CN102558322A

CN102558322A - 与大麦黄矮病毒运动蛋白互作的小麦蛋白mip1及其编码基因与应用

Info

Publication number: CN102558322A
Application number: CN2011104161371A
Authority: CN
Inventors: 夏宗良; 王美平; 吴建宇; 李志敏; 曹汝菲
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Shandong Guanfeng Seed Science and Technology Co., Ltd.; Henan Agricultural University
Priority date: 2011-12-14
Filing date: 2011-12-14
Publication date: 2012-07-11

Abstract

本发明提供一种与大麦黄矮病毒运动蛋白相互作用的小麦蛋白(movement protein interacting protein 1，MIP1)及其编码基因与应用。其目的是提供一种与大麦黄矮病毒运动蛋白相互作用的蛋白及其编码基因，以及在提高小麦对黄矮病抗性中的应用方法。通过下调或沉默MIP1基因的表达达到抑制病毒扩散，提高小麦对黄矮病毒抗性的效果。MIP1在小麦抗黄矮病毒病育种方面具有广阔的应用前景。

Description

与大麦黄矮病毒运动蛋白互作的小麦蛋白MIP1及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及一种与植物病毒运动蛋白互作的蛋白及其编码基因与应用，特别涉及一种与大麦黄矮病毒运动蛋白相互作用的蛋白及其编码基因MIP1(movement proteininteracting protein 1，MIP1)，以及在提高小麦对黄矮病抗性中的应用方法。

背景技术

大麦黄矮病毒(Barley Yellow Dwarf Virus，BYDV)是黄症病毒属(Luteovirus)的代表成员，其基因组为单链正义RNA分子。该病毒依靠介体蚜虫在植株间传播、扩散而引起小麦、大麦等禾本科作物的黄矮病。该病的流行难以预测，发病后又不可治愈，被称为“黄色瘟疫”。其发病症状表现为植株黄化、红化、矮化等(Plant Disease Report，1979，63：426-430)。其中，以大麦和小麦受害最为严重。在流行年份，可使大麦产量损失40％，小麦也有20％的损失，因此引起世界各个国家和地区的普遍关注。由大麦黄矮病毒引起的小麦黄矮病，也是我国华北、西北、华东等小麦主产区流行最广危害最严重的病毒病之一，对麦类作物的生产造成严重的威胁(植物病理学报，1986，16：17-22)。

20世纪60-90年代，国内外学者对大麦黄矮病毒开展了生物学、血清学、流行学等方面的研究。Rochow等根据蚜虫宿主种类和血清学关系，将大麦黄矮病毒分为MAV、PAV、SGV、RPV、RMV、GPV、GAV等株系(Phytopathology，1969，59：1580-1589)。周广和等鉴定出4种在我国流行的大麦黄矮病毒株系，分别为GAV(由麦二叉蚜和麦长管蚜传播)，GPV(由麦二叉蚜和禾缢管蚜传播)，PAV(由禾缢管蚜和麦长管蚜传播)和RMV(由玉米蚜传播)(中国农业科学，1987，20：7-12)。根据基因组结构和血清学特点将大麦黄矮病毒分为两个亚组：亚组I包括PAV，MAV和SGV株系；亚组II包括RMV和RPV株系。其中GAV在近几年成为我国小麦生产上的主流株系(Phytopathology，1984，74：1450-1453)。

