CN106319092A - 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法 - Google Patents

一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测引物、试剂盒及方法。其操作简单，只需PCR反应时加入荧光饱和染料即可；本发明检测速度快且高通量，全部操作过程只需2小时，可完成72个样品的检测，极大缩短了检测时间，是一种新型的用于鉴别诊断猪流行性腹泻经典株和变异株的方法：费用低，不需要特异性荧光标记探针；准确性高、特异性好，重复性好，可以准确、快速、高通量地进行分析，有利于在临床实践中推广应用。

Description

一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测 引物、试剂盒及方法
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测引物、试剂盒及方法。
背景技术
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）为单股正链RNA病毒属于冠状病毒科的，是引起各种年龄猪发生流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea, PED)的病原。PED 临床特征为发病猪呕吐、腹泻、脱水，对一周龄以内仔猪的危害较大，可导致 100%发病率及 50%～100%致死率，PED 目前在包括中国在内的全球多个国家流行，给世界养猪业造成了巨大损失。该疾病于1971年首次在英国被发，19 世纪 80 年代，亚洲也报道了 PED 的发生，并在亚洲持续流行。随后由于PED弱毒疫苗和灭活疫苗的广泛使用，PED的流行得到一定的控制。但自2010年起，中国主要养猪省份陆续暴发了PED。此次流行的PED主要侵害1周龄内仔猪，造成感染仔猪呕吐、腹泻、继而脱水和急性死亡。随后日本、韩国、泰国等亚洲国家和德国、法国、瑞士、匈牙利及意大利等欧洲国家也相继报道PED的发生。2013年4月，美国爱荷华州首次暴发了PED，而在之前美国并没有发生过PED。自暴发后，很快传遍美国各地，造成了仔猪的高死亡率及大量的经济损失，2014年7月，PED已经在美国31
个州和加拿大部分地区暴发。PEDV CV777的基因组全序列是在2001年确定的，十年后，中国韩国相继公布了许多PEDV全基因组序列。不同PEDV基因组全序列比对结果发现自2010
年以后的流行毒株多个基因发生变异，表明此次世界范围内流行的PED是由PEDV变异株引起的。
由于能够引起腹泻的疾病有很多，临床上很难直接诊断PED。容易造成误诊而造成防疫不当。因此需要结合实验室检测，才能判定是哪种病毒的侵染。现PEDV的实验室诊断方法主要包括：病毒分离与鉴定、免疫电镜、免疫荧光、病毒的中和试验、RT-PCR方法、ELISA方法等。但目前的诊断方法只能判断出病原是否为PEDV，而无法鉴别诊断样本中的PEDV是经典毒株还是变异株。传统的鉴别PEDV经典毒株和变异株的方法是通过核酸测序，构建进化树，该方法费时费力。所以迫切需要一种既可检测PDEV又能够鉴别是经典株还是变异株的快速检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测引物。
本发明的另一目的在于提供一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1: CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG（SEQ ID NO：1）；
引物P2: ATACCATGAACGCCACTA（SEQ ID NO：2）。
一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。
一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测方法，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，利用权利要求1所述的引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物P1 0.5µL
引物P2 0.5µL
酶 0.8µL
模板 1µL
LC green 染料 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL。
进一步的，步骤2）中RT-PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min ；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循环35 次；72℃终延伸5min 。
进一步的，步骤3）HRM分析过程中，80℃到90℃以每0.2℃/步的升温速率进行熔解曲线分析。
进一步的，步骤3）中HRM分析的具体分析过程为：在80~90℃熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线在83~83.5℃出现熔解峰时，判定该样品为猪流行性腹泻病毒经典株；若待检测样品熔解曲线在84.25~84.75℃出现熔解峰时，判定为猪流行性腹泻病毒变异株。
本发明的有益效果是：
1）本发明首次建立了一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测方法及引物，只需 PCR体系中加入荧光饱和染料进行常规PCR反应；检测速度快，全部操作过程只需2小时；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料用量少，1个样品的饱和染料成本为1元左右；可以简单、快速的实现高通量分析，适合于猪流行性腹泻病毒筛查。
2）本发明的PCR-HRM 引物，对猪流行性腹泻病毒经典株与变异株均有很好的扩增性， PCR扩增效率高，检测灵敏度高。
3）本发明的PCR-HRM 引物特异性好，能够特异性扩增猪流行性腹泻病毒RNA而不扩增猪常见的其他病毒性和细菌病原，保证了本方法的可靠性。
附图说明
图1为猪流行性腹泻病毒经典株与变异株标准样品HRM标准化熔解曲线；
图2为猪流行性腹泻病毒经典株与变异株标准样品HRM峰型化熔解曲线；
图3为猪流行性腹泻病毒经典株与变异株临床样品HRM峰型化熔解曲线；
图4为特异性试验凝胶电泳图；
图5为经典株阳性质粒样品的峰型化熔解曲线图；
图6为变异株阳性质粒样品的峰型化熔解曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1 HRM引物
本发明经过对所设计的大量引物进行筛选后，发现引物对P1和P2区分猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的效果最好，其碱基序列如下所示。
