CN105367642B - 速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1及其编码基因与应用 - Google Patents

速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1及其编码基因与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1及其编码基因与应用。本发明提供的蛋白质，是如下a)或b)或c)的蛋白质：a)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；b)在序列表中序列5所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；c)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。通过试验证明：GeNRT1.1蛋白具有硝酸盐转运蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生长。

Description

速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1及其编码基因与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及速生水生植物硝酸盐转运蛋白GeNRT1.1及其编码基因与应用。
背景技术
氮素是植物生长发育所必须的基本营养元素，在植物生长发育和形态建成中起着重要作用，其对作物的生命活动和产量形成也具有重要意义。硝酸盐(NO3 -)是作物主要的氮源之一，硝酸盐供应量不足会严重抑制作物的生长发育。生理学研究表明，植物从土壤中吸收NO3 -需有一整套高-和低-亲和力NO3 -转运系统参加，NO3 -的进入由跨质膜的H+梯度驱动。有些NO3 -转运系统是组成型表达，有的则受NO3 -诱导，且随着NO3 -的同化呈负反馈调控
矮珍珠是一种常见的透骨草科水生植物。在水中蔓延生长，生长迅速，根系发达，茂密浓郁。在适宜的环境条件下快速蓬勃生长。仅仅用两天能够长成一对叶。
在过去几十年中，多形汉逊酵母(Hansenulapolymorpha，又称Pichiaangusta)已经成为一种公认的模式生物。广泛应用于研究甲醇代谢、硝酸盐吸收机制等。在多形汉逊酵母中，所有与硝酸盐代谢相关的基因紧密地排列成基因簇，总长1040bp的DNA片段中大约92％为编码DNA。多形汉逊酵母可以同化硝酸盐并把硝酸盐作为唯一氮源，它只有一个高亲和硝酸盐转运蛋白(nitrate transporters,Ynt 1)，可以转运硝酸盐但是不能转运氯酸盐。YNT1结构上属于NNP(nitrate-nitrite porter)家族并且受到硝酸盐和亚硝酸盐的诱导。汉逊酵母基因YNT 1、YNR 1和YNI1分别编码硝酸盐转运蛋白、硝酸盐还原酶(nitratereductase)，亚硝酸盐还原酶(nitrite reductase)，它们的表达受硝酸盐和亚硝酸盐诱导并受按盐和谷氨酸抑致。YNT 1缺失突变可以导致菌株在硝酸盐浓度低于500ìM的条件下不能转运或生长。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种蛋白质。
本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)的蛋白质：
a)氨基酸序列是序列表中序列5所示的蛋白质；
b)在序列表中序列5所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；
c)将序列表中序列5所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列5所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表7所示的标签。
表7、标签的序列
标签 残基 序列
Poly-Arg 5-6(通常为5个) RRRRR
Poly-His 2-10(通常为6个) HHHHHH
FLAG 8 DYKDDDDK
Strep-tag II 8 WSHPQFEK
c-myc 10 EQKLISEEDL
上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列4所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。
本发明的另一个目的是提供与上述蛋白质相关的生物材料。
本发明提供的与上述蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A12)中的任一种：
A1)编码上述蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；
A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；
A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；
A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物；
A9)含有A1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
A10)含有A2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
A11)含有A3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
A12)含有A4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
上述生物材料中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
1)其编码序列是序列表中序列4的cDNA分子或DNA分子；
2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
上述生物材料中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
本发明还有一个目的是提供上述蛋白质或上述相关生物材料的新用途。
本发明提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在转运硝酸盐中的应用。
