JP2006006338A - トマト黄化壊疽ウイルス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】TSWV-B SのRNAをクローニングし、配列決定して、他のTSWV単離株の公表されている配列と比較することによって該TSWV-Bを特徴付けする。TSWVヌクレオキャプシドのためのヌクレオチド配列が記載され、TSMV単離株からの該ヌクレオキャプシドのヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック植物は、異なる血清群からのトスポウイルスに対する抵抗性を付与することが示された。加えて、TSWVのレタス単離株からのヌクレオキャプシドの ヌクレオチド配列を含有するトランスジェニック植物を作出し、多量のヌクレオキャプシド蛋白質を産生する植物は、同種単離株および遠縁のツリフネソウ壊疽斑点ウイルス(INSV)の単離株双方に対して中レベルの保護を有していた。
【選択図】なし
Description
図1は、本発明によるウイルスRNAからNP遺伝子をクローニングするための戦略を示す図である。
図2は、タバコ・プロトプラストにおける本発明によるトマト黄化壊疽病ウイルスのヌクレオキャプシド蛋白質(NP)遺伝子のイン・ビボ(in vivo)経時的発現を示す図である。
図3は、本発明によるTSWV-B S RNAにおける、配列決定したcDNAクローンの位置を示す図である。
図4は、本発明によるTSWV単離株の中での関係を示す樹系図である。
図5は、本明細書に記載したTSWV単離株の血清学的な関係を示す図である。
図6は、トランスジェニック植物におけるヌクレオキャプシド蛋白質(NP)の蓄積のレベルとTSWV単離株に対する抵抗性の度合との相関を示す図である。
図7は、本発明の1つの態様によりトランスジェニック植物に導入したTSWV-BL N暗号配列を示す図である。
図8は、本発明の1つの態様によりトランスジェニック植物に導入したTSWV-BLの半分のN遺伝子断片を示す図である。
TSWV-BL RNAの単離:
TSWV-BL単離株は、ダチュラ・ストラモニウム・エル(Datura stramonium L.)から以下のごとく精製した:感染組織を3倍容量の緩衝液(0.033MのKH2PO4、0.067MのK2HPO4、0.01MのNa2SO3)と共にワーリング・ブレンダーで45秒間摩砕した。そのホモジネートを前記緩衝液で湿らせた4層のチーズクローズを通して濾過し、7,000rpmにて15分間遠心した。そのペレットを組織の元の重量に等しい量の0.01M Na2SO3に再懸濁し、8,000rpmにて15分間再度遠心した。その後に、上清を元の組織重量の1/10に等しい量の0.01M Na2SO3に再懸濁した。そのウイルス抽出液を9,000rpmにて15分間遠心し、その上清を、0.01MのNa2SO3中に作成した10-40%スクロース段階勾配上に注意深く負荷した。23,000rpmにて35分間遠心した後に、ウイルスゾーン(メニスカスより約3cm下)を採取し、2倍容量の0.01M Na2SO3で希釈した。その半-精製ウイルスを27,000rpmにて55分間ペレット化した。
TSWVおよびウイルスRNAの精製
TSWV-BL単離株[プラント・ディジーズ(Plant Disease)第74巻:154頁(1990年)]は、実施例Iに記載のごとく、ダチュラ・ストラモニウム・エル(Datura stramonium L)から精製した。0.04%のベントナイト、10μg/mlのプオテイナーゼK、0.1Mの炭酸アンモニウム、0.1%(w/v)のジエチルチオカルバミン酸ナトリウム、1mMのEDTA、および1%(w/v)のドデシル硫酸ナトリウム(SDS)の溶液中に精製したウイルスを再懸濁し、65℃にて5分間インキュベートして、直ちにH2O-飽和フェノールから抽出し、続いてさらにクロロホルム/イソアミルアルコール(24:1)から抽出した。ウイルスRNAを2.5容量のエタノール中に沈殿させ、蒸留水に溶解した。
cDNAおよびPCRに基づくNP遺伝子のクローニング:
第一鎖cDNAは、グブラー(Gubler)およびホフマン(Hoffman)により記載されているランダム・プライマーを用いて、精製したTSWV-BLのRNAから合成した[ジーン(Gene)第25巻:263頁(1983年)参照]。第二鎖は、RNアーゼ H/DNAポリメラーゼで試料を処理することにより作製した。得られた二重鎖cDNA試料を、スクロース濃度勾配遠心法によりサイズ-分画し、EcoRIメチラーゼによりメチル化し、EcoRIリンカーを付加した。EcoRIで消化した後に、子ウシ腸アルカリ性ホスファターゼで処理することによってその5'-末端リン酸基が除去されているpUC18のEcoRI部位に、cDNA試料を連結した。イイ・コリ(E.coli)DH5αコンピテント・セル(ベセスダ・リサーチ研究所(Bethesda Research Laboratories))を形質転換し、TSWVのcDNAインサートを含むクローンを、50μg/mlのアンピシリン、IPTGおよびX-galを含有する寒天培地上に平板培養することによって一次選抜した。アルカリ溶解法を用いて、選抜クローンからプラスミドDNAを単離し[ビイアールエル・フォーカス(BRL Focus)第11巻:7頁(1989年)参照]、EcoRI制限酵素消化に続くジーンスクリーン・プラス(GeneScreen Plus)・ナイロンフィルター(デュポン社(DuPont))上へのDNAトランスファーによってインサートのサイズを測定した。TSWV-BL S RNAのcDNAインサートを含むプラスミドクローンは、以下に記載するごとく、TSWV-CPNH1 S RNAのヌクレオチド配列(GCAAGTTCTGCGAGTTTTGCCTGCT)に相補的な32P-標識オリゴマー(AGCAGGCAAAACTCGCAGAACTTGC)に対するハイブリダイゼーションによって同定した[ジャーナル・オブ・ジェネラル・バイロロジー(J.Gen.Virol.)第71巻:001頁(1990年)参照]。幾つかのクローンをアガロースゲル上で同定し分析して、インサートのサイズを測定した。クローンpTSWVS-23は、約1.7kbの長さの最も大きなcDNAインサートを含んでいることが判明した。
植物発現ベクターおよび植物形質転換ベクターの構築
実施例IIIからゲル単離したNP遺伝子断片を、50μl反応緩衝液[50mMのトリス-HCl(pH8.0)、10mMのMgCl2、0.1MのNaCl]中の制限酵素NcoIで37℃にて3時間消化し、NcoIで消化した植物発現ベクターpB1525に直接クローン化した。得られたプラスミドを同定し、カリフラワー・モザイク・ウイルス(CaMV)35Sプロモーターに対してセンス向きであるプラスミドをpB1525-NP+と命名し、逆向きであるものをpB1525-NP−と命名した。パン(Pang)らにより記載されているごとく[ジーン(Gene)、第112巻:229頁(1992年)参照]、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tobacum)プロトプラストにおけるNP遺伝子の経時的発現により、この発現カセットのNP産生能を測定した。次いで、(NP遺伝子は内部HindIIIおよびEcoRI部位を含んでいるため)HindIII/EcoRIでの部分消化によって、NP遺伝子を含有する発現カセットをpB1525-NP+から切り出し、同酵素で切断した植物形質転換ベクターpBIN19(クロンテック・ラボラトリーズ,インコーポレイティド(Clontech Laboratories,Inc.))に連結した。ホルスターズ(Holsters)らにより記載されている方法[モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス(Mol.Gen.Genet.)第163巻:181頁(1978年)参照]を用いて、得られたベクターpBIN19-NP+および対照プラスミドpBIN19をエイ・チュメファシエンス(A.tumefaciens)LBA4404株に移入した。
アグロバクテリウム媒介形質転換:
アグロバクテリウム株LAB4404(クロン・テク(Clon Tech))の液状培地中に一晩浸漬することによって、ベクターpBlN19−NP+または対照プラスミドpBlN19を含有する該アグロバクテリウム株と共にニコチアーナ・タバカム・バール・ハバナ・シイブイ(Nicotiana tabacum var Havana cv)423の葉ディスクをインキュベートし、該接種したリーフディスクを非選択的MS培地上で3日間インキュベートした[サイエンス(Science)第227巻:1229頁(1985年)参照]。形質転換した細胞を選択し、苗条再生のために、300μg/mlカナマイシンおよび500μg/mlカルベニシリンを含有するMS培地中で再生させた。小植物を無ホルモン培地に移した後、根を誘導した。根が出た形質転換体を土壌に移し、温室条件下で成長させた。該MS培地は、十分な強度のMS塩(シグマ社(Sigma))、30g/lのグルコース、1mg/lのBAおよび1mlのB5ビタミン[1mg/mlのニコチン酸、10mg/mlのチアミン(HCl)、1mg/mlのピリドキシン(HCl)、100mg/mlのMyo−イノシトール]を含有する。トランスジェニック植物を自家受粉させ、種子をカナマイシン培地上で選択的に発芽させた。
蛋白質の血清学的検出:
二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着法(DAS−ELISA)を用いて、TSWV−BL NPに対するポリクローナル抗体でトランスジェニック植物におけるNP遺伝子の発現を検出した。各試料は、酵素結合緩衝液[リン酸緩衝セーライン、0.05%ツイーン(Tween)20、2%ポリビニルピロリドン40、および0.2%オバルミン]の3ml中で、植物の頂部第2葉からのリーフディスク(約0.05g)を摩砕することによって調製した。タバコ・プロトプラストについては、遠心後の細胞抽出物をアッセイで直接用いた。トランスジェニック植物およびタバコ・プロトプラスト双方からの試料の10倍および3倍希釈物をDAS−ELISAの直前に作成した。
TSWV単離株でのトランスジェニック植物の接種
接種物は、ニコチアナ・ベンタミアナ・ドミン(Nicotiana benthamiana Domin.)を異なるTSWV単離株で感染させ、緩衝液(0.003M KH2PO4、0.067M K2HPO4および0.01M Na2SO3)15ml中でエヌ・ベンタミアナ植物の感染させた葉(0.5g)を摩砕する(接種1ないし2週間後)ことによって調製した。接種抽出物を、トランスジェニック植物のコランダム散布葉上で直ちに擦り、接種した葉を引き続いて水で濯いだ。TSWVは摩砕後イン・ビトロでは高度に不安定であるので、接種物の各バッチを用いて、NP遺伝子を含有するNP(+)植物をまず接種し;各接種物の最後の接種植物は、常に、ベクター配列単独を含有する対照NP(-)植物であって、特定のウイルス接種物はなお接種の最後において感染性であることを確実とした。
(NP)遺伝子を発現するR1植物のTSWV単離株での接種に対する反応
TSWV単離株に対する反応
エライザ
(R0pl.) BL アルカンサス 10W体菜 ベゴニア ブラジル
R0系
NP(+) 0.015 0/10 4/25 3/24 29/40 36/36
NP(+)4 0.386 6/30 21/23 18/21 9/48 42/42
NP(+)9 0.327 0/20 NT 20/20 - -
NP(+)14 0.040 0/20 - 9/20 8/18 18/18
NP(+)21 0.042 0/15 5/15 3/15 2/4 6/6
NP(+)22 0.142 0/20 - 15/20 31/36 36/36
NP(+)23 0.317 0/20 - 16/20 - -
NP(-) - 42/42 24/24 62/62 66/66 54/54
TSWV−CPNH1、TSWV−L3、およびTSWV−B1 S RNAの間の他の配列決定された領域との比較によって支持される。これらの比較は以下の表に示す:
植物年齢 R0クローン ELISAa 病巣/葉b NP(+):NP(-)c
7〜8葉 NP(+)1 0.374 7(199) 1:28
NP(+)2 0.015 0(199) 0:199
NP(+)3 0.407 23(102) 1:4
NP(+)4 0.386 2(102) 1:51
NP(+)5 0.023 0(124) 0:124
NP(+)6 0.197 35(325) 1:9
NP(+)7 0.124 1(325) 1:325
9〜10葉
NP(+)8 0.344 36(36) 1:1
NP(+)9 0.327 2(20) 1:10
NP(+)10 0.406 34(33) 1:1
NP(+)11 0.156 5(20) 1:4
NP(+)12 0.133 9(57) 1:6
NP(+)13 0.144 2(7) 1:4
NP(+)14 0.040 0(19) 0:19
NP(+)16 0.053 0(10) 0:10
5〜6葉
NP(+)20 0.487 203(117) 2:1
NP(+)21 0.042 0(117) 0:117
NP(+)22 0.142 0(208) 0:208
NP(+)23 0.317 223(208) 1:1
NP(+)24 0.051 0(35) 0:35
NP(+)25 0.286 13(35) 1:3
NP(+)26 0.037 0(22) 0:22
NP(+)27 0.425 305(22) 14:1
a トランスジェニック植物におけるNPの産生は二重抗体サンドイッチ酵素結合免疫吸着法(DAS−ELISA)によって検定した;コーティング用のウイルス粒子に対する抗体の濃度:1μg/ml;TSWV−BLへのコンジュゲートの希釈:1:250;基質添加後150分に採取した結果;405nmにおける読み
b 接種した葉で発達した局所病巣は接種7日後に計数した。データは3つの接種した葉の平均を表す。括弧に入れたデータは、同一接種物で接種した対照NP(+)植物から生じた病巣の数である。
c pBIN19−NP+
