CN109913585A - 一种利用pcr-elisa检测prv的方法 - Google Patents
一种利用pcr-elisa检测prv的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109913585A CN109913585A CN201910228460.2A CN201910228460A CN109913585A CN 109913585 A CN109913585 A CN 109913585A CN 201910228460 A CN201910228460 A CN 201910228460A CN 109913585 A CN109913585 A CN 109913585A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- pcr
- elisa
- prv
- detection
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种利用PCR‑ELISA检测PRV的方法，针对PRV的毒力基因TK基因设计引物检测PRV，分别标记生物素和地高辛标，利用链霉亲和素与生物素之间特异性结合的原理，使PCR产物牢牢的结合在酶标板上。本发明的方法将PCR与ELISA高灵敏性的特性有效的结合，消除了PCR凝胶电泳灵敏度低和ELISA样品制备复杂等过程，降低了试验难度，有效提高了检测的特异性和灵敏性，为猪伪狂犬病的预防与控制提供了一定的技术支撑。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测技术领域，更具体的说是涉及一种利用PCR-ELISA检测PRV的方法。
背景技术
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)又称Aujeszky病，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PRV)引起的以家畜和多种野生动物发热、奇痒及脑脊髓炎为特征的急性、热性传染病。新生仔猪主要表现为发热，体温可高达42℃，还有一些神经症状，如昏迷、肌肉震颤，严重时四肢呈划水样运动等，并且还可侵害消化系统；母猪感染后可引起流产、死胎及呼吸系统临诊症状；公猪则表现为繁殖障碍和呼吸系统临诊症状；成年猪一般为隐性感染，但终身带毒和排毒，成为本病的主要传染源，并且在本病的传播过程中具有重要意义。此外，PRV可引起多种家畜、实验动物和野生动物发病，已证实有35种动物可被感染，包括猪、牛、绵羊、兔、狗、水貂、雪貂、狐狸、猫和大鼠等，而猪是PRV的主要宿主。该病最早发现于美国，匈牙利学者Aujeszky于1902年首次分离出PRV，认定此病与狂犬病不同，是一种独特的疾病。此后世界各地陆续报道了该病的发生，我国于1947年在家猫体内首次发现该病，其后一些地区也出现了伪狂犬病的相关报道，在我国的大部分地区，伪狂犬病随着集约化养殖模式的逐步扩大呈流行性爆发，这种病一旦发生，很难根除，给养猪业造成了巨大的经济损失，虽然世界各国对该病的控制和根除己经取得较大的成就，但PR对于大多数国家仍是比较严重的猪病之一，每年给世界养猪业造成巨大的经济损失。目前常用的检测方法有酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA)，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)，包含常规RT-PCR、多重,RT-PCR、Real-Time PCR等多种PCR技术。其中，ELISA方法操作简单，不需要昂贵的仪器，适合大规模临床样品的检验检疫，但由于其特异性低、灵敏性差，容易出现假阳性或者假阴性结果，而普通PCR凝胶电泳敏感性较低，实时荧光定量PCR虽可以进行定量检测，但需要特殊的的设备和探针，实验费用昂贵。
因此，提供一种特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速的PCR-ELISA检测PRV的方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了一种利用PCR-ELISA检测PRV的方法，具有特异性强、灵敏度高并且检测方法操作简单、快速等特点。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的特异性引物，所述引物序列如下：
PRV-F：5’-TCCTTCGTGATGACGTGCGT-3’；SEQ ID NO.1；
PRV-R：5’-TGGCGGTCACGCCATAGTT-3’；SEQ ID NO.2；
所述上游引物PRV-F 5’端用地高辛标记，所述下游引物PRV-R 5’端用生物素标记。
进一步，一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取样品RNA，反转录成cDNA，得到扩增模板；
(2)利用所述的特异性引物，对步骤(1)获得的模板进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度；
(4)确定PCR-ELISA二抗最佳浓度；
(5)确定PCR-ELISA的临界值。
进一步，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：94℃预变性4min；94℃30s，63℃30s，72℃50s，30个循环；72℃延伸5min。
进一步，其特征在于，步骤(3)所述确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度的具体步骤为：将链霉亲和素用CBS倍比稀释从1:50-1:1600，PCR产物作为一抗，1:2000HRP标记的抗地高辛抗体为二抗，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测。
