WO2013050024A2 - Transgene pflanze der art beta vulgaris mit gesteigerter resistenz gegenüber cercospora - Google Patents

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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
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Definitions

  • the present invention relates to a transgenic plant of the species Beta vulgaris with increased resistance to a fungus of the genus Cercospora, transgenic parts of such a plant and a process for their preparation.
  • C. beticola As a hemibiotrophic fungus C. beticola has a biotrophic and a necrotrophic
  • Cercospora resistance to the toxin reduction or the detoxification of cercosporin The cercosporin photoactivated secondary metabolite produced by Cercospora species is a non-selective phototoxin and is considered to be a pathogenicity factor of these fungi (Daub 1982, Daub et al., 2005).
  • WO97 / 35001 describes transgenic plants comprising a genome containing genetic material for the expression of a Cercospora kikuchii membrane pump protein.
  • the transgenic plant is able to transport the accumulating fungal toxin out of the cell via the plasma membrane by means of the introduced pump protein.
  • this method does not prevent that
  • Cercosporin first enters the plant cell and causes damage there.
  • Transgenic tobacco plants which were created according to this method, show only a reduction of the lesion size but not the number of lesions after Cercospora nicotianae infestation.
  • the basic susceptibility of plants to Cercospora is not reduced by this approach (Upchurch et al., 2005).
  • Cercosporin biosynthesis was first described in C. nicotianae.
  • the inactivation of CnCTBI, CnCTB2, CnCTB3 or CnCTB8 leads to a feedback inhibition of the transcription of the entire gene cluster and thus to the inhibition of cercosporin biosynthesis in C. nicotiana (Chen, et al., 2007).
  • Such regulatory mechanisms of secondary metabolite gene clusters have also been found in other phytopathogenic fungi such as
  • the object of the present invention is therefore to provide a plant of the species Beta vulgaris with a relation to the prior art improved Cercospora resistance.
  • Cercosporin biosynthesis in the fungus is so impaired that the fungus is inhibited in its biotrophic growth phase and the plant compared to a
  • Control plant has an increased resistance to the fungus.
  • the present invention it became possible for the first time to ensure a specific and surprisingly early protection against Cercospora.
  • the early effect has the advantage that the toxin cercosporin is not even accumulated in large quantities in the plant cells and surprisingly already the penetration of C. beticola is prevented in the host tissue. This will not only the formation of
  • Leaf lesions which lead to significant limitations of the photosynthetic performance and a yield-reducing re-emergence, but already reduces the associated with the biotrophic colonization of the leaves plant energy loss and the proliferation of the pathogen.
  • the present invention prevents the spread of the fungus on the
  • Hemibiotrophic fungus Cercopora is unexpected because it has only been known to date that toxin production is directly related to the killing of the host tissue and thus the necrotrophic growth phase.
  • the results suggest that cercosporin plays an important role in the repression of plant pathogen defense in the early stages of infection and that disruption of cercosporin biosynthesis allows full expression of the natural resistance mechanisms of sugar beet.
  • the selected nucleic acid from which RNA is transcribed in the plant is stably integrated into the genome.
  • the nucleic acid is stably integrated into a chromosome of the plant.
  • it can also be integrated into an extra-chromosomal element.
  • the advantage of stable integration is that the selected nucleic acid can be passed on to subsequent generations of the transgenic plant.
  • infestation means the establishment of a contact between the pathogen and the host. With an attachment of a pathogen to a host
  • a fungal spore on a leaf surface of a plant employ mechanisms of pathogen recognition and signal transduction in the plant host cell.
  • the genus Cercospora includes various species, for example the species arachidicola, ariminiensis, asparagi, bertoreae, beticola, bizzozeriana, canescens, carotae, chenopodii, cistinearum, cladosporioides, diazu, dulcamarae, erysimi, hayii, kikuchii, malvacearum, malvicola, medicaginis, oryzaem, personata, plantaginis, ricinella, setariae, unamunoi, violae or zeae-maydis.
