CN107858341B

CN107858341B - 胡杨PeMIPS1基因及其应用

Info

Publication number: CN107858341B
Application number: CN201711283343.3A
Authority: CN
Inventors: 宿红艳; 王磊; 张静; 李媛媛; 朱世东
Original assignee: Ludong University
Current assignee: Ludong University
Priority date: 2017-12-07
Filing date: 2017-12-07
Publication date: 2020-12-15
Anticipated expiration: 2037-12-07
Also published as: CN107858341A

Abstract

本发明涉及一种胡杨PeMIPS1基因及其应用。属于植物分子生物学领域。本发明分离和应用一种包含PeMIPS1基因的DNA片段，核苷酸序列长度为1533bp，序列为SEQ.NO.1；对应的氨基酸序列为510个，序列为SEQ.NO.2。该片段赋予杨树对高盐和重金属铜胁迫的抗性增强。利用本发明基因培育的耐盐、抗重金属铜的杨树新品种将在植物修复中具有广阔的应用价值。

Description

胡杨PeMIPS1基因及其应用

技术领域

本发明属于植物分子生物学领域，具体地涉及胡杨PeMIPS1基因及其在提高杨树抗盐及抗重金属铜中的应用。

背景技术

土壤盐渍化和重金属污染是制约农业生产的主要限制因素。尤其是重金属污染不仅导致土壤退化、农作物产量和品质下降，而且通过径流和淋洗等作用污染地表水和地下水，严重威胁人类健康和生态环境。据统计，全世界平均每年排放汞约1.5万吨，铜340万吨，铅500万吨，锰1500万吨，镍100万吨，重金属在土壤中的污染不仅面积大，而且持续时间长。因此，降低重金属污染的负面效应以及加强污染土壤的治理和有效利用，对于改善生态环境和确保农业生产安全有重要意义。

植物修复技术是近年来发展的一项治理土壤污染的新兴绿色技术，其原理是利用植物及其根际微生物体系对环境中的污染物进行吸收、降解和转化，从而实现对环境的修复。由于土壤中的盐渍和重金属污染均会对植物造成伤害，抑制其生长发育，因此可用于土壤修复的植物材料除具备生物量大、生长速度快等特点之外，必须对逆境胁迫具有较强的耐受性。

肌醇(myo-inositol,MI)是植物体中广泛分布的一种小分子多元醇类,在植物生长发育过程中发挥多重作用，如信号转导、细胞壁合成及逆境胁迫响应等。肌醇的生物合成包括2步酶促反应，其中肌醇-1-磷酸合酶(MIPS；EC5.5.1.4)是限速酶。国内外学者已对来自于不同植物的MIPS1基因进行了功能鉴定，如拟南芥(Arabidopsis thaliana)的AtMIPS1,盐生植物互花米草(Spartina alterniflora Loisel.)的SaINO1及甘薯(Ipomoeabatatas L.)的IbMIPS1等，这些MIPS1基因超表达后，可显著提高转基因植株对抗干旱、高盐和低温等逆境胁迫的能力。但迄今，已报道的MIPS1基因仅局限于草本植物，且有关MIPS1基因参与植物抗重金属胁迫的研究也尚未见报道。

杨树是重要的造林绿化树种和经济树种之一，因其生物量高，且生长速度较快，也是一种重要的生物修复树种。由于多年生林木植物具有与草本植物不同的解剖学、生理学及遗传学特性，因此杨树中分离MIPS1基因，并鉴定其在提供林木抗逆性方面所发挥的功能，对于培育抗逆杨树新品种将具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种胡杨PeMIPS1基因及其在杨树抗盐及重金属铜中的应用。本发明分离和应用一种包含PeMIPS1基因的DNA片段，该片段赋予杨树对高盐和重金属铜胁迫的抗性增强。

