在本发明方法中使用的核酸分子经过多个世代后稳定整合到转基因植物中，在本发明方法中使用的每个编码区可以在其自身启动子、优选独特启动子的控制下表达。
核酸构建体有利地以如此方式构建，从而启动子后接一个用于插入待表达核酸的合适切割位点，其有利地在多接头中，随后根据需要是位于该多接头之后的终止子。根据需要，这个顺序可以重复几次，从而几个基因在一个构建体中组合并且因而可以被导入转基因植物以表达。该顺序例如重复多达3次。为了表达，将核酸序列借助合适的切割位点插入，其中所述切割位点在例如启动子之后的多接头中。如上文提及，每个核酸序列拥有自己的启动子和根据需要具有自己的终止子是有利的。但是，也有可能将几个核酸序列插在启动子之后和根据需要在终止子之前，尤其多顺反子转录在宿主或靶细胞中是可能时。在这种情况下，该核酸构建体中的插入位点或所插入核酸分子的顺序不是决定性的，也就是说核酸分子可以插在表达盒中的最先或最末位置，同时这不对表达产生重大影响。但是，也可能在构建体中仅使用一种启动子类型。
因而，在一个优选的实施方案中，本发明核酸构建体引起植物中核酸分子和任选地引起其他基因降低或阻抑并且包含一个或多个植物调节元件，其中所述的核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述的多核苷酸或编码的基因产物(例如，如表II第5列或第7列中所述或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽)或其在本文中所述的同源物。本发明所述的核酸构建体有利地包括植物启动子或植物终止子或者植物启动子和植物终止子。它还编码例如本发明的分离的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或本发明抗体或用于重组的核酸分子。
“植物”启动子包含介导植物细胞中编码性序列区段表达的调节元件。因此，植物启动子不必要是植物来源的，而可以源自病毒或微生物，尤其例如来自侵袭植物细胞的病毒。
植物启动子也可以源自植物细胞，例如来自用如本文中所述核酸构建体或载体所转化的植物。这也适用于其他“植物”调节信号，例如“植物”终止子。
适用于植物表达的核酸构建体优选地包含能够控制植物细胞中基因表达并且有效连接从而每个序列可以实现其功能的调节元件。因而，核酸构建体也可以包含转录终止子。用于转录终止的例子是多腺苷酸化信号。优选的多腺苷酸化信号是从根癌农杆菌T-DNA如Ti质粒pTiACH5(Gielen等，1984，EMBO J.3：835)的称作章鱼碱合酶的基因3或其功能等同物起源的那些多腺苷酸化信号，不过在植物中有功能活性的全部其它终止子也是适用的。
在适用于植物表达的核酸构建体用于表达多肽的情况下，它优选地还包含其它有效连接的调节元件，如翻译增强子，如包含提高蛋白质/RNA比的烟草花叶病毒5’非翻译前导序列的过度驱动序列(Gallie等人，1987，Nucl.Acids Research 15：8693-8711)。
对于在植物中的表达，如上文所述，核酸分子必须与合适启动子有效连接或包含合适启动子，其中所述的合适启动子在正确的时间点并以细胞-或组织-特异性方式表达例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或本发明的抗体。可用的启动子是组成型启动子(Benfey等人，EMBO J.8(1989)2195-2202)，如源自植物病毒如35S CAMV(Franck等人，Cell 21(1980)285-294)、19S CaMV(还参见US 5352605和WO84/02913)、34S FMV(Sanger等人，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443)的那些组成型启动子、欧芹遍在蛋白启动子或植物启动子如US 4,962,028中所述的Rubisco小亚基启动子或植物启动子PRP1[Ward等人，Plant.Mol.Biol.22(1993)]、SSU、PGEL1、OCS[Leisner(1988)Proc Natl Acad SciUSA 85(5)：2553-2557]、lib4、usp、mas[Comai(1990)Plant Mol Biol 15(3)：373-381]、STLS1、ScBV(Schenk(1999)Plant Mol Biol 39(6)：1221-1230)、B33、SAD1或SAD2(亚麻(flax)启动子，Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696-1701)或nos[Shaw等人(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846]。稳定地组成型表达本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或本发明的抗体可以是有利的。但是，如果在收获之前的晚期表达是有利的，则诱导型表达核酸分子以降低用于本发明方法的核酸分子是有利的，因为代谢操作可能引起植物生长迟滞。
也可以如上文所述通过化学诱导型启动子促进表达核酸分子以减少用于本发明方法的核酸分子(综述，见Gatz 1997，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，48：89-108)。当需要以时间特异性方式表达基因时，化学诱导型启动子是特别合适的。此类启动子的例子是水杨酸诱导型启动子(WO95/19443)、脱落酸诱导型启动子(EP 335 528)、四环素诱导型启动子[Gatz等人(1992)Plant J.2，397-404]、环己醇或乙醇诱导型启动子(WO93/21334)或如本文中所述的其他启动子。其他合适的启动子是应对生物胁迫或非生物胁迫条件的那些启动子，例如病原体诱导的PRP1基因启动子(Ward等人，Plant MoI Biol 1993，22：361-366)、番茄热诱导型hsp80启动子(美国专利号5,187,267)、马铃薯寒冷诱导型α-淀粉酶启动子(WO 96/12814)或创伤诱导的pinll启动子(EP-A-0 375 091)或如本文中所述的其他启动子。
优选的启动子尤其是在组织和器官、在种子细胞如胚乳细胞或正在发育的胚的细胞中引起基因表达的那些启动子。
合适的启动子是油籽油菜的油菜籽蛋白基因启动子(US5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)USP启动子(Baeumlein等人，Mol Gen Genet，1991，225(3)：459-67)、拟南芥油质蛋白启动子(WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(US 5,504,200)、芸苔属Bce4启动子(WO 91/13980)、豆类arc5启动子、胡萝卜DcG3启动子或豆科植物B4启动子(LeB4，Baeumlein等人，Plant J.，2(2)，1992：233-239)和在单子叶植物如玉米、大麦、小麦、黑麦、稻等中引起种子特异性表达的启动子。有利的种子特异性启动子是蔗糖结合蛋白启动子(WO 00/26388)、菜豆蛋白启动子和油菜籽蛋白启动子。必须考虑的合适启动子是大麦lpt2或lpt1基因启动子(WO 95/15389和WO 95/23230)和WO 99/16890中描述的启动子(来自大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的谷醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、玉米的玉米醇溶蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高梁kasirin基因和黑麦的黑麦碱基因的启动子)。其他合适的启动子是Amy32b、Amy 6-6和Aleurain[US5,677,474]、Bce4(油籽油菜)[US 5,530.149]、大豆球蛋白(大豆)[EP 571741]、烯醇式丙酮酸羧化酶(大豆)[JP 06/62870]、ADR12-2(大豆)[WO98/08962]、异柠檬酸裂合酶(油籽油菜)[US 5,689,040]或α-淀粉酶(大麦)[EP781849]。可用于表达基因例如表达在本发明方法中使用的核酸分子、尤其用于减少在本发明方法中降低其活性的核酸分子的其他启动子是植物中的叶特异性启动子如DE-A 19644478中所述的那些叶特异性启动子，或光调节性启动子，例如豌豆petE启动子。
其他合适的植物启动子是胞浆FBP酶启动子或马铃薯ST-LSI启动子(Stockhaus等人，EMBO J.8，1989，2445)、大豆磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶启动子(GenBank登录号U87999)或EP-A-0 249 676中所述的结节特异性启动子。
在特定情况下适用的其他启动子是引起质体特异性表达的那些启动子。合适启动子如病毒RNA聚合酶启动子在WO 95/16783和WO 97/06250中描述并且是在WO 99/46394中描述的拟南芥clpP启动子。
除了上文提及的几种病毒启动子和细菌启动子之外，用于强烈地表达基因例如在本发明方法中使用的核酸分子、尤其用于在尽可能多的组织中、特别在叶中减少于本发明方法中降低其活性的核酸分子的其他启动子优选地是肌动蛋白或遍在蛋白基因的植物启动子，例如稻肌动蛋白1启动子。组成型植物启动子的其他例子是甜菜V-ATP酶启动子(WO01/14572)。人造组成型启动子的例子是超级启动子(WO 95/14098)和从G-盒衍生的启动子(WO 94/12015)。根据需要，也可以进一步使用化学诱导型启动子，比较EP-A 388186，EP-A 335528，WO 97/06268。
本发明的另一个实施方案是适用于植物中表达的核酸构建体，其中所述核酸构建体在本发明方法中使用时引起例如本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子的核酸分子、显性失活突变体或本发明抗体表达。
如上文所述，优选的受体植物尤其是可以按照合适方式转化的那些植物。这些植物包括单子叶植物和双子叶植物。必须提及的植物尤其是农业有用的植物如禾谷植物和牧草例如小麦属物种、玉米、大麦、燕麦、黑麦、稻、珍珠粟、两色蜀黍、小黑麦、剪股颖属(Agrostis)物种、纤毛蒺藜草(Cenchrus ciliaris)、鸭茅(Dactylis glomerata)、苇状羊茅(Festuca arundinacea)、黑麦草属(Lolium)物种、苜蓿属物种和甘蔗属物种、豆类和油料作物，例如芥菜(Brassica juncea)、欧洲油菜、大豆、落花生、陆地棉、鹰嘴豆(Cicer arietinum)、向日葵、小扁豆(Lens culinaris)、亚麻、白芥(Sinapis alba)、白车轴草(Trifolium repens)和法国野豌豆(Vicianarbonensis)、蔬菜植物和果实例如香蕉、葡萄、番茄、芦笋、卷心菜、西瓜、猕猴桃果、马铃薯、甜菜(、木薯和菊苣、树木例如咖啡属(Coffea)物种、柑橘属(Citrus)物种、桉属(Eucalyptus)物种、云杉属(Picea)物种、松属(Pinus)物种和杨属(Populus)物种、药用植物和药用树木，和花。
本发明的一个实施方案也涉及用于产生载体的方法，所述方法包括将本文表征的核酸分子、本发明的核酸分子或本发明的表达盒插入载体。所述载体可以例如导入如本文对核酸构建体所述或下文在转化或转染下或实施例中所示的细胞，例如微生物或植物细胞。宿主或靶细胞的瞬时或稳定转化是可能的，然而优选稳定转化。
本发明的载体优选地是适用于在植物中降低、阻抑、减少或缺失本发明多肽的载体。所述方法因而也可以包括用于整合调节信号、尤其介导植物中降低、减少或缺失的信号至载体中一个或多个步骤。
因而，本发明也涉及载体，其包含在本文中表征为适用于植物表达的核酸构建体的组成部分的核酸分子或本发明的核酸分子。
在本发明方法中使用的有利载体(例如本发明载体)包含编码在本发明方法中所用核酸分子的核酸分子或适用于植物中表达的核酸构建体，所述核酸构建体包含如上文所述在本发明方法中有用的核酸分子。因而，在本发明方法中有利使用的重组表达载体包括在本发明方法中使用的核酸分子或本发明的核酸构建体，所述构建体的形式适用于阻抑包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的活性或如表II第5列或第7列中所述多肽或其同源物的活性和/或同时适用于在宿主细胞中表达本发明核酸分子或在本文中所述核酸分子所附带的额外基因。因而，该重组表达载体包含基于待用于表达的宿主细胞所选择的与待表达核酸有效连接的一个或多个调节信号。
根据本发明，术语“载体”指这样的核酸分子，其能够运输与之连接的另一个核酸分子。一种类型的载体是“质粒”，其意指可以将额外DNA区段连接到其中的环状双链DNA环。另一类型的载体是病毒载体，它可能将额外DNA区段连接到病毒基因组内。某些载体能够在已经导入这些载体的宿主细胞中自主复制(例如带细菌复制起点的细菌载体)。其它优选的载体在导入宿主细胞时有利地完全或部分整合至宿主细胞的基因组中，并且因此随宿主基因组一起复制。另外，某些载体能够控制与它们有效连接的基因表达。在这种情况下，这些载体称作“表达载体”。如上文提及，它们能够自主复制或可以完全或部分地整合至宿主基因组。通常适用于DNA重组技术的表达载体采取质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可以互换地使用，因为质粒是载体的最常用形式。但是，本发明也意图包括产生相似功能的表达载体的其它形式，如病毒载体。术语“载体”进一步还将包括熟练技术人员已知的其他载体，如噬菌体、病毒如SV40、CMV、TMV、转座子、IS元件、噬粒、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA。
在重组表达载体中，“有效连接”意指目的核苷酸序列以可能表达基因的方式与调节序列连接：它们以如此方式彼此连接，从而这两种序列实现了赋予所述序列的预期功能(例如在体外转录/翻译系统中，或如果将载体导入宿主细胞时，在宿主细胞中)。
术语“调节序列”意图包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如多腺苷酸化信号)。这些调节序列在例如“Goeddel；GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，Calif.(1990)”或见：Gruber和Crosby，在：Methods in PlantMolecular Biology and Biotechnology，CRC Press，Boca Raton，FIa.：编者Glick和Thompson，第7章，89-108”，包括其中引用的参考文献中描述。调节序列包括控制核苷酸序列在许多类型宿主细胞中组成型表达的那些调节序列和控制核苷酸序列仅在特定宿主细胞中或在特定条件下直接表达的那些调节序列。本领域技术人员知道表达载体的设计可能取决于以下因素，如待转化细胞的选择、蛋白质数量的减少程度等。上文描述对调节序列例如启动子、终止子、增强子等的优选选择过程。术语“调节序列”视为被术语“调节信号”所包括。上文描述了几种有利的调节序列，尤其启动子和终止子。通常，作为有利于适合表达的核酸构建体所描述的调节序列也可应用于载体。
所用重组表达载体可以专门设计成用于原核细胞/或真核细胞中表达在本发明方法中使用的核酸分子。这是有利的，因为为了简便起见，载体构建的中间步骤往往在微生物中实施。例如，本发明基因和其他基因可以用载体并按照如WO 98/01572描述的转化方法，在细菌细胞、昆虫细胞(使用杆状病毒表达载体)、酵母细胞或其它真菌细胞[Romanos(1992)，Yeast 8：423-488；van den Hondel，(1991)，在：More GeneManipulations in Fungi，J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页：Academic Press：San Diego；和van den Hondel，C.A.M.J.J.(1991)，在：Applied Molecular Genetics of Fungi，Peberdy，J.F.等人编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge]、藻类[Falciatore等人，1999，Marine Biotechnology.1，3：239-251]，并且优选地在多细胞植物的细胞中[见Schmidt，R.和Willmitzer，L.(1988)Plant Cell Rep.：583-586；PlantMolecular Biology and Biotechnology，C Press，Boca Raton，Florida，第6/7章，第71-119页(1993)；F.F.White，in：Transgenic Plants，Bd.1，Engineering and Utilization，编者：Kung和R.Wu，Academic Press(1993)，128-43；Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225(和其中引用的参考文献)]。合适的宿主细胞进一步在Goeddel，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，CA(1990)中讨论。备选地，重组表达载体的序列可以在体外转录和翻译，例如使用T7启动子调节序列和T7聚合酶。
在大多数情况下，可以使用控制融合蛋白或非融合蛋白表达的包含组成型或诱导型启动子的载体，在原核生物中表达多核苷酸(如RNA)或多肽或蛋白质。常见的融合表达型载体尤其是pGEX[PharmaciaBiotech Inc；Smith，D.B.和Johnson，K.S.(1988)Gene 67：31-40]、pMAL(New England Biolabs，Beverly，MA)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，NJ)，在所述载体中谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与重组靶蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子尤其是pTrc[Amann等人(1988)Gene 69：301-315]和pET11d[Studier等人，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CaliforniA(1990)60-89]。pTrc载体的靶基因表达基于借助宿主RNA聚合酶的杂合trp-lac融合启动子的转录作用。来自pET 11d载体的靶基因表达是基于由共表达的病毒RNA聚合酶(T7gn1)介导的T7-gn10-lac融合启动子转录。这种病毒聚合酶由宿主菌株BL21(DE3)或HMS174(DE3)从栖居性“Symbol”原噬菌体中提供，其中所述的原噬菌体携带受lacUV 5启动子转录性控制的T7gn1基因。
在原核生物中适用的其他载体是熟练技术人员已知的；这些载体例如是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR系列如pBR322、pUC系列如pUC18或pUC19、M113mp系列、pKC30、pRep4、pHS1、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、“Symbol”gt11或pBdCI、链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361、在芽孢杆菌中的pUB110、pC194或pBD214、棒状杆菌中的pSA77或pAJ667。
在又一个实施方案中，表达载体是酵母表达载体。用于酿酒酵母(S.cerevisiae)表达的载体例子包括pYeDesaturasec1(Baldari等人(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等人(1987)Gene54：113-123)和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，CA)。载体和用于构建适合在其他真菌如丝状真菌中使用的载体的方法包括在：van den Hondel，C.A.M.J.J.[(1991)，J.F.Peberdy编辑，第1-28页，Cambridge University Press：Cambridge；或在：More Gene Manipulations in Fungi；J.W.Bennet和L.L.Lasure编辑，第396-428页：Academic Press：San Diego]中详细描述的那些载体和方法。其他合适酵母载体的例子是2“Symbol”M、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23。
可以通过例举方式提及的其他载体是真菌中的pALS1、pIL2或pBB116或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。
作为备选，使用杆状病毒表达系统，可以在昆虫细胞中表达核酸序列。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等(1983)Mol.Cell Biol.3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)。
上文提及的载体仅是对潜在适合载体的简略概述。其它质粒是本领域技术人员已知的并且可在例如Cloning Vectors(编者PouwelsP.H.等人，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444904018)中描述。用于原核细胞和真核细胞的其他合适表达系统见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16和17章。
