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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Gen, das in Pflanzen die Resistenz
gegen Reisbrand kontrolliert, ein durch das Gen codiertes Protein
und deren Verwendung.
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Reisbrand
ist eine ernst zu nehmende Krankheit in Pflanzen wie Reis und wird
durch den Reisbrandpilz Magnaporthe grisea hervorgerufen. Die Krankheit
hat die Reisernten in Japan und in vielen anderen Reis anbauenden
Ländern
erheblich geschädigt.
Die Schädigung
ist bei niedrigen Temperaturen und hoher Luftfeuchtigkeit besonders
schwerwiegend. Die Krankheit wurde durch das Züchten von resistenten Sorten
ebenso wie durch die Anwendung von landwirtschaftlichen Chemikalien
bekämpft.
Ursprünglich
gab es Reisstämme,
die gegen die Krankheit resistent waren. Diese Stämme und
Sorten tragen Gene, die gegen eine bestimmte Unterart des Brandpilzes
resistent sind, und diese Gene wurden über einen langen Zeitraum untersucht.
Gegenwärtig
wurden etwa 30 Gene identifiziert, gegen Reisbrand resistent zu
sein (Kinoshita, Rice Genet. Newsl. 7:16-57 (1990), Iwata, Rice
Genet. Newsl. 13:12-35 (1996), Iwata, Rice Genet. Newsl. 14:7-22
(1997)). Diese Gene wurden verwendet, um hochresistente Sorten zu
züchten,
und folglich wurde eine Anzahl von resistenten Sorten gezüchtet. Wegen
der Entstehung neuer Unterarten des Brandpilzes werden jedoch die
eingebrachten Resistenzgene unwirksam (Kollaps der resistenten Sorten).
Darüber
hinaus bleiben die molekularen Mechanismen der Expression der Reisbrandresistenz
und der Interaktion zwischen den Reisbrandpilzen und den Resistenzgenen
unbekannt.
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Das
Resistenzgen Pi-b befindet sich am Ende des langen Arms des Reischromosoms
2 und vermittelt Resistenz gegen alle in Japan identifizierten Unterarten
des Brandpilzes außer
033b (Tabelle 1). Tabelle
1
- R:
- resistent
- S:
- anfällig
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Das
Gen war in Indica-Sorten wie Engkatek, Milek Kuning, Tjina und Tjahaja
in Indonesien und Malysia zu finden. In Japan ist der Stamm TohokulL9,
der für
Pi-b homozygot ist und den genetischen Hintergrund der sensitiven
Sorte Sasanishiki aufweist, an der Miyagi Prefectural Furukawa Agriculture
Experimental Station gezüchtet
worden.
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Der
Mechanismus der Resistenzexpression ist jedoch nicht geklärt und das
Pi-b-Gen ist auch
noch nicht isoliert worden.
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Ein
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Pi-b, ein Resistenzgen gegen
den Reisbrand, ein funktionell entsprechendes Gen und durch diese
Gene codierte Proteine bereitzustellen. Ein anderes Ziel ist es,
durch die Verwendung dieses Gens eine gegen den Reisbrand resistente
Pflanze zu erzeugen.
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In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wurde das Resistenzgen gegen den
Reisbrand isoliert, indem eine auf Karten basierende Clonierung
verwendet wurde, um das Gen Pi-b aus einer großen chromosomalen Region zu
isolieren. Im Speziellen wurden Kopplungsanalysen unter der Verwendung
von molekularen Markern durchgeführt.
Zuerst wurde der Pi-b-Locus einer chromosomalen Region zwischen
spezifischen Markern zugeordnet. Als nächstes wurde eine physikalische
Karte konstruiert, indem Cosmidclone in der Nähe der zugeordneten Region
aneinander ausgerichtet wurden. Anschließend wurden die Nucleotidsequenzen
der Clone bestimmt, um die Region des Pi-b-Kandidatengens zu finden,
das eine Nucleotidbindestelle (NBS), die häufig in den Resistenzgenen
verschiedener Pflanzen gefunden wird, enthält. Aus einer gegen den Reisbrand
resistenten Sorte wurde dann eine cDNA-Genbank konstruiert. Die
Genbank wurde unter der Verwendung der vorstehend genannten genomischen
Kandidatenregion als Sonde durchmustert und eine der genomischen
Region entsprechende cDNA wurde isoliert. Unter der Verwendung von
Oligonucleotidprimern, die auf der Basis der Nucleotidsequenz der
isolierten cDNA hergestellt wurden, wurde mit jeder mRNA-Fraktion, die aus
gegen den Reisbrand sensitiven und resistenten Sorten präpariert
wurde, eine RT-PCR durchgeführt,
um das Expressionsmuster der isolierten Pi-b-Kandidaten-cDNA zu analysieren. Die
cDNA wurde in den resistenten Sorten spezifisch amplifiziert. In Übereinstimmung
mit der vorliegenden Erfindung wurde also herausgefunden, dass der
isolierte cDNA-Clon das Pi-b-Gen ist. In Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung wurde ebenfalls gefunden, dass gegen Reisbrand resistente
Pflanzen erzeugt werden können,
indem das isolierte Gen oder dazu homologe Gene verwendet werden,
da eine unmittelbare Beziehung zwischen dem isolierten Gen und der
Resistenz gegen den Reisbrand besteht.