本发明分离和克隆的胡杨PeMIPS1基因的核苷酸序列长度为1533bp，序列为SEQ.NO.1；对应的氨基酸序列为510个，序列为SEQ.NO.2。

本发明还提供上述胡杨PeMIPS1基因在培育杨树耐盐碱抗重金属铜的杨树新品种中的应用。胡杨PeMIPS1基因受干旱、高盐、CuSO₄诱导后启动表达，携带本发明胡杨PeMIPS1基因的载体可选用本领域常规植物表达载体如PBI121或pCAMBIA2301等，采用农杆菌介导的方法导入植物细胞。转化的宿主是包括杨树在内的多种植物，培育抗干旱、高盐、或重金属铜的新品种。利用本技术培育的耐盐碱、抗重金属铜的杨树新品种将在植物修复中具有广阔的应用价值。

附图说明

图1PeMIPS1基因的表达受多种胁迫处理的诱导。

图2PBI121载体图。

图3转基因杨树的分子生物学鉴定。A为以野生型和转基因杨树基因组DNA为模板，对部分35S启动子和PeMIPS1编码区序列的扩增。B为PeMIPS1在野生型和转基因各株系中的相对表达水平。M，为DNA Marker DL,2000；WT，为野生型对照；L1-L14，为转基因株系。

图4野生型和转基因株系L4和L11叶片中的肌醇含量

图5野生型和转基因杨树植株在125mM NaCl胁迫处理后的生长状态。

图6野生型和转基因杨树植株在125mM NaCl胁迫处理后生长指标测定。

图7野生型和转基因杨树植株在125mM NaCl胁迫处理后生理指标测定。

图8野生型和转基因杨树植株在450μM CuSO₄胁迫处理后的生长状态。

图9野生型和转基因杨树植株在450μM CuSO₄胁迫处理后生长指标测定。

图10野生型和转基因杨树植株在450μM CuSO₄胁迫处理后生理指标测定。

具体实施方式

以下实施例定义了本发明，并描述了本发明在克隆包含有PeMIPS1基因完整编码区段的DNA片段，以及验证PeMIPS1基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用不同的用途和条件。

实例1检测胡杨PeMIPS1基因的表达水平

选用长势一致的一年生胡杨幼苗进行各种胁迫处理。30％PEG模拟干旱处理：将胡杨苗根部浸泡在30％PEG溶液中，分别在0hr，12hr，24hr，48hr和72hr收集叶片；300mM NaCl处理：将胡杨苗根部浸泡在30％PEG溶液中，分别在0hr，12hr，24hr，48hr和72hr收集叶片；1mM CuSO₄处理：将胡杨苗根部浸泡在30％PEG溶液中，分别在0hr，12hr，24hr，48hr和72hr收集叶片。总RNA的提取采用PureLinkTM RNA Mini试剂盒(购自Invitrogen,USA)，具体操作按照上述试剂盒的说明书进行。反转录采用PrimeSriptTM reagent试剂盒(购自Takara,China)，具体操作按照上述试剂盒的说明书进行。以上述反转录合成的cDNA为模板,定量PCR采用SYBR Premix Ex Taq II试剂盒(购自Takara,China)。PeMIPS1的3′-UTR(非编码区Uncoding translation region，UTR)特异扩增用设计的引物(PeMIPS1-F1：5′-CTGTCAAAGCAGCGTGCAATG-3′和PeMIPS1-R1：5′-AAGGGCAGCACTTGACCACAG-5′)。扩增内参选用胡杨的转录延伸因子基因EF-1α基因，扩增引物为5′-GACAAGAAGGCAGCGGAGGAGAG-3′和5′-CAATGAGGGAATCCACTGACACAAG-3′)。扩增条件为95℃预变性30sec之后，95℃3sec,58℃20sec，72℃15sec，40个循环。反应过程中进行荧光检测实时定量分析。结果表明，在干旱、高盐、CuSO₄处理后PeMIPS1基因(其核苷酸序列如序列表SEQ NO：1所示)表达水平显著上升(见图1)。

实施例2PeMIPS1过表达载体的构建

为了分析PeMIPS1基因的功能，申请人将其在杨树中过量表达，从转基因植株的表型评价其在植物抗逆基因工程改良中的应用潜力。

过量表达载体构建方法如下：首先采用同源比对的方法在美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的GenBank数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索到一条基因序列，注释号为XM_01103265，预测为胡杨中的肌醇-1-磷酸合酶基因。以实施例1中制备的胡杨叶片cDNA为模板，用引物PeMIPS1-Xbal