因而，本发明的一个实施方案涉及载体，该载体包含在本发明方法中使用的核酸分子或在本发明方法中使用的核酸构建体，例如包含分离的核酸分子的本发明核酸分子或核酸构建体，其中所述分离的核酸分子编码本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或者本发明的共抑制核酸分子或病毒的降解核酸分子或者编码针对基因、RNA或蛋白质的DNA结合因子、RNA结合因子或蛋白质结合因子、显性失活突变体或者本发明的抗体或适用于重组的本发明核酸分子、尤其用于同源重组的核酸分子。此类载体用于在生物、优选在植物中降低、阻抑、减少或缺失本发明的多肽。有利地，所述的核酸分子与用于原核宿主或真核宿主中或者原核宿主和真核宿主中表达的调节序列有效连接。适用于同源重组的其他载体也处于本发明的范围内。
因而，本发明的一个实施方案涉及已经以本发明方法中有用的载体、尤其以本发明载体或本发明核酸分子或本发明核酸构建体稳定或瞬时转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是微生物、非人动物细胞或植物细胞。
在一个实施方案中，本发明涉及由本发明核酸分子编码，例如由表IB第5列或第7列中所述核酸分子编码的多肽，这意味着例如本发明也涉及这样的多肽，其中所述多肽如表IIB第5列或第7列中描述，优选地在减少或阻抑表达或活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。有利地，由术语“本发明的多肽”包括的所述多肽或其片段、尤其表位或半抗原，可以用来产生或生成针对该多肽的抗体。有利地，该抗体失活或降低在本发明方法中降低其活性的多肽活性。
本发明也涉及用于产生本发明多肽的方法，所述多肽在本发明的宿主细胞中、优选在微生物、非人动物细胞或转基因植物细胞中表达。
在一个实施方案中，在该方法中用于产生此多肽的核酸分子从所述微生物、优选从所述原核或原虫细胞衍生，以所述真核生物作为宿主细胞。在另一个实施方案中，用从原核生物或真菌或藻类或另一种微生物衍生但不从植物衍生的核酸分子在所述的植物细胞或植物产生该多肽。在另一个实施方案中，用从植物或藻类衍生的核酸分子在所述的植物细胞或植物中产生该多肽。
熟练技术人员知道在不同生物中表达的蛋白质和DNA在许多方面和特性例如甲基化、降解和翻译后修饰，例如糖基化、磷酸化、乙酰化、十四烷酰化、ADP-核糖基化、法尼基化、羧基化、硫酸化、遍在蛋白化等方面不同，即便具有相同编码序列。优选地，对相应蛋白质的细胞性表达控制因而不同于控制内源性蛋白或另一种真核蛋白质的活性和表达的控制机制。原核生物或真核中所表达的蛋白质之间的一个主要差异是糖基化的量。例如在大肠杆菌中，不存在糖基化蛋白质。酵母中表达的蛋白质具有糖基化蛋白质中的高甘露糖含量，而在植物中，糖基化模式是复杂的。
本发明的多肽优选地通过重组DNA技术产生。例如，将编码该蛋白质的核酸分子克隆到(如上文所述的)载体中，该载体导入(如上文所述的)宿主细胞并且所述多肽在宿主细胞中表达。所述多肽可以随后通过适宜纯化方案，标准蛋白质纯化技术从细胞分离。作为重组表达的备选，可以使用标准肽合成技术化学地合成由包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的核酸分子或其同源物编码的多肽，尤其本发明的片段或肽。另外，可以从细胞(例如内皮细胞)分离，例如使用如下所述的本发明抗体分离具有相同结构和优选赋予在本发明方法中可使用的蛋白质的活性的天然多肽。该抗体可以通过标准技术利用予在本发明方法中可使用的多肽或其片段(即本发明多肽)产生。
在一个实施方案中，本发明涉及具有活性的多肽，其中所述活性由包含如表II第5列或第7列中所述多肽或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽代表，尤其是选自由以下蛋白质组成的组中的活性：1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990-蛋白、At5g40590-蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和/或遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶。所述多肽优选地引起前述活性，尤其该多肽在减少或阻抑细胞活性后，例如通过降低该多肽的表达或特定活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。在一个实施方案中，本发明涉及多肽，该多肽具有由本发明核酸分子编码的氨基酸序列或是通过产生本发明多肽的方法可获得的。
在一个实施方案中，所述多肽与如表IIA或B第5列或第7列中所述序列区别在于一个或多个氨基酸。在另一个实施方案中，本发明的所述多肽不由如表IIA或B的第5列或第7列中所述的序列组成。在又一个实施方案中，本发明的所述多肽与如表IIA或B第5列或第7列中所述序列的同一性小于100％、99.999％、99.99％、99.9％或99％。优选地，本发明多肽的序列与如表IIA或B第5列或第7列中所述序列的区别不大于80％或70％的氨基酸、优选不大于60％或50％、更优选不大于40％或30％、甚至更优选不大于20％或10％的氨基酸。在一个实施方案中，该多肽与如表IIA或B第5列或第7列中所述序列的区别多于5、6、7、8或9个氨基酸、优选地多于10、15、20、25或30个氨基酸、甚至更优选多于40、50或60个氨基酸。在一个实施方案中，本发明的多肽源自植物细胞。
优选地，该多肽是分离的。“分离的”或“纯化的”蛋白质或核酸分子或其生物活性部分在通过重组DNA技术产生时基本上不含细胞材料，或在化学合成时基本上不含化学前体或其它化学品。
语言“基本上不含细胞材料”包括这样的多肽制品，在所述多肽制品中蛋白质与其中天然或重组产生该蛋白质的细胞的某些细胞组分分开。在一个实施方案中，语言“基本上不含细胞材料”包括本发明多肽的制品，其中所述制品具有小于约30％(干重)的“杂质多肽”、优选小于约20％的“杂质多肽”、仍更优选小于约10％的“杂质多肽”并且最优选小于约5％的“杂质多肽”。“杂质多肽”涉及不是本发明多肽的多肽。当本发明多肽或其生物学活性部分重组地产生时，它还优选地基本上不含培养基，即培养基占蛋白质制备物的体积少于约20％、更优选小于约10％并且最优选小于约5％。词组“基本上不含化学前体或其它化学品”包括这样的制备物，在所述制备物中本发明的多肽与参与该蛋白质合成的化学前体或其它化学品是分开的。词组“基本上不含化学前体或其它化学品”包括这样的制备物，该制备物具有小于约30％(干重)的化学性前体或与该蛋白质不同的其他蛋白质或化学品、更优选小于约20％的化学性前体或其他蛋白质或化学品、仍更优选小于约10％的化学性前体或其他蛋白质或化学品并且最优选地小于约5％的化学性前体或与该蛋白质不同的其他蛋白质或化学品。在优选的实施方案中，分离的蛋白质或其生物活性部分不含来自同一种生物的杂质蛋白，其中本发明的多肽从所述生物中衍生。一般，此类蛋白质通过重组技术产生。
本发明的多肽优选地包含这样的氨基酸序列，其与如表II第5列或第7列中所述氨基酸序列充分同源或者其包含如表IV第7列中所述的共有序列或多肽基序，从而该蛋白质或其部分维持引起本发明活性的能力。优选地，所述多肽具有与如表II第5列或第7列中所述那样相同的氨基酸序列。
另外，本发明的多肽或在本发明方法中待降低其活性的多肽可以具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列杂交、优选在如上文所述的严格条件下杂交至本发明核酸分子的核苷酸序列。因而，该多肽具有由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列与如表I第5列或第7列中所述核酸分子之一至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％、优选至少约75％、80％、85％或90％并且更优选至少约91％、92％、93％、94％或95％，并且甚至更优选至少约96％、97％、98％、99％或更多同源。优选的多肽具有根据本发明和本文中所述活性的至少一种活性。优选的多肽弥补所述敲除作用，例如在敲除突变体中适度表达时，失活或降低、阻抑或缺失了包含表II第5列或第7列中所述多肽或包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽。适度表达在这种情况下意指以与敲除突变体中被失活、缺失或降低的多肽相似的品质和量和在与之相同的发育阶段、组织和区室中产生所述多肽。如上文定义，优选的本发明的多肽包括由核苷酸序列编码的氨基酸序列，其中所述核苷酸序列杂交、优选在严格条件下杂交至表I第5列或第7列的核苷酸序列或与之同源。
因而，如本文中详述，在本发明方法中待降低其活性的多肽，例如本发明的多肽，可以因天然变异或诱变而在氨基酸序列方面不同于表II第5列或第7列中所述多肽或包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的氨基酸序列。因而，该多肽包含这样的氨基酸序列，该氨基酸序列至少约35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％或70％、优选至少约75％、80％、85％或90％并且更优选至少约91％、92％、93％、94％或95％，并且最优选至少约96％、97％、98％、99％或更多同源于表II第5列或第7列中所述多肽或包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的完整氨基酸序列。
为比较氨基酸序列，可以使用如上所述的相同算法或核酸序列。通过使用Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman算法获得高质量的结果。因而，优选基于所述算法的程序。有利地，序列比较可以用程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360(1987)，Higgins等人，CABIOS，51989：151-153)或优选用分别基于Needleman与Wunsch算法(J.Mol.Biol.48；443-453(1970))和Smith与Waterman算法(Adv.Appl.Math.2；482(1981))的程序“Gap”和“Needle”BestFit”进行。这两个程序是GCG软件包[Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711(1991)；Altschul等人(1997)Nucleic Acids Res.25：3389 et seq.]的组成部分。因而，确定序列同源性百分数的计算优选地用程序Gap在序列的全部范围内进行。为比较氨基酸序列，使用以下标准调整：空位权重：8，长度权重：2，平均匹配：2.912，平均错配：-2.003。
多肽的生物活性部分包括这样的肽，所述肽包含从本文所公开多肽的氨基酸序列衍生的氨基酸序列，例如所述肽包含表II第5列或第7列中所述的氨基酸序列或表IV第7列的共有序列或多肽基序或与所述肽同源的蛋白质的氨基酸序列，所述肽包括的氨基酸比具有所述蛋白质的活性(例如所公开活性)的全长蛋白质更少或比同源于下述蛋白质的全长蛋白质更少，其中所述蛋白质具有如所公开蛋白质的活性或如本文中所述在本发明方法中待降低的多肽的活性，并且阻抑、降低或减少所述多肽引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
一般，生物(或免疫)活性部分即肽，例如具有5、10、15、20、30、35、36、37、38、39、40、50、100个或更多个氨基酸长度的肽，包含具有本发明多肽的至少一种活性或表位的结构域或基序。另外，可以通过重组技术制备其中缺失该多肽其他区域的其他生物活性部分并且评价一种或多种在本文中描述的活性。
引起本文中所公开活性提高或降低的针对本发明方法中可使用多肽，尤其本发明多肽的任意诱变策略不意图是限制性的；本领域技术人员轻易地明白这些策略的变化。使用此类策略并且纳入本文所公开的机制，本文所公开的核酸分子和多肽可以用来产生表达在本发明方法中仍可使用的突变核酸分子和/或多肽分子的植物或部分。这种想要的化合物可以是植物的任意天然产物，所述天然产物包括生物合成途径的终产物和天然存在的代谢途径的中间产物，以及在所述细胞的代谢过程中不天然存在但由本发明所述细胞产生的分子。
本发明也提供了嵌合或融合蛋白。
如本发明中所用，“嵌合蛋白”或“融合蛋白”包含这样的多肽，该多肽有效连接于不引起上文提及活性、尤其在降低其表达或活性时不引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的多肽。
在一个实施方案中，优选这样的蛋白质(＝“多肽”)，其中一旦降低所述蛋白质的活性，则它引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。所述蛋白质优选地指这样的多肽，所述多肽具有与如本文所公开多肽相应的氨基酸序列，优选地具有与包含如表II第5列或第7列中所述多肽或包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽或其同源物相应的氨基酸序列。
在融合蛋白范围内，术语“有效连接的”意指本文所公开的多肽和其他多肽或其部分互相融合，从而两种序列满足对所用序列赋予的建议功能。所述其他多肽可以融合于例如在本发明方法中待降低其活性的多肽的氨基末端或羧基末端。例如，在一个实施方案中融合蛋白是其中多肽的序列融合于GST序列羧基末端的GST融合蛋白。此类融合蛋白可以促进本发明重组多肽的纯化。
优选地，通过标准重组DNA技术产生本发明的嵌合或融合蛋白。例如，编码不同多肽序列的DNA片段根据常规技术以符合可读框方式连接起来，例如利用平末端或交错末端以连接，限制酶消化以提供适宜末端、补平粘末端(如适合)、碱性磷酸酶处理以避免不希望的连接和酶链接。融合基因可以通过自动DNA合成仪在内的常规技术合成。备选地，可以使用锚式引物实施基因片段的PCR扩增，其中所述锚式引物在两个交叠基因片段之间产生互补性突出端，其中随后可以复性并再扩增所述交叠基因以产生嵌合基因序列(见，例如Current Protocols in MolecularBiology，eds.Ausubel等人John Wiley & Sons：1992)。另外，已经编码融合部分(例如GST多肽)的许多表达载体是市售的。核酸分子可以克隆到这种表达载体中，从而所述融合部分以符合可读框方式连接于编码的蛋白质。
另外，可以使用适宜的计算机程序进行根据本发明方法待减少或阻抑的蛋白质(例如本文所公开多肽)的结构性基序的折叠模拟和计算机再设计(Olszewski，Proteins 25(1996)，286-299；Hoffman，Comput.Appl.Biosci.11(1995)，675-679)。蛋白质折叠的计算机建模可以用于详细的肽和蛋白质模型的构象和能量分析(Monge，J.Mol.Biol.247(1995)，995-1012；Renouf，Adv.Exp.Med.Biol.376(1995)，37-45)。适宜程序可以用于通过计算机辅助搜索互补性肽序列而鉴定多肽及其底物或结合因子或其他相互作用性蛋白质的相互作用性位点(Fassina，Immunomethods(1994)，114-120)。用于设计蛋白质和肽的其他适宜计算机系统在现有技术中描述，例如在Berry，Biochem.Soc.Trans.22(1994)，1033-1036；Wodak，Ann.N.Y.Acad.Sci.501(1987)，1-13；Pabo，Biochemistry 25(1986)，5987-5991中。从上述计算机分析获得的结果可以用于例如制备蛋白质或其片段的肽拟似物。蛋白质的天然氨基酸序列的此类假肽类似物可以极高效地模拟亲本蛋白质(Benkirane，J.Biol.Chem.271(1996)，33218-33224)。例如，将容易获得的非手性Q-氨基酸残基掺入蛋白质或其片段导致脂族链的多亚甲基单位置换酰胺键，因而提供了一种用于构建肽拟似物的便利策略(Banerjee，Biopolymers 39(1996)，769-777)。
在现有技术中描述了其他系统中小的肽激素的超活性肽拟似类似物(Zhang，Biochem.Biophys.Res.Commun.224(1996)，327-331)。也可以通过连续酰胺烷基化作用合成肽拟似物组合文库并检验所得化合物的例如结合特性和免疫学特性来鉴定多肽的适宜肽拟似物。在现有技术中描述用于生成和使用肽拟似物组合文库的方法，例如在Ostresh，Methods in Enzymology 267(1996)，220-234和Dorner，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，709-715中描述。
另外，蛋白质的三维结构和/或晶体学结构可以用于设计具有蛋白质活性的肽拟似物抑制物，其中所述的蛋白质包含如表II第5列或第7列中所述多肽或包含表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽(Rose，Biochemistry 35(1996)，12933-12944；Rutenber，Bioorg.Med.Chem.4(1996)，1545-1558)。
另外，本文所述蛋白质的三维结构和/或晶体学结构和对相互作用性位点及其底物或结合因子的鉴定可以用于设计具有修改的结合活性或周转活性的突变体。例如，可以将本发明多肽的活性中心建模并且可以修饰参与催化反应的氨基酸残基以增加或减少对失活该多肽的底物的结合。鉴定活性中心和参与催化反应的氨基酸促进筛选具有提高或降低的活性的突变体。
本发明的一个实施方案也涉及抗体，其特异性地结合至本文所公开的多肽，即结合于这种蛋白质的特定片段或表位。术语“表位”涉及抗原中的特异免疫反应性位点，也称作抗原决定簇。这些表位可以是聚合组合物中的单体(如蛋白质中的氨基酸)的线性排列或由更复杂的二级结构或三级结构组成或包含所述结构。技术人员会识别到免疫原(即能够激发免疫应答的物质)是抗原；但是，一些抗原如半抗原无免疫原性，不过可以通过偶联至载体蛋白分子而具有免疫原性。术语“抗原”包括能够针对其产生抗体和/或该抗体与其特异性发生免疫反应的物质。
抗体优选地引起蛋白质或其如本文中所述的同源物降低、阻抑或缺失，其中所述蛋白质包含如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述的多肽或包含如表IV第7列中所述的共有序列或多肽基序，例如该抗体因在生物或其部分中的结合作用而失活本发明的蛋白质。
本发明的抗体也可以用来鉴定和分离根据本发明应当降低其活性的靶多肽。此类抗体也可以在合适的宿主生物中表达，因而通过结合至本文公开的基因产物，导致例如位阻干扰其活性而降低基因产物的活性，其中所述基因产物例如是本文公开的多核苷酸或多肽，例如是包含如表I第5列或第7列中所述核酸分子的核酸分子，例如是包含如表II第5列或第7列中所述多肽的多肽。这些抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体或合成性抗体以及抗体片段，如Fab、Fv或scFv片段等。单克隆抗体可以例如通过如最初在
Figure GPA00001008527701781
和Milstein，Nature 256(1975)，495，和Galfr6，Meth.Enzymol.73(1981)，3中描述的技术制备，其中所述技术包括将小鼠骨髓瘤细胞融合于从免疫哺乳动物衍生的脾细胞细胞。
另外，针对前述肽的抗体或其片段可以通过使用例如在Harlow和Lane“Antibodies，A Laboratory Manual”，CSH Press，ColdSpring Harbor，1988中描述的方法获得。这些抗体可以用于例如免疫沉淀和免疫定位本发明的蛋白质以及用于监测例如重组生物中此类蛋白质的合成，并用于鉴定与本发明蛋白质相互作用的化合物。例如，如BlAcore系统中所用的表面等离子体共振可以用来提高选择噬菌体抗体的效率，导致来自噬菌体抗体单一文库的亲和力的高度增加，其中所述噬菌体抗体与本发明蛋白质的表位结合(Schier，Human Antibodies Hybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。在许多情况下，抗体与抗原的结合现象等同于其他配体/反配体结合作用。
本发明的又一实施方案也涉及用于产生转基因植物细胞或转基因植物组织或转基因植物的方法，所述方法包括将本发明的核酸构建体、本发明载体或本发明核酸分子导入植物、植物细胞或植物组织。
本发明的又一实施方案也涉及用于短暂产生转基因植物细胞或转基因植物组织或转基因植物的方法，所述方法包括将本发明的核酸构建体、本发明载体、本文表征为含于本发明核酸构建体中的核酸分子或在本发明方法中使用的核酸分子导入植物、植物细胞或植物组织，其中导入的核酸分子、核酸构建体和/或载体不整合到宿主或宿主细胞的基因组中。因而，转化体在宿主繁殖期间就导入的核酸分子、核酸构建体和/或载体而言不是稳定的。
在本发明的方法中，转基因生物如果采取植物形式，则也理解为意指植物细胞、植物组织、植物器官如根、幼苗、茎、种子、花、块茎或叶或者被培育的完整植物。
“培育”将理解为意指例如在营养培养基上或在其中培养转基因植物细胞、植物组织或植物器官，或在基质上或在基质中(例如在水培、盆栽堆肥或在田间土壤中)培养完整植物。
在所述方法的又一个有利实施方案中，可以在来自高等植物(例如种子植物如作物)的植物细胞中表达核酸分子。植物表达载体的例子包括在本文或在：Becker，D.[(1992)Plant Mol.Biol.20：1195-1197]和Bevan，M.W.[(1984)，Nucl.Acids Res.12：8711-8721；Vectors forGene Transfer in Higher Plants；在：Transgenic Plants，第1卷，ngineeringand Utilization，编者Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页]中详细描述的那些植物表达载体。双元载体及其用途的综述也存在于Hellens等人Trends in Plant Science(2000)5，446-451中。