近年来，对大麦黄矮病毒的研究主要集中在BYDV不同株系的基因组结构和基因产物的功能研究上。国外主要集中在PAV和MAV株系，而国内主要是GPV和GAV株系。黄矮病毒是单链正义RNA病毒，基因组约为5.7kb。对BYDV-PAV的基因组结构研究表明：PAV基因组RNA有6个开放阅读框(ORF)。其中，ORF1编码一个39kDa蛋白，ORF2和ORF1通过移码作用产生99kDa的病毒RNA聚合酶(RdRp)。ORF1和ORF2产物可能与病毒RNA转录有关。ORF3编码病毒的外壳蛋白(CP)，参与外壳的组装。ORF3中还含有一个完全重叠的编码17kDa蛋白的ORF4，可能编码一个运动蛋白(movement protein，MP)，与病毒的胞间移动有关。已有研究表明PAV的ORF4编码的17kDa蛋白是病毒在植物中扩散所必需的(Virology，1996，219：57-65；Phytopathology，1998，88：1031-1039)。对GAV-MP的生化分析表明：BYDV-GAV MP具有较强的病毒RNA的结合活性，其C末端富含精氨酸的结构域负责与RNA分子的结合，N端的α螺旋结构对于MP的核膜定位是必需的(Biopolymers，2005，79：86-96；Functional Plant Biology，2008，35：40-50)。

近年来，酵母双杂交技术成为研究病毒与寄主植物互作的有力工具。Jin等(2007)利用酵母双杂交技术，以马铃薯Y病毒HC-Pro蛋白为诱饵筛选拟南芥cDNA文库，分离出三个编码20S蛋白酶体亚基的互作蛋白(Journal of Virology，2007，81：12881-12888)；Cheng等(2008)以甘蔗花叶病毒HC-Pro蛋白为诱饵蛋白，利用酵母双杂交技术筛选玉米cDNA文库，筛选出一个编码铁氧还蛋白的互作蛋白，并研究了其互作对甘蔗花叶病毒侵染的影响(Journal of General Virology，2008，89：2046-2054)。小麦是我国重要的粮食作物，由大麦黄矮病毒引起的小麦黄矮病，也是我国小麦主产区流行最广危害最严重的病毒病之一，因此，开展黄矮病毒运动蛋白在病毒侵染寄主小麦过程中的作用机制的研究尤为重要。然而，目前尚未见大麦黄矮病毒运动蛋白与寄主互作机制的相关报道。

发明内容

本发明提供一种与大麦黄矮病毒运动蛋白相互作用的小麦蛋白MIP1及其编码基因与应用；通过抑制该基因的表达能提高小麦对黄矮病的抗性。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种与大麦黄矮病毒运动蛋白相互作用的蛋白MIP1(SEQ ID NO：1)及其编码基因(SEQ ID NO：2)；采用大麦条纹花叶病毒(BSMV)载体介导的基因沉默方法，证实MIP1基因的沉默能够增强小麦对黄矮病毒的抗性。本发明将在防治大麦黄矮病毒和培育抗大麦黄矮病毒的小麦新品种方面发挥重要作用。

附图说明

图1：大麦黄矮病毒运动蛋白的互作蛋白编码基因TaMIP1的PCR扩增电泳；

图2：小麦TaMIP1与大麦黄矮病毒运动蛋白MP互作的酵母双杂交验证；

图3：小麦TaMIP1与大麦黄矮病毒运动蛋白MP在植物细胞中互作的双分子荧光互补验证；

图4：TaMIP1基因植物沉默表达载体构建示意图；

图5：TaMIP1沉默表达小麦植株的分子检测；

图6：接种大麦黄矮病毒10天后，转染空载体小麦植株(对照)和TaMIP1沉默表达株系的抗性表现照片；

图7：TaMIP1沉默表达株系与转染空载体小麦植株(对照)接种大麦黄矮病毒后的病株率柱状图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1：小麦MIP1(movement protein interacting protein 1，MIP1)基因的克隆

A.小麦叶片总RNA的分离和纯化

1.总RNA的提取

(1)液氮研磨叶片至粉末状，取适量加入2ml离心管中，同时加入1ml TRIZOL裂解液，震荡混匀，室温静置5min。

(2)4℃，12,000rpm离心15min，取上清于新的离心管中。

(3)加入200μl氯仿，剧烈振荡15s，室温静置3分钟。

(4)4℃，12,000rpm离心15min。

(5)吸取上层水相400-600μl，于新的离心管中。

(6)加入和上步吸取液等体积的异丙醇，轻柔混匀，室温静置5-10min。

(7)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，RNA此时沉于管底。

(8)加入1ml 75％乙醇，轻柔振荡离心管，悬浮沉淀，室温静置5min。

(9)4℃，8,000rpm离心5min，尽量弃净上清。

(10)重复步骤(8)，(9)一次。

(11)室温晾干或真空干燥5-10min。

(12)加入40～60μl DEPC处理并高压灭菌过的H₂O溶解RNA。

2.RNA的纯化(以总RNA为50μl为例)