进一步，步骤(4)所述确定PCR-ELISA二抗最佳浓度：根据筛选出来的最佳链霉亲和素包被浓度，将HRP标记的抗地高辛抗体从1:1000依次倍比稀释到1:16000，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测。
进一步，步骤(5)所述确定PCR-ELISA的临界值：检测样品OD450值大于或者等于0.150时判定为阳性样品，小于0.150时则为阴性样品。
本发明针对PRV的毒力基因TK基因设计引物检测PRV，分别标记生物素和地高辛标，利用链霉亲和素与生物素之间特异性结合的原理，使PCR产物牢牢的结合在酶标板上。PCR-ELISA将PCR与ELISA高灵敏性的特性有效的结合，消除了PCR凝胶电泳灵敏度低和ELISA样品制备复杂等过程，降低了试验难度，有效提高了检测的特异性和灵敏性，为该病的预防与控制提供了一定的技术支撑。
经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种利用PCR-ELISA检测PRV的方法，该方法最低检测到3.5×103copies/μL，普通PCR最低检测到3.5×105copies/μL，PCR-ELISA灵敏性比普通PCR高约100倍。通过对临床20份未知样品进行检测，普通PCR检测出阳性样品2份，阴性18份，阳性率为10％。而PCR-ELISA检出阳性病料4份，阴性16份，阳性率为20％，阳性检出率增加10％。通过建立的Real-Time PCR进行验证，检测结果与PCR-ELISA一致，两者的符合度为100％。然后将普通PCR未检测出的阳性病料接种PK15细胞，进行病毒分离培养，通过间接免疫荧光(IFA)及普通PCR检测，该2份样品均为阳性。本发明所建立的PCR-ELISA具有灵敏、特异、准确、快速、安全等优势，可应用于PRV的快速诊断，为PRV的流行病学监测提供有力保障。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1附图为本发明PCR扩增结果；
其中，M：DL2000，1：目的基因，2：阴性对照(蒸馏水)；
图2附图为本发明菌液PCR结果；
其中，M：DL2000，1：目的基因，2：阴性对照(蒸馏水)；
图3附图为本发明重组质粒双酶切结果；
其中，M：DL2000，1：重组质粒双酶切；
图4附图为本发明质粒梯度稀释PCR结果；
其中，M：DL2000，1-12：3.5×109copies/μL-3.5×10-3copies/μL质粒；
图5附图为本发明标准曲线；
图6附图为本发明扩增曲线；
图7附图为本发明熔解曲线；
图8附图为本发明临床样品PCR检测结果；
其中，M：DL2000，1-2：2份临床样品，3：阴性对照(蒸馏水)；
图9附图为本发明间接免疫荧光试验结果；
其中，A：阳性对照(实验室保存的PRV病毒接种的PK15细胞)，B、C：样品感染的PK15细胞，D：阴性对照。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
猪伪狂犬病毒、PK15细胞、猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒由本实验室保存提供。
实施例1引物设计
根据GenBank猪瘟石门株序列(登录号：JQ809329.1)，设计特异性引物PRV-F、PRV-R，用于普通PCR扩增，基因片段为399bp，然后分别在引物上下游的5’端分别标记地高辛(DIG)和生物素(BIO)，同时设计1对特异性引物PRV-IF、PRV-IR，用于荧光定量PCR扩增，基因长度为125bp，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成并标记，如表1所示。
表1引物
实施例2 PRV普通PCR扩增
从-80℃冰箱取出实验室保存的猪伪狂犬病毒组织病料，取大约10mg淋巴结，根据TaKaRa MiniBEST ViralRNA/DNAExtraction Kit Ver.5.0说明书提取病毒DNA。以PRV DNA为模板，PRV-F、PRV-R为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸5min；结束后取5μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，扩增出大小约为399bp的目的条带，与预期目的片段大小一致。
实施例3阳性质粒的构建
将上述PCR产物与克隆载体PMD19-T Vector连接。连接体系为PMD19-T Vector0.5μL，目的基因4.5μL，Solution I5.0μL，总体积10.0μL，混匀后放于16℃恒温槽中过夜连接。次日，从-80℃冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞放置冰水混合物中溶解，加入连接产物5μL，冰浴30min，42℃热击90s立即取出，冰上放置1～2min，加入900μL不含抗性的LB液体培养基，放入37℃培养箱中振荡培养45min，4000rpm离心5min，保留约100μL上清，均匀涂布在含Amp抗性(100μg/mL)的LB固体培养基平板上，将平板倒置于37℃恒温培养箱过夜培养，通过菌液PCR和双酶切(BamHⅠ和HindⅢ)验证质粒构建结果，菌液PCR鉴定结果如图2所示，与预期结果一致；双酶切鉴定结果如图3所示，与预期结果一致。
实施例4 PRV PCR-ELISA方法的建立
(1)PCR扩增：以构建的PRV cDNA为模板，标记DIG的上游引物PRV-F，标记BIO的下游引物PRV-R为引物进行PCR扩增。PCR反应条件为94℃预变性4min；94℃30s，63℃30s，72℃50s，30个循环；72℃延伸5min；
(2)确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度：将链霉亲和素用CBS(包被液)倍比稀释从1:50-1:1600，PCR产物作为一抗，1:2000HRP标记的抗地高辛抗体为二抗，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测，结果如表2所示；链霉亲和素包被浓度1:50(1μg/孔)，包被时间1h时OD450接近于1.0并且P/N值最大，最符合预期要求，所以50倍稀释链霉亲和素为最佳包被浓度；