载体DNA可以通过常规转化或转染技术导入细胞。如本上下文中所用，术语“转化”和“转染”包括接合和转导，并且如本上下文中所用，意图包括用于导入外来核酸分子(例如DNA)至宿主细胞的多种现有技术方法，包括磷酸钙共沉淀法或氯化钙共沉淀法、DEAE葡聚糖介导的转染、PEG介导的转染、脂质体转染法、天然感受态法、化学介导的转移法、电穿孔法或粒子轰击法。用于转化或转染包括植物细胞在内的宿主细胞的合适方法可以在Sambrook等人(Molecular Cloning：A LaboratoryManual.，2版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)和在其他实验室教材如Methods in Molecular Biology，1995，第44卷，Agrobacterium protocols，编者Gartland和Davey，Humana Press，Totowa，New Jersey中找到。
用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的上述方法用于植物的瞬时转化或稳定转化。合适方法是借助聚乙二醇诱导DNA摄取的原生质体转化法、使用基因枪的生物射弹法-称作粒子轰击法、电穿孔法、干燥胚在含DNA溶液中温育法、微量注射法和通过农杆菌介导的基因转移法。以上提及的方法在例如B.Jenes，Techniques for Gene Transfer，在：Transgenic Plants，第1卷，Engineering and Utilization，S.D.Kung和R.Wu编辑，Academic Presss(1993)，128-143和在Potrykus，Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Molec.Biol.42(1991)，205-225)中描述。待表达的构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.Acids Res.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，尤其转化作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过在农杆菌溶液中浸泡划伤的叶或叶节段并随后在合适培养基中培育它们。以根癌农杆菌转化植物的过程例如由和Willmitzer在Nucl.Acid Res.(1988)16，9877描述或尤其从F.F.White，Vectors for GeneTransfer in Higher Plants；在Transgenic Plants，第1卷，Engineering andUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，Academic Press，1993，第15-38页中获知。
为了选择核酸分子、载体或核酸构建体至宿主生物的成功转移，使用已经如上文详细描述的标记基因是有利的。已知核酸稳定或瞬时地整合到植物细胞时，仅少数细胞摄取外来DNA，并且根据需要，将该外来DNA合至其基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，编码选择标记的基因(如上文所述，例如抗生素抗性)通常连同目的基因一起导入宿主细胞。植物中的优选选择标记包括赋予针对除草剂如草甘膦或草铵膦的抗性的那些选择标记。其他的合适标记例如是这样的标记，其编码参与例如糖或氨基酸生物合成途径的基因，如β-半乳糖苷酶、ura3或ilv2。编码基因如萤光素酶、gfp或其他荧光基因的标记同样是合适的。这些标记和前述标记可以在其中这些基因没有功能的突变体中使用，因为这些基因例如已经通过常规方法缺失。另外，编码选择标记的核酸分子可以在相同载体(如编码在所述方法中所用核苷酸分子的那些载体)上或在独立载体中导入宿主细胞。已经用所导入核酸分子稳定转染的细胞可以通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。
由于一旦已经成功导入标记基因，通常，尤其抗生素抗性和除草剂抗性基因，则所述核酸是转基因宿主细胞中不再需要或不想要的，故而用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够除去或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法称作共转化法。共转化法使用两种载体同时用于转化，一种载体携带本发明的核酸或核酸构建体而第二种载体携带标记基因。大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％和更多的转化体)这两种载体。随后可以通过实施杂交从转化植物中除去标记基因。在一个优选的实施方案中，使用了允许正向和负向选择的条件型标记，旨在首先通过正向选择鉴定转化事件并随后允许通过负向选择鉴定已经因杂交或分离而丢失所述标记的品系。赋予D-氨基酸抗性的标记是此类优选的条件型标记(Erikson等人，2004，Nature Biotech22(4)，455-458)。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与目的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功发生，则转座子从宿主细胞的基因组中跳出并丢失。在其他许多情况下，转座子跳到不同位置。在这些情况下，标记基因必须通过进行杂交消除。在微生物学中，开发了有可能或促进检测这类事件的技术。又一个有利方法依赖于所谓重组系统；其优势在于可以用该重组系统实行杂交消除。最知名的该类型系统是所谓Cre/lox系统。Cre1是除去位于loxP序列之间序列的重组酶。如果标记基因整合在loxP序列之间，一旦转化已经成功发生，则因表达该重组酶除去此标记基因。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.Cell Biol.，149，2000：553-566)。将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组是可能的。自然，这些方法也可以适用于微生物如酵母、真菌或细菌。
用本发明表达载体转化的农杆菌也可以按照本身已知的方式用于转化植物如实验植物，如拟南芥或作物植物如禾谷类植物、玉米、燕麦、黑麦、大麦、小麦、大豆、稻、棉属植物、甜菜、卡诺拉油菜、向日葵、亚麻、大麻、马铃薯、烟草、番茄、胡萝卜、甜辣椒、油籽油菜、木薯(tapioca)、木薯(cassava)、竹芋、万寿菊、苜蓿、芦笋和多种树、坚果、棉属植物和葡萄藤物种、尤其含油作物植物如大豆、落花生、蓖麻植物、向日葵、玉米、棉属植物、亚麻、油籽油菜、椰子、油棕、红花或可可豆，所述方式例如是通过在农杆菌溶液中浸泡划伤的叶或叶节段并随后在合适培养基中培育它们。
除了转化随后必需再生成完整植物的体细胞之外，还可转化植物分生组织的细胞，并且尤其是发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然植物发育过程，从而产生转基因植物。因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的(Feldman，KA和Marks MD(1987)Mol Gen Genet 208：274-289；Feldmann K(1992)，在：编者C Koncz，N-H Chua和J Shell，Methods in Arabidopsis Research.Word Scientific，Singapore，第274-289页)。备选方法基于反复除去花序并将莲座丛中心内的切除部位与转化的农杆菌温育，因而同样可以在较晚的时间点上获得转化的种子(Chang(1994)Plant J.5：551-558；Katavic(1994)Mol Gen Genet，245：363-370)。但是，特别有效的方法是改良真空渗入法，如“浸花”法。在拟南芥属植物真空渗入法的情况下，在减压下用农杆菌悬液处理完整植物(Bechthold，N(1993).C R Acad Sci ParisLife Sci，316：1194-1199)，而在“浸花法”的情况下，将正在发育的花组织与经表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂温育(Clough，SJ和Bent，AF(1998)The Plant J.16，735-743)。在这两种情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育与非转基因种子区分。
可以通过技术人员熟悉的全部方法再生遗传修饰的植物细胞。合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或
Figure GPA00001008527701831
和Willmitzer的出版物中找到。
因而，本发明因此也涉及包含本发明的核酸构建体、本发明核酸分子、本发明载体的植物细胞。因而，本发明因此也涉及根据产生植物细胞的以上所提及方法产生的植物细胞。
因而，本发明涉及任意细胞，尤其涉及植物细胞、植物组织或植物或其子代，它们对于本文所公开的任意核酸分子或构建体是转基因，例如所述核酸分子的阻抑或减少或其基因产物活性的阻抑或降低引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
因而，本发明涉及对于下述任意核酸分子为转基因的任意细胞，其中所述任意核酸分子包含待降低其活性的核酸分子或其部分的或编码在本发明的方法中待降低其活性的多肽，例如本发明的核酸分子、本发明的核酸构建体、本发明的反义分子、本发明的载体或编码本发明多肽例如编码具有本发明蛋白质活性的多肽的核酸分子。
因而，本发明涉及对于本发明载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、重组构建体或核酶分子或本发明的病毒核酸分子、本发明抗体为转基因的，例如对于所述载体、宿主细胞、多肽或所述反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、重组构建体或核酶分子或包含本文所公开核酸分子的片段的病毒核酸分子、与本文所公开多肽的表位结合的抗体为转基因的任意细胞。
天然存在的表达盒-例如蛋白质的启动子与编码目的蛋白的相应基因的天然存在组合-受到非天然的人工“人为”方法例如诱变法修饰时，变成转基因表达盒。已经描述过此类方法(US 5,565,350；WO00/15815；也见上文)。
另外，也可以转化植物细胞、植物组织或植物，从而(过量)表达或阻抑或减少其他酶和蛋白质以支持与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
就任意核酸序列、含有所述核酸序列的核酸构建体或用所述核酸序列或所述核酸构建体转化的生物(＝转基因生物)而言，“转基因”意指全部这些构建体，它们由遗传操作方法产生并且在其中a)所述核酸序列或其衍生物，或b)与所述核酸序列或其衍生物功能性连接的遗传调节元件，例如启动子，或c)(a)和(b)不位于其天然遗传环境中或已经通过遗传操作方法受到修饰，所述修饰可能采取例如替换、添加、缺失、倒位或插入一个或多个核苷酸或核苷酸残基的形式。“天然遗传环境”意指起源生物中的天然染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选至少部分地仍保留。该环境分布在所述核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，极优选至少5000bp序列长度。但是，转基因还意指尽管本发明核酸位于生物的基因组中它们的天然位置处，然而所述序列相对于天然序列而言已经受到修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经受到修饰。优选地，转基因/重组将理解为意指本发明方法中所用核酸在基因组的非天然位置中的表达，也就是说该核酸的表达是同源的，或优选地是异源的。这种表达可以是瞬时的或是稳定整合到基因组的序列的表达。
在本发明方法中本文所述的核酸序列或所述核酸构建体或用于产生转基因植物的本发明另一个实施方案的用途因此也是本发明的主题。
本发明使用的术语“转基因植物”指转基因植物的子代，例如T1、T2、T3和后续植物世代或BC1、BC2、BC3和后续植物世代。因而，本发明的转基因植物可以加以培养和自交或与其他个体杂交，旨在获得本发明的其他转基因植物。转基因植物也可以通过营养方式繁殖获得转基因植物细胞。本发明也涉及可以从本发明的转基因植物群体衍生的转基因植物材料。此类材料以其全部表现形式包括从实际转基因植物衍生和/或可以用于产生转基因植物的植物细胞和植物的某些组织、器官和部分，如种子、叶、花药、须根、块茎、根、根毛、茎、胚、愈伤组织、子叶、叶柄、收获的材料、植物组织、繁殖组织和细胞培养物。
根据本发明获得的任意转化植物可以在常规育种方案中或在体外植物繁殖法中用来产生具有相同特征的更多转化植物和/或可以用来在相同或相关物种中导入相同特征。此类植物也是本发明的部分。从遗传方式转化的植物中获得的种子也具有相同特征并且是本发明的部分。如前文提及，本发明原则上适用于可以用本领域技术人员已知的转化方法转化的任意植物和作物。在一个具体实施方案中，在可转化作物品种中就活性方面突变或减少根据本发明方法降低其活性的核酸或多肽。引起减少的核酸或多肽的基因或其突变形式随后通过例如(标记辅助)杂交转移至原种(商业重要)作物品种中，因而本发明核酸或多肽的突变或减少形式替换或阻抑原初或天然的和有活性的核酸或多肽。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的生物、宿主细胞、植物细胞、植物或植物组织是转基因的。
因而，本发明因此涉及用本文所公开的至少一种核酸分子，例如本发明反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、重组构建体或核酶分子或病毒核酸分子、核酸构建体或载体转化的转基因生物，并涉及从此类生物衍生的细胞、细胞培养、组织、部分-例如在植物生物的情况下植物组织，例如叶、根等或繁殖材料或者完整植物。
因而，本发明也涉及从此类生物衍生的细胞、细胞培养物、组织、部分-例如在植物生物的情况下植物组织，例如叶、根等或繁殖材料或者与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的完整植物。特别地，本发明也涉及从此类生物衍生的细胞、细胞培养物、组织、部分-例如在植物生物的情况下植物组织，例如叶、根等或繁殖材料或者具有降低或缺失的活性的完整植物，其中所述活性选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组。进一步地，本发明也涉及从此类生物衍生的细胞、细胞培养物、组织、部分-例如在植物生物的情况下植物组织，例如叶、根等或繁殖材料或者完整植物，其中所述完整植物具有根据本发明方法待减少的核酸分子或多肽的降低活性或表达。因而，本发明也涉及从此类生物衍生的细胞、细胞培养物、组织、部分-例如在植物生物的情况下植物组织，例如叶、根等或繁殖材料或者完整植物，其中所述完整植物包含如表IA或B的第5列或第7列中所述核酸分子的降低活性或表达或包含多肽的降低活性或表达，其中所述多肽包含如表IIA或B的第5列或第7列中所述的多肽或包含如表IV第7列中所述的共有序列或多肽基序。
术语“重组(宿主)”和“转基因(宿主)”在本上下文中可互换地使用。自然，这些术语不仅指所讨论的宿主生物或靶细胞，还指这些生物或细胞的子代或潜在子代。既然某些修饰可以因突变或环境效应而在后续世代中出现，这种子代不是必然地与亲代细胞相同，但仍处于如本文中使用的术语范围内。
用于本发明方法或作为宿主的合适生物是如上文公开的那些生物。用作宿主的生物是微生物，如细菌、真菌、酵母或藻类或植物，如双子叶或单子叶植物。
原则上，可以使用全部植物作为宿主生物，尤其使用上文提及的植物作为源生物。优选的转基因植物例如选自槭树科、漆树科、伞形科、菊科、伞形科、仙人掌科、葫芦科、大戟科、豆科、锦葵科、睡莲科、罂粟科、蔷薇科、杨柳科、茄科、棕榈科、凤梨科、莎草科、鸢尾科、百合科、兰科、龙胆科、唇形科、木兰科、毛莨科、忍冬科、茜草科、玄参科、石竹科、杜鹃花科、蓼科、堇菜科、灯心草科或禾本科并且优选地来自伞形科、菊科、十字花科、葫芦科、豆科、罂粟科、蔷薇科、茄科、百合科或禾本科。优选作物植物，如有利选自以下植物所在属的植物：落花生、欧洲油菜、卡诺拉油菜、向日葵、红花、橄榄、芝麻、榛子、扁桃、鳄梨、月桂、南瓜、亚麻、大豆、阿月浑子、琉璃苣、玉米、小麦、黑麦、燕麦、高粱和谷子、小黑麦、稻、大麦、木薯、马铃薯、甜菜、饲用甜菜、茄子、苜蓿和多年生牧草和饲料植物、油棕、蔬菜(芥菜、根用蔬菜、块茎类蔬菜、荚果蔬菜、果实类蔬菜、葱蒜类蔬菜、叶用蔬菜和茎用蔬菜)、荞麦、菊芋、蚕豆、野豌豆、兵豆、苜蓿、四季豆、羽扇豆、车轴草和紫花苜蓿，仅提到其中的一些植物。
优选的植物细胞、植物器官、植物组织或植物部分源自在源生物名下提及的植物科，尤其来自上文提及的植物属，更优选来自上文提及的植物物种。在本发明的一个实施方案中，植物细胞、植物器官、植物组织或植物部分选自玉米、大豆、油籽油菜(包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜)、棉属植物、小麦和稻。
本发明的另一个实施方案是组合物，其包含本发明的蛋白质、本发明的核酸分子、本发明的多肽、本发明的核酸构建体或载体、本发明的拮抗物、本发明的抗体和任选地可农业用载体。
在又一个方面，本发明也涉及本发明转基因植物的可收获部分并涉及其繁殖材料，其中所述可收获部分和繁殖材料含有表达本发明核酸分子的转基因植物细胞或含有这样的细胞，所述细胞显示降低、阻抑、降低或缺失的细胞活性，其中所述细胞活性选自由1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶组成的组，例如，所述细胞显示在本发明方法中待降低的核酸分子或多肽的降低、阻抑、降低或缺失的活性，尤其包含如表II第5列或第7列中所述、优选如表IIB中所述多肽或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽的降低或缺失的活性，或下述核酸分子的基因产物的降低或缺失的活性，其中所述核酸分子包含如表I第5列或第7列中所述、优选如表IB中所述的多核苷酸。
可收获部分原则上可以是植物的任意有用部分，例如花、花粉、籽苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根等。繁殖材料例如包括种子、果实、插条、籽苗、块茎、根状茎等。优选种子、籽苗、块茎或果实作为可收获材料或繁殖材料。
在一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定引起与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的基因产物的方法，所述方法包括以下步骤：a)使样品(例如细胞、组织、植物或微生物或核酸文库)的一种、一些或全部核酸分子与如表IA或B的第5列或第7列中所述核酸分子或其功能性同源物接触，例如杂交，其中所述样品可含有编码基因产物的候选基因，所述基因产物在降低或缺失其表达后，引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高；b)鉴定在宽松的严格条件下与所述核酸分子、尤其与如表I第5列或第7列中所示核酸分子序列杂交的核酸分子，并且任选地，分离全长cDNA克隆或完整基因组克隆；c)鉴定宿主细胞中，优选地植物细胞中的候选核酸分子或其片段；d)降低或缺失所鉴定核酸分子在宿主细胞中的表达；e)测试所述宿主细胞中与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的水平；和f)鉴定核酸分子及其基因产物，其中与野生型相比，在表达后，降低或缺失所述基因的表达引起宿主细胞中与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
宽松的杂交条件是：在标准杂交流程后，可以在低至中等严格条件实施洗涤步骤，与严格洗涤条件例如60至68℃，0.1％SDS相比，通常采用40°-55℃洗涤条件和含0.1％SDS的2×SSC和0.2×SSC之间的盐条件。可以在上文所列参考文献中找到用于严格杂交条件的其他例子。通常，以递增的严格性和时间长度重复洗涤步骤直至检测到有用的信/噪比，并且取决于许多因素，例如靶，如靶纯度、GC含量、大小等，探针例如探针长度、是否为RNA或DNA探针、盐条件、洗涤温度或杂交温度、洗涤时间或杂交时间等。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定基因产物的方法，其中减少所述基因产物引起与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高，该方法包括以下步骤：a)鉴定生物中的核酸分子，例如通过在数据库中的同源性搜索进行，其中所述核酸分子与编码蛋白质的核酸分子至少20％、优选25％、更优选30％、甚至更优选35％、40％或50％、甚至更优选60％、70％或80％、最优选90％或95％或更多同源，其中所述蛋白质包含如表II第5列或第7列中所述的多肽分子或包含如表IV第7列中所述的共有序列或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸或其如本文中所述同源物的核酸分子编码；b)阻抑、降低或缺失所鉴定核酸分子在宿主细胞中的表达；c)测试与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的水平；和d)鉴定宿主细胞，在所述宿主细胞中阻抑、降低或缺失所述核酸分子及其基因产物引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定基因产物的方法，其中减少所述基因产物引起与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的，该方法包括以下步骤：a)提供本发明的生物或宿主细胞，其中编码包含所述多肽的蛋白质的核酸分子已经在其活性方面被失活、消除或降低；b)用cDNA表达文库或基因组文库或能够高效表达所包含核酸序列的任何其它核酸文库转化该生物；c)测试与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的水平；和d)鉴定宿主细胞，在所述宿主细胞中导入的核酸序列逆转与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，从而重建野生型状态。在一个实施方案中，用于鉴定基因产物的不同方法可以以任何组合进行组合来优化该方法，其中减少所述基因产物引起与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