本发明还提供了上述蛋白质或上述相关生物材料在培育具有转运硝酸盐功能的转基因酵母中的应用。
本发明的最后一个目的是提供一种培育硝酸盐转运功能提高的转基因酵母的方法。
本发明提供的培育硝酸盐转运功能提高的转基因酵母的方法包括将上述蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母的步骤；所述转基因酵母的硝酸盐转运功能高于所述受体酵母。
上述方法中，所述蛋白质的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子。
上述方法中，所述上述蛋白质的编码基因是通过重组载体pYNR-GeNRT1.1导入受体酵母的；
所述重组载体pYNR-GeNRT1.1为将序列表中序列4所示的DNA分子插入pYNR-EX载体的speⅠ和salⅠ酶切位点间，且保持pYNR-EX载体的其他序列不变得到的载体。
上述方法中，所述受体酵母为△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母。
本发明从矮珍珠中克隆了一个硝酸盐转运蛋白的编码基因GeNRT1.1，并将该基因导入△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母中，得到转GeNRT1.1酵母。通过试验证明：GeNRT1.1蛋白具有硝酸盐转运蛋白的功能，能提高植物的氮素利用效率，使植物快速生长。
附图说明
图1为高亲和硝酸盐转运蛋白基因(GeNRT1.1)的克隆。
图2为硝酸盐转运蛋白基因的3’RACE。
图3为硝酸盐转运蛋白基因的5’RACE。
图4为pYNR-GeNRT1.1穿梭载体的双酶切验证。
图5为转基因酵母△ynt-GeNRT1.1的PCR验证。
图6为GeNRT1.1基因功能的验证。
图7为GeNRT1.1的硝酸盐吸收速率图。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的矮珍珠在文献“Donald H.Les，Introduction of Glossostogma(Phrymaceae)to North America:a taxonomic and ecological overview，2006”中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
下述实施例中的△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母在文献“Yuse Martin，Functional characterization of the Arabidopsis thaliana nitrate transporterCHL1in the yeast Hansenula polymorpha，2008”中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
下述实施例中的野生型酵母(WT)为多形汉逊酵母Hansenula polymorpha在文献“German Perdomo，Tobacco Nia2cDNA functionally complements a Hansenulapolymorpha yeast mutant lacking nitrate reductase.A new expression system forthe study of plant proteins involved in nitrate assimilation，2002”中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
下述实施例中的pYNR-EX载体在文献“German Perdomo，Tobacco Nia2cDNAfunctionally complements a Hansenula polymorpha yeast mutant lacking nitratereductase.A new expression system for the study of plant proteins involved innitrate assimilation，2002”中公开过，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
实施例1、GeNRT1.1的获得
一、GeNRT1.1的发现
1、矮珍珠的总RNA提取及cDNA的合成
使用TIANGEN公司的RNAprep Pure Plant试剂盒，参照试剂盒说明书提取矮珍珠的总RNA，反转录获得cDNA。
2、PCR扩增
以步骤1反转录获得的cDNA为模板，采用简并引物H5和H3进行PCR扩增，得到PCR产物。引物序列如下：H5:GGNGCNGAYCARTTYGAYG；H3：AVYTCYTCNACYTGNGTNAC。PCR扩增程序为：95℃预5min；94℃变性30s；52℃退火30s；72℃延伸1min，35cycle；72℃，10min。
3、电泳及测序
扩增结束后，1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物连接到T载体，测序结果结果表明：PCR扩增得到一条大小为475bp的条带(图1)，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，将其命名为硝酸盐转运蛋白基因。
二、3’RACE的获得
1、提取矮珍珠的总RNA，反转录获得cDNA；
2、套式PCR反应
以反转录获得的cDNA模板，采用引物H3Outer：TTATGGACACTATGGACCCTC和H3Inner：CCCTTAGCCATCACATTCATG使用TaKaRa LA Taq(Code No.RR002A)进行PCR反应，实验操作具体如下：
(1)Outer PCR反应
Outer PCR反应体系如表1所示，Outer PCR扩增程序为：95℃预3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，20cycle；72℃，10min。
表1、Outer PCR反应体系
PCR反应结束后，取5～10ìl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果表明：Outer PCR反应扩增获得了大小为800bp的一条带。
(2)Inner PCR反应
