CN109320594A - 一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术和疫苗制备技术领域，公开了一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由rS、rF和IBV M基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBV S1基因和IBV S‑TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDV Fecto基因和IBV S‑TM/CT基因连接而成。本发明还公开了该病毒样颗粒的制备方法和应用。本发明的优点在于，该病毒颗粒克服了以往IB和ND疫苗免疫力低下、不能有效保护禽类的缺陷。本发明提供的病毒样颗粒的制备方法简单易操作，稳定性好，便于推广。

Description

一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及 应用

技术领域

本发明属于生物技术和疫苗制备技术领域，具体涉及一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用。

背景技术

禽传染性支气管炎(infectious bronchitis，IB)和新城疫(newcastle disease，ND)是家禽养殖过程中极为常见的、高度接触性传染疾病，是危害全球养禽业的重大传染病。其病原分别为禽传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)和新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)。

目前，生产应用中针对IBV和NDV的主要控制手段为接种传统疫苗(分别接种两种疫苗或接种二联苗)，但传统疫苗(灭活疫苗和弱毒疫苗)存在一定的缺点，例如灭活疫苗不能有效的诱导机体产生细胞免疫，保护效力低，而弱毒疫苗则会发生突变，甚至与野毒株重组出现新毒株，导致免疫失败。目前，市面上也有一些IBV和NDV DNA疫苗，但大都免疫效力底下，不能提供有效的保护。因此，研发更为安全、高效的新型疫苗并且寻找能够有效提高疫苗免疫效果的方法是IBV和NDV防控研究的重要方向。

病毒样颗粒(virus like particles，VLPs)是不含有病毒遗传物质、但具有病毒粒子结构的空壳。由于缺失了遗传物质，故VLPs不具备感染性但可作为免疫原，它可通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，有效地诱导机体的免疫系统产生免疫保护反应，在疫苗领域具有广阔发展前景。

虽然基于VLPs的疫苗具有重要的经济价值，但目前市面上还没有对于IB和ND的VLPs DNA疫苗，如果将ND和IB有效整合到Bac-to-Bac系统上，必将克服以往IB和ND疫苗免疫力低下，不能有效保护禽类的缺陷，为IB和ND的疫苗做出巨大的贡献。

发明内容

为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种IB和ND的DNA的亚单位疫苗，具体为禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用。

本发明所采用的技术方案为：

IBV基因组全长约27.6kb，编码15个非结构蛋白(non-structural proteins，NSPs)和四种结构蛋白：纤突蛋白(spike glycoprotein，S)，小膜蛋白(small membraneprotein，E)，膜蛋白(membrane glycoprotein，M)和核衣壳蛋白(phosphorylatednucleocapsid protein，N)。M糖蛋白是病毒包膜中最丰富的蛋白质，在CoV装配和萌芽的过程中起着核心作用。E蛋白尽管包膜的最小成分也在CoV包膜形成中起决定性作用；S糖蛋白在翻译后被切割成两个不同的功能性亚基(S1和S2)，在CoV表面上形成独特的纤突结构，并负责受体结合宿主细胞膜表面受体并确定宿主向性，其中S1亚基可诱导机体产生病毒中和抗体(5)，而S2亚基则通过跨膜结构域(TM)将S蛋白锚定在病毒颗粒表面，并与M糖蛋白(6)共价相互作用形成羧基末端结构域(CT)。

NDV的基因组全长约15kb，编码六种蛋白：核衣壳蛋白(nucleocapsid，N)、基质蛋白(matrix protein，M)、磷蛋白(phosphoprotein，P)、融合蛋白(fusion protein，F)、血凝素-神经氨酸酶(haemagglutinin-neuraminidase protein，HN)以及聚合酶(largepolymerase protein，L)，其中F蛋白为NDV的主要抗原蛋白。

基于前述原理，本发明的方案如下：

一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述病毒样颗粒由rS、rF和IBV M基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBV S1基因和IBV S-TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDV Fecto基因和IBV S-TM/CT基因连接而成。

具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述IBV S1基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBV S-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述IBV S1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述IBV S-TM/CT基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述NDV Fecto基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBV S-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述NDV Fecto基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述IBV M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4。

具体的，所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，所述杆状病毒表达系统中杆状病毒穿梭质粒为pFastbac系列载体，所述杆状病毒表达系统中感受态细胞为DH10Bac，所述昆虫细胞为Sf9。