另外，在另一个实施方案中，本发明涉及用于鉴定化合物的方法，该化合物对所述植物刺激与相应的非转化野生型植物相比较而言时环境胁迫耐受性提高和/或抗性和生物量生产提高，所述方法包括步骤：a)使表达多肽的细胞与候选化合物在细胞培养条件下接触，其中所述的多肽如表II第5列或第7列中描述或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物或其mRNA编码；b)测试所述多肽或所述mRNA表达的降低、减少或缺失；c)将所述表达水平与所述候选化合物不存在下产生的标准应答比较；其中降低、减少或缺失的表达超过标准则表明该化合物刺激了与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
另外，在一个实施方案中，本发明涉及用于筛选多肽活性的拮抗物的方法，其中所述多肽如表II的第5列或第7列中描述或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码，所述多肽例如是在降低其细胞活性后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的多肽，其中所述细胞活性例如是具有由本发明方法中待减少的蛋白质或核酸分子所代表活性的多肽的活性或本发明多肽的活性，该方法包括：a)使表达本发明多肽的细胞、组织、植物或微生物与候选化合物或包含多种化合物的样品在允许表达本发明多肽的条件下接触；b)测试细胞、组织、植物或微生物或者培养或维持所述细胞、组织、植物或微生物的培养基中的环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产水平或多肽表达水平；和c)通过比较测量的环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产水平或多肽表达水平与所述候选化合物或包含所述多种化合物的样品不存在下所测量的标准环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产水平或多肽表达水平，鉴定拮抗物，其中提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产水平超过标准则表明该化合物或包含所述多种化合物的样品是拮抗物。
另外，本发明的另一个实施方案涉及用于鉴定化合物的方法，该化合物在植物中赋予与相应的非转化野生型植物相比较而言时提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产，所述方法包括以下步骤：a)培养或维持表达多肽的植物细胞或动物细胞或其组织或微生物和下述读出系统，其中所述多肽如表II的第5列或第7列中描述或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物或由编码所述多肽的多核苷酸编码，其中所述读出系统能够在允许该多肽在一种化学化合物或包含多种化学化合物的样品存在时相互作用于该读出系统的合适条件下与所述多肽相互作用，并且能够提供与一种化学化合物在引起所述读出系统和所述蛋白质阻抑的条件下结合至所述多肽相应的可检测信号，其中所述蛋白质如表II的第5列或第7列中描述或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码；和b)通过检测由所述读出系统产生的信号存在或不存在或降低或提高来鉴定该化学化合物是否为有效拮抗物。
所述化合物可以化学地合成或以微生物方式产生和/或例如存在于样品，例如来自植物、动物或微生物(例如病原体)的细胞提取物中。另外，所述化合物可以是本领域已知的，但是迄今不知道能够抑制本发明的多肽。反应混合物可以是无细胞提取物或可以包含细胞或组织培养物。用于鉴定本发明化合物的方法的合适建立是本领域技术人员已知的并且例如广泛地在Alberts等人，Molecular Biology of the Cell，3版(1994)、尤其第17章中描述。所述化合物可以例如添加至反应混合物、培养基，注射至细胞中或喷洒到植物上。
如果在所述方法中确定了含有化合物的样品，则可能从原始样品分离该化合物，其中所述原始样品被确定为含有能够与相应的非转化野生型植物相比较而言提高环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的该化合物，或者可以进一步细分该原始样品，例如，如果该原始样品由多种不同化合物组成，从而降低每个样品不同物质的数目，并且重复该方法，伴以细分该原始样品。取决于样品的复杂程度，上文所述步骤可以进行几次，优选地直至根据本发明方法鉴定的样品仅包含有限数目的或仅包含一种物质。优选地，所述样品包含具有相似化学属性和/或物理属性的物质，并且最优选地，该物质是相同的。优选地，进一步以适用于植物育种或植物细胞和组织培养中应用的方式配制根据上述方法鉴定的化合物或其衍生物。
可以根据所述方法检验和鉴定的化合物可以是表达文库例如cDNA表达文库、肽、蛋白质、核酸、抗体、小分子有机化合物、激素、肽拟似物、PNA等(Milner，Nature Medicine 1(1995)，879-880；Hupp，Cell83(1995)，237-245；Gibbs，Cell 79(1994)，193-198和其中引用的参考文献)。所述化合物也可以已知抑制物或激活物的功能性衍生物或类似物。用于制备化学衍生物和类似物的方法是本领域技术人员熟知的并且在例如Beilstein，Handbook of Organic Chemistry，Springer edition New YorkInc.，175Fifth Avenue，New York，N.Y.10010U.S.A.和Organic Synthesis，Wiley，New York，USA中描述。另外，可以根据本领域已知的方法检验所述衍生物和类似物的作用。另外，例如根据上文所述方法，可以使用肽拟似物和/或计算机辅助设计适宜的衍生物和类似物使用。可以在所述方法中使用的细胞或组织优选地是在前文实施方案中描述的本发明宿主细胞、植物细胞或植物组织。
因而，在又一个实施方案中，本发明涉及根据鉴定本发明拮抗物的方法所获得或鉴定的化合物，所述化合物是本发明多肽的拮抗物。
因而，在一个实施方案中，本发明还涉及通过用于鉴定本发明化合物的方法获得的化合物。
所述的化合物例如是本发明多肽的拮抗性同源物。在本发明方法中待减少的多肽的拮抗性同源物可以通过诱变产生，例如对本发明多肽的离散点突变或截短。如本发明中所用，术语“拮抗性同源物”指变体形式的蛋白质，其充当本发明多肽的活性的拮抗物。如表II第5列或第7列中所述或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码的蛋白质的拮抗物已经至少部分地丧失本发明多肽的生物学活性。特别地，所述拮抗物引起表II第5列或第7列中所述或由包含如表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子或其如本文中所述同源物编码的多肽的表达水平降低，并且所述拮抗物在生物或其部分中的表达引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。在这个意义上的典型的拮抗物将是显性失活形式的在本发明方法中待降低其活性的核酸分子或多肽，例如仍可以参与蛋白质复合体但不再能够履行其原始生物学功能例如酶功能并几乎使该完整复合体失活的蛋白质。
在一个实施方案中，本发明涉及特异性识别本发明化合物或拮抗物的抗体。
本发明也涉及包含本发明前述核酸分子、反义核酸分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、载体、蛋白质、抗体或化合物至少之一和任选地用于检测的合适手段的诊断组合物。
本发明的诊断组合物适用于从细胞分离mRNA并使如此获得mRNA与包含如上文所述核酸探针的探针在杂交条件下接触，检测与该探针杂交的mRNA的存在性，并且因而检测该细胞中蛋白质的表达。检测本发明蛋白质存在性的其他方法包括本领域熟知的免疫技术，例如酶联免疫吸附测定。用于检测的合适手段是本领域技术人员熟知的，例如用于杂交测定的缓冲液和溶液，例如前述溶液和缓冲液，如在例如Sambrook等人中描述的用于DNA印迹、蛋白质印迹、RNA印迹等的其他手段是已知的。在一个实施方案中，诊断组合物含有PCR引物，其中将所述PCR引物设计成特异性检测在本发明的方法中待降低的核酸分子(例如本发明的核酸分子)的现有水平或表达水平或区分本发明或在本发明方法中待降低其活性的核酸分子的不同变体或等位基因。
在另一个实施方案中，本发明涉及试剂盒，该试剂盒包含本发明核酸分子、载体、宿主细胞、多肽或反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子或核酶分子或病毒核酸分子、抗体、植物细胞、植物或植物组织、可收获部分、繁殖材料和/或根据本发明方法鉴定的化合物和/或拮抗物。
本发明试剂盒的化合物可以包装在容器如小瓶中，任选地在缓冲液和/或溶液中。根据需要，所述组分之一者或多者可能包装在一个且相同的容器中。另外或备选地，所述组分之一者或多者可以吸附至固体支持物，如硝化纤维素滤器、玻璃平板、芯片或尼龙膜或吸附至微量滴定平板的板孔上。该试剂盒可以用于本文所述的任意方法和实施方案，例如用于产生宿主细胞、转基因植物、药物组合物、检测同源序列、鉴定拮抗物或激动剂，作为食物或饲料或作为其补充物或作为用于处理植物等的补充物。
另外，该试剂盒可以包含该试剂盒用于任意所述实施方案、尤其用于产生生物或其部分的说明书，其中所述的生物或其部分具有与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
在一个实施方案中，所述试剂盒还包含编码一种或多种前述蛋白质的核酸分子，和/或抗体、载体、宿主细胞、反义核酸、植物细胞或植物组织或植物。在另一个实施方案中，所述试剂盒包含旨在检测和区分在本发明的方法中待降低的核酸分子例如本发明的核酸分子的PCR引物。
在又一个实施方案中，本发明涉及用于产生农业用组合物的方法，所述方法提供了根据本发明方法使用的核酸分子、本发明的核酸分子、本发明的载体、本发明的反义、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或抗体、本发明的病毒核酸分子或多肽或包括用于鉴定所述化合物或拮抗物的本发明方法的步骤；和配制本发明的核酸分子、载体或多肽或拮抗物或根据本发明方法鉴定的化合物或以可用作植物农业用组合物的形式使用本发明的主题。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于产生支持性植物培养组合物的方法，该方法包括本发明方法的步骤；和将鉴定的化合物以农业用组合物可接受的方式配制。
“作为农业用组合物可接受的”理解为该组合物符合管理杀真菌剂、植物营养物、除草剂等内容的法律。优选地，这种组合物对受保护的植物和以之为食的动物(包括人)没有任何伤害。
本文所公开的核酸分子，尤其如表IA或B的第5列或第7列中所述的核酸具有多种用途。首先，它们可以用来鉴定生物或其近缘亲属。另外，它们可以用来鉴定混合植物群体中该生物或其近缘亲属的存在性。通过在严格条件下用覆盖本发明基因中对该基因为独特的某个区域的探针探测独特或混合植物群体的培养物的基因组DNA提取物，可以确定是否已经使用了本发明或本发明或其近缘亲属是否存在。
另外，本文所公开的核酸分子，尤其如表IA或B的第5列或第7列中所述的核酸，可以充分地同源于相关物种的序列，从而这些核酸分子可以充当标记用于构建相关生物中的基因组图谱或用于联合作图。另外，与本文所公开核酸或其同源物、尤其如表IA或B的第5列或第7列中所述核酸分子相应的基因组区域内的天然变异可以导致本文所公开的蛋白质及其同源物的活性、尤其包含如表IIA或B的第5列或第7列中所述多肽或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的蛋白质的活性变异，并且因而产生天然变异。
因而，天然变异最终也以活性较低的等位变体形式存在，其中所述的等位变体已经引起相对提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。
因而，本发明涉及用于育种植物的方法，包括a)选择通过降低、阻抑、减少或缺失在本发明方法中降低其活性(如本文所公开)的多肽或核酸分子的表达而与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的第一植物变种，所述的多肽或核酸分子尤其是包含如表IA或B的第5列或第7列中所述核酸分子的核酸分子或包含如表IIA或B的第5列或第7列中所述多肽或包含如表IV第7列中所述共有序列或多肽基序的多肽或其如本文中所述同源物；b)将与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高与编码所述多肽或所述核酸分子的基因的表达水平或基因组结构关联；c)将第一植物变种与在环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产方面明显不同的第二植物变种杂交；和d)通过分析环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产的水平或所述多肽或核酸分子的表达或编码本发明所述多肽或核酸分子的基因的基因组结构，鉴定哪个后代变种已经获得与相应的非转化野生型植物相比较而言提高的环境胁迫耐受性和/或抗性和提高的生物量生产。在一个实施方案中，根据步骤(b)的基因的表达水平降低。
本发明的核酸分子也用于进化研究和蛋白质结构研究。通过将序列如表I第5列或第7列中所述序列与编码来自其它生物的相似酶的序列比较，可以评估该生物的进化相关性。类似地，这种比较允许评估该序列的哪些区域保守而哪些区域不保守，这可能有助于确定蛋白质中对酶功能为必需的那些区域。该类型的确定对于蛋白质工程研究是有价值的，并且可以提供该蛋白质可以耐受何种诱变而不丧失功能的线索。
因而，本文所公开核酸分子或其同源物、例如根据本发明方法待降低其活性(例如在表I第5列或第7列中所述)的核酸分子，可以用于鉴定其他核酸，其中所述的其他核酸在降低、阻抑、减少或缺失它们的表达后引起与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高。
另外，本文所公开的例如根据本发明方法待降低其活性(例如在表I第5列或第7列中所述)的核酸分子或其同源物、尤其本发明的核酸分子，或引起所编码表达产物(例如本发明多)表达的片段或基因可以用于标记辅助育种或环境胁迫耐受性和/或抗性和生物量生产相关性状的联合作图。
公开了这些实施方案和其他实施方案被并且它们由本发明的说明书和例子包括。
使用例如电子装置，可以从公共图书馆调取有关根据本发明待使用的方法、用途和化合物中任一者的其他文献。
例如可以使用公用数据库“Medline”，该数据库在互联网上可用，例如在hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.html上。其他数据库和地址如hftp://www.ncbi.nlm.nih.gov/，hftp://www.infobiogen.fr/，hftp://www.fmi.ch/biology/research-tools.html，hftp://www.tigr.org/是本领域技术人员已知的并且也可以使用例如hftp://www.lycos.com获得。用于追溯检索和用于现况了解的生物技术专利综述和相关专利信息调查在Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中给出。
本发明通过以下实施例和附图(图1-3)说明：
实施例
通过失活或下调胁迫相关基因工程化拟南芥植物
载体制备
基于改良的pPZP双元载体骨架(包含用于细菌选择的卡那霉素基因；Hajdukiewicz，P.等人，1994，Plant Mol.Biol.，25：989-994)和受mas2′1′和mas271f启动子(Velten等人，1984，EMBO J.3，2723-2730；Mengiste，Amedeo和Paszkowski，1997，Plant J.，12，945-948)驱动的选择标记bar-基因(De Block等人，1987，EMBO J.6，2513-2518)构建双元敲除载体。用于插入诱变的所得载体是pMTX1a300SEQ ID NO：1。
可用于插入诱变的其他双元载体的实例是pBIN19、pBI101、pBinAR、pSun或pGPTV。对于双元载体及其具体特征的概览在Hellens等人，2000，Trends in plant Science，5：446-451和在GuerineauF.，Mullineaux P.，1993，Plant transformation and expression vectors inplant molecular biology，LABFAX丛书，(Croy R.R.D.编辑)第121-127页，Bios Scientific Publishers，Oxford中给出。
农杆菌的转化
使用热休克法或电穿孔法，将所述质粒转化到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)(GV3101pMP90；Koncz和Schell，1986Mol.Gen.Genet.204：383-396)中。转化的菌落在28℃于YEB培养基上培育并由相应抗生素(Rif/Gent/Km)选择2日。这些农杆菌细菌培养物用于植物转化。
生态型C24拟南芥根据标准条件(Bechtold，N.，Ellis，J.，Pelletier，G.1993.通过浸润拟南芥植物的植物内农杆菌介导基因转移(Inplanta Agrobacterium mediated gene transfer by infiltration of Arabidopsisthaliana plants)，C.R.Acad.Sci.Paris 316：1194-1199；Bent，A.F.，Clough，J.C.，1998；成花浸渍法：用于农杆菌介导转化拟南芥的简化方法(Floraldip：a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis thaliana)，PLANT J.16：735-743)培育和转化。
通过利用它们的相应抗性标记选择转化植物(F1)。在
Figure GPA00001008527701991
抗性的情况下，用0.02％
Figure GPA00001008527701992
以2至3日间隔喷洒小植物4次并且允许转化的植物产生种子。50-100株籽苗(F2)再次进行标记选择，在BASTA抗性的情况下，通过连续4日在小植物期期间用0.1％
Figure GPA00001008527701993
喷洒进行。选择对单个抗性基因座分离的植物(抗性籽苗对敏感籽苗大约3∶1)用于进一步分析。再次允许来自这些品系的3株抗性籽苗(F2)产生种子并且通过在含有选择剂(
Figure GPA00001008527701994
，15mg/L草铵膦，Pestanal，Riedel deHaen，Seelze，德国)的琼脂培养基上体外萌发它们的种子(F3)检验其纯合性。显示几乎100％抗性后代(F3)的那些F2品系视为纯合子并用于功能性分析。
对胁迫耐受性和提高的生物量的测量
转化的拟南芥植物各自在生长室(York
Figure GPA00001008527702001
GmbH，曼海姆，德国)内于含有土壤和石英砂4∶1(v/v)混合物的花钵中培育。为诱导萌发，将播种的种子在4℃于黑暗中保持3日。随后，将条件改变至20℃/6℃白昼/黑夜温度，16/8小时昼夜循环，150μE/m2s，持续3日。标准生长条件是：16小时白昼和8小时黑夜的光周期，20℃，60％相对湿度和200μE光子流密度。每日给植物浇水直至它们大约3周龄，此时通过停水施加干旱。在停水大约12日后，大部分植物显示损伤的视观症状，如萎蔫和叶褐变，而将耐受性或抗性植物鉴定为在视观上饱满并在颜色上呈健康绿色。与野生型和近邻植物连续比较5-6日，对植物就干旱症状和生物量生产进行评分。
进行了连续3个实验。在第一实验中，检验了每个转化品系的一个个体。
在第二实验中，使下述品系经受根据相同实验流程的验证筛选，其中所述品系已经在第一实验中被评定为干旱耐受性或抗性，即比野生型对照存活更长并且与野生型和邻近植物相比显示提高的生物量生产。在这个实验中，如前述培育、处理和评定每个耐受性或抗性品系的最多10株植物。
在头两个实验中，与近邻和野生型植物相比测量抗性或耐受性生物量生产。
在第三实验(表1)中，如前述培育、处理和评定每个已证实的耐受品系(即已经在第二实验中被评定为干旱耐受性或抗性耐受品系的那些耐受品系)的15个复制物。
在第三实验中，在干旱大约10日后，试验中的对照(未转化的拟南芥)和大多数转化品系显示胁迫的极端视观症状，包括坏死和细胞死亡。几株转化植物仍保留活力，这由其饱满外观和维持绿颜色所证实。
表1表1对3周龄植物施加干旱胁迫后，转化的拟南芥的存活持续期和生物量生产。以目视方式隔日测量干旱耐受性和生物量生产。平均性能是比野生型对照存活更长的转基因植物的平均数。最大性能是任意单个转化植物比野生型对照存活更长的最长时间段。平均生物量是转基因植物与野生型对照和近邻植物相比提高生物量的平均日数。最大生物量是转任意单个转化植物与野生型对照和近邻植物相比显示生物量提高的最长时间段。表1
SeqID 基因座 平均性能 最大性能   平均生物量   最大生物量
  1418   At5g50870   2.7   5   0.6   2
  1025   At4g31120   4.7   5   0.5   5
  729   At3g14230   1.8   4   1.2   3
  27   At1g12110   3   5   1.8   3
  104   At1g13270   2.9   5   1.4   3
  190   At1g27080   2.9   5   1.3   2
  512   AT1G58360   2.5   4   1   2
  1464   At5g60780   2.4   5   1.3   3
  813   At3g54920   2.7   4   1   3