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Dementsprechend
betrifft die vorliegende Erfindung das Reisbrandresistenzgen Pi-b,
homologe Gene und durch die Gene codierte Proteine. Die Erfindung
betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung einer gegen Reisbrand
resistenten Pflanze durch die Verwendung der Gene. Im Spezielleren
betrifft die vorliegende Erfindung folgendes:
- (1)
Ein Protein, das Pflanzen eine Resistenz gegen Reisbrand verleiht,
wobei das Protein die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NR.1 oder dessen modifizierte Sequenz, in welcher eine
oder mehrere Aminosäuren substituiert,
deletiert oder hinzugefügt
wurden, umfasst,
- (2) ein Protein, das Pflanzen eine Resistenz gegen Reisbrand
verleiht, wobei das Protein durch eine DNA codiert wird, die mit
einer DNA, die die Nucleotidsequenz von SEQ ID NR.2 und/oder 3 umfasst,
hybridisiert,
- (3) eine das Protein von (1) oder (2) codierende DNA,
- (4) einen die DNA von (3) umfassenden Vektor,
- (5) eine den Vektor von (4) tragende Wirtszelle,
- (6) die Wirtszelle von (5), wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle
ist,
- (7) ein Verfahren zur Herstellung des Proteins von (1) oder
(2), wobei das Verfahren das Züchten
der Wirtszelle von (5) umfasst,
- (8) eine transformierte Pflanze, umfassend die Wirtszelle von
(6),
- (9) die Pflanze von (8), wobei die Pflanze eine Poaceae ist,
- (10) die Pflanze von (8), wobei die Pflanze P. oryzae ist,
- (11) die Pflanze von (8), (9) oder (10), wobei die Pflanze eine
Resistenz gegen Reisbrand aufweist,
- (12) ein Antikörper,
der spezifisch an das Protein von (1) oder (2) bindet, und
- (13) eine DNA, umfassend zumindest 15 Nucleotide, wobei die
DNA spezifisch mit der DNA von (3) hybridisiert.
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Die
Figuren zeigen:
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1 zeigt
schematisch die durch eine Kopplungsanalyse in grobem Maßstab vermutete
Region des Pi-b-Locus.
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2 zeigt
schematisch die durch eine Kopplungsanalyse in feinem Maßstab vermutete
Region des Pi-b-Locus.
-
3 zeigt
eine Fotografie von elektrophoretischen Mustern, die das Resultat
der RT-PCR-Analyse für
die Expression der Pi-b-Kandidaten-cDNA in Sorten, die sensitiv
und resistent gegenüber
Reisbrand sind, anzeigen. In A wurden Primer verwendet, die das
zweite Intron des cDNA-Clons c23 umfassen. In B wurden Primer verwendet,
die spezifisch für
das 4,6 kb-Fragment sind, das die an die Region c23 angrenzende
NBS enthält.
Die verwendete Matrize bestand aus genomischen DNAs von Sasanishiki
und TohokulL9 in den Spuren 1 und 2; den Cosmidclonen #40 und #147,
stammend von TohokulL9 in den Spuren 3 bzw. 4; der die cDNA c23
von TohokulL9 enthaltenden Plasmid-DNA in Spur 5; aus unbehandelten
Blättern
von TohokulL9 präparierter
mRNA (2000 ng; die gleiche Menge trifft nachstehend für mRNAs
zu) in Spur 6; mRNA, die aus Blättern von
TohokulL9 12 Stunden, 24 Stunden oder 4 Tage nach der Beimpfung
mit dem Reisbrandpilz präpariert
wurde, in den Spuren 7, 8 bzw. 9; aus unbehandelten Blättern von
Sasanishiki präparierter
mRNA in Spur 10; mRNA, die aus Blättern von Sasanishiki 12 und
24 Stunden nach der Beimpfung mit dem Reisbrandpilz präpariert
wurde, in den Spuren 10 bzw. 11; und sterilisiertem Wasser in Spur
12. Die Größenmarker
sind 1,4 K, 1,0 K, 0,9 K und 0,6 K von oben.
