KR101342437B1 - 유비퀴틴 결합 효소 ｅ２ 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물 및 이를 이용하여 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공하는 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 이용하는 경우, 식물에게 스트레스 저항성을 부여하여 식물 자원 유지 및 식량 생산의 증대에 이용 될 수 있다.

Description

유비퀴틴 결합 효소 Ｅ２ 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물 {Composition for stress resistantance comprising ubiquitin conjugating E2 or gene encoding thereof}

본 발명은 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 유비퀴틴 결합 효소 E2 (이하, 효소 E2)가 식물에 대한 스트레스에 저항성이 있음을 확인함을 바탕으로 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물 및 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 식물에 적용시키는 단계를 포함하는, 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

식물은 움직일 수 없으므로 외부 환경스트레스 조건에 대항할 수 있도록 진화해왔다. 이러한 스트레스 저항성 기작에 관련된 유전자 발현 및 조절에 대한 연구가 새로운 환경적응 작물 개발에 중요한 밑거름이 된다.

유비퀴틴(ubiqutin) 단백질은 매우 잘 보존된 76개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 모든 진핵생물에 존재하고, 세포 주기 조절, 전사의 조절, 스트레스 반응, 신호전달 경로, 항원의 제시, 비정상적인 단백질의 분해 등 많은 세포내 반응에 관여하는 것으로 알려져 있다(Wilkinson KD, (1995) Annu. Rev. Nutr. 15, 161;Hershiko amp; Ciechanover (1992) Annu. Rev. Biochem. 61, 761; Jentsch (1992) Annu. Rev. Genet. 26,179; Glotzer et al. (1991) Nature 349, 132; Bond amp; Sciesinger (1986) Mol. Cell. Biol. 6, 4602).

유비퀴틴화(ubiquitination)는 유비퀴틴 단백질을 기질 단백질에 공유 결합시키는 과정이다. 이 과정은 여러 단계로 구성되어 있으며, 유비퀴틴 활성화 효소 E1(ubiquitin-activating enzyme E1), 유비퀴틴 결합효소 E2(ubiquitin-conjugating enzyme E2), 유비퀴틴 리가제 E3(ubiquitin ligase E3)에 의해 이루어진다.

유비퀴틴은 먼저 E1의 시스테인 잔기에 티오에스테르 결합으로 붙여지는데, 이 과정은 ATP가 필요하다. E1에 결합된 유비퀴틴은 E2의 시스테인 잔기에 티오에스테르 결합한다. 마지막으로 E2에 결합된 유비퀴틴의 C 말단 부분과 기질 단백질의 리신 잔기가 이소펩타이드(isopeptide) 결합을 이루는데 이 과정은 유비퀴틴 리가제 E3에 의해 이루어진다. Ubi-E2(유비퀴틴과 유비퀴틴 결합 효소 E2의 결합체)는 단일 유비퀴틴화된(monoubiquitinated) 기질 단백질에 결합된 유비퀴틴의 48번째 리신 잔기와 반응하고 이렇게 다중 유비퀴틴화된 (poly-ubiquitinated) 기질 단백질은 결국 26S 프로테아좀(proteasome)에 의해 분해되며, 이 과정에서 E2와 E3가 주된 역할을 한다고 알려져 있다.

애기장대는 모두 37개의 UBC(ubiquitin conjugating enzyme) 도메인을 갖는 단백질이 있으며(Kraft et al. 2005), AtUBC1(Arabidopsis thaliana ubiquitin conjugating enzyme 1)과 AtUBC2를 포함한 17개의 UBC의 기내(in vitro)반응에서 E2 활성을 측정하였다(Kraft et al. 2005 Plant Physiol. 139, 1597-1611; Sullivan and Vierstra, 1993 J. Biol. Chem. 268, 8777-8780; Wen et al. 2006 Plant Mol. Biol. 61, 241-253). 식물의 UBC는 효모의 ubc 돌연변이체에서 상보(complementation) 기능을 보였다(Zwirn et al. 1997 Cur. Genet.32, 309-314). 또한 최근에 UBC는 식물에서 종자 휴면 등 세포 주기와 관련 있다는 것이 규명되었다(Fleury et al. 2007 Plant Cell, 19, 417-432; Liu et al. 2007 Plant Cell, 20, 292-306).

본 발명자들은 녹두에서 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자를 분리하고 그 유전자 산물의 특성연구를 거듭한 결과, 이러한 유전자가 과발현된 식물이 스트레스에 저항성을 갖음을 확인함으로써 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

이에 따라 본 발명의 목적은 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 제공하고자 함이다.

또한, 본 발명의 목적은 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공하고자 함이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 서열번호2로 나타낸 아미노산서열로 구성되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

상기 유전자는 바람직하게는 서열번호1에 나타낸 염기서열로 구성되는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 서열번호2로 나타낸 아미노산서열로 구성되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 식물에 적용시키는 단계를 포함하는, 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다.

본 발명에서 제공하는 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 이용하는 경우, 식물에게 스트레스 저항성을 부여하여 식물 자원 유지 및 식량 생산의 증대에 이용 될 수 있다.