  673   AT2G03670   2.8   5   1.5   4
  27   At1g12110   2.7 5   1.7   4
  512   AT1G58360   2.9 5   1.4 2
SeqID 基因座 平均性能 最大性能   平均生物量   最大生物量
  1385   At5g40590   2.5   5   0.9   2
  410   At1g33760   2.7   5   1.2   4
  923   At4g13430   2.5   5   1.3   4
  1593   At5g66160   4   5   0.1   0.1
  1083   At5g02330   2.2   4   1   3
  1551   At5g64070   2.3   4   0.7   2
  1650   At3g55990   4.5   5   2.2   4
对所选择抗胁迫品系的分析由于对所述品系就抗性标记的单个插入基因座和纯合位置进行预选择，故通过整合T-DNA破坏(突变)各单个基因预期导致抗胁迫表型。选择显示一致表型的品系用于分子分析。
使用标准方法(来自德国希尔顿Qiagen离心柱或来自德国弗莱堡Nucleon Phytopure试剂盒)，从大约100mg源于这些品系的叶组织中纯化基因组DNA。使用两种不同方法，完成T-DNA插入侧的扩增。通过Spertini D，Béliveau C.和Bellemare G.，1999，Biotechniques，27，308-314的衔接头PCR法，分别地将T-DNA特异性引物LB1(5’-TGA CGCCAT TTC GCC TTT TCA-3’；SEQ ID NO：4)或RB 1-2(5’-CAA CTTAAT CGC CTT GCA GCA CA-3’；SEQ ID NO：5)用于第一PCR并将T-DNA特异性引物LB2(5’-CAG AAA TGG ATA AAT AGC CTT GCTTCC-3’；SEQ ID NO：6)或RB4-2(5’-AGC TGG CGT AAT AGC GAAGAG-3’；SEQ ID NO：7)用于第二PCR。备选地，进行TAIL-PCR(LiuY-G，Mitsukawa N，Oosumi T和Whittier RF，1995，Plant J.8，457-463)。在这种情况下，对于第一PCR使用LB1(5’-TGA CGC CAT TTC GCCTTT TCA-3’，SEQ ID NO：4)或RB1-2(5’-CAA CTT AAT CGC CTTGCA GCA CA-3’；SEQ ID NO：5)，对于第二PCR使用LB2(5’-CAGAAA TGG ATA AAT AGC CTT GCT TCC-3’；SEQ ID NO：6)或RB4-2(5’-AGC TGG CGT AAT AGC GAA GAG-3’，SEQ ID NO：7)并且对于最后PCR使用LB3(5’-CCA ATA CAT TAC ACT AGC ATC TG-3’；SEQ ID NO：8)或RB5(5’-AAT GCT AGA GCA GCT TGA-3’；SEQ IDNO：9)分别作为T-DNA左边界或右边界的T-DNA特异性引物。
适宜的PCR-产物在琼脂糖凝胶上鉴定并且利用柱和标准方法(Qiagen，Hilden，德国)纯化。PCR产物用相对于扩增所用引物而指向所述边界存在的额外T-DNA-特异性引物测序。对于含有左边界序列的衔接头PCR产物，引物LBseq(5’-CAA TAC ATT ACA CTA GCA TCT G-3’；SEQ ID NO：10)，并且对于含有右边界序列的序列，引物RBseq(5’-AGA GGC CCG CAC CGA TCG-3’；SEQ ID NO：11)用于测序反应。对于含有左边界序列的TAIL PCR产物，引物LBseq2(5’-CTA GCA TCTGAA TTT CAT AAC C-3’；SEQ ID NO：12)，并且对于含有右边界序列的PCR产物，引物RBseq2(5’-GCT TGA GCT TGG ATC AGA TTG-3’；SEQ ID NO：13)用于测序反应。使用blast算法(Altschul等人，1990.J MolBiol，215：403-410)，将所得序列与从Genbank可获得的拟南芥基因组序列比较。
下表2中给出关于用来鉴定基因组基因座的PCR产物的其他细节。标出了拟南芥基因组中已鉴定的注释的可读框，所获得PCR产物的预期大小(碱基对为单位)、对其进行扩增的T-DNA边界(LB：左边界，RB：右边界)、产生所示PCR产物的方法(解释见上文)、衔接头PCR情况下的相应限制酶和TAIL PCR情况下的简并引物。使用常规方式简并的引物ADP2(5’-NGT CGA SWG ANA WGA A-3’；SEQ ID NO：14)、ADP3(5’-WGTGNAGWANCANAGA-3’；SEQ ID NO：15)、ADP5(5’-STT GNT AST NCT NTG C-3’；SEQ ID NO：16)、ADP6(5’-AGWGNAGWANCANAGA-3’；SEQ ID NO：17)、ADP8(5’-NTGCGASWGANWAGAA-3’；SEQ ID NO：18)、ADP9(5’-NTG CGA SWG ANT AGA A-3’；SEQ ID NO：19)和ADP11(5’-SST GGS TAN ATW ATW CT-3’；SEQ ID NO：20)。
在每种情况下，使用上文提及的T-DNA-特异性引物之一和从已鉴定的基因组基因座中推导的靠近插入侧的引物，通过对照PCR证实插入基因座的鉴定结果。使用这些成双引物从插入品系扩增出预期大小的PCR-产物，这证明通过T-DNA整合破坏了鉴定的基因座。
表2关于PCR产物的细节，其中所述PCR产物用来鉴定与相应的非转化野生型植物相比较而言显示环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的品系中下调的基因。下调的基因由其TAIR基因座(基因座)定义。表2PCR产物
  SEQ ID   基因座   边界   方法   限制酶或简并引物
  1418   At5g50870   RB   衔接法   MunI
  1025   At4g31120   LB   衔接法   SpeI
  729   At3g14230   LB   衔接法   BglII
  27   At1g12110   LB   衔接法   BglII
  104   At1g13270   LB   衔接法   MunI
  190   At1g27080   RB   衔接法   Psp1406I/Bsp119I
  512   AT1G58360   RB   衔接法   MunI
  1464   At5g60780   LB   衔接法   Psp1406I/Bsp119I
  813   At3g54920   LB   衔接法   BglII
  SEQ ID   基因座   边界   方法   限制酶或简并引物
  673   AT2G03670   LB   衔接法   BglII
  27   At1g12110   LB   衔接法   BglII
  512   AT1G58360   RB   衔接法   MunI
  1385   At5g40590   LB   衔接法   SpeI
  410   At1g33760   LB   衔接法   SpeI
  923   At4g13430   LB   衔接法   Psp1406I/Bsp119I
  1593   At5g66160   RB   衔接法   SpeI
  1083   At5g02330   LB   衔接法   MunI
  1551   At5g64070   RB   衔接法   SpeI
  1650   At3g55990   LB   衔接法   Psp1406I/Bsp119I
列1指已经敲除的基因的SEQ ID NO.，列2指敲除基因的TAIR基因座(基因座)，列3指对其扩增PCR产物的T-DNA边界，列4指用于扩增的PCR方法并且列5指在PCR方法中使用的简并引物的限制酶(对于第4和5列的详细解释，见上文；APX意指引物AP2、引物AP5、引物AP6、引物AP9或引物AP11)。
用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1025的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：104的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：190的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：410的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：512的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：673的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：729的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：923的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1083的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1385的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1418的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1464的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1551的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1593的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：813的基因)的活性或表达的反义构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1650的基因)的活性或表达的反义构建体的构建
通过PCR扩增SEQ ID NO：1025的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：104的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：190的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：410的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：512的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：673的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：729的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：27的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：923的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1083的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1385的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1418的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1464的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1551的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1593的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：813的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。通过PCR扩增SEQ ID NO：1650的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于基因方向的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相反。
表III第5列的横行中所示序列的片段的扩增可以使用与相同表III中相应同一横行中第7列中显示的那些引物进行，所述引物包含延伸部分5’-ATACCCGGG-3’(SEQ ID NO：21)或5’-ATAGAGCTC-3’(SEQ ID NO：22)。延伸部分5’-ATACCCGGG-3’(SEQ ID NO：21)或5’-ATAGAGCTC(SEQ ID NO：22)分别含有用于克隆目的的XmaI和SacI限制酶识别位点。
所述寡核苷酸在水中溶解以产生20μM浓度。PCR反应含有5μl Herculase缓冲液(Stratagene)、0.4μl dNTP(各25mM)(Amersham)、0.5μl各个引物、0.5μl Herculase(Stratagene)、0.5μlgDNA和42.6μl水。PCR在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上按照以下程序进行：4分钟94℃，随后30个循环：1分钟94℃，1分钟50℃，2分钟72℃，随后10分钟72℃并冷却至25℃。
PCR产物可以使用来自Qiagen的试剂盒进行纯化。该DNA随后用XmaI/SacI在37℃消化过夜。该片段随后可以克隆到用XmaI/SacI消化的载体1bxPcUbicolic SEQ ID NO：2。
用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1025的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：104的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：190的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：410的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：512的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：673的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：729的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：923的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1083的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1385的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1418的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1464的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1551的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1593的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：813的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1650的基因)的活性或表达的RNAi构建体的构建
通过PCR扩增SEQ ID NO：1025的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：104的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：190的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：410的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：512的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：673的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：729的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：27的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：923的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1083的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1385的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1418的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1464的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1551的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1593的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：813的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。通过PCR扩增SEQ ID NO：1650的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而将该片段中作为反向重复序列在所述载体导入2次，所述重复序列被DNA间隔区隔开。
表III第5列的横行中所示序列的片段的扩增可以使用与相同表III中相应同一横行中第7列中显示的那些引物进行，所述引物包含延伸部分5’-ATAGGTACC-3’(SEQ ID NO：23)或5’-ATAGTCGACC-3’(SEQ ID NO：24)。延伸部分5’-ATAGGTACC-3’(SEQ ID NO：23)或5’-ATAGTCGAC-3’(SEQ ID NO：24)分别含有用于克隆目的的Asp718和SalI限制酶识别位点。
所述寡核苷酸在水中溶解以产生20μM浓度。PCR反应含有5μl Herculase缓冲液(Stratagene)、0.4μl dNTP(各25mM)(Amersham)、0.5μl各个引物、0.5μl Herculase(Stratagene)、0.5μlgDNA和42.6μl水。PCR在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上按照以下程序进行：4分钟94℃，随后30个循环：1分钟94℃，1分钟50℃，2分钟72℃，随后10分钟72℃并冷却至25℃。
PCR产物可以使用来自Qiagen的试剂盒进行纯化。该DNA随后用Asp718/SalI在37℃消化过夜。该片段随后可以克隆到用Asp718/SalI消化的载体10xPcUbispacer SEQ ID NO：3。所得构建体用XhoI/BsrGI消化并且将Asp718/SalI消化的相同PCR片段连接到该载体中。随后，将产生BASTA抗性的表达盒作为XbaI片段连接到事先用XbaI切开并去磷酸化的这个载体中。
用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1025的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：104的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：190的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：410的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：512的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：673的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：729的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：923的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1083的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1385的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1418的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1464的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1551的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1593的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：813的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建用于阻抑基因(例如包含SEQ ID NO：1650的基因)的活性或表达的共抑制构建体的构建