以上述Outer PCR产物为模板，进行Inner PCR反应。Inner PCR反应体系如表2所示，Inner PCR扩增程序为：95℃预3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30cycle；72℃，10min。
PCR反应结束后，取5～10ìl的PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物连接到T载体，挑单克隆，测序。测序结果表明PCR扩增得到大小为615bp的条带(图2)，即为硝酸盐转运蛋白基因的3’序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。
表2、Inner PCR反应体系
三、5’RACE
1、去磷酸化处理
使用Alkaline Phosphatase(CIAP)对Total RNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。具体步骤如下：
(1)按表3的组份配制去磷酸反应液。
(2)0℃反应1小时。
(3)向上述反应液中加入20μl的3M CH3COONa(pH5.2)，130μl的RNaseFree dH2O，充分混匀。
(4)加入200μl的苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，充分混匀后13,000×g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的离心管中。
(5)加入200μl的氯仿，充分混匀后13,000×g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。
(6)加入2μl的NA Carrier均匀混合，再加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟。
(7)13,000×g 4℃离心20分钟，弃上清。加入500μl的70％冷乙醇(RNase FreedH2O配制)漂洗，13,000×g，4℃离心5分钟，弃上清后干燥。
(8)加7μl的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到CIAP-treated RNA。
表3、去磷酸反应液
2、“去帽子”反应
使用Tobacco Acid Pyrophosphatase(TAP)去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。
(1)按表4的组份配制“去帽子”反应液。
表4、“去帽子”反应液
(2)37℃反应1小时。取5μl用于5′RACE Adaptor连接反应，剩余的保存于-80℃。
3、 5′RACE Adaptor的连接
(1)配制如下溶液：CIAP/TAP-treated RNA 5μl、5′RACEA daptor(15μM)1μl、RNase Freed H2O 4μl，混匀。
(2)65℃保温5分钟后冰上放置2分钟，然后加入下列试剂。RNase Inhibitor(40U/μl)1μl、5×RNA Ligation Buffer 8μl、40％PEG#600020μl、RNA Ligase(40U/μl)1μl。
(3)16℃反应1小时。
(4)加入20μl 3M CH3COONa(pH5.2)，140μl RNase Free dH2O，充分混匀后再加入200μl苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，混匀，13,000×g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。
(5)加入200μl的氯仿，混匀，13,000×g室温离心5分钟，将上层水相转移至新的Microtube中。
(6)加入2μl的NA Carrier后均匀混合加入200μl的异丙醇，充分混匀后，冰上冷却10分钟。
(7)13,000×g 4℃离心20分钟，弃上清。加入500μl的70％冷乙醇(RNase FreedH2O配制)漂洗，13,000×g 4℃离心5分钟，弃上清，干燥。
(8)加入6μl的RNase Free dH2O溶解沉淀，得到Ligated RNA。
4、反转录反应
(1)按表5的组份配制反转录反应液。
表5、反转录反应液
(2)反转录反应条件如下：30℃10min；42℃1h；70℃15min。
(3)反应结束后可以进行下一步实验，或将反应液保存于-20℃。
5、Outer PCR扩增
Outer PCR扩增体系如表6所示，Outer PCR扩增程序为：95℃预3min；94℃变性30s；55℃退火30s；72℃延伸1min，30cycle；72℃，10min。
PCR反应结束后，取5～10ìl的PCR反应液进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物连接到T载体，挑单克隆，测序。
测序结果：PCR扩增得到大小为1057bp的条带(图3)，即为硝酸盐转运蛋白基因的5’序列，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。
表6、Outer PCR扩增体系
四、GeNRT1.1基因的克隆
根据上述步骤二和步骤三获得的3’RACE和5’RACE的核苷酸序列，设计了如下引物：H5(GTCGACATGGCTGATATAGAAGGCT)和H3(ACTAGTTCAAACTCGAGACGGTGTC)，以上述步骤一反转录获得的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。将其连接到pMD18-T，挑单克隆，测序。
测序结果表明：PCR扩增得到了大小为1440bp的条带，其核苷酸序列如序列表中序列4所示，将序列4所示的基因命名为GeNRT1.1基因，自5’端1-1440位为ORF，GeNRT1.1基因编码的蛋白的氨基酸序列如序列表中序列5所示。
实施例2、GeNRT1.1基因功能的验证
本实施例利用△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母来验证GeNRT1.1基因的功能。
一、转GeNRT1.1酵母的构建
1、穿梭质粒的构建
将序列表中序列4所示的DNA分子插入pYNR-EX载体的speⅠ和salⅠ酶切位点间，且保持pYNR-EX载体的其他序列不变，得到重组载体pYNR-GeNRT1.1。
2、线性化
将pYNR-GeNRT1.1用BstpⅠ酶切线性化，得到线性化的pYNR-GeNRT1.1，1％琼脂糖凝胶电泳(图4)，回收纯化目标产物，使用分光光度计进行定量，备用。