一种权利前述的病毒样颗粒的制备方法，包括如下步骤：

(1)扩增IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因；

(2)连接IBV S1和IBV S-TM/CT，得到rS基因，连接NDV Fecto和IBV S-TM/CT，得到rF基因；

(3)将所述rS、rF和IBV M基因转入杆状病毒表达系统，得到分别包含述rS、rF和IBV M基因的重组杆状病毒表达系统；

(4)将所述分别包含述rS、rF和IBV M基因的重组杆状病毒表达系统共转染入昆虫细胞，收获培养上清，得到rS、rF和M基因的重组杆状病毒。

具体的，所述制备方法，扩增所述IBV S1基因的引物为S1-F/S1-R，所述P1-F和P1-R的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；扩增所述IBV S-TM/CT基因的引物为S-TM/CT-F和S-TM/CT-R，所述S-TM/CT-F和S-TM/CT-R的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ IDNO.8所示；扩增所述NDV Fecto基因的引物为Fecto-F/Fecto-R，所述Fecto-F/Fecto-R的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；扩增所述IBV M基因的引物为M-F/M-R，所述M-F/M-R的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

具体的，所述制备方法，

所述步骤(1)具体包括如下步骤：分别扩增IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBVM基因，纯化，得到IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因的纯化产物；

所述步骤(2)具体包括如下步骤：分别对IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto的纯化产物进行酶切，得到IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto的酶切产物，将IBV S1和IBV S-TM/CT的酶切产物连接，得到rS基因，纯化，得到rS基因的纯化产物，将NDV Fecto和IBV S-TM/CT的酶切产物连接，得到rF基因，纯化，得到rF基因的纯化产物；

所述步骤(3)具体包括如下步骤：将所述rS、rF和IBV M基因的纯化产物分别进行分子克隆，提取质粒，得到分别包含rS、rF和M的克隆载体；分别对rS、rF和M的克隆载体进行酶切，同时对杆状病毒穿梭质粒进行酶切，得到rS基因、rF基因、M基因和杆状病毒穿梭质粒的酶切产物，将rS、rF和M基因的酶切产物分别与杆状病毒穿梭质粒的酶切产物纯化后连接，再分别进行分子克隆，提取质粒，得到分别包含rS、rF和M基因的重组杆状病毒穿梭质粒；将所述包含rS、rF和M基因的重组杆状病毒穿梭质粒分别转入昆虫细胞，培养，收获培养上清，得到rS、rF和IBV M基因的重组杆状病毒表达系统；

所述步骤(4)具体包括如下步骤：将所述rS、rF和M基因的重组杆状病毒表达系统均以5个MOI共转染昆虫细胞，培养96h，收获培养上清，即得所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒。

具体的，所述制备方法，所述步骤(4)中收获培养上清后还包括纯化病毒样颗粒，所述纯化过程中采用蔗糖密度梯度离心，所述蔗糖密度梯度离心中用到的蔗糖溶液包括蔗糖质量体积百分比分别为20％、30％、40％和50％的四种溶液。

一种前述的病毒样颗粒在制备治疗IB和ND疫苗中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明提供了一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，通过将IBV S1、IBVS-TM/CT及NDV F蛋白的核苷酸序列重组到Bac-to-Bac系统上，再将其在昆虫细胞内表达组装，最终得到与天然IBV病毒外观相同的病毒样颗粒，该病毒颗粒克服了以往IB和ND疫苗免疫力低下、不能有效保护禽类的缺陷。同时，本发明提供的病毒样颗粒的制备方法简单易操作，稳定性好，便于推广。

附图说明

图1是本发明的病毒样颗粒的rBV-rS、rBV-rF及rBV-M的WB检测结果图；

图2是本发明的病毒样颗粒的电镜检测结果图。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明做进一步阐释。

1.材料方法

1.1部分毒株和细胞

SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自购自大连宝生物公司(Takara)；pGEM-T Easy(pT)Vector System购自Promega公司；pFastbac-1质粒、大肠杆菌DH10Bac感受态细胞、Sf9昆虫细胞购自Invitrogen公司。

2.试验过程

2.1rS和rF基因的构建

2.1.1IBV M41和NDV LaSota毒株cDNA的制备

利用IBV M41和NDV LaSota毒株接种鸡胚，收集尿囊液，按如下方法提取病毒总RNA，操作步骤如下：

(1)将300μL病毒尿囊液和700μL 4℃预冷的RNAlso Plus温和混匀，室温静置5min；

(2)加入200μL氯仿，振荡混匀后，室温静置15min，12000r/min，4℃离心10min；

(3)弃沉淀，将上清移至新的无菌离心管中，加入700μL 4℃预冷的异丙醇，室温静置10min；

(4)7500r/min，4℃离心10min；

(5)弃上清，用1ml 75％的乙醇重悬洗涤沉淀后，12000r/min，4℃离心15min；

(6)弃上清后，将离心管敞口在超净台中风干沉淀；用适量的RNase-free水溶解沉淀，-20℃保存备用。

将上一步获得的病毒总RNA为模板，按照TakaRa公司的PrimeScript RT reagentkit反转录试剂盒标准步骤合成cDNA，反应体系：

表1

反应条件为：37℃，15min；85℃，5s。反应完成后得到cDNA产物，包括IBV M41和NDVLaSota的cDNA产物，置于-20℃保存备用。

2.1.2IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因的扩增

根据IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因的序列设计引物，并送往生物公司合成并验证，得到表2中的引物，具体如下：