도 1은 녹두로부터 분리한 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자 (MLT13)의 cDNA 염기서열을 나타낸 것이다.
도 2는 녹두의 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 cDNA 염기서열로부터 번역된 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 3은 녹두로부터 분리한 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 발현양상을 알아보기 위해 저온, 상처, ABA, 고염 스트레스 처리한 녹두 잎으로부터 전체 RNA를 분리하고 노던 블롯 분석을 수행한 결과이다.
도 4는 녹두로부터 분리한 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 개수를 녹두 게놈에서 알아보기 위해 서던 블롯 분석을 수행한 결과이다.
도 5는 녹두로부터 분리한 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자와 GFP의 재조합 융합 단백질을 담배 표피 세포와 원형질체에 발현시켜 세포내 위치를 분석한 그림이다.
도 6은 녹두로부터 분리한 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자 전체를 포함하고 있는 재조합 단백질을 대장균에서 대량 발현시켜 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 통하여 분석한 사진이다 (T, total protein; S, soluble protein; V, vector; MLT13, pBAD-MLT13).
도 7은 대장균에서 발현시킨 재조합단백질을 이용하여 반응시간을 달리하고, E2 농도를 달리하여 기내에서 유비퀴틴이 MLT13으로 전이되는 양을 비교하기 위하여 단백질 전기영동(SDS-PAGE) 후 His-tag 항체를 이용하여 웨스턴 분석을 통하여 분석한 사진이다.
도 8는 MLT13 발현 효모 벡터 모식도와 정상 효모, MLT13 발현 돌연변이 효모, 벡터 발현 돌연변이 효모 그리고 돌연변이 효모를 YDPA 배지에 스트리크한 후 30°C에서 배양한 후 생장을 비교하기 위해 찍은 사진이다.
도 9은 식물형질전환용 MLT13 발현 벡터 모식도이다.
도 10은 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물에서 MLT13 전사체 발현을 확인한 RT-PCR 결과와 이들 식물을 삼투 스트레스(0.2 M mannitol), 염분 스트레스(0.15 M NaCl)와 스트레스를 주지 않았을 때 식물체 뿌리 생장을 비교 분석한 그래프와 정상 배지와 염분(0.1M NaCl) 함유 배지에 키운 후 찍은 사진이다.
도 11A은 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물(L19, L23)을 정상 배지, 염분(0, 100, 150, 250 mM NaCl), 마니톨(0, 100, 200, 300 mM), 또는 부식산(0, 0.5, 1, 5 μM)을 함유한 배지에 발아시킨 5일 후 발아율을 날짜별로 조사하여 비교 분석한 그래프다. 도 11B는 위의 실험을 보여주는 발아하는 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물을 비교하기 위해 찍은 사진이다.
도 12A은 6주된 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물(L19, L23)을 15일 동안 물을 주지 않고 그 후에 물을 주어 살아남은 생존율(%)을 조사하기 위해 찍은 사진이다. 도 12B는 6주된 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물잎을 채취해 시간별 무게를 비교 분석한 그래프다.
도 13A은 6주된 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물(L19, L23)의 잎을 0(control), 0.3 M NaCl, 0.1 mM ABA에 3시간 처리한 후 현미경을 통해 표피조직의 공변세포의 개폐정도를 비교한 사진이다. 도 13B는 0(control), 0.3 M NaCl, 0.1 mM ABA에 3시간 처리한 후 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물(L19, L23)의 공변세포의 개폐율(공변세포 열린정도/가로길이)을 비교 분석한 그래프다. 공변세포 50개를 측정하고 3반복씩 계산하였으며, 대조구와 통계적 차이는 Student’s t test를 이용하여 분석하였다(* 0.01 ≤ P < 0.05, ** P < 0.01).
도 14은 6주된 대조 식물과 MLT13 형질전환 식물잎을 채취해 페이퍼 타월위에 올려놓고 비닐 백안에서 0, 6, 12 시간 동안 스트레스를 처리한 후 RNA를 분리하여 20 μg을 젤에 로딩한 후 ABA에 의해 발현이 조절되는 각 유전자 cDNA를 이용해 방사성 ³²P 탐침을 합성해 노던 블롯 분석을 수행한 결과이다.

본 발명은 서열번호2로 나타낸 아미노산서열로 구성되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 유비퀴틴 결합 효소 E2 의 범위는 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열로 구성되는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 의미한다. '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과 상기 서열번호: 2에 나타낸 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호: 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. '실질적으로 동질의 생리활성'이란 유비퀴틴 결합 효소 E2 효소 활성을 가지고 있음을 의미한다.

본 발명에 따른 단백질은 자연(예, 녹두)으로부터 추출하거나 또는 본 발명의 단백질을 암호화하는 재조합 핵산의 발현에 의해 또는 화학적 합성에 의해 수득될 수 있다.

본 발명의 발명자들은 일 실시예에서 녹두의 저온 스트레스를 가한 잎과 가하지 않은 입에서 mRNA를 추출하여, 저온 스트레스에 의해서만 발현되는 단편의 cDNA를 확보하였다.