(5′-CGCTCTAGAATGTTTATTGAGAAGTTTAA-3′，序列特异引物外接Xba I位点)和PeMIPS1-Sal(5′-ACGGTCGACTCACTTGTATTCCAAAATCA-3′，序列特异引物外接Sal I位点)，扩增出包含PeMIPS1完整编码区的cDNA片段，扩增产物就是本发明SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(1-1533bp)。PCR反应条件为：94℃3min预变性后，94℃40sec，56℃40sec，72℃90sec，共35个循环。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，扩增出一条大小为1.5kb左右的特异条带，将扩增获得的PCR产物连入T-Vector pMD^TM19(Simple)载体(购自Takara公司)，筛选阳性克隆，并送北京华大基因研究中心测序证实为PeMIPS1cDNA编码区全序列，该克隆命名为PeMIPS1-pMD。提取PeMIPS1-pMD中的质粒DNA，进行Xba I和Sal I双酶切，回收目的片段。用同样的方法对PBI121载体进行Xba I和Sal I双酶切，回收载体片段(如图2所示)。按照210:1的比例在T4DNA连接酶作用下16℃过夜。其后，转化大肠杆菌DH5α(购自北京全式金生物技术有限公司)。挑取阳性克隆，提质粒，进行酶切鉴定，获得的重组质粒载体被命名为PeMIPS1-PBI121(载体上的PeMIPS1基因序列就是SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，其序列长度为1533bp)。

实施例3山新杨遗传转化

首先将实施例2中获得重组表达载体PeMIPS1-PBI121转化农杆菌EHA105。EHA105感受态细胞制备方法为：

(1)挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于5mL附加有50mg/L的利福平的液体YEB培养基中，28℃过夜培养；

(2)取2mL培养物至液体YEB中，继续培养至OD₈₀₀为0.5左右；

(3)将培养物冰浴30min，4℃，5000rpm，离心5min；

(4)弃去上清，10mL冷的NaCl(0.1mol/L)悬浮菌体；

(5)4℃，5000rpm，离心5min；

(6)弃上清，1mL冷的CaCl₂(20mmol/L)悬浮，分装成200μL/管，液氮中冷冻后-70℃保存。

农杆菌EHA105转化、筛选的方法：

(1)冰上融化感受态细胞，加入1-2μL重组质粒DNA(PBI121-PeMIPS1)，冰浴45min，液氮中冷冻1min，再37℃水浴3min；

(2)加入1mL无抗生素的YEB，28℃，200rpm，3hr；

(3)12000rpm离心1min以浓缩菌液，100μL回溶菌体；

(4)将转化后的菌液涂于附加50mg/L卡那霉素，50mg/L利福平的固体LB培养基上，置于28℃下培养2-3天；

(5)进行菌落PCR反应验证，阳性菌落即为已导入PBI121-PeMIPS1载体的农杆菌EHA105。

进而采用叶盘法进行杨树遗传转化。杨树品种为山新杨(Populus davidiana×Populus bolleana)。具体按以下步骤进行：

(1)无菌材料的培养

截取山新杨组培苗的茎端进行继代培养，培养基为MS生根培养基(MS+0.1mg/LNAA)，大约30-40天后选取长势良好的组培苗用于遗传转化。

(2)预培养

取山新杨的组培苗叶片，去除主叶脉，剪成1cm×1cm的小块，置于MS分化培养基(MS+0.1mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.01mg/L TDZ)上，24℃黑暗培养过夜。

(3)侵染、共培养

将含有PBI121-PeMIPS1载体的EHA105菌种接种于含有34mg/mL利福平(Rifampicin，Rif)和50mg/mL卡那霉素(Kanamycin,Kan)的液体LB培养基中，28℃，200rpm培养至OD₆₀₀约为0.45-0.5之间；将培养好的菌液分装至大离心管中，6000rpm室温离心5min，将收集的菌体用液体MS基本培养液稀释调节到OD₆₀₀约为0.2-0.3之间；放入经预培养的叶片，浸泡15-20min，期间可用手轻摇几次；将浸泡过的叶片取出置于无菌滤纸上，将吸附在叶片表面的菌液吸干；将叶片转移至MS分化培养基上，暗培养48h。