表2

表中下划线碱基为限制性内切酶识别位点；带边框序列为酶切位点保护碱基；粗斜体序列为插入碱基，即：S1、Fecto基因下游插入一个甘氨酸(Gly)密码子，S-TM/CT基因上游插入一个丝氨酸(Ser)密码子。

利用普通PCR方法扩增上述基因片段，用S1-F/S1-R扩增IBV S1基因，用Fecto-F/Fecto-R扩增NDV Fecto基因，用S-TM/CT-F和S-TM/CT-R扩增IBV S-TM/CT基因，用M-F/M-R扩增IBV M基因，反应体系如下，表3中F即S1-F、Fecto-F、S-TM/CT-F或M-F，R为与F对应的S1-R、Fecto-R、S-TM/CT-R或M-R。各基因扩增体系如下所示：

表3

组分	体积(μL)
		Q5High-Fidelity 2×Master Mix	25
F(10μM)	2.5
		R(10μM)	2.5
cDNA	2
		Nuclease-Free H<sub>2</sub>O	18

反应条件：98℃预变性30s；98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸60s，循环30次；72℃延伸5min，得到PCR反应产物。

分别取5μL上述PCR产物，利用1％的琼脂糖凝胶电泳进行初步鉴定，鉴定出凝胶电泳的条带大小与预期相符，用Omega公司的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购纯化回收目的DNA片段。

胶回收的操作步骤如下：PCR产物经凝胶电泳分离后，从凝胶中切下目的条带，转移至1.5mL无菌离心管中，称重，加入其质量相对3倍体积的溶液PN，50℃水浴中放置10min，待琼脂完全融化；将溶液转入吸附柱CA2中(CA2放于收集管中)，室温放置2min，12000r/min离心1min，弃废液，向CA2中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，重复漂洗一次；弃废液后，将CA2放回收集管中，12000r/min离心2min，弃除残留的PW，室温放置5min；将CA2转入无菌的1.5mL离心管中，加入20μL去离子水，室温放置2min，12000r/min离心2min，得到IBVS1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因的纯化产物；置于-20℃保存备用。

2.1.3rS、M及rF克隆载体的制备

将IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto基因的纯化产物分别用BamH I DNA内切酶酶切，体系如下：

表4

将表4中反应体系于PCR管中混匀后，置于PCR仪中，反应条件为37℃孵育4h，分别胶回收后得到IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto的酶切产物。

将上述IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto的酶切产物用T4DNA连接酶连接，即IBVS1与IBV S-TM/CT连接，NDV Fecto与IBV S-TM/CT连接，反应体系如下：

表5

组分	体积(μL)
		10×T4DNA Ligase Buffer	5
T<sub>4</sub>DNA Ligase	5
		IBV S1/NDV Fecto	20
IBV S-TM/CT	20

将表5中反应体系于PCR管中混匀后，4℃连接过夜，得到连接产物，将所述连接产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定与预期相符后，胶回收，得到纯化后的IBV S1与IBV S-TM/CT的连接片段，纯化后的NDV Fecto与IBV S-TM/CT的连接片段，分别命名为rS和rF。

再将纯化后的rS、rF及M基因分别与pGEM-T Easy(pT)Vector连接，反应体系如下：

表6

组分	体积(μL)
		2×T<sub>4</sub>DNA Ligase Buffer	5
目的基因	3
		T<sub>4</sub>DNA Ligase	1
pGEM-T Easy	1

分子克隆的反应条件：将表6中体系混匀后，4℃连接过夜，得到连接产物，取5μL前述连接产物，加入到100μL DH5α感受态细菌中；轻轻混匀后，冰浴30min，42℃热休克2min，再冰浴2min；加入不含抗生素的LB液体培养基900μL，于37℃恒温摇床中120r/min培养45min，3000r/min离心2min，弃部分上清，将剩余的100μL左右菌液中沉淀悬起；混匀后涂布于含有X-gal和IPTG的50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB平板上，置于37℃恒温生化培养箱中，培养16h左右，通过蓝白斑筛选出阳性克隆；接种于50μg/mL氨苄青霉素抗性的LB培养液中，于37℃恒温摇床中200r/min摇菌16h左右，将得到的菌液通过PCR鉴定，鉴定正确的菌液送往生物公司进行测序，测序正确的菌液即为分别包含rS、rF和M的克隆载体的菌液，分别命名为pGEM-T-rS、pGEM-T-M及pGEM-T-rF菌液。