  • the plant according to the invention has an increased resistance to Cercospora compared to a control plant.
  • the control plant ideally has the identical genotype as the transgenic plant and has been grown under identical conditions, but does not contain the nucleic acid introduced into the transgenic plant.
  • An increase in resistance can be measured, for example, by a reduced fungal biomass on the host plant: this can be done with the aid of the fungal DNA
  • the time frame of the "biotrophic" growth phase is, for example, C.
  • beticola up to 10 days after the impact of the fungal spore on the leaf surface and, in addition to the pathogen, is influenced by environmental factors such as e.g. Humidity or temperature and the plant host determined.
  • environmental factors such as e.g. Humidity or temperature and the plant host determined.
  • necrotrophic growth phase is meant the growth phase of the fungus which causes cell death in the host cells. At the beginning of the necrotrophic phase, the fungus has colonized the mesophyll cells of the plant and necroses are visible in the plant tissue. These necroses eventually lead to the differentiation of new conidiospores.
  • the transgenic plants show few, preferably none in Cercospora BeetW
  • the leaves remain nearly free of necrosis and can fully photosynthesize. Furthermore, a re-emergence of leaves can be omitted, which is associated with an undesirable consumption of stored in the root sucrose.
  • the differentiation of new conidiospores of the fungus on the leaf surface is severely limited.
  • the proliferation and spread of the fungus is inhibited.
  • the fungus is Cercospora beticola, which is one of the most important and destructive leaf pathogens of sugar beet, beetroot and Swiss chard and can cause yield losses of over 40%:
  • the fungus produces the secondary metabolite cercosporin, which
  • ROS reactive oxygen species
  • the nucleic acids used here are directed in particular against the cercosporin biosynthesis genes from C. beticola.
  • the cercosporin biosynthesis genes form a gene cluster responsible for the biosynthesis of the non-selective phototoxin cercosporin
  • This gene cluster corresponds to fungal secondary metabolite biosynthetic gene clusters.
  • Fungal secondary metabolite synthesis genes are those genes that are adjacent to a locus in the genome as clusters and whose transcription is regulated in a coordinated fashion.
  • the gene cluster comprises the eight genes CbCTBI, CbCTB2, CbCTB3, CbCTB4, CbCTB6, CbCTB6, CbCTB7 and CbCTB8, which are responsible for a
  • CbCTBI Polyketide synthase
  • CbCTB2 O-methyltransferase
  • CbCTB3 protein with C-terminal monooxygenase and N-terminal O-methyltransferase activity
  • CbCTB5 oxidoreductases
  • CbCTB4 MFS transporter
  • CbCTB8 zinc finger transcription factor
  • the nucleic acid introduced into the plant is transcribed, whereby the formed RNA directed against one or more genes of cercosporin biosynthesis can reduce or inhibit the expression and the function of the fungal C7B gene cluster genes.
  • the nucleic acids used can be of different lengths. So can the
  • Nucleic acids having a nucleotide sequence according to one of SEQ ID NOS: 1-12 have a length of 256, 329, 359, 580, 2189, 2495, 2699, 2760, 3186, 3247, 4021 or 8436 nucleotides.
  • a particularly suitable nucleic acid encodes the O-methyltransferase CbCTB2 having a nucleotide sequence according to SEQ ID NO: 2 with a length of 2495 nucleotides.
  • the nucleic acids used may also be one or more fragments of one or more nucleotide sequences according to SEQ ID NOS: 1-12.
  • the fragments should be at least 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 , 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 or 2100 consecutive nucleotides of one or more nucleotide sequences according to SEQ ID NOS: 1-8 or at least 15 , 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200
  • the fragments are preferably selected from the coding region of the nucleotide sequences according to SEQ ID NOS: 1-8, but may also comprise parts of the non-coding regions, such as e.g. Parts of the intron regions or parts of the promoter region.