(4)筛选培养

用无菌水清洗叶片2-3次；转移到含有400mg/L特美汀(Timentin，Ti)和50mg/LKan的MS分化培养基上，24℃培养；每隔一周，将外植体转移至新的含有400mg/L Ti和50mg/L Kan的MS分化培养基上。

(5)生根培养

待外植体细胞分化长出抗性芽，且具有5-6片叶时，将新芽转移到含有400mg/L Ti和50mg/L Kan的生根培养基上。待根系发育好后(5-6片叶)，移入盛有无菌土的花盆中，温室常规管理。

实施例4转基因杨树的PCR检测及其抗逆境胁迫分析

转基因杨树的PCR检测。

分别提取野生型和14个转基因株系的基因组DNA(EasyPure Plant Genomic DNAKit，北京全式金生物技术有限公司)，具体操作按说明书进行。在35S启动子区域设计一个上游引物(5′-CGCACCATCGTCGGCTACAG-3′)，在PeMIPS1编码区设计一个下游引物(5′-AGGGACATGAATATCAGTCT-3′)，以提取的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应条件为：94℃5min预变性后，94℃40sec，56℃40sec，72℃90sec，共35个循环。结果显示，转基因植株中均扩增出与目的片段大小一致的产物，而阴性对照的野生型植株则无相应的PCR产物出现(见图3A)。进一步利用RNeasy Plant Mini Kit(Qiagen公司)提取野生型和14个转基因株系的叶片总RNA，进行定量PCR分析，检测PeMIPS1在各样品中的表达水平。反转录及定量PCR检测所用试剂盒和操作同实施例1。扩增引物为PeMIPS1-F2(5′-ATCATCCTCGACTTGGTTCT-3′)和PeMIPS1-R2(5′-AGGGACATGAATATCAGTCT-3′)。结果显示，PeMIPS1在转基因植株中的表达水平都高于野生型对照，其中第11号转基因株系(L11)中的PeMIPS1表达水平最高(见图3B)。以上结果表明，PeMIPS1已整合到转基因植株的基因组中，并且成功表达。

肌醇含量测定

选取第4号和第11号转基因株系(L4和L11)进行进一步的肌醇含量及抗逆性分析。分别收集野生型和各转基因植株叶片2g，液氮中研磨，用10倍体积的80％乙醇(乙醇/水，体积/体积)研磨成匀浆，置于60℃水浴中30min，4℃6000rpm离心收集上清，重复3次，合并上清，置于真空旋转蒸发仪旋蒸至近干，再用双蒸水充分溶解。经0.45μM膜过滤后进行，取10μL进行HPLC分析。分析条件：色谱柱为SEP-C18，检测器为Shimadzu RID-10A示差折光检测器，柱温30℃，流动相为蒸馏水。结果显示，转基因株系L4和L11中的肌醇含量高于野生型，并且其肌醇含量与PeMIPS1的表达水平呈正相关性(见图4)，说明PeMIPS1过量表达促进转基因植株中的肌醇积累。

转基因杨树的抗逆性分析

将野生型和转基因株系L4和L11的组培苗移入花盆中，生长3个月之后，选择长势一致的植株进行抗逆性分析。

(1)盐胁迫处理：每隔3天浇一次125mM NaCl溶液，每个株系10株重复。

(2)重金属铜胁迫处理：每隔3天浇一次450μM CuSO₄溶液，每个株系10株重复。

处理15天后，取从上面数第4-6片叶进行抗逆生理指标测定。过氧化氢(H₂O₂)含量测定采用钛-过氧化氢比色法；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定；SOD活性采用氮蓝四唑(NBT)还原法测定；POD活性采用愈创木酚法测定；CAT活性采用紫外线分光光度计吸收法；每项指标均为3次重复的平均值。结果显示，在NaCl和CuSO4胁迫处理后，与野生型相比，转基因株系的生长状态均有显著优势(图5，6，8和9)，并且转基因杨树的H₂O₂和MDA含量明显低于野生型(图7和图10)。进一步分析结果显示，NaCl处理后，转基因杨树中的SOD和CAT活性明显高于野生型对照(图7)；CuSO4处理后，转基因杨树中的CAT活性高于野生型对照(图10)。说明，PeMIPS1的过量表达可以降低转基因杨树中的膜脂的过氧化作用，保护植物的细胞膜系统。