2.2携带rS、rF及M基因的重组杆状病毒的构建

2.2.1提取质粒

质粒的提取方法：收集菌液于干净的1.5mL离心管中，12000r/min离心1min，弃上清，向沉淀中加入250μL溶液P1，振荡混匀，重悬沉淀，再加入250μL溶液P2，温和翻转6～8次使菌体充分裂解，加入350μL溶液P3，充分混匀，12000r/min离心10min；此时收集上清于吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)，12000r/min离心1min，弃收集管中废液，向CP3中加入600μL漂洗液PW，12000r/min离心1min，重复漂洗一次；将CP3放入收集管中，12000r/min离心2min，去除残留PW，将CP3转入干净的1.5mL离心管中，向CP3中滴加50μL无菌的去离子水，室温静置2min后，12000r/min离心2min，收集质粒溶液。质粒置于-20℃保存备用。

按照前述质粒提取方法提取pGEM-T-rS、pGEM-T-M及pGEM-T-rF菌液的质粒，得到pGEM-T-rS、pGEM-T-M及pGEM-T-rF质粒，同时提取pFastbac-1菌液的质粒，得到pFastbac-1载体(pFastbac-1载体在后续酶切实验中分为两份)。

2.2.2连接

将得到的pFastbac-1载体、pGEM-T-rS质粒、pGEM-T-M质粒分别用EcoRI和HindIII进行双酶切，反应体系如下：

表7

组分	体积(μL)
		pFastbac-1/pGEM-T-rS/pGEM-T-M	8
EcoR I	0.5
		Hind III	0.5
10CutSmart Buffer	1

将得到的pFastbac-1载体、pGEM-T-rF质粒用Sal I和Hind III双酶切，反应体系如下：

表8

组分	体积(μL)
		pFastbac-1/pGEM-T-rF	8
Sal I	0.5
		Hind III	0.5
10×CutSmart Buffer	1

表7和表8中的酶切体系的酶切反应条件如下：将上述反应体系在离心管中混匀后，金属浴37℃孵育2h，得到双酶切后的rF、rS和M，还得到经EcoRI和Hind III双酶切后的pFastbac-1载体，以及经Sal I和Hind III双酶切后的pFastbac-1载体。

将前述双酶切后的基因片段及载体片段进行胶回收纯化，得到纯化后的rF、rS、M和两种pFastbac-1载体，分别将纯化后的rS、rF及M分别与带有相同粘性末端的pFastbac-1载体连接并转化入DH5α感受态细胞，PCR鉴定为阳性的菌即为分别包含rS、rF和M基因的重组杆状病毒穿梭质粒的菌液，分别命名为：rpFB-rS、rpFB-rF及rpFB-M菌液。

2.2.3重组Bacmid的构建

分别按照前述方法提取rpFB-rS、rpFB-rF及rpFB-M菌液的质粒，并转化入含有杆状病毒穿梭载体(Bacmid)和具有编码转座酶和四环素抗性基因的辅助质粒(Helper)的DH10Bac感受态细胞，分别得到rpFB-rS、rpFB-rF及rpFB-M的Bac-to-Bac菌液，再提取经PCR鉴定为阳性Bac-to-Bac菌液的质粒，Bac-to-Bac菌液的质粒具体提取方法如下：

(1)平衡过滤柱：在过滤柱中加入2ml EQ1溶液，使其在重力作用下自由沉降，得到平衡后过滤柱；

(2)收集菌体：分别收集1.5mL rpFB-rS、rpFB-rF及rpFB-M的Bac-to-Bac菌液，9000g离心10min，除去上清，加入400μL含有RNase A的R3溶液重悬混匀沉淀，混悬液一；

(3)向(2)中得到的混悬液一中加入400μL裂解液L7，轻轻混匀，不可采用漩涡振荡，静置于室温，使其反应5min，再向其中加入400μL N3溶液，立即上下颠倒轻微混匀后，室温15000g离心20min，收集上清；

(4)将步骤(3)中得到的上清转移到步骤(1)中平衡后过滤柱中，液体通过重力作用自然流下，然后用2.5mL漂洗液PW洗涤过滤柱两次；

(5)将经过步骤(4)处理的过滤柱置于干净的1.5mL离心管中，加入900μL洗脱液E4，随重力自然沉降，将DNA洗脱下来，得到洗出液，再加630μL异丙醇至洗出液中，混匀后冰浴10min，4℃，12000g低温离心30min，小心弃除上清，得到DNA沉淀；