表2 PCR-ELISA包被浓度的筛选
注：P表示OD450阳性值，N表示OD450阴性值。
(3)确定PCR-ELISA二抗最佳浓度：根据筛选出来的最佳链霉亲和素包被浓度，将HRP标记的抗地高辛抗体从1:1000依次倍比稀释到1:16000，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测，结果如表3所示；二抗稀释浓度1:1000时OD450接近于1.0并且P/N值最大，最符合预期要求，所以选择1000倍稀释作为最佳反应条件；
表3 PCR-ELISA二抗最佳浓度的筛选
(4)确定PCR-ELISA的临界值：将30份PRV阴性样品，进行PCR-ELISA，确定PCR-ELISA的阳性判断结果；
阳性对照OD值为1.860，空白对照OD值为0.088。根据30份阴性样品检测结果的OD450值计算出平均值(X)等于0.087，标准方差(SD)等于0.021，根据公式X+3SD＝0.150得到PCR-ELISA判定标准为：检测样品OD450值大于或者等于0.150时判定为阳性样品，小于0.150时则为阴性样品。
实施例5普通PCR与PCR-ELISA灵敏性实验
将构建好的PRV阳性质粒按10倍梯度稀释，10-1-10-12分别对应3.5×109copies/μL-3.5×10-3copies/μL，进行PCR-ELISA和普通PCR检测，比较其灵敏性。
灵敏性实验结果显示，PCR-ELISA最低检测到3.5×103copies/μL(表4)，而PCR最低检测到3.5×105copies/μL(图4)，PCR-ELISA敏感性比普通PCR高约100倍。
表4 PCR-ELISA的敏感性
实施例6 PRV荧光定量PCR检测方法的建立
以PRV DNA为模板，PRV-IF、PRV-IR为引物进行PCR扩增，质粒构建参照实施例3，获得荧光定量PCR标准质粒。将标准质粒浓度换算成拷贝数，然后按照10倍梯度稀释10-1-10-10，制作标准曲线，然后进行PRV荧光定量PCR灵敏性、特异性、重复性分析。
根据重组质粒OD260nm值为108ng/μL，计算得出其拷贝数为3.5×1010copies/μL，10倍梯度稀释后，分别作为模板进行SYBR Green I Real-Time PCR扩增，结果显示线性关系良好，标准曲线如图5所示，扩增曲线如图6所示，熔解曲线如图7所示。
灵敏性与特异性实验结果显示，SYBR Green I Real-Time PCR最低检出量为3.5×103copies/μL，其灵敏性约为常规PCR的100倍。将已知阳性样品CSFV、PPV、PRV、PCV2、PRRSV作为模板进行SYBR Green I Real-time PCR检测，结果显示，只有PRV出现特异性扩增(表5)。
表5 SYBR Green Ⅰ Real-Time PCR特异性检测结果
实施例7临床病料检测
从本地周边疑似感染猪瘟的猪场采集口腔粘液和肛门粘液20份，分别用本发明构建好的普通PCR、PCR-ELISA、荧光定量PCR 3种检测方法对20份样品进行临床检测。结果显示检测的20份样品，其中普通PCR有2份为阳性，18份为阴性，阳性率为10％。PCR-ELISA和Real-Time PCR检出了4份阳性样品，两种检测方法符合度100％，阳性率为20％，阳性率增加10％，检测结果如表6所示。
表6 PCR-ELISA、PCR和Real-Time PCR临床样品检测结果
实施例8病毒分离
为进一步验证PCR-ELISA的灵敏性和准确性，选取普通PCR检测为阴性而PCR-ELISA检测为阳性的临床样品进行病毒分离，将2份样品分别加入灭菌的PBS 1mL，12000rpm离心5min，取上清液用0.22μm滤膜进行过滤。接种PK15细胞，72h后收获病毒，进行普通PCR检测，结果显示，收获的病毒液里均含有PRV(图8)。
实施例9间接免疫荧光检测(IFA)
将生长状态良好的PK15细胞平铺于96孔细胞培养板中，待细胞生长至80％，接种上述实验收获的病毒液，设立阳性对照。置于37℃5％CO2的培养箱中培养72h，进行IFA检测，具体步骤如下：
(1)固定：用预冷的3％H2O2甲醇固定，4℃20min，50μL/孔，弃去固定液，PBST洗6遍。
(2)封闭：用5％脱脂奶粉，300μL/孔，37℃恒温培养箱温育1h，PBST洗涤6遍。
(3)加一抗：加入1:100PRV阳性血清，50μL/孔，37℃恒温培养箱作用1h，PBST洗涤6遍。
(4)加二抗：加入1:100兔抗猪lgG-FITC，50μL/孔，37℃恒温培养箱作用1h，PBST洗涤6遍。
(5)每孔加入50μL的PBS，在荧光显微镜下观察结果。
结果如图9所示，2份普通PCR检测结果为阴性的PRV病毒均为阳性，与PCR-ELISA和Real-Time PCR结果一致，说明PCR-ELISA灵敏度较高，可用于临床样品的检测。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
序列表
<110> 新乡学院
<120> 一种利用PCR-ELISA检测PRV的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
tccttcgtga tgacgtgcgt 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tggcggtcac gccatagtt 19
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
caccgcacgt acaagttc 18
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
taccagtagt tcaccacctc 20
Claims (6)