引物P1：CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG（SEQ ID NO：1）；
引物P2：ATACCATGAACGCCACTA（SEQ ID NO：2）。
实施例2 标准样品的制备及其PCR-HRM 分析
1）猪流行性腹泻病毒RNA 的提取：
采用天根RNA提取试剂盒提取样品中的猪流行性腹泻病毒RNA，样品可以是肠道、肠道内容物、粪便、疫苗或细胞培养物。
2）阳性标准样品的制备
为了验证本发明方法可行性与可靠性，同时构建标准阳性样品，为之后的临床样品检测提供HRM 阳性对照，本发明需优先制备猪流行性腹泻病毒经典株与变异株阳性标准样品。
分别取经过测序确定为经典株和变异株的质粒DNA（质粒浓度稀释至106copies/μL），作为阳性标准样品。
3）阳性标准样品的PCR-HRM操作
分别以上述获得的猪流行性腹泻病毒经典株和变异株的阳性质粒样品作为模板，以P1和P2 为上下游引物在加有荧光饱和染料下的进行RT-PCR扩增，其预扩增反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物P1 0.5µL
引物P2 0.5µL
酶 0.8µL
模板 1µL
LC green 染料 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL。
RT-PCR扩增反应程序为：94℃预变性3 min ；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循环35 次；72℃终延伸5min；HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.2℃的速率从80℃到90℃进行荧光信号的收集。
4）阳性标准样品PCR-HRM 结果分析
HRM分析过程在Rotor-Gene Q 分析仪进行，该仪器可以完成PCR-HRM分析全过程，也可以在普通PCR仪上完成PCR扩增再将PCR产物直接转移至Rotor-Gene Q中完成熔解分析。由于无需开盖，从而保证了PCR产物不受污染。猪流行性腹泻病毒经典株与变异株标准样品HRM结果如图1、图2所示。
图1为猪流行性腹泻病毒经典株与变异株阳性质粒标准品PCR扩增产物的HRM标准化熔解曲线图，可见经典株与变异株熔解曲线差异明显。
图2为猪流行性腹泻病毒经典株与变异株阳性质粒标准品PCR扩增产物的HRM峰型化熔解曲线图，其中经典株扩增的熔解曲线在83-83.5℃出现熔解峰，变异株扩增的熔解曲线在84.25~84.75℃出现熔解峰时，二者熔解峰区分明显。
实施例 3 临床样品的PCR-HRM检测
1）从样本中提取病毒RNA ：方法同实施例2中 RNA 提取方法；
2）以提取的RNA 为模板，进行RT-PCR扩增，扩增反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物P1 0.5µL
引物P2 0.5µL
酶 0.8µL
模板 1µL
LC green 染料 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL
PCR扩增反应程序为：94℃预变性3 min ；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循环35 次；72℃终延伸5min ；HRM分析仪器熔解温度设定是以每步升温0.2℃的速率从80℃到90℃进行荧光信号的收集。
3）对扩增产物进行HRM分析，确定毒株类型
本发明对18份临床样本和疫苗株进行了检测，检测结果如图3。
图3为峰型熔解曲线图，两种毒株PCR扩增产物熔解峰值差异明显。通过对图形的分析，发现其中有7份样本出现熔解峰在83-83.5℃，判定为猪流行性腹泻病毒经典株；另外11份样本熔解峰在84.25-84.75℃，判断为猪流行性腹泻病毒变异株。
由于实际检测中熔解曲线Tm受多方面因素的影响会有些变化，包括核酸片段本身、反应试剂盐离子浓度及饱和荧光染料浓度微弱变化，故介定一个宽的Tm范围。
以本发明引物和方法，在99%置信区间内，且在80-90℃熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线在83-83.5℃出现熔解峰时，判定该样品为猪流行性腹泻病毒经典株；若待检测样品熔解曲线在84.25-84.75℃出现熔解峰时，判定为猪流行性腹泻病毒变异株。。
另外，对这18份样品用针对保守基因的引物进行扩增并测序，做进化分析，分析结果与本发明方法检测的结果完全一致，说明本发明方法的准确性高，可达100%。
实施例 4 特异性试验
选取猪易感的几种RNA和DNA病毒进行特异性检测，选取的病毒有猪瘟病毒（CSFV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）、猪德尔塔病毒（Delta coronavirus）猪轮状病毒（RV）、猪圆环病毒（PCV2）、猪伪狂犬病毒（PRV）、猪细小病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸障碍综合症（PRRSV）、口蹄疫病毒（FMDV）。将非猪流行性腹泻病毒样本与阳性标准品按照相同的加样体系和PCR反应条件进行反应，分析PCR产物熔解曲线结果。
特异性试验凝胶电泳图结果如图4所示。图4表明除了阳性标准品对照外，其他非猪流行性腹泻病毒病原电泳图中未出现目的条带。非猪流行性腹泻病毒病原的未能扩增的实验依据保证了本发明所涉及的引物的特异性，进一步也保证了本发明方法的可靠性。
实施例 5 灵敏性试验
方法：
用实施例2构建好的猪流行性腹泻病毒经典株与变异株阳性质粒样品进行敏感性试验，阳性质粒用灭菌双蒸水作10倍倍比稀释至10-9，共9个稀释度，并用灭菌双蒸水作阴性对照。PCR-HRM的扩增反应：方法同实施例2的反应体系和反应程序。
敏感性试验PCR-HRM结果分析：
PCR扩增产物用Rotor-Gene Q分析仪进行分析。结果如图5和图6。
图5和图6分别是经典株与变异株阳性质粒样品的峰型化熔解曲线图，从图中可以看出，经典株阳性质粒从10-1稀释至10-8均出现了特异性的熔解峰，变异株阳性质粒从10-1稀释至10-9均出现了特异性的熔解峰。结果表明该方法的灵敏度高，对经典株与变异株阳性质粒的最低检测限分别为1.35x103 copies/µL和192 copies/µL。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
<110> 广州维佰生物科技有限公司
<120> 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测引物、试剂盒及
方法
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cggttctttt caaaatttaa tg 22
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ataccatgaa cgccacta 18