(6)用1mL 70％乙醇重悬步骤(5)中得到的DNA沉淀，4℃，15000g低温离心5min，弃上清，在超净台内使装有DNA沉淀的离心管敞口、自然风干10min，用20μL无热源水重悬、溶解DNA 10min，保存于-20℃，分别命名为rB-rS、rB-rF及rB-M，备用。

步骤(5)和步骤(6)应于超净工作台中进行。

2.2.4重组病毒的收获

利用脂质体介导的方法，将构建的各重组杆状病毒穿梭质粒：rB-rS、rB-rF及rB-M分别转染对数生长期的Sf9昆虫细胞，以下为具体操作方法：

(1)用不含抗生素和血清的Unsupplement Grace培养基将生长在对数期的Sf9昆虫细胞接种到六孔板，每孔2ml，室温贴壁15min；

(2)制备DNA和脂质体混合物：先分别用100μL转染用的Unsupplement Grace细胞培养液分别将8μL的脂质体CellfectinⅡ和1μg的重组穿梭载体稀释，然后再将制备的CellfectinⅡ与重组穿梭载体稀释液(rB-rS、rB-rF或rB-M)轻轻混合均匀(体积约为210μL)，室温孵育30min；

(3)在6孔板内的细胞中逐滴加入约210μL上述DNA与脂质体的混合物；同时，以仅含8μL转染试剂而不含DNA的等量转染用培养基培养一孔Sf9昆虫细胞中作为阴性对照，以排除由于脂质体本身对细胞的毒性作用而对试验结果造成的干扰；

(4)27℃培养4h，除去6孔板中Unsupplement Grace细胞培养液，每孔加入2mL的完全培养基sf-900II SFM，置于27℃继续培养；

(5)每日在显微镜下观察细胞的生长状态，直到细胞出现变大、结团、脱壁甚至破裂等明显的病变症状时，收获6孔板内细胞培养混合物，500g低速离心5min以除去混合物中细胞及碎片，收集上清；

(6)将步骤(5)中得到的上清分装于干净的离心管中，作为第一代重组杆状病毒(P1)，-80℃保存，将各重组病毒分别命名为rBV-rS、rBV-rF及rBV-M。

2.3Western blot鉴定重组蛋白的表达

2.3.1样品制备

(1)将上述各第一代重组杆状病毒(rBV-rS、rBV-rF及rBV-M)传至第3代，分别以5个MOI单独感染T25细胞培养瓶中生长在对数期的Sf9昆虫细胞，感染3d后，分别收集培养上清一和细胞沉淀；

(2)细胞沉淀样品由PBS重悬，再经过超声破碎和-80℃冻融处理后，于4℃12,000g离心10min，弃除杂质，收集上清二；

(3)将步骤(1)中得到的上清一和步骤(2)中得到的上清液二合并为上清，将上清与细胞沉淀分别与2×SDS上样缓冲液混匀，沸水浴10min，离心去除样品中残渣，以防样品中仍有杂质会对之后的电泳试验带来影响；

(4)经12％的SDS-PAGE电泳，利用Western-blot试验检测目的蛋白，其中，检测rS和M蛋白的一抗为IBV的兔源高免血清，检测rF的一抗为NDV的兔源高免血清，二抗为HRP标记山羊抗兔IgG抗体。

其中一抗的制备如下：选择体重在2.0kg左右的雄性新西兰兔作为免疫动物，适应性饲养一周后进行免疫，免疫程序如下：

表9

免疫次数	免疫时间	免疫剂量(ml/只)	免疫方式	免疫佐剂
					首免	0天	1	颈背部皮下多点注射	弗氏完全佐剂(FCA)
二免	14天后	1	颈背部皮下多点注射	弗氏不完全佐剂(FCA)
					三免	14天后	1	颈背部皮下多点注射	弗氏不完全佐剂(FCA)
四免	7天后	0.5	耳缘静脉注射	无

末次免疫七天后耳静脉采血，4℃3000r/min离心10min分离收集血清，-80℃保存备用。

Western-blot试验的具体步骤为：通过半干转方法将样品中的蛋白转印至NC膜上，采用恒电流方式，电流大小以及转膜时间根据NC膜面积和蛋白分子量大小相应调整。将转好的NC膜放入5％脱脂奶中，4℃封闭过夜；将NC膜从封闭液中取出，用1×PBS洗膜3次，10min/次；加入1:500稀释后的一抗，室温，摇床孵育2h；用1×PBS洗4次，3min/次；然后加入1:1000稀释的二抗，室温，摇床孵育1h；用1×PBS洗5次，3min/次；用DAB显色，观察结果。