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4 vergleicht
das Pi-b-Gen und die konservierten Regionen von bekannten Resistenzgenen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Protein, das Pflanzen einen gegen
Reisbrand resistenten Phänotyp
verleiht. Die Aminosäuresequenz
eines Proteins, das durch das „Pi-b"-Gen codiert wird
(nachstehend als Pi-b-Protein bezeichnet) und das in einem Protein
der vorliegenden Erfindung eingeschlossen ist, ist in SEQ ID NR.1
gezeigt. Es war bekannt, dass das Pi-b-Gen, das ein Protein codiert,
das Reis einen gegen Reisbrand resistenten Phänotyp verleiht, irgendwo innerhalb
einer großen
Region des Reischromosoms 2 lokalisiert ist. In Übereinstimmung mit der vorliegenden
Erfindung konnte sein Locus zum ersten Mal identifiziert und das
Gen als einzelnes Gen isoliert werden. Das Pi-b-Protein verleiht
Reis eine Resistenz gegen alle Unterarten des Reisbrandpilzes in
Japan außer
033b. Dies ist der weiteste Resistenzbereich unter den bisher identifizierten
Genen (Tabelle 1). Diese Merkmale des Pi-b-Proteins legen nahe,
dass das Pi-b-Protein oder ein dazu funktionell entsprechendes Protein
ziemlich gut geeignet sind, um gegen Reisbrand resistente Pflanzensorten zu
erzeugen.
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Es
ist möglich,
zum Beispiel durch das nachstehend beschriebene Verfahren ein dem
Pi-b-Protein funktionell entsprechendes Protein herzustellen. Verfahren,
Mutationen in die Aminosäuresequenz
des Pi-b-Proteins einzuführen,
sind Fachleuten gut bekannt. Ein Fachmann kann nämlich die Aminosäuresequenz des
Pi-b-Proteins (SEQ ID NR.1) durch ortsgerichtete Mutagenese verändern (Kramer,
W. und Fritz, H.-J. Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis
via gapped duplex DNA, Methods in Enzymology 154:350-367, (1987)),
um ein mutiertes Protein herzustellen, das dem Pi-b-Protein funktionell
entsprechend ist. Mutationen von Aminosäuren können spontan geschehen. Das
Protein der vorliegenden Erfindung schließt ein Protein ein, das eine
Aminosäuresequenz
des Wildtyp-Pi-b-Proteins mit einer oder mehreren substituierten,
deletierten oder hinzugefügten
Aminosäuren
aufweist und dem Wildtyp-Pi-b-Protein funktionell entspricht. Der
Ort und die Anzahl der veränderten
Aminosäurereste
in einem Protein ist so lange nicht eingeschränkt, als das veränderte Protein
dem Wildtyp-Pi-b-Protein funktionell entspricht. Üblicherweise
liegen nicht mehr als 50 veränderte
Aminosäurereste
vor, vorzugsweise nicht mehr als 30, mehr bevorzugt nicht mehr als
10 und am meisten bevorzugt nicht mehr als 3. Der hier verwendete
Ausdruck „dem
Wildtyp-Pi-b-Protein funktionell entsprechend" bedeutet, dass das veränderte Protein
Pflanzen eine Resistenz gegen Reisbrand verleiht. Der Ausdruck „Pflanzen
eine Resistenz gegen Reisbrand verleihen" bedeutet, dass das Protein zumindest
einer Pflanzensorte Resistenz gegen zumindest eine Unterart des
Reisbrandpilzes verleiht. Die Pflanze, der eine Resistenz verliehen
werden soll, ist vorzugsweise eine Poaceae und mehr bevorzugt Poaceae
oryza. Ob ein Protein Pflanzen eine Resistenz gegen Reisbrand verleiht,
kann zum Beispiel bewertet werden durch (i) das Beimpfen von jungen
Pflanzen (zum Beispiel von drei bis vier Wochen alten Reissämlingen)
durch direktes Besprühen
mit einer durch eine bestimmte Unterart des Reisbrandpilzes gebildeten
Sporensuspension, (ii) das Inkubieren der beimpften Pflanze bei
25°C und
100% Luftfeuchtigkeit für
24 Stunden unmittelbar nach der Beimpfung, anschließend Züchtung unter
normalen Bedingungen für
etwa zwei Wochen, (iii) die Beobachtung, ob lokale Läsionen ihr
Auswachsen aufgrund von spezifischer Nekrose als Ergebnis einer
hypersensitiven Reaktion beenden werden (eine Pflanze, die ein Resistenzgen
trägt)
oder ob die lokalen Läsionen
fortfahren werden, auszuwachsen, was den Tod der Pflanze verursacht
(eine Pflanze ohne ein Resistenzgen).
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Fachleuten
sind auch die Hybridisierungstechnik (Southern, E.M., J. Mol. Biol.