Claims (7)

1.一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM引物，其核苷酸序列如下所示：
引物P1: CGGTTCTTTTCAAAATTTAATG（SEQ ID NO：1）；
引物P2: ATACCATGAACGCCACTA（SEQ ID NO：2）。
2.一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有权利要求1所述的引物。
3.一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的HRM检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从样品中提取病毒核酸；
2）以核酸为模板，利用权利要求1所述的引物对P1和P2以及荧光饱和染料，进行RT-PCR扩增反应获得扩增产物；
3）对扩增产物进行HRM分析，确定病毒类型；
上述方法用于非疾病的诊断和治疗。
4.根据权利要求3 所述的方法，其特征在于，步骤2）中RT-PCR扩增的反应体系为：
5×buffer 4µL
dNTP 0.8µL
引物P1 0.5µL
引物P2 0.5µL
酶 0.8µL
模板 1µL
LC green 染料 1µL
ddH2O 11.4µL
Total 20µL。
5.根据权利要求3 或4 所述的方法，其特征在于，步骤2）中RT-PCR扩增反应程序如下：94℃预变性3 min ；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸35s ；循环35 次；72℃终延伸5min 。
6.根据权利要求3 所述的方法，其特征在于：步骤3）HRM分析过程中，80℃到90℃以每0.2℃/步的升温速率进行熔解曲线分析。
7.根据权利要求3 所述的方法，其特征在于：步骤3）中HRM分析的具体分析过程为：在80~90℃熔解温度范围内，若待检测样品熔解曲线在83~83.5℃出现熔解峰时，判定该样品为猪流行性腹泻病毒经典株；若待检测样品熔解曲线在84.25~84.75℃出现熔解峰时，判定为猪流行性腹泻病毒变异株。
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