  • Nucleic acids include the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 11. Combining several cercosporin biosynthetic genes or fragments thereof reduces the likelihood that the plant's resistance will be broken by a naturally occurring mutation in the fungus. The corresponding nucleic acids can be known and established in plant biotechnology
  • Transformation methods are introduced together, for example on a binary vector or separately, for example via co-transformation in a plant cell. It is also possible to have a combination of, for example, two different ones
  • Nucleotide sequences according to SEQ ID NOS: 2 and 4 to achieve by crossing corresponding transgenic plants according to known methods of plant breeding.
  • nucleotide sequence introduced into the plant may be complementary to one or more of the nucleotide sequences described above.
  • complementary is referred to a nucleotide sequence in the 5'-3 'direction, a nucleotide sequence in the 3'-5' direction understood, the bases corresponding to the base pairing rules with the bases of the first nucleotide sequence.
  • nucleic acids which have a few, for example 1 or 2, nucleotides which are not complementary to the fungal target gene sequence of the cercosporin biosynthesis genes. Sequence variations occurring in the fungus which are based, for example, on a genetic mutation by, for example, addition, deletion or substitution or on a polymorphism in a Cercospora strain and which in a mismatch over a range of 1, 2 or more Nucleotides can thus be tolerated, provided that the RNA produced by the plant still interferes with the fungal target gene.
  • the RNA formed is um
  • Form RNA (ribonucleic acid) is understood to mean all types of ribonucleic acids, such as, for example, double-stranded RNA (dsRNA), small interfering RNA (siRNA), messenger RNA (mRNA), microRNA (miRNA) or transfer RNA (tRNA) ,
  • dsRNA double-stranded RNA
  • siRNA small interfering RNA
  • mRNA messenger RNA
  • miRNA microRNA
  • tRNA transfer RNA
  • the transgenic plant produces dsRNA starting from the introduced nucleic acid, which are processed by endogenous RNAi / silencing mechanisms to siRNAs and miRNAs.
  • a first nucleic acid having a nucleotide sequence according to one of SEQ ID NOS: 1-12 or a fragment thereof can be in sense and a second
  • Nucleic acid which carries this nucleotide sequence in antisense orientation, can be used, wherein the two nucleic acids are separated by an intron which does not
  • the nucleic acid may be directed against the fungal CbCTB2 gene.
  • an RNA transcript When expressed in a plant cell, an RNA transcript is formed, which can be due to the homology between the sense and antisense sequence regions to assemble a dsRNA. Due to the lack of base pairing in the intron region, the dsRNA forms a hairpin structure.
  • a dsRNA having a hairpin structure can also be replaced by a nucleic acid having a
  • the nucleotide sequence in sense orientation may be, for example, 190 nucleotides longer than the nucleotide sequence in antisense orientation or vice versa.
  • silencing or silencing describes processes for the decommissioning of genes. Silencing can, for. B. on transcriptional level or post-transcriptional level.
  • the silencing mechanism is based on dsRNA such as hairpin RNA structures or gene duplexes.
  • the dsRNA will lead to short dsRNAs by means of a dsRNA-specific endonuclease (Dicer), which are processed using long nucleotide sequences to short dsRNAs of preferably 21-25 base pairs, a process of both the "stem-loop" (pre-miRNA) and also for long complementary dsRNA precursors similarly.
  • Argonaut proteins as central components of the RNA-induced silencing complex (RISC) bind and deplete siRNA and miRNA, so that the duplex strand leads to the mRNA by base pairing and leads to its degradation.
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • the RNA formed is miRNA or siRNA.
  • RNA formed in the plant between the host plant and the pathogenic fungus can take place.
  • these RNAs can lead to sequence-specific gene silencing of one or more genes of the cercosporin biosynthetic gene cluster.
  • Proteins and protein complexes such as Dicer, RISC (RNA-induced silencing complex) and RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) may also be involved in this process.
  • siRNA effect can be continued when the RdRP synthesizes new siRNAs from the degraded mRNA fragments.