2.4VLPs的纯化

用rBV-rF，rBV-rS和rBV-M(第三代)共感染对数期的Sf9昆虫细胞96小时后，4,000g，4℃离心20min，得到上清，将上清80,000g，4℃超速离心1.5小时，收集沉淀，沉淀用PBS重悬。配制20％、30％、40％和50％的蔗糖梯度，进行蔗糖密度梯度离心，将溶于PBS的沉淀样品缓缓加入到蔗糖梯度的最上层；80,000g，4℃，超速离心4h；用长针头将30％-40％蔗糖梯度之间明显的白色条带缓慢吸出；再将此样品加入另一个装满PBS的超速离心管中，混匀，80,000g，4℃，离心4h，弃上清，得到VLPs沉淀，用PBS重悬VLPs沉淀，置于-80℃保存，备用。

2.5透射电镜观察VLPs

利用透射电镜(JEM-100CX,JEOL,Japan)观察经密度梯度离心纯化后的VLPs形态。具体方法为：取1μL 2.4中得到的VLPs样品滴加到200目铜网上，吸附5min；用吸水纸将多余的样品吸除，用2％的磷钨酸(PTA)对样品负染色1min；风干后，转到电镜下观察。

3.结果

3.1rS、rF及M蛋白的表达

Sf9昆虫细胞的培养上清中rBV-rF，rBV-rS和rBV-M检测结果如图1所示，均可见rS、rF和M蛋白的目的条带，表明这三种病毒构建成功。

3.2透射电镜观察VLPs

对纯化后的VLPs进行磷钨酸负染色处理之后，用透射电镜观察VLPs的形成情况。结果如图2所示，左图为本发明构建的病毒样颗粒，颗粒周围环绕一层明显的状若皇冠的突起，右图为天然的IBV病毒离子，由此可见，在MOI为5的情况下，本发明构建的rBV-rF，rBV-rS和rBV-M成功组合为了病毒样颗粒，该病毒样颗粒具有典型球形，大小和形态与天然的IBV病毒粒子比较接近，直径在100nm左右，表明本发明提供的VLPs病毒构建成功。

本发明涉及到的序列如下：

表10

本发明不局限于上述可选的实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品。上述具体实施方式不应理解成对本发明的保护范围的限制，本发明的保护范围应当以权利要求书中界定的为准，并且说明书可以用于解释权利要求书。

序列表

<120> 一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒、制备方法及应用

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1602

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgttggtaa cacctctttt actagtgact cttttgtgtg tactatgtag tgctgctttg 60

tatgacagta gttcttacgt ttactactac caaagtgcct ttagaccacc taatggttgg 120

catttacacg ggggtgctta tgcggtagtt aatatttcta gcgaatctaa taatgcaggc 180

tcttcacctg ggtgtattgt tggtactatt catggtggtc gtgttgttaa tgcttcttct 240

atagctatga cggcaccgtc atcaggtatg gcttggtcta gcagtcagtt ttgtactgca 300

cactgtaact tttcagatac tacagtgttt gttacacatt gttataaata tgatgggtgt 360

cctataactg gcatgcttca aaagaatttt ttacgtgttt ctgctatgaa aaatggccag 420

cttttctata atttaacagt tagtgtagct aagtacccta cttttaaatc atttcagtgt 480

gttaataatt taacatccgt atatttaaat ggtgatcttg tttacacctc taatgagacc 540

acagatgtta catctgcagg tgtttatttt aaagctggtg gacctataac ttataaagtt 600

atgagagaag ttaaagccct ggcttatttt gttaatggta ctgcacaaga tgttattttg 660

tgtgatggat cacctagagg cttgttagca tgccagtata atactggcaa tttttcagat 720

ggcttttatc cttttattaa tagtagttta gttaagcaga agtttattgt ctatcgtgaa 780

aatagtgtta atactacttt tacgttacac aatttcactt ttcataatga gactggcgcc 840

aaccctaatc ctagtggtgt tcagaatatt caaacttacc aaacacaaac agctcagagt 900

ggttattata attttaattt ttcctttctg agtagttttg tttataagga gtctaatttt 960

atgtatggat cttatcaccc aagttgtaat tttagactag aaactattaa taatggcttg 1020

tggtttaatt cactttcagt ttcaattgct tacggtcctc ttcaaggtgg ttgcaagcaa 1080

tctgtcttta gtggtagagc aacttgttgt tatgcttatt catatggagg tccttcgctg 1140

tgtaaaggtg tttattcagg tgagttagat cttaattttg aatgtggact gttagtttat 1200

gttactaaga gcggtggctc tcgtatacaa acagccactg aaccgccagt tataactcga 1260

cacaattata ataatattac tttaaatact tgtgttgatt ataatatata tggcagaact 1320

ggccaaggtt ttattactaa tgtaaccgac tcagctgtta gttataatta tctagcagac 1380

gcaggtttgg ctattttaga tacatctggt tccatagaca tctttgttgt acaaggtgaa 1440

tatggtctta cttattataa ggttaaccct tgcgaagatg tcaaccagca gtttgtagtt 1500

tctggtggta aattagtagg tattcttact tcacgtaatg agactggttc tcagcttctt 1560

gagaaccagt tttacattaa aatcactaat ggaacacgtc gt 1602

<210> 2

<211> 210

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tggtatgtgt ggttagccat agcttttgcc actattatct tcatcttaat actaggatgg 60