98, 503 (1975)) und die Polymerasekettenreaktions (PCR)-Technik
(Saiki, R.K. et al., Science 230:1350-1354, (1985), Saiki, R.K.
et al., Science 239:487-491, (1988)) als weitere Verfahren bekannt,
um ein funktionell entsprechendes Protein herzustellen. Ein Fachmann
kann nämlich üblicherweise
eine DNA isolieren, die zu dem Pi-b-Gen von Reis oder anderen Pflanzen
in hohem Maße
homolog ist, unter der Verwendung der Nucleotidsequenz des Pi-b-Gens
(SEQ ID NR.2 oder NR.3) oder eines Teiles davon als Sonde oder unter
der Verwendung von Oligonucleotidprimern, die spezifisch mit dem
Pi-b-Gen (SEQ ID NR.2 oder NR.3) hybridisieren, um aus der DNA ein
dem Pi-b-Protein entsprechendes Protein zu erhalten. Das Protein
der vorliegenden Erfindung schließt ein dem Pi-b-Protein funktionell
entsprechendes Protein ein, das durch die Hybridisierungstechnik
oder die PCR-Technik isoliert wurde. Der hier verwendete Ausdruck „dem Pi-b-Protein
funktionell entsprechend" bedeutet,
dass das durch die Hybridisierungstechnik oder die PCR-Technik isolierte
Protein Pflanzen eine Resistenz gegen Reisbrand verleiht. Die Pflanzen,
die für
die Isolierung eines Gens durch die vorstehenden Techniken verwendet
werden sollen, schließen
außer
Reis Nutzpflanzen ein, die mögliche
Wirte des Reispilzes sind, wie zum Beispiel Hordeum, Triticum, Setaria,
Panicum, Echinoloa und Coix (Crop Disease Encyclopedia, (1988),
Kishi, K. Hrsg. Japan Agriculture Education Association). Normalerweise
weist ein durch das isolierte Gen codiertes Protein auf Aminosäureebene
eine hohe Homologie zu dem Pi-b-Protein auf, wenn das Protein dem
Pi-b-Protein funktionell entsprechend ist. Die hohe Homologie bedeutet
vorzugsweise eine Homologie von 30% oder mehr, mehr bevorzugt 50%
oder mehr, noch mehr bevorzugt 70% oder mehr und am meisten bevorzugt
90% oder mehr.
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Das
Protein der vorliegenden Erfindung kann als rekombinantes Protein
unter der Verwendung von Fachleuten bekannten Verfahren mit Hilfe
von rekombinanter DNA-Technologie oder als natürliches Protein hergestellt
werden. Ein rekombinantes Protein kann zum Beispiel hergestellt
werden, indem eine das Protein der vorliegenden Erfindung codierende
DNA in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, der Vektor in
geeignete Zellen eingebracht wird und anschließend das Protein aus den transformierten
Zellen gereinigt wird. Ein natürliches
Protein kann hergestellt werden, indem zum Beispiel Zellextrakte
(zum Beispiel von Reiszellen), die das Protein der vorliegenden
Erfindung exprimieren, einer Affinitätssäule ausgesetzt werden, die mit
einem Antikörper,
der durch die Immunisierung eines geeigneten Immuntieres mit einem
rekombinanten Protein oder einem Teil davon hergestellt wurde, gepackt
wurde, und gebundene Proteine von dieser Säule gereinigt werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch eine DNA, die das Protein der
vorliegenden Erfindung codiert. Die DNA der vorliegenden Erfindung
ist nicht eingeschränkt
und schließt
eine genomische DNA, eine cDNA und eine chemisch synthetisierte
DNA ein, solange die DNA ein Protein der vorliegenden Erfindung
codiert. Die Nucleotidsequenzen der Pi-b-cDNA und der genomischen
Pi-b-DNA der vorliegenden Erfindung sind in SEQ ID NR.2 bzw. NR.3
gezeigt.
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Ein
Fachmann kann eine genomische DNA oder eine cDNA unter der Verwendung
von Standardverfahren herstellen. Eine genomische DNA kann zum Beispiel
in zwei Schritten hergestellt werden. Konstruiere zuerst eine genomische
Genbank (unter Verwendung eines Vektors wie ein Plasmid, Phage,
Cosmid oder BAC) unter der Verwendung von genomischer DNA, die aus
den Blättern
einer Reissorte (zum Beispiel TohokulL9) extrahiert wurde, die ein
Resistenzgen gegen Reisbrand trägt.