  • This secondary or transitive RNAi can enhance silencing and also result in the silencing of various transcripts when they share highly conserved sequences.
  • the nucleotide sequence is DNA operably linked to a promoter.
  • a “promoter” is a non-translated DNA sequence, typically upstream of a coding region, which includes the binding site for the RNA polymerase and initiates transcription of the DNA.
  • a promoter contains specific elements that act as regulators of gene expression (e.g., c / s regulatory elements). By operatively linked, it is meant that the DNA comprising the integrated nucleotide sequence is linked to a promoter in a manner that permits expression of that nucleotide sequence.
  • the promoter can be of plant, animal or microbial origin or synthetically prepared and can be selected, for example, from one of the following group of promoters: constitutive, inducible, developmentally specific, cell type-specific, tissue-specific or organ-specific. While constitutive promoters are active under most conditions, inducible promoters exhibit expression as a result of an inducing signal, which may be due, for example, to biotic stressors such as pathogens or abiotic stressors such as cold or dryness or chemicals.
  • the promoter is a constitutive promoter, e.g. the CaMV 35S promoter. It is also possible to use a tissue-specific promoter such as the C1 promoter (US Pat. No. 7,767,801 B2, EP2 298 917 A2).
  • Flanking nucleic acid molecule allows expression of the respective individual DNA strand, forming two complementary RNAs that hybridize and form a dsRNA.
  • the two promoters can be used such that one promoter is directed to the transcription of a selected nucleotide sequence and the second promoter is directed to the transcription of a nucleotide sequence complementary to the first nucleotide sequence. If both nucleotide sequences are transcribed, a dsRNA is generated.
  • a bidirectional promoter can be used which allows expression of two nucleotide sequences in two directions, one nucleotide sequence in the 3 'direction and a second nucleotide sequence in the 5' direction being read. If the two nucleotide sequences are complementary to one another, a dsRNA can be formed.
  • transgenic parts of the transgenic plant in particular transgenic seeds and transgenic cells are provided.
  • transgenic plant in particular seeds, roots, leaves, flowers and cells of the plant according to the invention.
  • isolated is meant, for example, isolated cells with a cell wall or aggregates thereof, or protoplasts, and the transgenic parts of the transgenic plant are also those which can be harvested, such as the
  • the transgenic plant For the production of transgenic seeds carrying the integrated nucleic acid, the transgenic plant can be selfed. However, the transgenic plant may also be crossed with a similar transgenic plant or with a transgenic plant carrying one or more other nucleic acids other than the invention or with a non-transgenic plant via known methods of plant breeding To produce seeds. These seeds can be used to
  • having a herbicide resistance can be crossed in the
  • Offspring will be created a stack of transgenes. The creation of hybrids is possible.
  • the present invention further relates to a method for producing a transgenic plant, seeds and parts of a plant of the species Beta vulgaris, wherein the plant in the
  • a cell of a plant of the species Beta vulgaris is transformed with a nucleic acid and the transgenic plant is regenerated therefrom, RNA being transcribed from the nucleic acid in the plant and RNA formed in the case of infestation of the plant with a fungus of the genus Cercospora of can be included so that the cercosporin biosynthesis in the fungus is so impaired that the fungus is inhibited in its biotrophic growth phase and the plant has an increased resistance to the fungus compared to a control plant.
  • Plant biotechnology known. Each of these methods can be used to introduce a selected nucleic acid, preferably in a vector, into a plant cell to obtain a transgenic plant of the present invention.
  • Transformation methods can involve direct and indirect methods of transformation and are applicable to dicotyledonous and mostly monocotyledonous plants.
  • Suitable direct transformation methods include PEG-induced DNA uptake, liposome-mediated transformation, biolistic methods by particle bombardment, electroporation or microinjection.
  • the indirect methods include, for example, the Agrobacterium -mediated transformation technique or the viral infection by means of viral vectors.