본 발명에서 유비퀴틴 결합 효소 E2을 코딩하는 유전자는 서열번호2의 단백질을 코딩하는 서열 뿐 아니라 이들 단백질에 하나 이상의 치환, 결손, 역위, 전위 등과 같은 돌연변이를 통하여 변형된 동일한 활성을 가진 모든 변형단백질을 코딩하는 유전자인 것이 바람직하고, 서열번호 2에 기재된 것이 더욱 바람직하나 코드 디제너리시등을 고려하여 서열번호 2와 적어도 80% 이상의 상동성을 가진 유전자인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

본 발명에 있어서 “스트레스”란, 내부 또는 외부에서 식물체의 생장에 미칠 수 있는 영향을 의미하며, 바람직하게는 염분 스트레스 또는 가뭄 스트레스일 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.

또한 본 발명은 서열번호2로 나타낸 아미노산서열로 구성되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 식물에 적용시키는 단계를 포함하는, 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법을 제공한다. 상기 스트레스는 바람직하게는 염분 스트레스 또는 가뭄 스트레스 일 수 있다.

가뭄 스트레스 저항성을 증가시키는 방법은 (a) 조성물을 식물 세포에 도입시키는 단계; 및

(b) 상기 식물세포로부터 가뭄 스트레스 저항성이 증가된 식물체를 확인하여 수득하는 단계를 포함할 수 있으나, 그에 한정하는 것은 아니다.

본 명세서에서, 용어 “식물(체)”는 성숙한 식물뿐만 아니라 성숙한 식물로 발육할 있는 식물 세포, 식물 조직 및 식물의 종자 등을 모두 포함하는 의미로서 이해된다.

본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물체는 특별하게 제한되지 않는다. 본 발명의 방법이 적용될 수 있는 식물로는 상치, 배추, 감자 및 무를 포함하는 대부분의 쌍자엽 식물(dicotyledonous plant) 또는 벼, 보리, 바나나 등의 단자엽 식물 (monocotyledonous plant)을 모두 이용될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 방법은 벼, 밀, 보리, 옥수수, 콩, 감자, 밀, 팥, 귀리 및 수수를 포함하는 식량 작물류; 아라비돕시스, 배추, 무, 고추, 딸기, 토마토, 수박, 오이, 양배추, 참외, 호박, 파, 양파 및 당근을 포함하는 채소 작물류; 인삼, 담배, 목화, 참깨, 사탕수수, 사탕무우, 들깨, 땅콩 및 유채를 포함하는 특용작물류; 사과나무, 배나무, 대추나무, 복숭아, 양다래, 포도, 감귤, 감, 자두, 살구 및 바나나를 포함하는 과수류; 장미, 글라디올러스, 거베라, 카네이션, 국화, 백합 및 튤립을 포함하는 화훼류; 및 라이그라스, 레드클로버, 오차드그라스, 알파알파, 톨페스큐 및 페레니얼라이그라스를 포함하는 사료작물류로 구성된 군으로부터 선택되는 식물체에 적용된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

< 실시예1 > 녹두의 저온 스트레스에 의해 유도되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 염기서열 및 아미노산 서열 분석

생육상에서 3주 이상 키운 녹두에 저온(4℃) 스트레스를 가한 잎과 가하지 않은 잎에서 poly(A+) mRNA를 추출한 후 PCR-Select cDNA Subtraction(Clontech)을 이용하여 제조회사 추천방법에 따라 저온 스트레스에 의해서만 발현되는 단편의 cDNA를 확보하였다. 확보된 cDNA를 subcloning 벡터인 pCR2.1(Invitrogen)에 클로닝하고, 플라스미드 DNA는 Plasmid purification kit(Bioneer)를 이용하여 분리하였다. 염기서열 분석은 마크로젠에 의뢰하여 수행하였다. 그 염기서열의 비교 분석은 NCBI, GenBank, EMBL 및 SwissProt databases에서 제공된 DNASIS 및 BLAST 프로그램에 의해 수행하였다. MLT13 partial cDNA의 염기서열 결과를 토대로 gene-specific primer (5'-GTGAGCACAGTGAAGAATATCAG CAACTG-3'; 서열번호: 3)와 AP1 primer (5'-CCATCCTAATACGACTC ACTATAGGGC-3'; 서열번호: 4)를 이용하여 RACE PCR(Marathon cDNA Amplification Kit; Clontech)을 실시하여 전체 염기서열을 확보하였다.

그 결과, 저온 스트레스에 의하여 유도되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 cDNA는 전체 841 bp의 염기서열로 구성되어 있었다(도 1; 서열번호: 1). 도 1의 염기서열에 의해 148개의 아미노산을 연역하였고, 그 결과를 도 2(서열번호: 2)에 나타내었다. 상기 염기서열 및 연역 아미노산 서열은 데이터베이스 검색에 의해 저온 스트레스에 의해 유도되는 새로운 유전자임이 판명되었다.