Führe zweitens
eine Kolonie- oder Plaquehybridisierung mit der ausplattierten Genbank
unter der Verwendung einer Sonde durch, die auf der Basis der Nucleotidsequenz
einer DNA hergestellt wurde, die ein Protein der vorliegenden Erfindung
codiert (zum Beispiel SEQ ID NR.1 oder 2). In einer anderen Ausführungsform
kann eine genomische DNA präpariert
werden, indem eine PCR unter der Verwendung von Primern durchgeführt wird,
die für
eine ein Protein der vorliegenden Erfindung codierende DNA spezifisch
sind (zum Beispiel SEQ ID NR.1 oder NR.2). Eine cDNA kann auch hergestellt
werden, indem zum Beispiel cDNA aus mRNA, die aus den Blättern einer
ein Resistenzgen gegen Reisbrand tragenden Reissorte (zum Beispiel
TohokulL9) extrahiert wurde, synthetisiert wird, die cDNA zur Konstruktion
einer cDNA-Bank in einen Vektor wie λZAP inseriert wird und mit der
ausplattierten Genbank eine Kolonie- oder Plaquehybridisierung durchgeführt oder
wie vorstehend beschrieben eine PCR durchgeführt wird.
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Eine
DNA der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um ein rekombinantes
Protein zu präparieren
oder um gegen Reisbrand resistente transformierte Pflanzen zu erzeugen.
Ein rekombinantes Protein wird üblicherweise
hergestellt, indem eine ein Protein der vorliegenden Erfindung codierende
DNA in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, der Vektor
in eine geeignete Zelle eingebracht wird, die transformierten Zellen
gezüchtet
und die exprimierten Proteine gereinigt werden. Ein rekombinantes
Protein kann als Fusionsprotein mit anderen Proteinen exprimiert
werden, um auf einfache Weise gereinigt werden zu können, zum
Beispiel als Fusionsprotein mit dem Maltosebindeprotein von Escherichia
coli (New England Biolabs, USA, pMAL-Vektorserie), als Fusionsprotein
mit der Glutathion-S-Transferase (GST) (Amersham Pharmacia Biotech,
pGEX-Vektorserie) oder mit Histidin markiert (Novagen, pET-Serie).
Die Wirtszelle ist nicht eingeschränkt, solange die Zelle für die Expression
des rekombinanten Proteins geeignet ist. Es ist möglich, außer dem
vorstehend beschriebenen E. coli Hefen oder verschiedene Tier-,
Pflanzen- oder Insektenzellen zu verwenden. Ein Vektor kann in Wirtszellen
durch verschiedene, Fachleuten bekannte Verfahren eingebracht werden.
Zum Beispiel kann ein Transformationsverfahren unter der Verwendung
von Calciumionen (Mandel, M. und Higa, A., J. Mol. Biol. 53:158-162,
(1970); Hanahan, D., J. Mol. Biol. 166:57-580, (1983)) verwendet
werden, um einen Vektor in E. coli einzubringen. Ein in Wirtszellen
exprimiertes rekombinantes Protein kann durch bekannte Verfahren
gereinigt werden. Wenn ein rekombinantes Protein als Fusionsprotein
mit dem Maltosebindeprotein oder anderen Partnern exprimiert wird,
kann das rekombinante Protein auf einfache Weise durch Affinitätschromatographie
gereinigt werden.
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Eine
transformierte, gegen Reisbrand resistente Pflanze kann unter der
Verwendung einer DNA der vorliegenden Erfindung generiert werden.
Es wird nämlich
eine DNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, in
einen geeigneten Vektor inseriert, der Vektor wird in eine Pflanzenzelle
eingebracht und die resultierende, transformierte Pflanzenzelle
wird regeneriert. Der Vektor ist nicht eingeschränkt, so lange er inserierte
Gene in Pflanzenzellen exprimieren kann. Zum Beispiel können Vektoren
verwendet werden, die einen Promotor für konstitutive Genexpression
in Pflanzenzellen (wie zum Beispiel den 35S-Promotor des Blumenkohl-Mosaik-Virus)
oder einen durch exogene Stimuli induzierbaren Promotor enthalten.
Die Pflanzenzelle, die mit dem Vektor transfiziert werden soll,
ist nicht eingeschränkt,
aber Poaceae-Zellen sind bevorzugt. Beispiele für die Zellen schließen außer Reis
Hordeum, Triticum, Setaria, Panicum, Echinochloa und Coix ein. Der
hier verwendete Ausdruck „Pflanzenzelle" schließt verschiedene
Formen von Pflanzenzellen ein, wie gezüchtete Zellsuspensionen, einen
Protoplasten, einen Blattschnitt und einen Kallus. Ein Vektor kann
in Pflanzenzellen durch bekannte Verfahren wie dem Polyethylenglykol-Verfahren,
Elektroporation, Agrobacterium vermittelten Transfer und Teilchenbeschuss
eingebracht werden. In Abhängigkeit
von der Art der Pflanzenzelle können Pflanzen
aus transformierten Pflanzenzellen durch ein bekanntes Verfahren
regeneriert werden (Toki et al., (1995) Plant Physiol. 100:1503-1507).