(1)纯化体系

(2)37℃温浴30min，去除RNA中的DNA。

(3)加DEPC-H₂O至300μl。

(4)加入300μl的酚/氯仿(1∶1)，摇匀静置5min。

(5)4℃，12,000rpm离心15min，吸上清。

(6)加入等体积的异丙醇，-20℃沉淀1-2h。

(7)4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，晾干沉淀。

(8)加入30～40μl用DEPC处理并高压灭菌过的H₂O溶解RNA。

B.RT-PCR扩增小麦ZmMIP1基因

1.小麦叶片第一链cDNA合成

将所述的小麦叶片总RNA吸取1-2μg于1.5ml离心管中，按照Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明进行反转录，得到小麦叶片第一链cDNA。

2.TaMIP1基因的PCR扩增

以所述的第一链cDNA为模板，进行小麦MIP1基因的PCR扩增，得到PCR扩增产物(图1)。

根据前期文库筛选得到互作阳性克隆的测序信息，获得MIP1的部分cDNA序列，在小麦数据库中进行EST序列拼接，获得小麦MIP1全长的电子克隆，并依据此信息设计小麦MIP1基因的全长cDNA引物：

上游引物：5’-ATGGCCGCCCCGACGCCGCAG-3’；

下游引物：5’-CTAACTATATAAGTCGTCATC-3’。

PCR反应体系组成为：

cDNA模板(约50ng)：1μl，上游引物：2μl，下游引物：2μl，10×PCR Buffer：5μl，Ex-Taq酶：1μl，10×dNTPs：2μl，灭超水：37μl。

PCR扩增程序：

将所述的PCR产物在1.0％的琼脂糖凝胶电泳，凝胶照相系统检测到一条分子量约为2500bp的片段(图1)。

3.电泳结束后，用生工生物工程上海公司的胶回收试剂盒，按照产品说明回收纯化所述的PCR扩增产物；经测序验证，与预测的片段大小一致，该基因开放阅读框(ORF)全长2442bp。

实施例2：小麦MIP1与大麦黄矮病毒运动蛋白MP互作的酵母双杂交验证A.MIP1与MP酵母双杂交表达载体的构建

以实施例1中克隆的MIP1为模板，用含有NdeI和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经NdeI和BamHI双酶切、回收后，正向插入表达载体pGADT7(Clontech公司)的NdeI和BamHI位点之间，经菌落PCR和酶切鉴定无误，得到重组载体pGADT7-MIP1。

引物序列如下：

上游引物：5’-TACCATATGGCCGCCCCGACGCCGCAG-3’(SEQ ID NO：3)；

下游引物：5’-GATGGATCC CTAACTATATAAGTCGTCATC-3’(SEQ ID NO：4)。

以实施例1中方法提取大麦黄矮病毒感染的小麦叶片总RNA，按照Fermentas公司的RevertAid^TM First Strand cDNA Synthesis Kit产品说明进行反转录，得到小麦叶片第一链cDNA。以所述的第一链cDNA为模板(大麦黄矮病毒运动蛋白编码基因MP)，用含有NdeI和BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经NdeI和BamHI双酶切、回收后，正向插入表达载体pGBKT7(Clontech公司)的NdeI和BamHI位点之间，经菌落PCR和酶切鉴定正确，得到重组载体pGBKT7-MP。