1.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的特异性引物，其特征在于，所述引物序列如下：
PRV-F：5’-TCCTTCGTGATGACGTGCGT-3’；SEQ ID NO.1；
PRV-R：5’-TGGCGGTCACGCCATAGTT-3’；SEQ ID NO.2；
所述上游引物PRV-F5’端用地高辛标记，所述下游引物PRV-R5’端用生物素标记。
2.一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的方法，其特征在于，具体步骤如下：
(1)提取样品RNA，反转录成cDNA，得到扩增模板；
(2)利用权利要求1所述的特异性引物，对步骤(1)获得的模板进行PCR扩增，获得PCR产物；
(3)确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度；
(4)确定PCR-ELISA二抗最佳浓度；
(5)确定PCR-ELISA的临界值。
3.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的方法，其特征在于，步骤(2)所述PCR扩增的反应体系为：94℃预变性4min；94℃30s，63℃30s，72℃50s，30个循环；72℃延伸5min。
4.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的方法，其特征在于，步骤(3)所述确定PCR-ELISA链霉亲和素最佳包被浓度的具体步骤为：将链霉亲和素用CBS倍比稀释从1:50-1:1600，PCR产物作为一抗，1:2000HRP标记的抗地高辛抗体为二抗，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测。
5.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的方法，其特征在于，步骤(4)所述确定PCR-ELISA二抗最佳浓度：根据筛选出来的最佳链霉亲和素包被浓度，将HRP标记的抗地高辛抗体从1:1000依次倍比稀释到1:16000，100μL/孔，进行PCR-ELISA检测。
6.根据权利要求2所述的一种以非诊断治疗为目的利用PCR-ELISA检测PRV的方法，其特征在于，步骤(5)所述确定PCR-ELISA的临界值：检测样品OD450值大于或者等于0.150时判定为阳性样品，小于0.150时则为阴性样品。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910228460.2A CN109913585A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种利用pcr-elisa检测prv的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910228460.2A CN109913585A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种利用pcr-elisa检测prv的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109913585A true CN109913585A (zh) | 2019-06-21 |
Family
ID=66966663
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910228460.2A Pending CN109913585A (zh) | 2019-03-25 | 2019-03-25 | 一种利用pcr-elisa检测prv的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN109913585A (zh) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102495208A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-06-13 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 禽流感病毒rt-pcr elisa诊断方法及应用该方法的试剂盒 |
| CN103695562A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-04-02 | 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 | Prv毒力基因突变的检测方法及检测试剂盒 |
| CN104745703A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-07-01 | 大连工业大学 | 副溶血性弧菌的pcr-elisa检测试剂盒及检测方法 |
| WO2018059195A1 (zh) * | 2016-09-27 | 2018-04-05 | 广州市维佰生物科技有限公司 | 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法 |
-
2019
- 2019-03-25 CN CN201910228460.2A patent/CN109913585A/zh active Pending
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102495208A (zh) * | 2011-10-24 | 2012-06-13 | 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 | 禽流感病毒rt-pcr elisa诊断方法及应用该方法的试剂盒 |