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Darüber hinaus
betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper, der spezifisch an ein
Protein der vorliegenden Erfindung bindet. Der Antikörper der
vorliegenden Erfindung kann entweder ein polyclonaler Antikörper oder
ein monoclonaler Antikörper
sein. Ein polyclonaler Antikörper
kann hergestellt werden, indem Immuntiere wie Kaninchen mit einem
gereinigten Protein der vorliegenden Erfindung oder einem Teil davon
immunisiert werden, nach einem bestimmten Zeitraum Blut abgenommen
wird und Blutgerinnsel entfernt werden. Ein monoclonaler Antikörper kann
hergestellt werden, indem Myelomzellen und Antikörper bildende Zellen von Tieren,
die mit dem vorstehenden Protein oder einem Teil davon immunisiert
wurden, fusioniert werden, eine monoclonale Zelle, die einen gewünschten
Antikörper
exprimiert, (Hybridom) isoliert und der Antikörper aus der Zelle gewonnen
wird. Der erhaltene Antikörper
kann für
die Reinigung oder den Nachweis eines Proteins der vorliegenden
Erfindung verwendet werden.
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Weiterhin
betrifft die vorliegende Erfindung eine DNA, die spezifisch mit
einer DNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung codiert, hybridisiert
und zumindest 15 Nucleotidreste umfasst. Der hier verwendete Ausdruck „hybridisiert
spezifisch" bedeutet,
dass die DNA mit einer DNA, die ein Protein der vorliegenden Erfindung
codiert, aber nicht mit irgendeiner ein anderes Protein codierenden
DNA unter Standard-Hybridisierungsbedingungen und vorzugsweise unter
stringenten Hybridisierungsbedingungen hybridisiert. Solche Hybridisierungsbedingungen
werden zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al., Molecular Cloning;
A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (1989), Cold Spring Harbour Laboratory
Press, Cold Spring Harbour, NY. Die DNA kann zum Beispiel als Sonde
verwendet werden, um eine ein Protein der vorliegenden Erfindung
codierende DNA nachzuweisen oder zu isolieren, oder als Primer für eine PCR-Amplifikation.
Ein Beispiel ist DNA, die aus mindestens 15 Nucleotiden besteht,
die zu der Nucleotidsequenz von SEQ ID NR.2 oder NR.3 komplementär sind.
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Die
vorliegende Erfindung stellt das Reisbrand-Resistenzgen Pi-b, funktionell
entsprechende Gene davon und durch die Gene codierte Proteine bereit.
Das Reisbrand-Resistenzgen der vorliegenden Erfindung kann Pflanzen
eine Resistenz gegen einen weiten Bereich von Reisbrandpilzen verleihen.
Daher wird das Gen in hohem Maße
zur Kontrolle der Krankheit und zur Erhöhung der Ernte von Nutzpflanzen
beitragen, zum Beispiel wenn es in Nutzpflanzen wie Reis eingebracht
wird.
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Die
vorliegende Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf Beispiele im
Detail veranschaulicht, soll aber nicht als auf diese beschränkt angesehen
werden.
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BEISPIEL 1: Kopplungsanalyse
in grobem Maßstab
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Um
den ungefähren
Bereich des Pi-b-Gens auf der Kopplungskarte des Reischromosoms
2 zu identifizieren, wurde unter der Verwendung von DNA-Markern
zunächst
eine Kopplungsanalyse durchgeführt.
Die verwendete Quelle war eine segregierende Population von 94 Pflanzen
als Ergebnis einer Selbstbefruchtung einer F1-Nachkommenschaft,
die aus zwei Rückkreuzungen
zwischen Sasanishiki und der F1-Nachkommenschaft einer Kreuzung
zwischen Sasanishiki und TohokulL9 stammte. Diese Kopplungsanalyse
ergab, dass das Pi-b-Gen zwischen den RFLP-Markern C2782 und C379 auf Chromosom
2 lag und mit R1792, R257 und R2821 co-segregierte (Japanese Society
of Breeding, das 87. Treffen, 1).
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BEISPIEL 2: Kopplungsanalyse
in feinem Maßstab
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Eine
große
segregierende Population wurde analysiert, um das Gen zu isolieren.
Aus der vorstehenden Population von 94 Pflanzen wurden 20 für den Pi-b-Locus heterozygote
Pflanzen ausgewählt
und eine segregierende Population von etwa 20000 Samen, einschließlich selbst
befruchteter Samen, wurde für
die Analyse verwendet (Japanese Society of Breeding, das 89. Treffen).
Innerhalb der Analyse wurde das Pool-Stichprobenverfahren angewendet,
um die Aufgabe klein zu halten (Churchill et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 90:16-20 (1993)).
