CN111440901A - 一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的pcr-hrm引物、方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR‑HRM引物、方法及其应用。本发明提供的引物对特异性好，使用一对引物即可对SADS‑CoV和PEDV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两种病毒熔解曲线的不同来鉴别。本发明提供的检测方法不需要病毒的分离鉴定，缩短了鉴别病毒的时间；不需要凝胶电泳观察结果，PCR结束即可利用软件分析结果；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料便宜易得；具有特异性好、敏感性高和重复性好的特点，可以准确、快速地进行区分，可以在临床检测中推广使用。

Description

一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR- HRM引物、方法及其应用

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，具体涉及一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物、方法及其应用。

背景技术

冠状病毒主要有4个分群，包括Alpha、Beta、Gamma和Delt冠状病毒，对人和家畜已经造成巨大的危害和经济损失。2017年，在华南某猪场发生急性腹泻疾病暴发的病例中鉴定出一种新的类蝙蝠冠状病毒HKU-2株，随后被鉴定为猪急性腹泻综合征冠状病毒(SwineAcuteDiarrhoea Syndrome Coronavirus,SADS-CoV)。猪急性腹泻综合征的临床症状与其他已知的致猪肠道冠状病毒引起的临诊症状非常相似，表现为急性呕吐和腹泻，新生仔猪体重迅速减轻导致急性死亡。该病可感染各种年龄的猪，但对新生仔猪的影响最为严重，在5天或更小日龄的仔猪中，死亡率高达90％，病后2～6天死亡，而感染的母猪只有轻度腹泻，大多数母猪在两天内恢复。组织病理学检查显示发病仔猪的肠绒毛萎缩变短。

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)也是冠状病毒属族成员，是猪的一种急性的肠道性传染病，主要症状有腹泻，并伴有呕吐和脱水等临床症状。猪流行性腹泻病毒可以感染不同日龄的猪只，而日龄较小的哺乳仔猪死亡率很高。此病毒1978年在比利时首次被分离到。大量的文献证明中国PEDV毒株仍在流行，并且不断变异，产生新的基因型，引起我国各省份猪群中10日龄以内的哺乳仔猪的高发病临床和高死亡，造成了巨大的经济损失。

流行病学调查表明，猪急性腹泻综合征冠状病毒可单独感染，也可与其他导致猪腹泻冠状病毒(如猪流行性腹泻病毒、猪德尔塔冠状病、猪传染性胃肠炎病毒和轮状病毒)混合感染，混合感染中以SADS-CoV和PEDV的混合感染率最高。猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒的临床症状及解剖症状极为相似，在临床和组织病理学上很难区分，其鉴别诊断通常需借助实验室诊断技术，传统的检测方法费时费力，操作方法繁琐，不利于疾病的及时诊断治疗，造成重大的经济损失。因此，建立能够简单、快速、准确区分这两种病毒感染的方法，对于临床实践具有重要意义。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物。

本发明的另一目的在于提供上述鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物的应用。

本发明的另一目的在于提供一种鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物，包括引物对P-F和P-R，引物对的核苷酸序列如下：

P-F：GATGGTGGTTGTAASACTAT；

P-R：ACAGTRGCACCTATGTAGCC。

引物P-F中引入了1个简并碱基S(相当于G/C)，P-R中引入了1个简并碱基R(相当于A/G)。

上述鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物在制备鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒中的应用。

一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒，包括上述PCR-HRM引物，和PCR-HRM扩增反应所需的试剂。

所述的PCR-HRM扩增反应所需的试剂包括HRM Analysis Premix；所述的HRMAnalysis Premix中包含饱和荧光染料。

所述的饱和荧光染料优选为EvaGreen荧光染料。

上述鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒在鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒中的应用。所述的应用为非诊断目的研究中的用途。

一种鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻的方法，是从待测样品中提取病毒基因组，利用上述PCR-HRM引物进行荧光定量PCR扩增和HRM分析，根据HRM曲线鉴别出猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒。

所述的病毒基因组可以是病毒DNA或病毒RNA；为病毒RNA时，先将得到的病毒RNA逆转录成cDNA，以得到的cDNA为模板，利用上述PCR-HRM引物进行荧光定量PCR扩增和HRM分析。