通过PCR扩增SEQ ID NO：1025的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：104的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：190的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：410的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：512的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：673的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：729的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：27的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：923的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1083的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1385的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1418的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1464的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1551的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1593的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：813的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。通过PCR扩增SEQ ID NO：1650的片段。为了能够克隆PCR产物，可以将限制性位点添加至用于扩增的引物。备选地，可以将重组位点添加至所述引物以能够进行重组反应。将PCR片段以如此方式克隆或重组到双元载体中，优选地处在组成型、组织特异性或发育特异性强启动子控制下，从而相对于所述启动子的取向与该基因在其原始基因组位置中具有的方向相同。
表III第5列的横行中所示序列的片段的扩增使用与相同表III中相应同一横行第7列中显示的那些引物进行，所述引物包含延伸部分5’-ATACCATGG-3’(SEQ ID NO：25)或5’-ATATTAATTAA-3’(SEQID NO：26)。延伸部分5’-ATACCATGG-3’(SEQ ID NO：25)或5’-ATATTAATTAA-3’(SEQ ID NO：26)分别含有用于克隆目的NcoI和PacI限制酶识别位点。
所述寡核苷酸在水中溶解以产生20μM浓度。PCR反应含有5μl Herculase缓冲液(Stratagene)、0.4μl dNTP(各25mM)(Amersham)、0.5μl各个引物、0.5μl Herculase(Stratagene)、0.5μlgDNA和42.6μl水。PCR在MJ-Cycler Tetrad(BioZym)上按照以下程序进行：4分钟94℃，随后30个循环：1分钟94℃，1分钟50℃，2分钟72℃，随后10分钟72℃并冷却至25℃。
PCR产物使用来自Qiagen的试剂盒进行纯化。该DNA随后用NcoI/PacI在37℃消化过夜。该片段随后可以克隆到用NcoI/PacI消化的载体1bxPcUbicolic SEQ ID NO：2。
通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1025的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：104的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：190的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：410的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：512的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：673的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：729的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：27的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：923的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1083的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1385的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1418的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1464的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1551的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1593的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：813的基因)的活性或表达通过人工转录因子降低基因(例如包含SEQ ID NO：1650的基因)的活性或表达
基因和其在其他物种中的同源ORF也可以通过导入合成的特定阻抑物下调。为此目的，构建了用于嵌合锌指蛋白的基因，其与目的基因或目的基因在其他物种中的同源物的调节区域或编码区内的特定区域结合。人工的锌指蛋白包含由例如锌指和任选的阻抑结构域如EAR结构域(Hiratsu等人，2003.Plant J.34(5)，733-739拟南芥中通过包含阻抑结构域EAR基序的嵌合阻抑物显性阻抑靶基因(Dominant repression oftarget genes by chimeric repressors that include the EAR motif，arepression domain，in Arabidopsis))组成的特异性DNA结合结构域。
这种嵌合阻抑物例如在植物中的表达随后引起靶基因或靶基因在其他植物物种中的同源物的特异性阻抑，导致代谢物生产增加。实验细节，尤其关于设计和构建特定锌指结构域的实验细节，可以如WO01/52620或Ordiz MI(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，第99卷，第20期.13290)或Guan，(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2002，99卷，第20期.13296)所描述那样实施。
通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1025的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：104的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：190的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：410的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：512的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：673的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：729的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：27的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：923的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1083的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1385的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1418的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1464的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1551的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1593的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：813的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物通过阻抑黑麦草中基因(例如与包含SEQ ID NO：1650的基因同源的基因)的活性或表达工程化黑麦草植物
可以使用几种不同黑麦草品种的种子作为外植体来源用于转化，所述品种包括可从Svalof Weibull种子公司获得的商业品种Gunne或品种Affinity。种子依次用1％吐温20持续1分钟、100％漂白剂持续60分钟、用去离子水和蒸馏H2O漂洗3次(每次5分钟)进行表面消毒，并且随后在潮湿、无菌的滤纸上在黑暗中萌发3-4日。籽苗再次用1％吐温20持续1分钟、75％漂白剂持续5分钟、用dd H2O漂洗3次(每次5分钟)进行表面消毒。
将表面消毒的种子置于含有Murashige和Skoog基础盐和维生素、20g/l蔗糖、150mg/l天冬酰胺、500mg/l酪蛋白水解物、3g/l植物凝胶、10mg/l BAP和5mg/l麦草畏的愈伤组织诱导培养基上。将平板在25℃于黑暗中孵育4周以萌发种子和诱导胚发生愈伤组织。
在愈伤组织诱导培养基上4周后，剪去籽苗的幼枝和根，将愈伤组织转移至新鲜培养基，维持培养另外4周，并且随后转移至MSO培养基在光照下2周。使几片愈伤组织(11-17周龄)滤过10目筛并置于愈伤组织诱导培养基上，或在250烧瓶内的100ml液体黑麦草愈伤组织诱导培养基(与具琼脂的用于愈伤组织诱导的培养基相同)中培养。烧瓶用箔片包裹并在23℃于黑暗中175转/分钟振摇1周。用40目筛过滤液体培养物以收集细胞。将筛子上所收集的部分涂布在固体黑麦草愈伤组织诱导培养基上并在25℃于黑暗中培养1周。随后将愈伤组织转移至含有1％蔗糖的MS培养基并在其上培养2周。
转化可以用农杆菌或用粒子轰击方法完成。在pUC载体中产生含有组成型或适宜的植物启动子和反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、重组构建体或核酶分子或病毒核酸分子、核酸构建体的表达载体。使用Qiagen试剂盒根据制造商说明书，从大肠杆菌细胞制备质粒DNA。大约2g胚发生愈伤组织涂布在培养皿中的无菌滤纸的中央。含10g/l蔗糖的一等份液体MSO添加至该滤纸上。金粒子(大小1.0μm)根据Sanford等人1993年的方法用质粒DNA涂敷并按照以下参数递送至胚发生愈伤组织：500μg粒子和2μg DNA/每次射击，1300psi和从终止平板至愈伤组织平板的靶距离8.5cm并且1次射击/每个愈伤组织平板。
轰击后，将愈伤组织转移回至新鲜愈伤组织发育培养基并在黑暗中在室温维持1周时间。随后将愈伤组织转移至光照下在25℃的生长条件，用合适的选择剂如250nM咪唑烟酸(Arsenal)、5mg/l PPT或50mg/L卡那霉素启动胚分化。抵抗所述选择剂的幼枝出现并且一旦生根，则转移至土壤。
原代转基因植物(T0)的样品通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交证实，在所述Southern杂交中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)来通过PCR制备洋地黄甙标记的探针并且如制造商推荐那样使用。另外，通过标准方法如RNA印迹法或定量RTPCR对原代转基因植物(T0)分析待阻抑的基因的受阻抑表达。
转基因T0黑麦草植物通过切下分蘖以营养方式繁殖。在温室中维持移植的分蘖2个月直至充分建立。使幼苗脱叶并允许其生长2周。
通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1025的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：104的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：190的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：410的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：512的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：673的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：729的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：27的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：923的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1083的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1385的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1418的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1464的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1551的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1593的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：813的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物通过阻抑大豆中基因(例如与包含SEQ ID NO：1650的基因同源的基因)的活性或表达工程化大豆植物
可以根据对Texas A&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。通过在70％(v/v)乙醇浸泡6分钟并且补充有0.1％(v/v)吐温的25％商业漂白剂(NaOCl)中浸泡20分钟消毒，随后用无菌重蒸水漂洗4次，将种子消毒。从繁殖成7日龄籽苗的每株籽苗去掉胚根、下胚轴和一片子叶。随后，带有一片子叶的上胚轴转移至培养皿中的新鲜萌发培养基并在25℃在16小时光周期下(大约100μE-m-2s-1)孵育3周。从3至4周龄的植物切下腋生结节(长度约4mm)。将腋生结节切下并在农杆菌LBA4404培养物中孵育。
已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体系统(例如An，G.在Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑，Humana Press，Totowa，New Jersey)。多种双元载体基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic Acid Research.1984.12：8711-8721)，所述pBIN19载体包括侧翼分布有源自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因-选择标记基因和植物启动子组成，其中所述的植物启动子调节反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、核酶分子或病毒核酸分子的转录。如上所述，可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利5,767,366和6,225,105)。类似地，可以使用多种启动子来调节阻抑盒以如上所述提供对基因转录的组成型、发育性、组织或环境性阻抑。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对阻抑盒的组成型阻抑。
在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至补充有500mg/L特美汀的选择培养基。切下苗并置于苗伸长培养基上。将长度超过1cm的苗置于生根培养基2至4周，随后移植至土壤。
原代转基因植物(T0)通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交证实，在所述Southern杂交中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)来通过PCR制备洋地黄甙标记的探针并且如制造商推荐那样使用。另外，通过标准方法如RNA印迹法或定量RTPCR对原代转基因植物(T0)分析待阻抑的基因的受阻抑表达。
通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1025的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：104的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：190的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：410的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：512的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：673的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：729的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：27的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：923的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1083的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1385的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1418的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1464的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1551的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1593的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：813的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物通过阻抑谷物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1650的基因同源的基因)的活性或表达工程化谷物植物
玉米的转化用Ishida等人(1996).Nature Biotech 14745-50所述方法的改良方法进行。在谷物中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源(Fromm等人，1990Biotech8：833-839)，不过其他基因型也可以成功地使用。从授粉后大约11日(DAP)的谷物植物收获谷穗，此时不成熟胚的长度是约1至1.2mm。将不成熟胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并且通过器官发生作用恢复转基因植物。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。载体可以如所述那样构建。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6025541)。类似地，可以使用多种启动子来调节阻抑盒以提供反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体或核酶分子或病毒核酸分子的组成型、发育性、组织或环境性表达。在本实施例中，使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对阻抑盒的组成型表达。