  • a preferred embodiment of the invention comprises Agrobacterium-mediated DNA transfer using binary vectors. After the transformation of
  • Plant cells are selected for one or more markers which have been transformed into the plant with the nucleic acid of the invention and include genes which preferably confer antibiotic resistance, such as the neomycin phosphotransferase II gene NPTII, which mediates kanamycin resistance.
  • markers which have been transformed into the plant with the nucleic acid of the invention include genes which preferably confer antibiotic resistance, such as the neomycin phosphotransferase II gene NPTII, which mediates kanamycin resistance.
  • the transformed cells are regenerated to complete plants.
  • the plants obtained can be checked, for example, by quantitative PCR for the presence of the nucleic acid of the invention. Resistance tests of these plants against Cercospora in vitro and in the
  • FIG. 1 Gene disruption strategy for CbCTB2 in the C. beticola isolates Ahlburg and Ferrara.
  • the CöC7ß2 disruption construct is shown schematically.
  • the 800 bp 5 'and 3' fragments of CbCTB2 were each amplified with primers 1 (CTB2 1 F), 2 (CTB2 2R) and 3 (CTB2 3F), 4 (CTB2 4R), and overlapping sequence regions with hygromycin Resistance cassette fused.
  • the resulting construct was amplified with primers that attached the Notl and Apal cleavage sites to the construct so that it could be cloned into the vector pGEMT after digestion.
  • Fig. 3 In vitro cultured sugar beet plants after treatment with toxin extract of C. beticola ⁇ cto2 disruption mutants and wild-type.
  • the sugar beet plants show various symptoms of disease one day after inoculation with the toxin extract obtained from fungus mycelium from C. beticola cultivated on agar plates. Inoculation with the extract of wild-type plates of the isolates Ahlburg and Ferrara results in black necrotic plants, while plants after inoculation with the extract obtained from plates of the Z ⁇ ciö2 disruption mutant strain look green and healthy. Water: negative control.
  • Fig. 4 The z ⁇ ciö2 disruption mutant strain does not cause disease symptoms to be disrupted.
  • Control strain with hygB vector (pGEMThyg): Ahlburg hyg.
  • Fig. 6 Light and fluorescence microscopic analysis of the wild-type and Z ⁇ ciö2 disruption mutant strain.
  • a and B The bright field image shows a necrotic leaf spot caused by the wild type 21 days after the infection, as is typical for leaf spot disease (A).
  • the -4cf02-Disruptionsmut.anten-St.amm does not produce any visible leaf symptoms after 21 days (B).
  • C and D Detection of the red fluorescent mycelium of the dsRed-expressing wild-type in the leaf spot (C), whereas the Actb2 disruption mutant strain transformed with the dsRed construct grows only weakly on the leaf surface (D).
  • a leaf cross-section shows wild-type hyphae growing between leaf parenchyma cells in the leaf 21 days after inoculation.
  • a leaf cross-section shows 21 days after inoculation with _4ctö2 disruption mutant strain that the hyphae of the cercosporin-deficient transformant are detectable only on the epidermis but not in the parenchyma.
  • the hyphae of the Actb2 disruption mutant strain were not tightly associated with the cuticle and could be easily displaced.
  • G A cross section through a wildtype-induced lesion 21 days after inoculation. Numerous hyphae grow in the necrosis. The decrease of the blue
  • FIG. 8 Schematic representation of the cercosporin biosynthesis gene cluster from C.
  • FIG. 9 pABM_70Sluci vector (FIG. 9A) and the pABM_70SlucidosRNA.CTB8 based thereon (FIG. 9B) for expression of a fusion construct consisting of a luciferase reporter gene and the gene fragment to be tested.
  • Fig. 10 Binary Ti plasmid p95N_RNAi_CTB2, which mediated for the Agrobacterium
  • Fig. 1 1 plasmid pRNAi, which was used for the construction of the sense intron antisense fragments.