< 실시예2 > 신규 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 저온, 상처, ABA , 고염 스트레스 처리에 따른 발현 검정

생육상에서 3주 이상 재배한 녹두에 저온(4 °C), 상처, ABA(abscisic acid), 고염 스트레스를 가한 후 시간별로 잎을 샘플링하여 전체 RNA를 RNA extraction kit(Ambion 사 구입)을 이용하여 분리하였다. 상처 스트레스의 경우 녹두 잎을 가위로 상처를 내고 6시간, 24시간째 샘플링을 하였고, ABA 스트레스의 경우 ABA(100 μM)를 스프레이하였다. 고염 스트레스의 경우 식물체를 0.1 M NaCl 용액에 담근 후 각각 6시간, 24시간째 샘플링하였다 (도 3). 분리한 전체 RNA를 1.0 % 포름알데히드 겔에 전기영동한 후, 겔을 20 × SSC 용액 (3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate)으로 나일론 막 (AP Biotech 사 구입)에 전이시키고 방사성 동위원소 [α-³²P] dCTP로 표식된 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 단편 500 bp cDNA를 탐침으로 하여 노던 블롯 분석을 수행하였다.

그 결과, 저온에 의해서 오히려 MLT13 전사체양이 약간 감소하였다. 저온에 특이하게 발현되는 유전자 스크린닝 방법 SSH에 의해 MLT13이 클로닝되었지만 Northern blot 분석 결과 MLT13 RNA 발현이 강하게 유도되지 않는 것을 관찰하였다. 즉, MLT13 RNA는 실제로 저온에 특이적으로 유도되는 것이 아니라는 것을 Northern blot으로 증명하는 것이다.), 그 외 상처 스트레스에 의해서도 MLT13 전사체양이 변화되지 않는 것을 확인할 수 있었다 (도 3). 반면, ABA에 의해 6시간, 24시간째 모두 MLT13의 전사가 강하게 유도되고, 고염에 의해 24시간째 MLT13의 전사가 강하게 유도됨을 확인할 수 있었다(도 3).

< 실시예3 > 서던 블롯을 통한 녹두 게놈상 MLT13 유전자 개수 검정

녹두 잎 조직으로부터 genomic DNA를 추출하여 EcoRI 또는 HindIII 제한효소로 반응시킨 후 0.8 % 아가로스 겔에 전기영동한 후, 겔을 변성 용액 (0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)에 침지한 후 중성화 용액 (0.5 M Tris-Cl, 1.5 M NaCl, pH 7.5)에 침지한 다음 10 × SSC 용액 (1.5 M NaCl, 0.15 M Sodium citrate)으로 나일론 막 (AP Biotech)에 전이시키고 방사성 동위원소 [α-³²P] dCTP로 표식된 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자의 단편 500 bp cDNA를 탐침으로 하여 서던 블롯 분석을 수행하였다. 그 결과 주요한 3개의 밴드가 검출되었고 여러 개의 약한 밴드가 검출됨을 알 수 있었다 (도 4).

< 실시예4 >식물 발현 벡터계를 이용하여 GFP 재조합 융합 단백질 발현

상기 실시예 2에서 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자는 ABA 또는 고염 스트레스에 의해 발현되는 유전자임을 확인하였다. 본 실시예에서는 세포내 위치를 분석하는지를 알아보기 위해서 식물 발현 binary 벡터를 이용하여 GFP 재조합 융합 단백질을 발현시켰다.

상기 실시예 1에서 분리된 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자 cDNA 전체를 주형으로 이용하여 CACC-MLT13 primer (5'-CACCATGGCCTCTA AGCGGATT-3'; 서열번호: 5)와 3GFP-MLT13 primer (5'-GCCCATTGCATACTTCTGAGTCC-3'; 서열번호: 6)로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물(500 bp)을 pENTR vector(Invitrogen)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-MLT13 플라스미드와 GFP 타겟팅용 gateway 벡터인 pK7FWG2(Plant Systems Biology) 플라스미드와 LR Recombinase(Invitrogen)와 반응하여 MLT13 coding region이 GFP의 N 말단 부분과 in-frame으로 융합하였다(도 5). MLT13-GFP 융합 단백질 발현을 담배 식물에서 실시하였다(도 5). 인터넷 단백질 위치 분석 프로그램인 TargetP (http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/)를 이용하여 녹두의 MLT13 단백질을 분석한 결과, MLT13 단백질은 주로 세포질로 타겟팅된다고 예측하였다(0.45). MLT13-GFP 융합단백질의 세포내 위치를 담배 표피세포와 원형질체에서 발현시켜 분석한 결과 핵 주변과 세포질에 발현되는 것을 알 수 있었다(도 5).

< 실시예5 > 대장균 발현 벡터계를 이용하여 재조합 융합 단백질 발현과 분리

상기 실시예 2에서 유비퀴틴 결합 효소 E2는 ABA 또는 고염 스트레스에서 발현되는 유전자임을 확인하였다. 본 실시예에서는 대장균 발현 벡터인 pBAD202(Invitrogen)를 이용하여 N 말단에 thioredoxin과 C 말단에 His-tag이 융합된 재조합 단백질을(33.5 kDa) 대장균에서 발현시키는데 성공하였다(도 6). 상기 실시예 1에서 분리된 유비퀴틴 결합 효소 E2 유전자 cDNA 전체를 주형으로 이용하여 CACC-MLT13 primer (5'-CACCATGGCCTCTAAGCGGATT-3'; 서열번호: 5)와 R-MLT13 primer (5'-GCCCATTGCATACTTCTGAGTCC-3'; 서열번호: 7)로 PCR로 증폭하여 증폭된 PCR 산물 (500 bp)을 pBAD202 vector (Invitrogen)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다.