序列表

<110> 鲁东大学

<120> 胡杨PeMIPS1基因及其应用

<130> 无

<141> 2017-12-07

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 胡杨( Pobulus eubhratica)

<400> 1

atgtttattg agaagtttaa ggttgagagt cctaacgtta agtacactga agatgagatt 60

cactccgtgt acaactacga aaccaccgaa cttgttcatg agaacaaaaa cggttcttat 120

cagtggactg tcaagcccaa aactgtccaa tatgaattca agactgatat tcatgtccct 180

aaactaggtg ttatgcttgt ggggtggggc ggaaacaatg gttcaactct cactggtggt 240

gttattgcca acagagaagg aatctcctgg gcaaccaagg acaaggtgca acaagccaat 300

tactttggct cacttaccca ggcatcaagt atcagggttg ggtccttcaa tggagaggag 360

atttatgctc cattcaagag cctcctcccc atggtgaacc cagatgatat tgtatttggg 420

ggatgggaca taagtgacat gaacttagca gatgccatgg cgagggccaa ggttttcgac 480

tttgacttgc aaaagcaatt gaggccctac atggaatcca tggtaccact ccctggaatt 540

tacgaccctg atttcattgc tgccaatcaa gactcacgtg ctaacaatgt tatcaaaggc 600

actaagaaag aacaagtcca gcaaattatc aaagacatta gggagttcaa ggagaaaaac 660

aaggtggaca aggtggttgt gttgtggact gccaacacag agaggtacag taatattgtt 720

gtggggctaa atgacaccat ggagaacctc ctggctgctg tggagaagga tgaatcagag 780

atatccccat caaccttgta tgctctggct tgcatttatg aaaatattcc tttcataaat 840

ggaagcccac agaacacttt tgttccagga cttgttgatt tggctattaa gaggaacagt 900

ttgattggcg gagatgactt taagagtggt cagaccaaga tgaaatctgt tctggttgat 960

ttccttgttg gggccggtat taagccaaca tcaatagtga gttacaacca tctgggaaac 1020

aatgatggca tgaacctctc agcacctcaa accttccgct ccaaagaaat ctccaagagc 1080

aatgttgttg atgacatggt ctctagcaat ggcatcctct atgagcctgg tgaacatcct 1140

gaccatgttg tagtaatcaa gtatgtgcca tatgttggag atagcaagag agctatggat 1200

gagtacacct cggagatatt catgggtggg aaaaacacta tagtgctgca caacacctgt 1260

gaagactccc tcttggctgc accaatcatc ctcgacttgg ttcttcttgc agaacttagc 1320

acaaggatcc agctcaaagg cgaagcagag ggcaagtttc actctttcca cccagttgct 1380

actattctca gttacctcac aaaggctcct cttgttccac cgggcacacc agtggtgaat 1440

gcactgtcaa agcaacgtgc aatgcttgag aacatactga gagcttgtgt tgggttagct 1500

cctgagaaca acatgatttt ggaatacaag tga 1533

<210> 2

<211> 510

<212> PRT

<213> 胡杨( Pobulus eubhratica)