  • FIG. 12 Diagnostic PCR for checking the sugar beet transgenicity (PR211)
  • FIG. 13 Relative luciferase activity in transgenic sugar beet lines of the genotype 3DC4156 with stable integration of the RNAi construct against the CTB2 gene from C. beticola after bombardment with the vector pABM-70Sluci_dsRNA.CTB2.
  • 3DC control non-transgenic control of the sugar beet genotype 3DC4156
  • RNAi lines 4-7 transgenic
  • Preferred nucleic acids have nucleotide sequences or fragments thereof from the following group:
  • SEQ ID NO: 3 nucleotide sequence coding for a dual function protein
  • SEQ ID NO: 6 nucleotide sequence of NADPH-dependent oxidoreductase (CbCTB6)
  • SEQ ID NO: 7 nucleotide sequence of the FAD / FMN-dependent oxidoreductase
  • SEQ ID NO: 8 nucleotide sequence of zinc finger transcription factor (CbCTB8)
  • SEQ ID NO: 9 Fragment of the nucleotide sequence of O-methyltransferase (CbCTB2 555 .
  • SEQ ID NO: 1 Fragment of the nucleotide sequence of the O-methyltransferase (CbCTB2 1483 .
  • the gene CbCTB2 was disrupted by gene disruption using the double-homologous recombination fusion PCR approach ( Figure 1).
  • fusion PCR was a
  • Fusion PCR is a method for cloning multiple fragments (Szewczyk et al., 2006).
  • the hygromycin resistance cassette was cut with the restriction enzyme Smal from the vector pGEMThyg (Le Thi Thu Giang, University of Hamburg), the CbC7 ⁇ 2 fragments were cleaved with the primers CTB2 1 F (5'-CGCTAGATTTAGGTGTTGGA-3 '), CTB2 2R (5').
  • Primers were designed using the sequence of C. nicotiana (accession number DQ991505). In the fusion PCR reaction, equal amounts of the CbCTB2 fragments and the hygromycin resistance cassette were fused without primer.
  • the PCR program included: denaturation at 95 ° C for 5 minutes, denaturation at 95 ° C for 1 minute, annealing in the gradient from 55 ° C to 60 ° C for 1 minute, extension at 72 ° C for 5 minutes, 20- repeated repetition of steps 2 - 4, final extension at 72 ° C for 10 minutes.
  • the resulting PCR product was amplified using the primers CTB2 5F (5 '-AACCTCCTTTGCGTATTCTC-3') and CTB2 6R (5'-ATGTTTCCGAGTTCTTGATGTG-3 '), cloned into the vector pGEMT and excised by means of the restriction enzymes Noü and Apa ⁇ , whose interfaces were attached to the fragment using primers.
  • E. coli strain XL1 -blue (Stratagene, LaJolla, CA) was used.
  • Protoplasts were prepared for the transformation of C. beticola as described in Jenczmionka ei al. 2003 and the PEG-mediated transformation was performed as previously described (Proctor et al., 1995). Buffers were prepared as described in the protocol for the transformation of C. nicotiana (Chung et al., 2002).
  • Transformant 1070.4 was used for transformation with the vector pll99dsRed (Nakimi et al., 2001) resulting in fluorescent transformants. From these, the fluorescent transformant 1080.1 was selected for further analysis.
  • the gene CbCTB2 of the C. beticola isolate Ferrara was, as described for the isolate Ahlburg, destroyed by means of gene disruption by means of the fusion PCR approach via double homologous recombination.
  • Two transformants (1029.16 and 1029.27) were selected for further analysis.
  • Transformant 1029.16 was used for transformation with the vector pll99dsRed resulting in fluorescent transfoments. From these, the fluorescent transformant 1071.9 was selected for further analysis.