녹두의 MLT13 유전자를 대장균에서 발현하기 위하여 전이벡터인 pBAD-MLT13을 대장균 LMG194 cell에 온도충격 (42 ℃)으로 삽입하였다. 삽입된 대장균 세포를 75 ㎍/ml의 암피실린(Duchafa)이 함유된 LB (Luria-Bertani) 액체 배지에 1시간 배양한 후 LB-Amp 고체배지에 도말하여 37℃에서 16시간 이상 배양하였다. 배양결과로 확보된 균을 50 ml의 LB-Amp 액체배지에서 OD 0.6 (1.0× 10⁶ 세포)까지 배양한 후 아라비노스(0.002%)를 넣고 28℃에서 3시간 배양하였다. 배양 후 3,000 rpm에서 5분간 원심 분리하여 세포를 수집한 후 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액을 1.7 ml 넣고 세포 파쇄기를 이용하여 세포를 파괴한 후 5,000 rpm에서 5분간 원심 분리하였다. 원심분리 후 상층액을 분리하여 다시 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 수용성 단백질과 비수용성 단백질을 분리하여 12 % SDS-단백질 전기영동(Laemmli 1970 Nature 227, 680-685)을 수행하여 재조합 융합 MLT13 재조합 단백질 발현을 분석하였다(도 6). 그 결과 아라비노스에 의해 MLT13 재조합 단백질이 수용성 형태로 발현되는 것을 확인할 수 있었다(도 6). 또한 대장균 발현계에 의해 발현된 MLT13-His 재조합 단백질은 His-tag column을 이용하여 분리할 수도 있었다.

< 실시예6 > 유비퀴틴 결합 효소 E2 의 기능 검정

대장균에서 분리한 MLT13-His 재조합 단백질을 이용하여 기내에서 유비퀴틴 결합 효소 E2의 기능을 검정할 수 있었다(도 7). 유비퀴틴 결합 효소 E2를 발현하는 대장균을 LB(Amp 75 ㎍/ml) 500ml 액체배지에서 OD 0.6까지 배양한 후 0.002% 아라비노스를 넣고 28 ℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양 후 3,000 rpm에서 15분간 원심 분리하여 세포를 모은 후 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) 완충용액을 20 ml 넣고 세포 파쇄기를 이용하여 세포를 파괴한 후 12,000 rpm에서 10분 동안 원심분리 후 상층액을 His-tag column을 이용하여 His-tag 융합단백질을 분리하였다. 분리된 MLT13-His 단백질(1 ㎍)을 기내에서 효모의 유비퀴틴 활성화 효소 E1(0.2 ㎍)(Sigma), His-tag 유비퀴틴(1 ㎍), 무기 피로포스파타제(0.4 unit) 또는 ATP(0.5 mM)를 첨가하여, 총 20 ㎕ 용액을 30℃에서 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 또는 30분간 반응하였다(50 mM Tris, pH 7.6, 10 mM MgCl₂, 0.1 mM dithioerythritol)(도 7). 반응액을 단백질 전기영동한 후 coomassie로 염색하고 또 His-tag 항체로 웨스턴 한 결과 반응 시간 1분 후 아주 약한 Ubi-MLT13 밴드가(40kDa) 보였으며, 2.5분 후부터 눈에 띄게 Ubi-MLT13이 나타났으며 30분 반응시간이 가장 많이 Ubi-MLT13 밴드가 보여졌다(도 7; 위 그림).

유비퀴틴화에 관여하는 E2 농도를 알아보기 위해 각각 E2 농도를 0, 1, 2, 5, 10 ㎍으로 도 7과 같이 반응하여 단백질 전기영동 후 coomassie 염색과 웨스턴 반응을 하였다(도 7; 아래 그림). 그 결과 기질인 MLT13 농도를 높게 해준 결과 Ubi-MLT13 양도 비례적으로 증가하는 것을 알 수 있었다(도 7; 아래 그림).

< 실시예7 >효모 발현벡터와 ubc4 / ubc5 돌연변이를 이용하여 MLT13 기능 검정

실시예 7에서는 효모 UBC4와 UBC5 단백질 서열과 81% 상동성을 갖는 MLT13를 ubc4 / ubc5 double mutant에서 발현시켜 기능을 분석하였다 (도 8).