gttttcttca tgactggatg ttgtggttgt tgttgtggat gctttggcat tatgcctcta 120

atgagtaagt gtggtaagaa atcttcttat tacacgactt ttgataacga tgtggtaact 180

gaacaaaaca gacctaaaaa gtctgtttaa 210

<210> 3

<211> 1497

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggctcca gaccttctac caagaaccca gcacctatga cgctgactat ccgggttgcg 60

ctggtactga gttgcatctg tccggcaaac tccattgatg gcaggcctct tgcagctgca 120

ggaatcgtgg ttacaggaga caaagccgtc aacatataca cctcatccca gacaggatca 180

atcatagtta agctcctccc gaatctgccc aaggataagg aggcatgtgc gaaagccccc 240

ttggatgcat acaacaggac attgaccact ttgctcaccc cccttggtga ctctatccgt 300

aggatacaag agtctgtgac tacatctgga ggggggagac aggggcgcct tataggtgcc 360

attattggcg gtgtggctct tggggttgca actgccgcac aaataacagc ggccgcagct 420

ctgatacaag ccaaacaaaa tgctgccaac atcctccgac ttaaagagag cattgccgca 480

accaatgagg ctgtgcatga ggtcactgac ggattatcgc aactagcagt ggcggttggg 540

aagatgcagc agtttgttaa tgaccaattt aataaaacag ctcaggaatt agactgcatc 600

aaaattgcac agcaagttgg tgtagagctc aacctgtacc taaccgaatt gactacagta 660

ttcggaccac aaatcacttc acctgcttta aacaagctga ctattcaggc actttacaat 720

ctagctggtg gaaatatgga ttacttattg actaagttag gtgtagggaa caatcaactc 780

agctcattaa tcggtagcgg cttaatcacc ggtaacccta ttctatacga ctcacagact 840

caactcttgg gtatacaggt aactctacct tcagtcggga acctaaataa tatgcgtgcc 900

acctacttgg aaaccttatc cgtaagcaca accaggggat ttgcctcggc acttgtccca 960

aaagtggtga cacaggtcgg ttctgtgata gaagaacttg acacctcata ctgtatagaa 1020

actgacttag atttatattg tacaagaata gtaacgttcc ctatgtcccc tggtatttat 1080

tcctgcttga gcggcaatac gtcggcctgt atgtactcaa agaccgaagg cgcacttact 1140

acaccataca tgactatcaa aggttcagtc atcgccaact gcaagatgac aacatgtaga 1200

tgtgtaaacc ccccgggtat catatcgcaa aactatggag aagccgtgtc tctaatagat 1260

aaacaatcat gcaatgtttt atccttaggc gggataactt taaggctcag tggggaattc 1320

gatgtaactt atcagaagaa tatctcaata caagattctc aagtaataat aacaggcaat 1380

cttgatatct caactgagct tgggaatgtc aacaactcga tcagtaatgc tttgaataag 1440

ttagaggaaa gcaacagaaa actagacaaa gtcaatgtca aactgactag cacatct 1497

<210> 4

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgtccaacg aaacaaattg tactcttgac tttgaacagt cagttgagct ttttaaagag 60

tataatttat ttataactgc attcttgttg ttcttaacca taatacttca gtatggttat 120

gcaacaagaa gtaagtttat ttatatactt aaaatgatag tgttatggtg cttttggccc 180

cttaacattg cagtaggtgt aatttcatgt atatacccac caaacacagg aggtcttgtc 240

gcagcgataa tacttactgt gtttgcgtgt ctttcttttg taggttattg gatccagagt 300

attagactct ttaagcggtg tagatcttgg tggtcattta acccagaatc taacgccgta 360

ggttcaatac tcctaactaa tggtcaacaa tgtaattttg ctatagagag tgtgccgatg 420

gtgctttctc ctattataaa gaatggtgtt ctttattgtg agggtcagtg gcttgctaaa 480

tgtgaaccag accacttgcc taaagacata tttgtatgca caccagatag acgtaatatc 540

tatcgtatgg tgcagaaata cattggtgac caaagcggaa ataagaaaag gtttgctaca 600

tttgtctatg caaagcagtc agtagacact ggcgagctag aaagtgtagc aacaggtgga 660

agtagccttt acacataa 678

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gaattcatgt tggtaacacc tcttttacta g 31