所述的荧光定量PCR扩增的体系为：每20μL反应体系中，含：2×HRM AnalysisPremix10μL，上游引物P-F(10μmol/L)0.5μL，下游引物P-R(10μmol/L)0.5μL，模板1μL，无核酸酶双蒸水余量；所述的HRM Analysis Premix中包含饱和荧光染料。

所述的饱和荧光染料优选为EvaGreen荧光染料。

所述的荧光定量PCR扩增的条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。

所述的HRM分析的条件为70℃到83℃以0.1℃/s的熔解速率运行。

所述的HRM分析优先通过Rotor-Gene QM软件分析。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明首次提供了可以快速鉴别SADS-CoV和PEDV的HRM引物和相应的检测方法。使用一对引物即可对SADS-CoV和PEDV进行PCR扩增，然后通过实时监测升温过程中双链DNA荧光染料与PCR扩增产物的结合情况，采集荧光数据，根据两种病毒熔解曲线的不同来鉴别SADS-CoV和PEDV。不需要病毒的分离鉴定，缩短了鉴别病毒的时间；不需要凝胶电泳观察结果，PCR结束即可利用软件分析结果；费用低，不需要特异性探针，荧光饱和染料便宜易得；具有特异性好、敏感性高和重复性好的特点，可以准确、快速地进行区分，可以在临床检测中推广使用。

附图说明

图1为扩增产物凝胶电泳结果图；其中，泳道M为Marker，其中，泳道M为Marker，泳道1为阴性对照，泳道2为SADS-CoV，泳道3为阴性对照，泳道4为PEDV。

图2为标准化熔解曲线图。

图3为峰型化熔解曲线图。

图4为特异性凝胶电泳结果图；其中，泳道M为Marker，泳道1为SADA-CoV，泳道2为PEDV，泳道3为TGEV，泳道4为PDCoV，泳道5为PoRV，泳道6为阴性对照。

图5为敏感性标准化熔解曲线图。

图6为敏感性峰型化熔解曲线图。

图7为重复性标准化熔解曲线图。

图8为重复性敏感性峰型化熔解曲线图。

图9为体外混合标准化熔解曲线图。

图10为体外混合峰型化熔解曲线图。

图11为临床样品标准化熔解曲线图。

图12为临床样品峰型化熔解曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

实施例1PCR-HRM引物设计

根据猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒基因保守序列设计出扩增猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒部分基因序列的引物对P-F和P-R，其碱基序列如下所示：

P-F：GATGGTGGTTGTAASACTAT；

P-R：ACAGTRGCACCTATGTAGCC。

引物P-F中引入了1个简并碱基S(相当于G/C)，P-R中引入了1个简并碱基R(相当于A/G)。

实施例2标准样品的制备及其PCR-HRM分析

(1)病毒RNA的提取：用AxyPrep^TM体液病毒DNA/RNA制备试剂盒(产品序列号:PID0320425)分别提取病料样品(2019年采自广东省某猪场)中的猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒RNA。病料样品主要是肠道等组织样品。

(2)反转录得到cDNA：用上一步骤中所得RNA为模板，加入反转录试剂，按下表1所示反应体系，将PCR管放入PCR仪，经37℃反转录15min；85℃灭活5s，放入-20℃保存备用。

表1反转录PCR反应体系

反转录体系先把前三个试剂加入PCR管中，70℃水浴10min，冰上急冷2min，离心数秒使RNA溶液聚集在EP管底部；然后加入剩余试剂，振荡，42℃水浴一小时后，70℃保温15min，冰上冷却3min，最终得到cDNA。

(3)质粒的制备：分别取经过测序确定为猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒的cDNA作为模板，分别以P-F和P-R为引物进行荧光定量PCR扩增，其扩增反应体系如下表2：

表2荧光定量PCR反应体系

荧光定量PCR扩增的反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min。

将扩增产物分别进行琼脂糖凝胶电泳检测并切胶纯化，凝胶电泳结果如图1所示。图中的M为Marker(DL1000 DNA Marker)，泳道1～4分别为1：阴性对照，2：SADS-CoV，3：阴性对照，4：PEDV。凝胶电泳结果显示，猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒阳性样品在149bp左右有目的条带，表明所设计的引物能够同时扩增出猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的目的条带。