상기 실시예 1에서 분리된 ubiquitin conjugating enzyme E2 유전자 cDNA 전체를 template으로 이용하여 CACC-MLT13 primer (5'-CACCATGGCCTCTAAGCGGATT-3') (서열번호5)와 3-MLT13 primer (5'-CTAGCCCATTGCATACTTCTGAGTCC-3') (서열번호8)로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물(700 bp)을 pENTR vector(Invitrogen 사 구입)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-MLT13와 pENTR-GFP 각각plasmid와 효모 발현용 gateway 벡터인 pYES-DEST52(Invitrogen 사 구입) 플라스미드와 LR Recombinase(Invitrogen 사 구입)와 반응하여 GAL 프로모터 뒤에MLT13 그리고 GFP coding region을 클로닝하고 DNA sequencing을 통하여 염기서열을 확인하였다(도 8A). pYES-GFP와 pYES-MLT13 각각의 플라즈미드를 LiAc 방법으로 ubc4 / ubc5 double mutant(Seufert and Jentsch 1990 EMBO J. 9, 543-550)에 형질전환하여 SD (Ura 결핍) 선택배지에 도말한 후 30℃에 2일 배양하여 자란 콜로니들을 플라즈미드 존재 여부를 PCR로 검정하였다. pYES-MLT13인 경우 T7 primer (5'-TAATACGACTCACTATAGGGA-3') (서열번호9)와 3-MLT13 primer (5'-CTAGCCCATTGCATACTTCTGAGTCC-3') (서열번호8)로 pYES-GFP인 경우 T7 primer (5'-TAATACGACTCACTATAGGGA-3') (서열번호9) 와 3-GFP primer (5'-TTATTTGTATAGTTCATCCATGTG-3') (서열번호10)로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물을 아가로즈 젤 상에서 확인하였다. wild-type으로 AH109 (Invitrogen사 구입), ubc4 / ubc5 mutant, ubc4 / ubc5(pYES-MLT13) 그리고 ubc4/ubc5(pYES-GFP)를 YPDA 배지(20g/L Difco peptone, 10g/L Yeast extract, 20g/L Agar)에 스트리크한 후 30℃에서 배양한 후 찍은 사진이다(도 8B). AH109 다음으로 ubc4 / ubc5(pYES-MLT13) 균주가 생장이 좋은 것을 알 수 있었다(도 8B). 그러므로 MLT13은 효모의 UBC4와 UBC5 기능을 보완하는 역할을 하는 것을 알 수 있었다.

< 실시예8 > MLT13 과다발현 형질전환 식물을 이용하여 고염분 스트레스 저항성 기능 분석

실시예 8에서는 MLT13을 애기장대에서 과다발현시켰을 때 고염분 저항성이 증진되는지 알아보기 위해서 식물 발현 binary 벡터를 이용하였다(도 9).

상기 실시예 1에서 분리된 ubiquitin conjugating enzyme E2 유전자 cDNA 전체를 template으로 이용하여 CACC-MLT13 primer (5'-CACCATGGCCTCTAAGCGGATT-3')와 3-MLT13 primer (5'-CTAGCCCATTGCATACTTCTGAGTCC-3')로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물(500 bp)을 pENTR vecto (Invitrogen 사 구입)에 directional PCR 클로닝한 후 염기서열을 확인하였다. 염기서열이 확인된 pENTR-MLT13 plasmid와 과다발현 형질전환용 gateway 벡터인 pH7WG2D(Plant Systems Biology 사 구입) 플라스미드와 LR Recombinase(Invitrogen 사 구입)와 반응하여 35S-MLT13 플라즈미드를 제작하였다(도 9). Agrobacterium tumefaciens C58c1 균주에 35S-MLT13과 pCAMBIA1301을 freeze-thaw 방법을 통해 형질전환하였고, 형질전환된 Agrobacterium은 floral dip 방법을 통해 애기장대에 형질전환하여 형질전환 종자를 1/2 MS (2% sucrose, hygromycin 25 μg/ml) 선택배지에 발아시켜 형질전환 식물을 선발한 후 각 식물체의 종자를 채취하여 발아시키고 키운 후 식물 잎에서 RNA를 추출하여 RT-PCR을 수행하여MLT13 전사체 발현을 확인하였다(도 10A). 벡터 및 MLT13 과다발현 식물체에서 RNA를 분리하여 oligo d(T)18-30 primer를 이용하여 cDNA를 제작하고 애기장대 actin 유전자 발현은 5-actin primer (5'-TGGACTCTGGTGATGGTGTC-3') (서열번호11)와 3-actin primer (5'-CCTCCAATCCAAACACTGTA-3') (서열번호 12)로, MLT13 유전자 발현은 5-MLT13 primer(5'-ATGGCCTCTAAGCGGATTCTGAAG-3') (서열번호13)와 3-MLT13 primer (5'-CTAGCCCATTGCATACTTCTGAGTCC-3') (서열번호8)로 PCR 증폭하여 증폭된 PCR 산물을 아가로즈(1%)젤에 전기영동한 후 ethidium bromide 스테이닝된 젤을 UV 조사된 이미지를 사진으로 촬영하였다(도 10A). 대조식물은 pCAMBIA1301 벡터로 형질전환된 애기장대 식물을 사용하였다.

MLT13 과다발현 형질전환식물체가 염분(0.15 M NaCl)과 mannitol(0.2M)을 첨가한 배지에서 저항성을 보이는지 알기 위해 발아 후 10일된 유묘를 무첨가 배지, NaCl과 mannitol이 첨가된 배지에 옮겨 10일동안 배양하여 식물의 뿌리 생장을 비교하였다(도 10B). 그 결과 mannitol과 염분 스트레스에서는 MLT13과다발현 형질전환식물이 대조군보다는 생장이 좋았지만 mannitol스트레스보다 염분 스트레스에 대해 효과가 크지 못했다(도 10B). 외관상으로 MLT13을 발현하는 형질전환체가 대조 식물보다 뿌리와 잎의 생장이 mannitol과 염분 스트레스에서 강한 것을 확인하였다(도 10C). 식물체에서 MLT13 유전자 과다발현은 삼투 스트레스 저항성을 부여하는 것이라고 생각된다.