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Um
die Genauigkeit der Kopplungsanalyse zu erhöhen, ist es notwendig, die
Anzahl der DNA-Marker in der Nähe
des Zielgens zu erhöhen
und die Stichprobenpopulation zu vergrößern. Dementsprechend wurden YAC-Clone,
die den Pi-b-Locus tragen, was durch die Kopplungsanalyse im groben
Maßstab
festgestellt wurde, subcloniert, um die Anzahl der DNA-Marker in
der Nähe
des Pi-b-Gens zu
erhöhen
(Monna et al., Theor. Appl. Genet. 94:170-176 (1997)). Diese Kopplungsanalyse
unter der Verwendung einer großen
Population engte den Pi-b-Locus
auf einen Bereich zwischen den RFLP-Markern S1916 und G7030 ein.
Darüber
hinaus wurde das Pi-b-Gen mit drei RFLP-Markern (G7010, G7021 uns
G7023; 2) co-segregiert.
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BEISPIEL 3: Ausrichtung
des Pi-b-Locus unter der Verwendung von Cosmidclonen
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Um
den Pi-b-Locus weiter einzuengen, wurden Cosmidclone für die Ausrichtung
verwendet. Genomische DNA wurde durch das CTAB-Verfahren aus TohokulL9,
der das Resistenzgen trägt,
extrahiert. Die DNA wurde dann mit der Restriktionsendonuclease
Sau3A partiell gespalten. Aus dem Spaltungsprodukt wurden Fragmente
mit einer Größe von etwa
30 bis 50 kb durch Saccharose-Dichtegradientenzentrifugation
fraktioniert. Die resultierenden DNA-Fragmente und der Cosmidvektor
SuperCos (Stratagene, Wahl et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:2160-2164
(1987)) wurden verwendet, um eine Cosmid-Genbank zu konstruieren.
Die Cosmid-Genbank wurde unter der Verwendung von fünf DNA-Clonen
in der Nähe
des Pi-b-Locus (S1916, G7010, G7021, G7023 und G7030) als Sonden
durchmustert. Als Ergebnis wurden sechs Cosmidclone (COS140, COS147,
COS117, COS137, COS205 und COS207) ausgewählt. Die Konstruktion der Restriktionskarten
dieser Clone und die Untersuchung ihrer überlappenden Bereiche zeigte,
dass der Pi-b-Locus in dem Genombereich durch drei Clone abgedeckt
ist (COS140, COS147 und COS117; 2).
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BEISPIEL 4: Ermittlung
der genomischen Kandidatenregion durch Sequenzanalyse
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Drei
ausgerichtete Cosmidclone, von denen angenommen wird, dass sie das
Pi-b-Gen enthalten, wurde subcloniert und ihre Nucleotidsequenz
wurde teilweise analysiert. Die erhaltenen Nucleotidsequenzen wurden
durch eine BLAST-Homologiesuche
in der öffentlichen
Nucleotiddatenbank analysiert. Als Ergebnis zeigte sich, dass die
Teile der Nucleotidsequenzen eines von COS140 erhaltenen 2,3 kb
großen
Clons und eines 4,6 kb großen
Clons von COS147 eine Nucleotidbindestelle (NBS) enthalten, die
häufig
in den Resistenzgenen einiger Pflanzen wie dem RPM1-Krankheits-Resistenzgen
in Arabidopsis gefunden wird. Daher wurde erwartet, dass diese Nucleotidsequenzen
Kandidatenregionen für
das Pi-b-Gen sind.
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BEISPIEL 5: Isolierung
der cDNA und Sequenzanalyse
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Die
cDNA wurde isoliert, um zu untersuchen, ob die durch die Nucleotidsequenzanalyse
aufgezeigten Kandidatenregionen in der resistenten Sorte TohokulL9
exprimiert werden. Die resistente Sorte TohokulL9 wurde ausgesät und die
Sämlinge
des 4-Blatt-Stadiums wurden entsprechend dem Standard-Verfahren
mit dem Reisbrandpilz TH68-141 (Unterart 003) beimpft. Die Blätter wurden
dann an drei Zeitpunkten gesammelt, 6 Stunden, 12 Stunden und 24
Stunden nach der Beimpfung. Boten-RNA wurde aus den Proben isoliert
und eine cDNA-Genbank wurde konstruiert. Ein 1 kb-Fragment (von
Position 3471 bis 4507 in SEQ ID NR.3), das durch eine weitere Subclonierung
des 2,3 kb-Fragmentes der genomischen Kandidatenregion erhalten
wurde, wurde als Sonde verwendet, um die Genbank zu durchmustern.
Als Ergebnis wurden acht cDNA-Clone ausgewählt. Die Sequenzanalyse der
Clone ergab, dass die Nucleotidsequenz von c23 vollständig mit
der des Cosmidclons COS140 übereinstimmt.
Somit wurde bestätigt,
dass die genomische Kandidatenregion in TohokulL9 exprimiert wird.
Der ausgewählte
Clon c23 umfasst ungefähr
4 kb und enthält
vermutlich beinahe den gesamten Bereich des Gens. Die vollständige Nucleotidsequenz
dieses Clons wurde bestimmt (SEQ ID NR.2).