  • the -_icflb2 disruption mutant shows reduced toxin production
  • Toxin production was measured on PDA plates (Potato Dextrose Agar) pH 5.6 in the light. Cercosporin was extracted in 5N KOH as described in Chung (2003). The plates were inoculated with C. öef co / a conidiospores and incubated under daylight for 2 weeks at room temperature. The agar was cut into small pieces and covered with KOH in a beaker overnight. The agar pieces were filtered off. The absorption of the filtrate was measured spectroscopically (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech) at 480 nm. A standard curve was used to calculate the cercosporin concentration.
  • the cercosporin concentration was calculated on the basis of the molecular weight of 534.51 g / mol. Each measurement was performed 3x with three different extractions. As can be seen in Fig. 2, Ahlburg shows higher toxin concentrations than Ferrara, which may explain the greater aggressiveness of this isolate. No toxin was formed in the ⁇ ci02 disruption mutant strain. Transformants with the empty vector pGEMThyg, (Le Thi Thu Giang, University of Hamburg) served as
  • CbCTB2 is essential for the pathogenicity of Cercospora beticola
  • PDA plates (pH 5.6) were inoculated with equal parts of mycelium previously minced in the Waring blender and incubated for two weeks in daylight. About one plate was used to infect a sugar beet plant. The conidia were gently scraped off the mycelial surface with the addition of sterile water using a spatula. The scraped material was sequentially filtered through a household strainer, a layer of Miracloth and a 200 m Wilson sieve to collect all agar material
  • the disease index of sugar beet plants was calculated by counting the percentage of infected leaf surface (Rossi and Battilani 1989). For each fungus strain, 25 three-month-old sugar beet plants were used for the infection test. The severity of the disease was evaluated after 21 days. Plants infected with conidiospores of the .4cf02 disruption mutant did not show disease symptoms, whereas plants after infection with the wild-type strain had a disease index of 4 on a scale of 1-9 ( Figure 5). However, after 24 days, 12% of the leaves infected with the Actb2 disruption mutant strain also showed isolated lesions (disease index 1). Histological analysis of these lesions showed that the strain had not yet spread in the plant tissue. The lesions were 2-3 mm in diameter and did not grow larger 21 days after inoculation. The .cto2 disruption mutant strain is impaired in the penetration of the host plant leaves
  • Hemibiotrophic fungus is unexpected because toxin production is directly related to the killing of the host tissue and thus to the necrotrophic growth phase.
  • the effect of the CbCTB2 encoded O-methyltransferase on the successful penetration of the host tissue is therefore to attenuate the defense response of the plant to the pathogen to allow its entry. This could be ensured by an intermediate of cercosporin biosynthesis, which acts as an effector downregulates the defense response of the host.
  • the O-methyltransferase could target more
  • RNAi vectors in sugar beet leaves are highly expressed proteins that are structurally similar to the plant defense and thus allow the biotrophic growth in the host tissue.
  • the cercosporin biosynthesis may have an influence on the oxidative stress response of the fungus: If the expression of redox-regulating genes (in) is directly upregulated by the cercosporin biosynthesis, the fungus is "on alert" at the beginning of the infection and thus can be potential Damaging the toxin and especially damage by the defense reactions of the plant.
  • Transient test method for the RNAi vectors in sugar beet leaves are transient test method for the RNAi vectors in sugar beet leaves
  • RNAi vectors which encode RNA directed against fungal cercosporin biosynthetic genes and which are ingested in the case of infestation of C. beticola sugar beet plants.
  • an RNAi vector targeting a cercosporin biosynthesis gene is transiently expressed in sugar beet leaves together with a fusion construct consisting of a luciferase reporter gene and the cercosporin biosynthesis gene fragment to be tested. If the dsRNA construct encoded in the RNAi vector is processed, the formation of dsRNA and, consequently, the formation of siRNAs should be ensured.
  • the plasmid pABM-70Sluci comprises a CaMV 35S promoter, a multiple cloning site, the coding sequence of the gene lue from Photinus pyralis, which codes for a luciferase, separated from a modified intron PIV2 from the potato gene St-LS1 (Eckes et al 1986, Vancanneyt et al., 1990), another multiple cloning site, and a CaMV 35S terminator.