ABA는 환경 스트레스에 저항성을 유도한다고 알려져 있다. 특히 불리한 환경조건에서 ABA는 식물의 종자 발아와 발아 후 생육 억제하여 스트레스를 받지 않도록 유도한다고 한다(Lopez et al., 2001 Pro. Natl. Acad. Sci. USA 98, 4782-4787). MLT13 유전자가 ABA와 삼투 스트레스 조건에서 종자 발아에 미치는 영향을 알아보기 위하여 여러 가지 농도의 삼투제 및 ABA가 첨가된 배지에 발아율을 조사하였다(도 11). MLT13 과다발현 애기장대와 벡터 형질전환 종자를 NaCl(0, 100, 150, 200 mM), mannitol(0, 100, 200, 300 mM), ABA(0, 0.15, 1, 5 μM)이 포함된 1/2 MS(2% sucrose) 선택배지에 발아시켜 4°C에 3일간 휴면타파시킨 5일 후에 발아율을 조사하였다(도 11A). MLT13 과다발현 형질전환체(L19, L23)는 특히 고농도의 NaCl, mannitol, ABA에 발아율이 대조 식물에 비해 낮았다(도 11A). 발아 후에도 생장이 MLT13 과다발현 형질전환체에서 대조 식물보다 늦는 것을 관찰할 수 있었다(도 11B). 발아과정상 식물체에서 MLT13 유전자는 삼투 스트레스와 ABA에 더 민감한 반응을 유도한다고 생각된다. 따라서 MLT13 유전자는 발아단계와 유묘 발달 단계에 ABA와 삼투 스트레스 신호전달에 결정적인 역할을 한다고 생각된다.

< 실시예9 > MLT13 과다발현 형질전환 식물을 이용하여 가뭄 스트레스 저항성 기능 분석

MLT13 과다발현 애기장대와 벡터 형질전환 식물체를 6주 키운 후 15일간 물을 주지 않은 다음 물을 주어 회복시킨 사진이다(도 12A). 대조 식물(WT)에 비해 MLT13 과다발현 형질전환식물은 생존율이 훨씬 높았다(도 12A). 대조 식물과 MLT13 형질전환식물의 수분증발량을 비교한 결과 대조 식물이 형질전환체 보다 증발량이 훨씬 높은 것을 알 수 있었다(도 12B). 식물체에서 MLT13 유전자는 가뭄 스트레스 저항성을 부여하며, 이는 수분 증발을 억제하는 효과에 기인된 것이라고 생각된다.

MLT13 과다발현 애기장대의 수분 증발 억제 효과가 기공 개폐와 관련이 있는지 알아보았다(도 13). 대조 식물과 MLT13 형질전환식물잎에 NaCl(0.3 M)이나 ABA(0.1 mM)를 3시간 처리한 후 표피조직을 현미경으로 관찰한 사진이다(도 13A). 완충용액에서는 대조 식물과 과다발현 형질전환체 기공이 모두 열려있는 것을 보여준다(도 13A). NaCl(0.3 M) 처리에서 대조 식물의 기공이 열려있으나 과다발현 형질전환체에서 기공이 닫혀있었고, ABA(0.1 mM)에 의해서 대조 식물의 기공도 닫혀있었으나, 과다발현 형질전환체에서 기공이 더 많이 닫혀있는 것을 알 수 있었다(도 13A). 기공의 개폐율을 기공이 열린정도/기공 길이로 계산한 결과 NaCl 처리보다 ABA 처리에서 대조구와 형질전환체와 차이가 많이 나는 것을 알 수 있었다(도 13B).

ABA 식물 호르몬은 기공의 폐쇄, 발아 억제 및 삼투 스트레스 저항성과 밀접한 관련이 있다. ABA에 의해 여러 가지 유전자 발현이 유도되며, 스트레스 저항성이 증진된다(Giraudat et al., 1994 Plant Mol. Biol. 26, 1557-1577). MLT13 과다발현 형질전환체는 삼투 스트레스 저항성이 증진되었으며, ABA와 삼투 스트레스에 대한 민감도가 유도되는 것을 알 수 있었다(도 10-13). 식물체에서 MLT13 과다발현이 ABA 신호전달에 관련된 유전자 발현에 영향을 주는지 알아보기 위해 대조 식물과 형질전환체에 수분 결핍스트레스를 처리하여(0, 6, 12 h), 여러 유전자의 발현을 노던 블랏으로 분석하였다(도 14). 식물을 비닐백에 넣고 0, 6, 12시간 처리한 후 샘플링하여 전체 RNA를 RNA extraction kit(Ambion 사 구입)을 이용하여 분리하였다. 분리한 전체 RNA를 1.0 % 포름알데히드 겔에 전기영동한 후, 겔을 20 × SSC 용액 (3 M NaCl, 0.3 M Sodium citrate)으로 나일론 막 (AP Biotech 사 구입)에 전이시키고 방사성 동위원소 [α-³²P] dCTP로 표식된 각 유전자PCR 산물을 탐침으로 하여 노던 블롯 분석을 수행하였다. 애기장대 잎에서 RNA를 추출하여 oligo d(T)18-30 primer를 이용하여 cDNA를 제작하고 각 유전자는 해당 프라이머로 RT-PCR을 수행하여 각 PCR 산물을 pGEMT-Easy vector(Promega사)에 클로닝하여 염기서열을 확인한 후 방사성 동위원소 표지를 위하여 사용하였다(표 1).