| CN103695562A (zh) * | 2013-12-05 | 2014-04-02 | 北京大北农科技集团股份有限公司动物医学研究中心 | Prv毒力基因突变的检测方法及检测试剂盒 |
| CN104745703A (zh) * | 2015-03-31 | 2015-07-01 | 大连工业大学 | 副溶血性弧菌的pcr-elisa检测试剂盒及检测方法 |
| WO2018059195A1 (zh) * | 2016-09-27 | 2018-04-05 | 广州市维佰生物科技有限公司 | 一种快速鉴别猪流行性腹泻病毒经典株与变异株的hrm检测引物、试剂盒及方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| 杨少华等: "禽流感病毒RT-PCR ELISA诊断方法的建立", 《中国农学通报》 * |
| 耿昕颖等: "鸭肝炎病毒 PCR-ELISA 检测方法的建立", 《中国兽医科学》 * |
| 许立华等: "三种猪繁殖障碍性病毒混合感染的分子生物学调查", 《中国兽医科技》 * |
| 陈晴等: "PCR-ELISA在疫病病原分子诊断中的应用", 《中国家禽》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Pantin-Jackwood et al. | Molecular characterization and typing of chicken and turkey astroviruses circulating in the United States: implications for diagnostics | |
| Hasoksuz et al. | Biologic, antigenic, and full-length genomic characterization of a bovine-like coronavirus isolated from a giraffe | |
| Sandvik | Laboratory diagnostic investigations for bovine viral diarrhoea virus infections in cattle | |
| Park et al. | Detection and characterization of bovine coronaviruses in fecal specimens of adult cattle with diarrhea during the warmer seasons | |
| CN107299155A (zh) | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 | |
| CN104862420B (zh) | Rpa‑侧流层析检测口蹄疫病毒气溶胶的引物、探针及试剂盒 | |
| CN110358867A (zh) | 非洲猪瘟病毒荧光型raa检测试剂盒 | |
| Johnson et al. | First report of bluetongue virus serotype 1 isolated from a white-tailed deer in the United States | |
| CN109609688A (zh) | 鹅星状病毒、鹅副黏病毒、鹅细小病毒多重pcr检测引物对及检测方法和应用 | |
| CN109913591A (zh) | 基于TaqMan探针法的A型塞尼卡病毒荧光定量RT-PCR检测方法和试剂盒 | |
| CN110358866A (zh) | 新型鹅星状病毒SYBR Green染料法荧光定量PCR检测试剂盒 | |
| CN104745730A (zh) | 非洲猪瘟病毒cp204l基因的荧光pcr检测试剂及其制备方法与用途 | |
| CN104745729A (zh) | 非洲猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合症病毒的二重荧光rt-pcr检测试剂及其制备方法与用途 | |
| CN108318686A (zh) | 一种牛冠状病毒elisa检测试剂盒 | |
| CN110804677B (zh) | 一种区分非洲猪瘟病毒野毒株与基因缺失株的巢式二重pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN109913585A (zh) | 一种利用pcr-elisa检测prv的方法 | |
| CN105734165A (zh) | 一种舒伯特气单胞菌特异性引物及其在大菱鲆养殖过程中的应用 | |
| EP0464010A1 (en) | A method of detecting an infection caused by a specific type of virus, primers, probes and a test kit | |
| CN109868331A (zh) | 通用型猪流行性腹泻病毒和猪丁型冠状病毒的双重巢式rt-pcr引物及检测方法与应用 | |
| CN108676922A (zh) | 用于检测猪流行性腹泻病毒野毒株的引物和探针及TaqMan实时荧光定量PCR方法 | |
| CN108977579A (zh) | 一种检测导致鸭脾脏坏死的新型鸭呼肠孤病毒的荧光定量pcr试剂盒 | |
| CN104372110A (zh) | 一种用于检测小反刍兽疫病毒的Taqman Real-time RT-PCR试剂盒 | |
| McCrae | Nucleic Acid‐Based Analyses of Non‐Group A Rotaviruses | |
| CN107937606A (zh) | 一种鉴定狂犬病毒疫苗株和野生型毒株的试剂以及方法 | |
| CN109988868A (zh) | 一种利用pcr-elisa检测csfv的方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20190621 |