引物序列如下：

上游引物：5’-GATCATATGGCCCAAGGAGAGCAAG-3’(SEQ ID NO：5)；

下游引物：5’-TCCGGATCCTCACCGAGCTCTCCCTG-3’(SEQ ID NO：6)。

B.MIP1与MP在酵母中的互作

利用LiAC转化法将重组载体pGBKT7-MP和pGADT7-MIP1分别转化酵母菌株AH109，发现对酵母细胞生长无毒性和自激活现象，表明可以进行互作实验。将四种载体组合pGBKT7+pGADT7，pGBKT7+pGADT7-MIP1，pGBKT7-MP+pGADT7，pGBKT7-MP+pGADT7-MIP1共转化AH109酵母细胞，将菌液涂在SD/-Leu/-Trp培养基上，30℃培养至单克隆出现。单克隆经扩大培养后，不同质粒组合的酵母菌落划线于SD/-Leu/-Trp/-Ade/-His缺陷培养基上，观察菌落生长状况。图2可以看出，只有pGBKT7-MP+pGADT7-MIP1共转化的酵母菌落能够在四缺培养基上生长，而其它三种质粒组合都不能在四缺的培养基上生长。这一现象表明，MIP1与MP能够在酵母细胞体内发生互作。

实施例3：小麦MIP1与大麦黄矮病毒运动蛋白MP在植物体内互作验证

A MIP1与MP双分子荧光互补实验表达载体的构建

以实施例1中克隆的MIP1为模板，用含有BamHI和XhoI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经BamHI和XhoI双酶切、回收后插入表达载体pSPYNE-35S的BamHI和XhoI位点之间，经菌落PCR和酶切鉴定无误，得到重组载体pSPYNE-35S-MIP1(简称NE-MIP1)。

引物序列如下：

上游引物：5’-TACGGATCCATGGCCCAAGGAGAGCAAG-3’(SEQ ID NO：7)；

下游引物：5’-GATCTCGAGCCGAGCTCTCCCTG-3’(SEQ ID NO：8)。

以实施例2中获得的运动蛋白MP基因片段为模板，用含有BamHI和XhoI接头序列的特异引物进行PCR扩增，扩增产物经BamHI和XhoI双酶切、回收后，正向插入表达载体pSPYCE-35S的BamHI和XhoI位点之间，经菌落PCR和酶切鉴定正确，得到重组载体pSPYCE-35S-MP(简称CE-MP)。

引物序列如下：

上游引物：5’-GATGGATCCATGGCCCAAGGAGAGCAAG-3’(SEQ ID NO：9)；

下游引物：5’-TCCCTCGAGCCGAGCTCTCCCTG-3’(SEQ ID NO：10)。

B MIP1与MP在烟草叶肉表皮细胞中的互作

利用基因枪转化法将重组载体pSPYNE-35S-MIP1和pSPYCE-35S-MP共转化烟草叶片，放于MS培养基上25℃培养24h后，利用荧光显微镜观察YFP荧光蛋白的表达情况。图3可以看出，黄色荧光主要聚集在烟草叶肉表皮细胞的核中，因为以前的研究发现MP能进入细胞核(Functional Plant Biology，2008，35：40-50)，这一结果表明MIP1与MP在细胞体内确实发生了互作。

实施例4：大麦条纹花叶病毒(BSMV)载体系统介导的小麦MIP1基因沉默及沉默表达小麦株系的分子检测

A植物表达载体的构建

以实施例1中克隆的MIP1为模板，用两端都含有BamHI接头序列的特异引物进行PCR扩增，获得MIP1部分片段(长为480bp)的扩增产物，经BamHI单酶切、回收后，插入大麦条纹花叶病毒(BSMV)γ基因组的载体(该病毒载体的构建方法详见Petty ITD，Hunter BG，Wei N and Jackson AO(1989)Infectious barley stripe mosaic virus RNAtranscribed in vitro from full-length genomic cDNA clones.Virology 171，342-349)的BamHI位点，得到重组载体BSMV-MIP1gs(图4)。