노던 블롯 분석 결과 MLT13 과다발현 식물체에서 ABI1, ABI5 그리고 ABF3과 같은 유전자 발현이 현저히 증가되는 것을 알 수 있었다(도 14). ABI1은 protein phosphatase 2C를 암호화하며 ABA에 반응하는 기공 폐쇄에 중요한 역할을 한다고 보고되었다 (Allen et al., 1999 Plant Cell 11, 1785-1798). ABI5와 ABF3 유전자는 bZIP (basic leucine zipper) 전사조절인자를 암호화하며 ABA 신호전달에 중요한 역할을 한다고 알려져있다 (Choi et al., 2000 J. Biol. Chem. 21, 1723-1730; Kim et al., 2002 Plant Physiol. 130, 688-697). 이외에도 ABI2 , ABI3 , ABF2 , ABF4와 같은 유전자 발현도 약간 MLT13 형질전환식물에서 증가하였다(도 14). 이들 유전자들은 ABA 신호전달에 관련되어있다. 결론적으로, MLT13 과다발현 식물체에서 ABA 신호전달에 관련된 유전자 발현이 증가되었으며, MLT13유전자 발현에 의한 삼투 스트레스 저항성 또는 ABA 민감성이 증진되는 표현형과 깊은 관련이 있을 것으로 판단하였다.

프라이머	서열정보	서열번호
5‘-ABI1	5’-TCAAGATTCCGAGAACGGAGATC-3’	서열번호14
3'-ABI1	5’-GAGGATCAAACCGACCATCTAAC-3’	서열번호15
5‘-ABI2	5’-GTTCTTGTTCTGGCGACGGAGC-3’	서열번호16
3'-ABI2	5’-CCATTAGTGACTCGACCATCAAG-3’	서열번호17
5‘-ABI3	5’-CTGATTCTTGAATGGGTC-3	서열번호18
3'-ABI3	5’-TTGTTATTAGGGTTAGGGT-3’	서열번호19
5‘-ABI5	5’-AGATGACACTTGAGGATTTCTTGGT-3’	서열번호20
3'-ABI5	5’-TGGTTCGGGTTTGGATTAGG-3’	서열번호21
5‘-ABF2	5’-GCTAGTGGTGTGGTTCCAAGTTC-3’	서열번호22
3'-ABF2	5’-CTGAGCTCTTGCAGCAACCTG-3’	서열번호23
5‘-ABF3	5’-AGAACCTCAACCGGTGGAGAGTG-3’	서열번호24
3'-ABF3	5’-GGAGTCAGATCAGGTGACATCTGG-3’	서열번호25
5‘-ABF4	5'-AACTGTGTTCAACAGATGGGTCAG-3'	서열번호26
3'-ABF4	5'-GGTTCCTCCGTAACTAGCTAATCC-3'	서열번호27
5‘-ABA4	5’-ATGTTGCCAGAGTTGTCTGGAAT-3’	서열번호28
3'-ABA4	5’-TTATTTGTACTGGTTGTTGATTATA-3’	서열번호29
5‘-sus1	5’-ACGGTCAGTTCAGGTGGATCTCCTC-3’	서열번호30
3'-sus1	5’-AAGGTAACGACGGGCCTCAAGACG-3’	서열번호31
5‘-rd29b	5’-AAGCTACCTCTCTCCGGAGGTGGAAGTG-3’	서열번호32
3'-rd29b	5’-TACGTGTAACAGCAAGGACGAGGGAG-3’	서열번호33
5‘-rab18	5’-TGATGTGACACGAAGAGACACGTTCAC-3’	서열번호34
3'-rab18	5’-AAGACGAGCAGCAGTAGCTCGACGAGG-3’	서열번호35

서열목록 전자파일 첨부

Claims (5)

1. 서열번호2로 나타낸 아미노산서열로 구성되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 식물 스트레스에 대한 저항성 증가용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서 상기 유전자는 서열번호1에 나타낸 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 조성물.
   
3. 제1항에 있어서 상기 스트레스는 염분 스트레스 또는 가뭄 스트레스인 것을 특징으로 하는 조성물.
   
4. 서열번호2로 나타낸 아미노산서열로 구성되는 유비퀴틴 결합 효소 E2 또는 이를 코딩하는 유전자를 식물에 적용시키는 단계를 포함하는, 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법.
   
5. 제4항에 있어서 상기 스트레스는 염분 스트레스 또는 가뭄 스트레스인 것을 특징으로 하는 식물에 스트레스 저항성을 증가시키는 방법.
   
   

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