用TaKaRa公司的试剂盒将纯化后的cDNA连接至pMD-19T载体中，载体连接反应体系如下表3(10μL)，反应条件：16℃，2h以上。

表3载体连接反应体系

将连接产物转化至DH5α感受态细胞，挑选单克隆，进行菌落PCR鉴定，将鉴定为阳性菌的菌落进行质粒抽提，送去测序。

质粒的PCR-HRM操作步骤：分别将以上述获得的猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒的两种阳性质粒为DNA模板，分别进行PCR-HRM扩增反应和分析；PCR-HRM反应体系如表4所示：

表4 PCR-HRM反应体系

PCR-HRM扩增反应程序：95℃预变性2min；95℃变性10s、60℃退火30s，循环35次；70℃到83℃以延伸0.1℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。

质粒的PCR-HRM结果分析：PCR扩增产物用Rotor-GeneQ分析仪进行分析。猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒的质粒HRM(高分辨率熔解曲线，HighResolutionMeltingcurve)结果如图2、图3所示。

从图2所示的标准化熔解曲线图上可看出，猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒质粒的熔解曲线相互分开，表明所设计引物适合用于HRM分析。

从图3所示的峰型化熔解曲线图上可看出，两种质粒熔解曲线形状不同，从而可以明显的区分。

实施例3特异性实验

分别提取其他猪常见导致腹泻的病毒RNA，如猪传染性胃肠炎病毒(PorcineTransmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)(TGEV-SY株，已在文献“尤刘阳等,猪传染性胃肠炎病毒SY株的分离鉴定及S基因的序列分析.中国兽医科学,2016.46(05):第579-585页.”中公开)、猪丁型冠状病毒(Porcine Deltacoronavirus，PDCoV)(H223株，已在文献“贺东生等,猪德尔塔病毒H223株的分离鉴定和持续传代及N基因遗传进化分析.猪业科学,2019.36(07):第72-74页.”中公开)和猪轮状病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)(猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒(G5型)三联活疫苗(弱毒华毒株+弱毒CV777株+NX株)(简称猪腹泻三联苗)，哈尔滨维科生物技术开发公司)RNA分别作为RNA模板，以实施例2标准样品的制备方法进行荧光定量PCR反应，将PCR产物进行凝胶带电泳分析，电泳结果如图4所示。图中的M为Marker(DL1000 DNA arker)，泳道1～6分别为1：SADA-CoV，2：PEDV，3：TGEV，4：PDCoV，5：PoRV，6：阴性对照。凝胶电泳结果显示，猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒阳性样品在149bp左右有目的条带，而其他样品均未出现电泳条带，表明所设计的引物特异性好，适用于HRM分析。

实施例4敏感性实验

测得两种病毒的质粒标准品的浓度分别为24.8ng/μL、21.6ng/μL，以此10倍倍比稀释，稀释梯度为10^-1～10^-9。按照实施例2的操作进行敏感性实验。结果如图5标准化熔解曲线图和图6峰型化熔解曲线图所示。产生的峰图与预期符合，10^-7为SADS-CoV最低检测限，最低检测到7.96×10²copies/μL；10^-7为PEDV最低检测限，最低检测到6.93×10²copies/μL。表明所设计的引物灵敏度高。

实施例5重复性实验

分别取三个批次两种病毒的三个阳性质粒样品，按照实施例2的操作进行重复性实验。实验结果如图7和图8所示，表明所建立的方法重复性良好。

实施例6体外混合实验

由于临床中常常有混合感染的病例，而且两种病毒感染宿主所引起的临床症状和病理变化相似，所以本研究模拟了体外混合感染的情况，以此评价PCR-HRM方法对混合感染样品的鉴别能力。体外按比例混合SADS-CoV和PEDV的质粒标准品，PEDV和SADS-CoV比例分别为体积比10:0、9:1、7:3、5:5、3:7、1:9、10:0。结果如图9和图10所示。结果表明，当SADS-CoV和PEDV产物以不同比例混合时溶解曲线形状逐渐向优势产物熔解曲线靠近，当混合比例1：1(体积比)时熔解曲线变化最大，与单独感染某种病毒的熔解曲线离合程度越明显。对于临床中的混合感染病例，能够清晰地看见有两个峰，以此来区分混合感染病例。