<400> 2

Met Phe Ile Glu Lys Phe Lys Val Glu Ser Pro Asn Val Lys Tyr Thr

1 5 10 15

Glu Asp Glu Ile His Ser Val Tyr Asn Tyr Glu Thr Thr Glu Leu Val

20 25 30

His Glu Asn Lys Asn Gly Ser Tyr Gln Trp Thr Val Lys Pro Lys Thr

35 40 45

Val Gln Tyr Glu Phe Lys Thr Asp Ile His Val Pro Lys Leu Gly Val

50 55 60

Met Leu Val Gly Trp Gly Gly Asn Asn Gly Ser Thr Leu Thr Gly Gly

65 70 75 80

Val Ile Ala Asn Arg Glu Gly Ile Ser Trp Ala Thr Lys Asp Lys Val

85 90 95

Gln Gln Ala Asn Tyr Phe Gly Ser Leu Thr Gln Ala Ser Ser Ile Arg

100 105 110

Val Gly Ser Phe Asn Gly Glu Glu Ile Tyr Ala Pro Phe Lys Ser Leu

115 120 125

Leu Pro Met Val Asn Pro Asp Asp Ile Val Phe Gly Gly Trp Asp Ile

130 135 140

Ser Asp Met Asn Leu Ala Asp Ala Met Ala Arg Ala Lys Val Phe Asp

145 150 155 160

Phe Asp Leu Gln Lys Gln Leu Arg Pro Tyr Met Glu Ser Met Val Pro

165 170 175

Leu Pro Gly Ile Tyr Asp Pro Asp Phe Ile Ala Ala Asn Gln Asp Ser

180 185 190

Arg Ala Asn Asn Val Ile Lys Gly Thr Lys Lys Glu Gln Val Gln Gln

195 200 205

Ile Ile Lys Asp Ile Arg Glu Phe Lys Glu Lys Asn Lys Val Asp Lys

210 215 220

Val Val Val Leu Trp Thr Ala Asn Thr Glu Arg Tyr Ser Asn Ile Val

225 230 235 240

Val Gly Leu Asn Asp Thr Met Glu Asn Leu Leu Ala Ala Val Glu Lys

245 250 255

Asp Glu Ser Glu Ile Ser Pro Ser Thr Leu Tyr Ala Leu Ala Cys Ile

260 265 270

Tyr Glu Asn Ile Pro Phe Ile Asn Gly Ser Pro Gln Asn Thr Phe Val

275 280 285

Pro Gly Leu Val Asp Leu Ala Ile Lys Arg Asn Ser Leu Ile Gly Gly

290 295 300

Asp Asp Phe Lys Ser Gly Gln Thr Lys Met Lys Ser Val Leu Val Asp

305 310 315 320

Phe Leu Val Gly Ala Gly Ile Lys Pro Thr Ser Ile Val Ser Tyr Asn

325 330 335

His Leu Gly Asn Asn Asp Gly Met Asn Leu Ser Ala Pro Gln Thr Phe

340 345 350

Arg Ser Lys Glu Ile Ser Lys Ser Asn Val Val Asp Asp Met Val Ser

355 360 365

Ser Asn Gly Ile Leu Tyr Glu Pro Gly Glu His Pro Asp His Val Val

370 375 380

Val Ile Lys Tyr Val Pro Tyr Val Gly Asp Ser Lys Arg Ala Met Asp

385 390 395 400

Glu Tyr Thr Ser Glu Ile Phe Met Gly Gly Lys Asn Thr Ile Val Leu

405 410 415

His Asn Thr Cys Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ala Pro Ile Ile Leu Asp

420 425 430

Leu Val Leu Leu Ala Glu Leu Ser Thr Arg Ile Gln Leu Lys Gly Glu

435 440 445

Ala Glu Gly Lys Phe His Ser Phe His Pro Val Ala Thr Ile Leu Ser

450 455 460

Tyr Leu Thr Lys Ala Pro Leu Val Pro Pro Gly Thr Pro Val Val Asn

465 470 475 480

Ala Leu Ser Lys Gln Arg Ala Met Leu Glu Asn Ile Leu Arg Ala Cys

485 490 495

Val Gly Leu Ala Pro Glu Asn Asn Met Ile Leu Glu Tyr Lys

500 505 510

Claims

1.胡杨PeMIPS1基因在培育杨树耐盐及抗重金属铜的杨树新品种中的应用，所述胡杨PeMIPS1基因的核苷酸序列长度为1533 bp，序列为 SEQ.NO.1；对应的氨基酸序列为510个，序列为 SEQ.NO.2。