3、双突变多形汉逊酵母(△ynt-Leu)感受态细胞的制备
①挑取△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母单菌落，接种至5mLYGNH培养基(0.17％(w/v)酵母氮源基础-无氨基酸无硫酸铵(Difco),2％葡萄糖(Biodee),5mM NH4Cl(福臣化学))中，37℃、200r/min培养过夜，得到培养液。
②取100μL上述培养液接种至100mL YGNH培养基中，37℃、200r/min，培养14-16h，使菌液浓度达到OD6001.3～1.5。
③将上述菌液转入预冷的50mL无菌用离心管中，4℃，1200r/min离心5min，收集菌体。
④将收集的菌体分别用50mL和25mL预冷的无菌水重悬各清洗一次。
⑤用2mL的冰预冷的1mol/L的山梨醇溶液将菌体沉淀重悬，得到△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母感受态细胞，分装-80℃备用。
4、转化
①将线性化的pYNR-GeNRT1.1加入80μL△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母感受态细胞中，混匀，冰浴5min后移入冰冷的电转杯中。
②电转仪预热后，设定参数，150v、130Ω，电击。
③电击后，加入600μl冰预冷的山梨醇溶液将菌体混匀，转至1.5mL的EP管中，37℃静置培养1h。
④将菌液涂布于含氨苄抗性的YNGH平板上，37℃培养3～4d至有单克隆。
5、转GeNRT1.1酵母阳性株的筛选
挑单菌落，采用实施例1中的H5和H3为引物，利用PCR筛选酵母阳性克隆。PCR扩增程序：95℃预3min；94℃变性30s；57℃退火30s；72℃延伸1min，30cycle；72℃，10min。
PCR反应结束后，将PCR扩增产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，PCR扩增得到大小为1440bp的条带(图5)，即为转GeNRT1.1酵母阳性株，将其命名为△ynt-GeNRT1.1。
二、GeNRT1.1蛋白的功能验证
1、为了验证GeNRT1.1蛋白具有硝酸盐转运蛋白的功能，分别挑取△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母、野生型酵母(WT)和转GeNRT1.1酵母(△ynt-GeNRT1.1)单菌落，接种到10mL YNGL培养基中，37℃、200r/min培养过夜，利用分光光度计测量OD600的吸光值。
结果如图6所示：△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母在YNGL培养基中不能生长，而野生型酵母和转GeNRT1.1酵母在YNGL培养基中可以正常生长，表明GeNRT1.1蛋白可以使△ynt-Leu恢复生长，具有硝酸盐转运蛋白的功能。
2、吸收速率的测定
硝酸根离子在紫外区有强烈的吸收，利用它在220nm波长处的吸光度可定量测定硝酸盐的浓度。虽然溶解在溶液中的有机物在220nm处也会有吸收，但硝酸根离子在275nm处没有吸收。因此，在275nm处作另一次测量，以校正硝酸盐氮值。A校＝A220-2A275。根据文献报道，通过测定硝酸盐转运蛋白的硝酸盐吸收效率Km，可以来判定该蛋白是高亲和还是低亲和转运蛋白。当Km<1000uM为高亲和转运蛋白；当Km>1000uM为低亲和转运蛋白。
①挑取△ynt-GeNRT1.1酵母单菌落，接种至5mL YGNH培养基中，37℃、200r/min培养过夜，得到培养液。
②取100ìL上述培养液接种至100mL YGNH培养基中，37℃、200r/min，培养14-16h，使菌液浓度达到OD6001.3～1.5，4℃，1200r/min离心5min，收集菌体备用。
③取6个50mL的离心管中加入10mL YG培养基(0.17％(w/v)酵母氮源基础-无氨基酸无硫酸铵(Difco),2％葡萄糖(Biodee))，每管中分别加入100mg酵母细胞，震荡培养2h，以使每管中的酵母处于相同的生长状态。
④4℃，1200r/min离心5min，弃上清，将各管的酵母菌体分别用50mL冰冷的含有50μM、100μM、300μM、500μM、μM、1000μM、1500μM硝酸盐的YG培养基重悬，冲洗一遍。
⑤重复④两次。
⑥将上述各管分别加入含有相应硝酸盐浓度的YG培养基10mL，37℃振荡培养30分钟后测定吸光度，绘制吸收速率曲线，并计算Km值。
吸收速率曲线如图7所示：从图中可以看出：GeNRT1.1蛋白的Km值为1800μM，大于1000μM，说明本发明的GeNRT1.1蛋白是一个低亲和的硝酸盐转运蛋白，具有提高硝酸盐吸收效率的功能。

Claims (9)

1.一种蛋白质，其氨基酸序列如序列表中序列5所示。
2.与权利要求1所述的蛋白质相关的生物材料，为下述A1)至A4)中的任一种：
A1)编码权利要求1所述的蛋白质的核酸分子；
A2)含有A1)所述核酸分子的重组载体；
A3)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；
A4)含有A2)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：所述核酸分子为序列表中序列4所示的cDNA分子或DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在酵母转运硝酸盐中的应用。
5.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在提高酵母硝酸盐吸收效率中的应用。
6.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在培育硝酸盐转运功能提高的转基因酵母中的应用。
7.一种培育硝酸盐转运功能提高的转基因酵母的方法，包括将权利要求1所述的蛋白质的编码基因导入受体酵母中，得到转基因酵母的步骤；所述转基因酵母的硝酸盐转化能力高于受体酵母。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述权利要求1所述的蛋白质的编码基因为序列表中序列4所示的DNA分子。
9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述受体酵母为△ynt-Leu双突变多形汉逊酵母。
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