引物序列如下：

上游引物：5’-TACGGATCCCTTGCAGATG ACACTTGTG-3’(SEQ ID NO：11)；

下游引物：5’-GATGGATCCCAGACTTGAAAAGCTGAGGGTG-3’(SEQ ID NO：12)。

B BSMV-MIP1_gs重组质粒转染小麦

1)BSMV病毒载体由pRNAα、pRNAβ、pRNAγ组成，将BSMV：00(pRNAα、pRNAβ、pRNAγb)体外转录反应液各25μl混合作为对照，BSMV-MIP1_gs(pRNAα、pRNAβ、pRNAγ-MIP1_gs)体外转录反应液各25μl混合作为检验样品。每个混合样品中加入等体积的GKP接种缓冲液(50mM glycine，30mM dipotassium hydro genphosphate，pH9.2，1％bentonite，1％celite)，混匀，接种小麦叶片。

2)接种完成后，在叶片上喷洒少量灭菌水，用塑料膜罩住麦苗过夜。24h后移去，正常培养。

C 转染BSMV：00和BSMV-MIP1_gs小麦株系的分子检测

对获得BSMV：00和BSMV-MIP1_gs小麦株系，挑选代表性的株系按照实施例1中所述的方法提取总RNA，并反转录成第一链cDNA。以cDNA为模板，采用半定量RT-PCR技术进行了分子检测(图5)。图5表明：转染BSMV-MIP1_gs的S1-S4株系都表现出较好的基因沉默效果，其表达水平显著低于BSMV：00(对照CK)，表明我们已经获得了MIP1沉默的小麦株系。

根据MIP1基因全长cDNA序列设计的半定量PCR特异引物为：

上游引物：5’-ACACTTGTGAGGAGCCAAAG-3’(SEQ ID NO：13)；

下游引物：5’-GACGCAGTGGGAGTTCAACCAG-3’(SEQ ID NO：14)。

PCR反应体系(25μl)组成为：

cDNA模板(约25ng)：0.5μl，上游引物：1μl，下游引物：1μl，2×PCR Mix 12.5μl，灭超水：10μl。

PCR扩增程序：

半定量PCR所用的小麦内参基因Tubulin的特异引物为：

上游引物：5’-ACATCTGCCGCCGCTCCCTT-3’(SEQ ID NO：15)；

下游引物：5’-GCGCTGTTGGTGATTTCG-3’(SEQ ID NO：16)。

PCR反应体系和程序如本实施例中所述。

实施例5：MIP1沉默表达小麦株系对黄矮病毒的抗性表现

对实例4中获得的小麦MIP1沉默株系和对照(转染空载体的株系)，通过麦二叉蚜和麦长管蚜传毒BYDV-GAV接种小麦植株，每株5头蚜虫，接种3d后，杀灭蚜虫，培养1-2周，观察各株系发病情况。图6表明，接种10天后MIP1沉默株系表现出较强的抗性，症状较轻，植株生长较好；而对照株系出现叶尖发黄，植株生长迟缓，生长势明显较弱(图6)。对接种病毒后的沉默株系和对照株各统计60株，鉴定抗感表现型，根据抗病表现计算病株率。图7显示，MIP1沉默株系对黄矮病毒表现出较高的抗性，病株率仅10％，而对照株感病较多，病株率达90％(图7)。由此表明，通过沉默或抑制MIP1的表达可以显著提高小麦对黄矮病毒的抗性。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.与大麦黄矮病毒运动蛋白互作的小麦蛋白MIP1，其氨基酸序列由SEQ IDNO：1定义。

2.与大麦黄矮病毒运动蛋白互作的小麦蛋白MIP1的编码基因，其核苷酸序列由SEQ ID NO：2定义。

3.根据权利要求1所述的与大麦黄矮病毒运动蛋白互作的小麦蛋白MIP1在提高小麦对黄矮病抗性中的应用，通过下调或沉默MIP1基因的表达，达到抑制病毒扩散，提高小麦对黄矮病毒抗性的效果。