切下的胚在愈伤组织诱导培养基上培育，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的玉米再生培养基上培育。培养板在25℃于光照下孵育2至3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2至3周，直至根发育。生根的苗移植至温室中的土壤内。从显示耐受咪唑啉酮除草剂并显示待阻抑基因的表达受阻抑的植物产生T1种子。这种分析可以通过标准方法如RNA印迹法或定量RTPCR法进行。
T-DNA单基因座插入的T1世代可以对转基因以3∶1比率分离。含有一个或两个拷贝的转基因的那些子代耐受咪唑啉酮除草剂。纯合T2植物可以显示与T1植物相似的表型。纯合转基因植物和非转基因植物的杂交植物(F1子代)也可以显示提高的相似表型。
通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1025的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：104的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：190的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：410的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：512的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：673的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：729的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：27的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：923的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1083的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1385的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1418的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1464的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1551的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1593的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：813的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物通过阻抑小麦中基因(例如与包含SEQ ID NO：1650的基因同源的基因)的活性或表达工程化小麦植物
用Ishida等人(1996，Nature Biotech.14745-50)所述的方法开展小麦转化。栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CYMMIT获得)通常用于转化中。不成熟的胚与携带“超级双元”载体的根癌农杆菌共培养，并且通过器官发生作用恢复转基因植物。日本烟草的超级双元载体系统在WO专利WO94/00977和WO95/06722中描述。载体可以如所述那样构建。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的玉米基因(美国专利6,025,541)。类似地，可以使用多种启动子来调节阻抑盒以提供反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体或核酶分子或病毒核酸分子的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对阻抑盒的组成型表达。
在与农杆菌孵育后，胚在愈伤组织诱导培养基上培育，随后在含有咪唑啉酮作为选择剂的再生培养基上培育。培养板在25℃于光照下孵育2至3周，或直至苗发育。将绿色苗从每个胚转移至生根培养基并在25℃孵育2至3周，直至根发育。生根的苗移植至温室中的土壤内。从显示耐受咪唑啉酮除草剂并显示待阻抑基因的表达受阻抑的植物产生T1种子。这种分析可以通过标准方法如RNA印迹法或定量RTPCR法进行。
T-DNA单基因座插入的T1世代可以对转基因以3∶1比率分离。含有一个或两个拷贝的转基因的那些子代耐受咪唑啉酮除草剂。纯合的T2植物显示相似的表型。
通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQID NO：1025的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：104的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：190的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：410的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：512的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：673的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：729的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：27的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：923的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1083的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1385的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1418的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1464的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1551的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1593的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：813的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物通过阻抑油菜籽/卡诺拉油菜植物中基因(例如与包含SEQ ID NO：1650的基因同源的基因)的活性或表达工程化油菜籽/卡诺拉油菜植物植物
使用5-6日龄年幼籽苗的子叶柄和下胚轴作为组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，Plant Cell Rep 17：183-188)转化。商业品种Westar(Agriculture Canada)是用于转化的标准品种，不过可以使用其他品种。
含有双元载体的根癌农杆菌LBA4404用于卡诺拉油菜转化。已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体(例如An，G.在Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑，Humana Press，Totowa，NewJersey)。多种双元载体基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic AcidResearch.1984.12：8711-8721)，所述pBIN19载体包含侧翼分布有源自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因-选择标记基因和调节性状基因的阻抑表达盒转录的植物启动子组成。可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利57673666和6225105)。类似地，可以使用多种启动子来调节阻抑盒以提供反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、核酶分子或病毒核酸分子的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对阻抑盒的组成型表达。
卡诺拉油菜种子在70％乙醇中持续2分钟，随后在含一滴吐温20的30％Clorox中持续10分钟进行表面消毒，随后用消毒蒸馏水漂洗3次。种子随后在不含激素、1％蔗糖、0.7％植物琼脂的半浓度MS培养基上，在23℃16小时光照下体外萌发5日。从体外籽苗切下带子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切口端浸入细菌混悬液而用农杆菌接种。所述外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/l BAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/l BAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗长度是5至10mm时，切下这些苗并转移至苗伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/l BAP)。将长度大约2cm的苗转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。
原代转基因植物(T0)的样品通过PCR分析以证实T-DNA的存在。这些结果通过Southern杂交证实，在所述Southern杂交中将DNA在1％琼脂糖凝胶上电泳并转移至带正电荷的尼龙膜(Roche Diagnostics)。使用PCR DIG探针合成试剂盒(Roche Diagnostics)来通过PCR制备洋地黄甙标记的探针并且如制造商推荐那样使用。另外，通过标准方法如RNA印迹法或定量RTPCR对原代转基因植物(T0)分析待阻抑的基因的受阻抑表达。
通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1025的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：104的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：190的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：410的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：512的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：673的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：729的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：27的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：923的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1083的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1385的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1418的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1464的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1551的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1593的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：813的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物通过阻抑苜蓿中基因(例如与包含SEQ ID NO：1650的基因同源的基因)的活性或表达工程化苜蓿植物
使用McKersie等，1999Plant Physiol 119：839-847的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(Agriculture Canada)或如Brown DCW和A Atanassov(1985.Plant Cell Tissue Culture 4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，1978Am J Bot 65：654-659)。
叶柄外植体与含有双元载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999 Plant Physiol 119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。已经描述了用于植物转化的许多不同的双元载体(例如An，G.在Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology第44卷，第47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑，Humana Press，Totowa，New Jersey)。多种双元载体基于Bevan描述的载体pBIN19(Nucleic AcidResearch.1984.12：8711-8721)，所述pBIN19载体包含侧翼分布有源自根癌农杆菌Ti质粒的左边界和右边界序列的植物基因表达盒。植物基因表达盒由至少两个基因-选择标记基因和植物启动子组成，其中所述的植物启动子调节反义分子、RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制构建体、核酶分子或病毒核酸分子的转录。如上所述，可以使用多种选择标记基因，包括编码突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)的拟南芥基因(美国专利57673666和6225105)。类似地，可以使用多种启动子来调节阻抑盒以提供对基因阻抑的组成型、发育性、组织或环境性调节。在本实施例中，可以使用34S启动子(GenBank登录号M59930和X16673)来提供对阻抑盒的组成型表达。
所述外植体在黑暗中于含有288mg/L Pro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/L K2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。所述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺种在不含乙酰丁香酮而含有抑制农杆菌生长的合适选择剂和合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓度Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的籽苗移植至花钵内并且在温室中培育。
T0转基因植物通过结节插条繁殖并且在Turface生长培养基中生根。将植物脱叶并培育至约10cm高度(在脱叶后大约2周)。另外，通过标准方法如RNA印迹法或定量RTPCR对原代转基因植物(T0)分析待阻抑的基因的受阻抑表达。
根据[0412.1.1.1](黑麦草植物)、[0420.1.1.1](大豆植物)、[0425.1.1.1](谷物植物)、[0429.1.1.1](小麦植物)、[0433.1.1.1](油菜籽/卡诺拉油菜)或[0438.1.1.1](苜蓿植物)的耐受性植物比易感植物具有更高存活率和生物量生产，包括种子产量、光合作用和干物质生产。
通过例如包含SEQ ID NO：1025中所示序列的基因的同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：104中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：190中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：410中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：512中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：673中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：729中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：27中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：923中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1083中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1385中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1418中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1464中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1551中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1593中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：813中所示序列的基因同源重组敲除基因通过例如包含SEQ ID NO：1650中所示序列的基因同源重组敲除基因
1.在随机诱变群体中鉴定基因中的突变：
a)在化学或放射突变的群体中
产生化学或放射突变的群体是一项常规技术并且是熟练技术人员已知的。方法由Koorneef等人1982和其中引文并由Lightner和Caspa在“Methods in Molecular Biologyy”第82卷中描述。这些技术通常诱导可以在任意已知基因中使用如TILLING(Colbert等人2001)的方法鉴定到的点突变。
b)在通过反向遗传学的T-DNA或转座子突变的群体中
已经对多种情况描述了鉴定目的基因中插入突变体的反向遗传学策略，例如Krysan等人，1999(Plant Cell 1999，11，2283-2290)；Sessions等人，2002(Plant Cell 2002，14，2985-2994)；Young等人，2001，(Plant Physiol.2001，125，513-518)；Koprek等人，2000(Plant J.2000.24，253-263)；Jeon等人，2000(Plant J.2000.22，561-570)；Tissier等人，1999(Plant Cell 1999，11，1841-1852)；Speulmann等人，1999(Plant Cell1999，11，1853-1866)。简而言之，从T-DNA或转座子诱变的大的植物群体的全部植物中收获材料并制备基因组DNA。随后，基因组DNA按照例如Krysan等人1999年(Plant Cell 1999，11，2283-2290)中描述的特定结构汇集。随后通过检测插入性致变物(例如T-DNA或转座子)和目的基因的组合的特异性多重PCR反应筛选基因组DNA的汇集物。因此，用T-DNA或转座子边界引物和基因特异性引物的特定组合对所述DNA汇集物进行PCR反应。引物设计的一般原则可以再次取自Krysan等人，1999(PlantCell 1999，11，2283-2290)。再次筛选较低水平的DNA汇集物导致鉴定其中目的基因被插入性致变物破坏的单个植物。[0449.2.1.1]低温条件下生长的植物筛选法在标准实验中，将土壤制备为营养丰富土壤(GS90.Tantau，Wansdorf，德国)和砂的3.5∶1(v/v)混合物。将花钵填满土壤混合物并置于托盘中。将水添加至托盘以使土壤混合物吸收适宜量的水用于播种流程。转基因拟南芥植物的种子播种在花钵(直径6cm)中。将花钵集中直至它们装满生长室的托盘。随后，装满的托盘用透明盖子覆盖并转移到预冷却(4℃-5℃)的生长室的搁架系统中。在4℃-5℃于黑暗中持续2-3日时间建立层积催芽。种子的萌发和生长在20℃、60％相对湿度、16小时光周期和用荧光灯以200μmol/m2s照明的生长条件下启动。播种后7日撤除盖子。播种后第9日通过从顶部喷洒带小植物的花钵进行BASTA选择。因而，喷洒BASTA浓缩剂(183g/l草铵膦)在自来水中的0.07％(v/v)溶液。转基因事件和野生型对照植物随机地分布遍及整个生长室。播种后7日，在工作日期间改变托盘在生长室内部的位置。从托盘上撤除盖子后，每隔两日实施浇水。在播种后12-13日通过除去多余籽苗，使植物个体化，在一个花钵中留下一株籽苗。播种后14日施加寒冷(激冷至11℃-12℃)直至实验结束。为测量生物量性能，在收获时间(播种后29-30日)通过收割并称重幼枝确定植物鲜重。除了称重外，在不同于野生型对照的植物的情况下添加表型信息。当收获时，植物处于开花前和花序生长之前的阶段。通过应用Student t检验(参数：双向，不等方差)计算生物量变化统计显著性的显著性值。进行了连续3个实验。在第一实验中，检验了每个转化品系的一个个体。在第二实验中，使下述事件经受根据相同实验流程的验证筛选，其中所述事件已经在第一实验中确定为寒冷耐受性或抗性，即与野生型相比显示提高的产量，在本例中是提高的生物量生产。在这个实验中，如前述培育、处理和测量每个耐受性或抗性事件的最多10株植物。在头两个实验中，将寒冷抗性或耐受性和生物量生产与野生型植物比较。在第三实验中，如前述培育、处理和评定每个已证实的耐受事件的多达20个重复样品，即已经在第二实验中被评定为耐受性或抗性的那些。其结果汇总于表VIII。表3在施加寒冷胁迫后转基因拟南芥的生物量生产通过称重植物莲座丛测量生物量生产。将生物量提高计算为转基因植物的平均重量与野生型对照植物平均重量相比较的比率。对于基因座给出了在转基因事件组中看到的最小和最大生物量提高，同时全部事件显示显著性值≤0.1和生物量提高≥1.1。表3