で形質転換したNP(+)植物で発達した局所病巣-対-同一接種物で接種した場合の対照NP(-)植物で発達した局所病巣の比率
比較a nt nt aa nt nt aa
B/CPNH1 76.4b 80.0 86.1(78.3)c 72.4 77.5 91.5(79.1)
B/L3 75.8 79.0 89.0(82.0) 76.4 78.0 91.1(79.9)
B/BL 76.3 - - 72.8 77.6 90.3(79.5)
B/I 63.0 - - - 63.1 69.7(55.3)
CPNH1/L3 94.8 95.6 92.0(89.4) 89.2 96.8 99.6(98.5)
CPNH1/BL 96.4 - - 95.9 97.2 98.8(96.9)
CPNH1/I 62.7 - - - 60.8 69.5(55.1)
L3/BL 95.1 - - 92.6 97.3 99.2(98.5)
L3/I 60.9 - - - 60.9 69.5(55.1)
I/BL 61.7 - - - 60.9 68.8(53.9)
a 単離株TSWV−CPNH1(2.916kb)、TSWV−L3(2.837kb)、TSWV−BL(2.037kb)およびTSWV−1(1.144kb)の部分的および完全なS RNA配列を、TSWV−BのS RNA配列(3.049kb)との比較のために用いた。
b パーセント類似性は、GCG配列決定分析ソフトウェアパッケージのプログラムBESTFITを用い、それらのヌクレオチドまたは予想されるアミノ酸配列の比較によって計算した。
c パーセント同一性は括弧に入れた。
トランスジェニック・R1またはR2トマトにおけるウイルス抵抗性
接種単離株a
植物系 TSWV-BL TSWV-T91 TSWV-B
R1植物:
T13-1 0/22 1/26 7/24
T13-2 6/20 NTb NT
T13-3 2/42 0/20 12/18
T13-4 0/25 NT NT
T13-9 0/20 NT NT
T13-10 1/50 2/26 11/26
T13-11 0/22 NT NT
T13-12 1/29 NT NT
T13-13 0/22 NT NT
合計 10/252 3/72 30/68
R2植物:
T13-1-7 0/8 2/8 5/8
T13-1-9 0/8 1/8 2/8
T13-1-11 0/8 1/9 5/9
合計 0/24 4/25 12/25
対照 92/95 51/53 52/53
a エヌ・ベンサミアーナ(N.benthamiana)、H423タバコまたはトマトの5-、10-または20-倍希釈葉抽出液で、第一葉ないし第二葉段階の植物を接種した;同一の植物を7日後に再接種し、さらに14日後に病徴を記録した;病徴を呈する植物数/試験植物数として反応性を表した。
b 試験せず
(N)蛋白質を発現するR1植物の、トスポウイルスでの接種に対する反応性
感染植物数/接種植物数b
TSWV単離株 INSV単離株
R0系 ELISAa BL 10W Beg LI TSWV-B
N--2/-6 <0.02 32/32 32/32 32/32 20/20 32/32
N+-28 0.005 16/16 16/16 15/16 16/16
N+-21 0.085 9/40 17/40 39/40 18/20 40/40
N+-34 0.715 25/28c 28/28 23/28c 28/28
N+-37 0.510 26/28c 22/22 21/28c 16/20c 22/22
a R1植物が由来するR0系のaELISAデータ;
b 感染したエヌ・ベンサミアーナ植物の30倍希釈葉抽出物を3−5葉段階の3枚の植物葉に適用した。各抽出物を常に用いてN+植物を接種した。データは少なくとも接種後2カ月毎日収集し、全身感染植物数/接種植物数として表した;cほとんど全ての感受性R1植物は病徴の出現の顕著な遅延を示すことを示す。
TSWL−BL N遺伝子のプライマー特異的突然変異誘発およびクローニングは以下のごとくに行った:
N遺伝子の全長は、ここに引用して本明細書の一部とみなすファイトパソロジー(Phytopathology)第82巻:1223頁(1992年)に記載されるごとく、逆転写およびポリメラーゼ鎖反応により得た。翻訳不能N−コーディング配列は、オリゴマープライマーA、(AGCATTGGATCCATGGTTAACACACTAAGCAAGCAC)(TSWV−BL N遺伝子の3’−非暗号領域におけるS RNAと同一)、およびB、(AGCTAATCTAGAACCATGGATGACTCACTAAGGAAAGCATTGTTGC)(N遺伝子の5'末端においてS RNAに相補的)を用いたRT−PCRにより同様に作られた。後者のオリゴマープライマーは転写開始コドンの直後のフレームシフト変異および起こり得る翻訳のリードスルーを阻止するためのいくつかの終止コドンを含んでいる。