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgcggatcct ccacgacgtg ttccattagt g 31

<210> 7

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtcgacatgg gctccagacc ttctacc 27

<210> 8

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgcggatcct ccagatgtgc tagtcagttt g 31

<210> 9

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatcct catggtatgt gtggttag 28

<210> 10

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

aagcttttaa acagactttt taggtctg 28

<210> 11

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gaattcatgt ccaacgaaac aaattgtac 29

<210> 12

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

aagcttttat gtgtaaaggc tacttccacc tg 32

Claims (10)

1.一种禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述病毒样颗粒由rS、rF和IBV M基因分别转入杆状病毒表达系统，再将分别包含rS、rF和M基因的杆状病毒表达系统转入昆虫细胞内组装而成，所述rS基因由IBV S1基因和IBV S-TM/CT基因连接而成，所述rF基因由NDV Fecto基因和IBV S-TM/CT基因连接而成。

2.根据权利要求1所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述IBV S1基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBV S-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述IBV S1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述IBV S-TM/CT基因的序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述NDV Fecto基因的核苷酸序列的3＇端和所述IBV S-TM/CT基因的核苷酸序列的5＇端连接，所述NDV Fecto基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求3所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述IBV M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4。

5.根据权利要求4所述的禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒，其特征在于：所述杆状病毒表达系统中杆状病毒穿梭质粒为pFastbac系列载体，所述杆状病毒表达系统中感受态细胞为DH10Bac，所述昆虫细胞为Sf9。

6.一种权利要求4或5所述的病毒样颗粒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)扩增IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因；

(2)连接IBV S1和IBV S-TM/CT，得到rS基因，连接NDV Fecto和IBV S-TM/CT，得到rF基因；

(3)将所述rS、rF和IBV M基因转入杆状病毒表达系统，得到分别包含述rS、rF和IBV M基因的重组杆状病毒表达系统；

(4)将所述分别包含述rS、rF和IBV M基因的重组杆状病毒表达系统共转染入昆虫细胞，收获培养上清，得到rS、rF和M基因的重组杆状病毒。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中扩增所述IBV S1基因的引物为S1-F/S1-R，所述P1-F和P1-R的序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；扩增所述IBV S-TM/CT基因的引物为S-TM/CT-F和S-TM/CT-R，所述S-TM/CT-F和S-TM/CT-R的序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；扩增所述NDV Fecto基因的引物为Fecto-F/Fecto-R，所述Fecto-F/Fecto-R的序列分别如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示；扩增所述IBV M基因的引物为M-F/M-R，所述M-F/M-R的序列分别如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：

所述步骤(1)具体包括如下步骤：分别扩增IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因，纯化，得到IBV S1、IBV S-TM/CT、NDV Fecto和IBV M基因的纯化产物；

所述步骤(2)具体包括如下步骤：分别对IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto的纯化产物进行酶切，得到IBV S1、IBV S-TM/CT和NDV Fecto的酶切产物，将IBV S1和IBV S-TM/CT的酶切产物连接，得到rS基因，纯化，得到rS基因的纯化产物，将NDV Fecto和IBV S-TM/CT的酶切产物连接，得到rF基因，纯化，得到rF基因的纯化产物；

所述步骤(3)具体包括如下步骤：将所述rS、rF和IBV M基因的纯化产物分别进行分子克隆，提取质粒，得到分别包含rS、rF和M的克隆载体；分别对rS、rF和M的克隆载体进行酶切，同时对杆状病毒穿梭质粒进行酶切，得到rS基因、rF基因、M基因和杆状病毒穿梭质粒的酶切产物，将rS、rF和M基因的酶切产物分别与杆状病毒穿梭质粒的酶切产物纯化后连接，再分别进行分子克隆，提取质粒，得到分别包含rS、rF和M基因的重组杆状病毒穿梭质粒；将所述包含rS、rF和M基因的重组杆状病毒穿梭质粒分别转入昆虫细胞，培养，收获培养上清，得到rS、rF和IBV M基因的重组杆状病毒表达系统；

所述步骤(4)具体包括如下步骤：将所述rS、rF和M基因的重组杆状病毒表达系统均以5个MOI共转染昆虫细胞，培养96h，收获培养上清，即得所述禽传染性支气管炎和新城疫的病毒样颗粒。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中收获培养上清后还包括纯化病毒样颗粒，所述纯化过程中采用蔗糖密度梯度离心，所述蔗糖密度梯度离心中用到的蔗糖溶液包括蔗糖质量体积百分比分别为20％、30％、40％和50％的四种溶液。

10.一种权利要求1-5任意一项所述的病毒样颗粒在制备治疗IB和ND疫苗中的应用。