  SeqID   基因座   最小生物量提高   最大生物量提高
  1385   At5g40590KO   1.233   1.233
等同物利用不超出常规的实验，本领域那些普通技术人员会认识到，或将能够确定与本文中所述的本发明具体实施方案的许多等同物。此类等同物将由以下权利要求书包括。
附图简述图1：用于插入诱变的T-DNA插入载体pMTX1a300，SEQ ID NO：1。图2：用于构建共抑制构建体以阻抑基因的活性或表达的载体1bxPcUbiColic，SEQ ID NO：2。图3：用于构建RNAi构建体以阻抑基因的活性或表达的载体10xPCUbiSpacer，SEQ ID NO：3。
Figure GPA00001008527702411
Figure GPA00001008527702431
Figure GPA00001008527702441
Figure GPA00001008527702451
Figure GPA00001008527702461
Figure GPA00001008527702471
Figure GPA00001008527702481
Figure GPA00001008527702501
Figure GPA00001008527702511
Figure GPA00001008527702521
Figure GPA00001008527702531

Claims (41)

1.用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)降低、阻抑或缺失植物细胞、植物或其部分中一种或多种选自以下的活性：1-磷脂酰肌醇4-激酶、氨基酸通透酶(AAP1)、At3g55990蛋白、At5g40590蛋白、ATP依赖性肽酶/ATP酶/核苷三磷酸酶/丝氨酸型内肽酶、含有DC1结构域的蛋白质/蛋白质结合蛋白/锌离子结合蛋白、DNA结合蛋白/转录因子、水裂解酶/乌头酸水合酶、金属外肽酶(MAP1C)、甲基转移酶、硝酸盐转运蛋白(ATNRT2.3)、硝酸盐/氯酸盐转运蛋白(NRT1.1)、果胶酸裂合酶蛋白/白粉病易感蛋白(PMR6)、肽酶/遍在蛋白-蛋白质连接酶/锌离子结合蛋白(JR700)、质子依赖性寡肽转运蛋白、转录因子、和遍在蛋白缀合酶/遍在蛋白样活化酶，和
b)产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转化植物并在允许植物发育的条件下培育。
2.用于产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转基因植物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)降低、阻抑或缺失植物细胞、植物或其部分中以下对象的活性
(i)分别包含表II或表IV的第5列或第7列中所述的多肽、共有序列或至少一个多肽基序的多肽；或
(ii)包含表I第5列或第7列中所述多核苷酸的核酸分子的表达产物，
(iii)或者(i)或(ii)的功能等同物；
和
b)产生与相应的非转化野生型植物相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的转化植物并在允许植物发育的条件下培育。
3.权利要求1或2中所述的方法，包括降低、减少或缺失至少一种核酸分子的表达或活性，所述核酸分子具有或编码表I第5列中所述核酸分子所代表的至少一种核酸分子的活性并且包含选自以下的核酸分子：
a)编码表II第5列或第7列中所示多肽的核酸分子；
b)表I第5列或第7列中所示的核酸分子；
c)核酸分子，其能够因遗传密码的简并性从表II第5列或第7列中所述的多肽序列衍生；
d)与包含表I第5列或第7列中所示核酸分子的多核苷酸的核酸分子序列具有至少30％同一性的核酸分子；
e)编码多肽的核酸分子，所述多肽与由(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少30％同一性，并且具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
f)编码多肽的核酸分子，所述多肽可以借助针对由(a)至(e)的核酸分子之一编码的多肽产生的单克隆或多克隆抗体分离，并且具有由包含表I第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
g)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列中所示的共有序列或一个或多个多肽基序，并且优选地具有由包含表II或表IV第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
h)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有表II第5列中所述蛋白质代表的活性；
i)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中在5’端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸并且优选地具有由包含表II或表IV的第5列中所述多核苷酸的核酸分子代表的活性；
j)编码多肽的核酸分子，所述多肽通过替换、缺失和/或添加由核酸分子(a)至(d)编码的多肽的氨基酸序列的一个或多个氨基酸衍生；和
k)通过用包含核酸分子(a)或(b)的互补序列的探针或用其片段在严格杂交条件下筛选合适核酸文库可获得的核酸分子，其具有与在(a)至(d)中表征并编码下述多肽的核酸分子序列互补的核酸分子的至少15nt、优选20nt、30nt、50nt、100nt、200nt或500nt，所述多肽具有由包含表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性；
或其包含与之互补的序列；
或者降低、阻抑、减少或缺失包含(a)至(k)中所述核酸分子的核酸分子的表达产物，例如包含表II第5列或第7列中所示多肽的多肽，
或由所述核酸分子编码的蛋白质。
4.权利要求1至3中任一项所述的方法，包括降低植物细胞、植物或其部分中多肽的活性或表达，所述多肽包含由权利要求3中表征的核酸分子编码的多肽。
5.权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述方法包括至少一个选自以下的步骤：
(a)导入编码核糖核酸序列的核酸分子，其能够形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt的片段与选自以下的核酸分子具有至少50％的同源性：
(aa)权利要求1至3中任一项所表征的核酸分子；
(ab)表I第5列或第7列中所述的或编码表II第5列或第7列中所述多肽的核酸分子，和
(ac)核酸分子，其编码具有表II第5列中所述多肽的活性的多肽或编码包含表I第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的表达产物；
(b)导入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子，其中所述RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子包含与选自本权利要求的(a)部分中所定义的核酸分子具有至少50％同源性的至少17nt的片段；
(c)导入特异性切割选自本权利要求的(a)部分中所定义的核酸分子的核酶；
(d)导入在(b)中表征的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子和在(c)中表征的核酶；
(e)导入赋予下述核酸分子表达的有义核酸分子，其中所述核酸分子包含选自权利要求2或3中所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的核酸分子或包含编码下述多肽的核酸分子，所述多肽与由权利要求3的(a)至(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有由包含表II第5列中所述多肽的蛋白质代表的活性，用于诱导对内源性表达产物的共抑制作用；
f)导入赋予下述蛋白质的显性失活突变体表达的核酸分子，所述的蛋白质具有表II第5列或第7列中所示蛋白质的活性或包含在权利要求2或3中表征的核酸分子所编码的多肽；
g)导入编码下述因子的核酸分子，其中所述因子与这样的核酸分子结合，该核酸分子包含选自权利要求2或3中所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的赋予蛋白质表达的核酸分子，所述的蛋白质具有在权利要求2或3中表征的核酸分子所编码蛋白质的活性；
h)导入引起RNA分子下降的病毒核酸分子，其中所述RNA分子包含选自权利要求2或3中所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的赋予蛋白质表达的核酸分子，所述的蛋白质由权利要求2或3中表征的核酸分子编码；
(i)导入核酸构建体，所述核酸构建体能够与下述内源基因重组并沉默、失活、阻抑或降低该内源基因的活性，其中所述内源基因包含选自权利要求2或3中所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的赋予蛋白质表达的核酸分子，所述的蛋白质由权利要求2或3中表征的核酸分子编码；
j)在包含核酸分子的内源基因中导入非沉默突变，所述的核酸分子选自权利要求2或3中所定义的或在本权利要求书(ab)或(ac)部分中所定义的核酸分子；和
k)导入赋予(a)至(i)任一项中表征的核酸分子表达的表达构建体。
6.权利要求1至5中任一项所述的方法，其中序列的3’-或5’-核酸序列的至少17bp的片段用于减少在权利要求2或3中表征的核酸分子或由所述核酸分子编码的多肽，所述序列包含选自权利要求2或3中所定义的或在本权利要求的(ab)或(ac)部分中所定义的具有至少50％同一性的核酸分子。
7.权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述降低或缺失通过应用化学化合物至植物细胞、植物或其部分引起。
8.权利要求1至7中任一项所述的方法，其中植物选自漆树科(Anacardiaceae)、菊科(Asteraceae)、伞形科(Apiaceae)、桦木科(Betulaceae)、紫草科(Boraginaceae)、十字花科(Brassicaceae)、凤梨科(Bromeliaceae)、番木瓜科(Caricaceae)、大麻科(Cannabaceae)、旋花科(Convolvulaceae)、藜科(Chenopodiaceae)、葫芦科(Cucurbitaceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、杜鹃花科(Ericaceae)、大戟科(Euphorbiaceae)、豆科(Fabaceae)、牻牛儿苗科(Geraniaceae)、禾本科(Gramineae)、核桃科(Juglandaceae)、樟科(Lauraceae)、豆科(Leguminosae)、亚麻科(Linaceae)、多年生牧草、草料作物、蔬菜植物和观赏植物。
9.权利要求1至8中任一项所述的方法，包括导入RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体和/或反义核酸的步骤，其中前述各分子经设计旨在靶向包含权利要求2或3中所表征核酸分子的基因的表达产物以诱导所述目的基因的mRNA断裂并且因而使基因表达沉默，或以诱导确保所述目的基因表达的表达盒断裂。
10.分离的核酸分子，其包含选自以下的核酸分子：
a)核酸分子，其编码包含在表IIB第5列或第7列中所示多肽的多肽；或者
b)包含在表IB第5列或第7列中所示多核苷酸的核酸分子；或者
c)核酸分子，其包含能够因遗传密码的简并性而从表IIB第5列或第7列中所述的多肽序列衍生的核酸序列并且具有由表II第5列中所述蛋白质代表的活性；
d)编码多肽的核酸分子，所述多肽与由(a)或(c)的核酸分子编码的多肽的氨基酸序列具有至少50％同一性并且具有由表II第5列中所述蛋白质代表的活性；
e)编码多肽的核酸分子，所述多肽借助针对由(a)至(c)的核酸分子之一编码的多肽的单克隆抗体分离，并且具有由表II第5列中所述蛋白质代表的活性；
f)编码多肽的核酸分子，所述多肽包含表IV第7列中所示的共有序列或多肽基序并且具有由表II第5列中所述蛋白质代表的生物学活性；
g)编码多肽的核酸分子，所述多肽具有表II第5列中所述蛋白质代表的活性；
h)核酸分子，其包含通过使用表III第7列中在5’端不以核苷酸ATA开始的引物扩增cDNA文库或基因组文库获得的多核苷酸；和
i)核酸分子，其能够通过严格杂交条件下用包含(a)至(c)的核酸分子的序列之一的探针或用在(a)至(h)任一项中表征的至少17nt的片段筛选合适文库获得，并编码具有由表II第5列中所示蛋白质代表的活性的多肽；
或其包含与之互补的序列；
其中根据(a)至(i)的核酸分子与表IA第5列或第7列中所述序列至少一个或多个核苷酸不同，并且优选地其编码与表IIA第5列或第7列中所述的蛋白质序列至少一个或多个氨基酸不同的蛋白质。
11.RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或反义核酸分子，用于降低在权利要求1中表征的活性或降低在权利要求2至10中任一项所表征核酸分子的或由所述核酸分子编码的多肽的活性或表达。
12.权利要求的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子，包含权利要求10的核酸分子的至少17nt的片段。
13.双链RNA(dsRNA)、RNAi、snRNA、siRNA、miRNA、反义或ta-siRNA分子或核酶，其能够形成双链核糖核酸分子，其中所述双链核糖核酸分子的至少17nt的片段与选自以下的核酸分子具有至少50％同源性：
(aa)权利要求2或3中所表征的核酸分子；
(ab)表I第5列或第7列中所述的或编码表II第5列或第7列中所述多肽的核酸分子，和
(ac)核酸分子，其编码具有表II第5列或第7列中所述多肽的活性的多肽或编码包含表I第5列或第7列中所述核酸分子的多核苷酸的表达产物。
14.权利要求10至13中任一项所述的dsRNA分子，其中所述有义链和反义链彼此共价地结合并且所述反义链基本上是“有义”RNA链的互补物。
15.引起RNA分子下降的病毒核酸分子，其中所述RNA分子赋予具有在权利要求1中所表征活性的蛋白质表达，或赋予在权利要求2至10任一项中表征的核酸分子或由所述核酸分子编码的多肽的活性或表达。
16.用于鉴定敲除基因的TILLING引物，所述基因包含表I第5列或第7列的任一列中所述核酸分子的核酸序列。
17.包含表II第5列或第7列中所示多肽的多肽的显性失活突变体。
18.编码权利要求17的显性失活突变体的核酸分子。
19.权利要求16的TILLING引物，包含表I第5列或第7列中所述核酸序列的片段或其互补片段。
20.核酸构建体，其赋予权利要求11至14中任一项所述的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、抗体或反义核酸分子、权利要求15的病毒核酸分子或权利要求10的核酸分子表达。
21.核酸构建体，其包含权利要求10中所述的分离核酸分子或权利要求11至14中任一项所述的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶、或反义核酸分子、或权利要求15的病毒核酸分子，其中所述核酸分子功能性地连接至一种或多种调节信号。
22.载体，其包含权利要求10中所述的核酸分子或权利要求11至14中任一项所述的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子、或权利要求15的病毒核酸分子、或权利要求21中所述的核酸构建体。
23.权利要求22中所述的载体，其中核酸分子与用于植物细胞、植物或其部分中表达的调节序列有效连接。
24.转基因植物细胞、植物或其部分，其已经用权利要求22或23中所述的载体或权利要求10中所述的核酸分子或权利要求20或21中所述的核酸构建体稳定或瞬时转化。
25.转基因植物细胞、植物或其部分，其中包含表II、优选表IIB的第5列或第7列或表IV第5列或第7列中所述多肽、共有序列或多肽基序的蛋白质的活性或包含表I、优选表IB的第5列或第7列所述核酸分子的核酸分子的活性降低。
26.从单子叶植物衍生的权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分。
27.从双子叶植物衍生的权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分。
28.权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分，其中所述植物选自：玉米(谷物)、小麦、黑麦、燕麦、小黑麦、稻、大麦、大豆、落花生、棉属植物、包括卡诺拉油菜和冬油籽油菜在内的油籽油菜、木薯、辣椒、向日葵、亚麻、琉璃苣、红花、亚麻籽、报春花、油菜籽、芜菁、万寿菊、茄科植物、马铃薯、烟草、茄子、番茄、蚕豆属(Vicia)物种、豌豆、苜蓿、咖啡、可可、茶、柳属(Salix)物种、油棕、椰子、多年生牧草、饲草作物和拟南芥(Arabidopsis thaliana)。
29.权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分，从裸子植物、优选从云杉、松和冷杉衍生。
30.分离的多肽，其由权利要求10中所述的核酸分子编码或包含表IIB第7列中所述的多肽。
31.抗体，其特异结合至权利要求31中所述的多肽。
32.包含权利要求24或25中所述植物细胞的植物组织、植物、收获的植物材料或植物的繁殖材料。
33.用于产生由权利要求10中所述核酸序列编码的多肽的方法，所述多肽在权利要求24或25中所述的宿主细胞中表达。
34.权利要求24至29中任一项所述的转基因植物细胞、植物或其部分，其中环境胁迫选自盐度胁迫、干旱胁迫、温度胁迫、金属胁迫、化学胁迫、病原性胁迫和氧化胁迫、或它们的组合。
35.权利要求34的转基因植物细胞、植物或其部分，其中环境胁迫是干旱和/或脱水。
36.权利要求24或25的转基因植物细胞、植物或其部分，具有
i)在水限制未转化的野生型植物细胞、植物或其部分生长的条件下提高的生物量生产；
ii)在干旱和/或脱水条件下提高的生物量生产，其中所述条件限制未转化的野生型植物细胞、植物或其部分的生长；
和/或
iii)在低湿度条件下提高的生物量生产，其中所述条件限制未转化的野生型植物细胞、植物或其部分的生长。
37.用于筛选权利要求1中表征的活性或由权利要求2或3中表征的核酸分子编码的多肽所代表的活性的拮抗物的方法，所述方法包括：
i)使表达所述多肽的生物、其细胞、组织或部分与化学化合物或包含多种化学化合物的样品在下述条件下接触，所述的条件允许编码由该蛋白质所代表活性的核酸分子的表达降低或缺失或允许该蛋白质的活性降低或缺失；
ii)测试植物、其细胞、组织或其部分中该蛋白质活性的水平或多肽的表达水平；和
iii)通过将该蛋白质活性的测量水平或该多肽表达水平与所述化学化合物或包含所述多种化学化合物的样品不存在下测量的该蛋白质活性的标准水平或该多肽表达水平比较而鉴定拮抗物，其中与标准相比降低的水平表明该化学化合物或包含所述多种化学化合物的样品是拮抗物。
38.用于鉴定与相应的非转化野生型植物相比较而言赋予植物中环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的化合物的方法，所述方法包括以下步骤：
i)培养或维持植物或其部分和下述读出系统，所述的植物或其部分表达具有在权利要求1中所表征活性的多肽或由权利要求2或3中表征的核酸分子所编码的多肽或编码所述多肽的多核苷酸，所述读出系统在允许该多肽与所述读出系统相互作用的合适条件下，在化学化合物或包含多种化学化合物的样品存在时能够与所述多肽相互作用，并且在允许阻抑所述读出系统和所述多肽的条件下，能够提供反映化学化合物与所述多肽结合的可检测信号；和
ii)通过检测由所述读出系统产生的信号存在或不存在或降低或提高来鉴定该化学化合物是否为有效拮抗物。
39.组合物，其包含根据权利要求30的蛋白质、权利要求10的核酸分子、权利要求20或21的核酸构建体、权利要求22或23的载体、根据权利要求37鉴定的拮抗物、权利要求31的抗体、权利要求24至29中任一项所述的植物、在权利要求2或3中表征的核酸分子、权利要求11至14中任一项所述的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子和任选地可农业用载体。
40.食物或饲料组合物，其包含根据权利要求30的蛋白质、权利要求10的核酸分子、权利要求20或21的核酸构建体、权利要求22或23的载体、根据权利要求37鉴定的拮抗物、权利要求31的抗体、权利要求24至29中任一项所述的植物、在权利要求2或3中表征的核酸分子、权利要求11至14中任一项所述的RNAi、snRNA、dsRNA、siRNA、miRNA、ta-siRNA、共抑制分子、核酶或反义核酸分子、权利要求32或36的植物、植物组织、收获的植物材料或植物的繁殖材料。
41.i)权利要求11至14中任一项所述的核酸分子、权利要求15的病毒核酸分子或权利要求10的核酸分子，或
ii)根据权利要求20或21的核酸构建体，或
iii)权利要求22或23的载体的用途，用于制备与相应的非转化野生型植物细胞相比较而言环境胁迫耐受性和/或抗性提高和生物量生产提高的植物细胞、植物或植物部分。
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