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BEISPIEL 6: Analyse des
Expressionsmusters der Kandidaten-cDNA
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Unterschiede
in den Expressionsmustern der Kandidaten-cDNA-Region zeigten sich
in einer sensitiven Sorte (Sasanishiki) und einer resistenten Sorte
(TohokulL9). Die vorstehenden zwei Sorten wurden im 4-Blatt-Stadium
mit der Unterart 003 des Reisbrandpilzes beimpft und Blätter wurden
6 Stunden, 12 Stunden und 24 Stunden nach der Beimpfung gesammelt.
mRNA wurde anschließend
extrahiert und als Matrize für RT-PCR
verwendet. Die auf der Nucleotidsequenz des cDNA-Clons c23 basierenden
Primer SEQ ID NR.4/5'-AGGGAAAAATGGAAATGTGC-3' (Antisense) und
SEQ ID NR.5/5'-AGTAACCTTCTGCTGCCCAA-3' (Sense) wurden für eine RT-PCR
entworfen, um die Region spezifisch zu amplifizieren. Die PCR wurde
durchgeführt
mit einem Zyklus von 94°C
für 2 Minuten;
30 Zyklen von 94°C
für 1 Minute,
55°C für 2 Minuten
und 72°C
für 3 Minuten;
und einem Zyklus von 72°C
für 7 Minuten.
Nach der PCR wurde eine spezifische Amplifikation in einer resistenten
Sorte von TohokulL9 nachgewiesen, aber unter der Verwendung von
mRNA einer sensitiven Sorte (Sasanishiki, 3) wurde
keine Amplifikation nachgewiesen. Dies legt nahe, dass der cDNA-Clon
c23 spezifisch in resistenten Sorten exprimiert wird. Auch unter
der Verwendung der Primer SEQ ID NR.6/5'-TTACCATCCCAGCAATCAGC-3' (Sense) und SEQ
ID NR.7/5'-AGACACCCTGCCACACAACA-3' (Antisense), die
auf der Nucleotidsequenz des 4,6 kb großen Fragmentes basieren, das
die NBS enthält
und benachbart zu der c23-Region liegt, wurde eine RT-PCR durchgeführt. Die
Region des 4,6 kb großen
Fragmentes wurde weder in einer sensitiven Sorte (Sasanishiki) noch
in einer resistenten Sorte (TohokulL9; 3) amplifiziert.
Es wird stark angenommen, dass die dem Clon c23 entsprechende genomische
Region der Pi-b-Locus
ist.
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BEISPIEL 7: Sequenzanalyse
der genomischen Region des Pi-b-Kandidatengens
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Die
vollständige
Nucleotidsequenz der dem cDNA-Clon c23 entsprechenden genomischen
Region wurde bestimmt. Der Cosmidclon COS140 wurde durch eine Spaltung
mit fünf
unterschiedlichen Restriktionsenzymen subcloniert und die Nucleotidsequenzen
der resultierenden Subclone wurde von beiden Enden so weit wie möglich bestimmt.
Die Regionen, die durch die vorstehende Analyse nicht zugänglich waren,
wurden durch Deletion verkürzt
und einer DNA-Sequenzierung unterzogen. Die bestimmte Region erstreckt
sich über 10,3
kb (SEQ ID NR.3).
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BEISPIEL 8: Struktur des
Pi-b-Gens
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Die
Pi-b-Kandidaten-cDNA c23 weist in voller Länge 3925 Basenpaare auf und
umfasst einen ORF von 3618 Basenpaare, der drei Exons unterbrochen
durch zwei Introns enthält.
Das translatierte Pi-b-Produkt ist ein Protein von 1205 Aminosäureresten
(SEQ ID NR.1) mit zwei NBSs (P-Schleife an der Aminosäureposition
386-395 und Kinase 2 an Position 474-484) und drei konservierten
Regionen (Domäne
1 an der Aminosäureposition
503-513, Domäne
2 an Position 572-583 und Domäne
3 an Position 631-638), welche in vielen Resistenzgenen gefunden
werden. Diese Domänen
zeigen eine hohe Homologie zu den konservierten Regionen bekannter
Resistenzgene wie RPM1 (
4). Das Gen weist auch an der
3'- Seite 12 unvollständige, Leucin-reiche
Wiederholungen auf (LRR an Aminosäureposition 755-1058). Diese
Strukturen zeigen eine extrem hohe Homologie zu den Resistenzgenen
der vorher berichteten NBS-LRR-Klasse. Auf der Basis der vorstehenden
Ergebnisse haben die Erfinder geschlossen, dass es sich bei der
analysierten cDNA und der entsprechenden genomischen Region um das
Reisbrand-Resistenzgen Pi-b handelt. SEQUENZPROTOKOLL