实施例7临床样品PCR-HRM分析

(1)从临床样本(2019年采自广东省某猪场)中提取病毒RNA：方法同上述实施例2中RNA提取方法；

(2)以提取的病毒RNA反转录得到的cDNA为模板，进行荧光定量PCR扩增，其扩增反应体系如表5所示：

表5荧光定量扩增反应体系

PCR-HRM扩增反应程序：95℃预变性2min；95℃变性10s、60℃退火30s，循环35次；70℃到83℃以延伸0.1℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。对扩增产物进行HRM分析，确定病毒的种类。

本实施例检测了15份临床样品，PCR-HRM的结果如图11、图12所示。有7份样品为猪急性腹泻综合征病毒，有6份样品为猪流行性腹泻病毒，2份为猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒混合感染。

实施例8检测试剂盒的组装

一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒与猪流行性腹泻病毒的HRM检测试剂盒，包括以下成分：浓度10μmol/L、体积分别为0.5μL的引物P-F和P-R，10μL 2×HRM Analysis Premix(包含EvaGreen荧光染料)。

PCR-HRM扩增反应程序：95℃预变性2min；95℃变性10s、60℃退火30s，循环35次；70℃到83℃以延伸0.1℃/s的熔解速率进行熔解曲线分析。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 华南农业大学

<120> 一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物、方法及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P-F

<220>

<223> s相当于g/c

<400> 1

gatggtggtt gtaasactat 20

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> P-R

<220>

<223> r相当于a/g

<400> 2

acagtrgcac ctatgtagcc 20

Claims (10)

1.一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物，其特征在于：包括引物对P-F和P-R，引物对的核苷酸序列如下：

P-F：GATGGTGGTTGTAASACTAT；

P-R：ACAGTRGCACCTATGTAGCC。

2.权利要求1中所述的鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的PCR-HRM引物在制备鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒中的应用。

3.一种鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1中所述的PCR-HRM引物，和PCR-HRM扩增反应所需的试剂。

4.根据权利要求3中所述的鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：所述的PCR-HRM扩增反应所需的试剂包括HRM Analysis Premix；所述的HRM Analysis Premix中包含饱和荧光染料。

5.根据权利要求4中所述的鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒，其特征在于：所述的饱和荧光染料为EvaGreen荧光染料。

6.权利要求3～5任一项中所述的鉴别猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒的试剂盒在鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻中的应用，其特征在于：所述的应用为非诊断目的研究中的用途。

7.一种鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻的方法，其特征在于：从待测样品中提取病毒基因组，利用权利要求1中所述的PCR-HRM引物进行荧光定量PCR扩增和HRM分析，根据HRM曲线鉴别出猪急性腹泻综合征病毒和猪流行性腹泻病毒；所述的方法为非诊断目的研究方法。

8.根据权利要求7中所述的鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻的方法，其特征在于：所述的病毒基因组为病毒RNA时，先将得到的病毒RNA逆转录成cDNA，以得到的cDNA为模板，再利用权利要求1中所述的PCR-HRM引物进行荧光定量PCR扩增和HRM分析。

9.根据权利要求7或8任一项中所述的鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻的方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增的体系为：每20μL反应体系中，含：2×HRM AnalysisPremix 10μL，浓度为10μmol/L的上游引物P-F 0.5μL，浓度为10μmol/L的下游引物P-R 0.5μL，模板1μL，无核酸酶双蒸水余量；所述的HRM Analysis Premix中包含饱和荧光染料。

10.根据权利要求9中所述的鉴别猪急性腹泻综合征和猪流行性腹泻的方法，其特征在于：所述的荧光定量PCR扩增的条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s、60℃退火30s、72℃延伸20s，循环35次；72℃终延伸10min；

所述的HRM分析的条件为70℃到83℃以0.1℃/s的熔解速率运行。

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