無傷のおよび変異のN遺伝子断片は実施例IIに記載したごとく1.2%アガロースゲルによって精製した。ゲル精製した無傷のおよび変異のN遺伝子断片を適当な制限酵素で消化し、それぞれ実施例IVに記載されているごとく、直接BamHI/およびXbaI消化の植物形質転換ベクターpBIN19およびNcoI消化の植物発現ベクターpBI525にクローンした。得られたプラスミドを同定し、カリフラワー・モザイク・ウイルス35Sプロモーターに対し、無傷の無プロモーターN遺伝子、およびセンスおよびアンチセンスの向きで変異コーディング配列を有するpB1525−mNおよびpB1525−asNを含むpBIN19−Nと命名された。ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)プロトプラストにおける一過性発現分析により発現カセット中の変異Nコーディング配列の翻訳可能性をチェックし;センスまたはアンチセンスの変異Nコーディング配列を含む発現カセットをHindIII/EcoRIによる部分消化(なぜならNコーディング配列は内部のHindIIIおよびExoRI配列を含むので)により切り出し、同酵素で既に切断されている植物形質転換ベクターpBIN19に連結した。pBIN19-Nと同様得られたベクターを、実施例IVに記載した方法を用いてエイ・チュメファシエンスLBA4404株に移入した。エヌ・タバカム・バール・ハバナ・シイブイ(N.tabacum var Havana cv 423)のリーフディスクを、様々な構築物を含有するエイ・チュメファシエンスのLBA4404株で接種し、得られたトランスジェニック植物を自家授粉させ、種子を選択的カナマイシン培地上で発芽させた。
タバコ・プロトプラストはR1植物由来の表面を殺菌した葉から調製した
[ツェット・プフランツェフィジオル(Z.Pflanzanphysiol)第78巻:453頁(1992年)に変更を加えたので、参照のこと]単離されたプロトプラスト(6×106プロトプラスト)をPEG法[プラント・アンド・モレキュラー・バイオロジー(Plant Mol.Biol.)第8巻:363頁(1987年)参照]を用いて、OD260nm値0.68の精製したTSWL−BLウイルス粒子抽出物で形質転換した。次いで、形質転換したプロトプラストを暗所にて26℃で終密度1×106プロトプラスト/ml培養培地になるまで培養した。様々な間隔のインキュベーションの後で、培養したプロトプラストをW5溶液で2度洗浄しエンザイム結合緩衝液中、浸透圧のショックにより溶解させた。ウイルスの増殖(複製)はDAS−ELISA法を用いてウイルスのN蛋白質を測定することによって見積もった。
R0系 6DPI 15DPI 30DPI
対照 50/50
1N −149 17/17
1N −151 2/20 13/20 17/20
1N'−123 16/20 17/20 17/20
1N'−124 20/20
1N'−126 19/19
1N−−130 12/15 15/15
1N−−132 18/19 19/19
2N −155 20/20
2N'−134 0/20 10/20 10/20
2N'−135 19/19
2N−−142 20/20
2N−−143 20/20
上記の表において、感染したエヌ・ベンサミアーナ(N.benthamiana)からの
30倍希釈の抽出物を、3−4葉段階のトランスジェニック植物、次いで対照トランスジェニック植物に接種するのに用いた。DPI=接種後の日数
その分野、またはそれが最も密接に関連した分野に属するいかなる当業者にも、同じ事をさせ使用させることができるように、十分で、明瞭で、完結で、正確な術語を用いて、本発明およびそこにおいてなされた方法および過程を記載した;
Claims (2)
- そのゲノムに挿入されたトランス遺伝子を含むトスポウイルス抵抗性植物であって、該トランス遺伝子は、トスポウイルスの全長ヌクレオキャプシド蛋白質の長さの少なくとも約半分であるヌクレオキャプシドポリペプチド断片をコードする翻訳可能または翻訳不可能mRNAいずれかを発現し、ここに、該トランス遺伝子は、該トスポウイルスに対する抵抗性を該植物に付与することを特徴とする該植物。
- 宿主植物にトランス遺伝子を挿入することを含み、該トランス遺伝子は、トスポウイルスの全長ヌクレオキャプシド蛋白質の長さの少なくとも約半分であるヌクレオキャプシドポリペプチド断片をコードする翻訳可能または翻訳不可能mRNAいずれかを発現し、ここに、該トランス遺伝子は該トスポウイルスに対する抵抗性を宿主植物に付与することを特徴とするトスポウイルスによる感染に対する抵抗性を宿主植物に供する方法。
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