  • the amplified by PCR fragment of the coding sequence region of the Q C7B8 gene is cloned, which was also cloned for the production of the dsRNA construct in the pRNAi vector.
  • the PCR template used is the vector pRNAi_CTB8-3, which contains only the sense fragment.
  • the PCR product is cut with the restriction enzymes HindIII and Sali and cloned into the vector pABM-70Sluci (FIG. 9A). This is likewise cut with the restriction enzymes HindIII and Sali and the 5.9 kb vector fraction is fractionated by agarose gel electrophoresis and subsequently isolated.
  • the ligation mixture is transformed into E. coli strain XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA).
  • the vector pABM_70SlucidosRNA.CTB8 (FIG. 9B) can be used for transient sugar beet transformation by means of
  • Particle bombardment can be used.
  • This transient test system can not only serve to validate the general functionality of the RNAi constructs, but can also be used to generate a variety of different RNAi constructs
  • the luciferase activity determinations are performed using the Dual Luciferase® Reporter Assay (Promega, Mannheim) (Schmidt et al., 2004).
  • This vector contains a CaMV 35S promoter, a multiple cloning site, the second intron from the gene AtAAP6, which encodes an amino acid permease in Arabidopsis thaliana, another multiple cloning site and a CaMV 35S terminator.
  • the vector was cut with Xhol and Ecl13611 and the 4,098 kb vector fraction was fractionated by agarose gel electrophoresis and then isolated.
  • the ligation mixture was transformed into E. coli strain XLI-blue (Stratagene, LaJolla, CA).
  • pRNAi_CTB2_sense the CbC 7ß2 fragment of 256 bp was now in antisense
  • RNAi-CTB2 gene fragment sense-intron antisense CbCTB2
  • pAM gene fragment sense-intron antisense CbCTB2
  • both pAM and pRNAi-CTB2 were HindIII cut and ligated, so that the plasmid pAM_CTB2 is formed.
  • the RNAi-CTB2 fragment was integrated by Sfil digestion and ligation in the vector p95N, which was used for sugar beet transformation (FIG. 10).
  • the binary vector was transformed into Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 according to An (1987). Selection of recombinant A. tumefaciens clones was made using the antibiotic kanamycin (50 mg / l).
  • the multiplication of the sprouts tested positive for PCR is carried out on MS + 0.1 mg / l BAP + 250 (500) mg / l timentin + 200 mg / l paromomycin.
  • the shoots are converted to MS + 6.25 mg / l NAA.
  • the transgenic sugar beet is infected under in vitro conditions with a transgenic strain of the leaf spot pathogen C. beticola of the sugar beet. This strain expresses a gene that is responsible for the green
  • fluorescent protein GFP which can be detected fluorimetrically and thus serves to quantify the fungal biomass.
  • 4 plants of a transgenic sugar beet line are immersed in a suspension of C.beticola mycelium fragments (400,000 fragments / ml) and 4 plants for control purposes in diluted Albani vegetable juice.
  • Infected plants and control plants are then incubated at 25 ° C and 16 h illumination in a culture cabinet.
  • Infected and non-infected leaf material is collected 1, 2, 3, 4 and 6 - 7 days after inoculation and the GFP fluorescence quantified with the GFP Quantification Kit (Cell Biolabs Inc., CA) as described above.
  • the increased fungal resistance of the transgenic plants is added to the other
  • the concentration of mycelial fragments and fungal spores is determined by means of a counting chamber.
  • the inoculum density is adjusted by dilution with water to a concentration of 20,000 fragments / ml.
  • 30 plants are inoculated by spraying with the mycelial suspension and the plants are randomized in the greenhouse.
  • the resistance test is carried out on the one hand via a visual assessment, whereby credit score of 1 (not susceptible) - 9 (very vulnerable) are assigned, on the other hand via a quantification of fungal biomass by means of quantitative PCR, in which the proportion of fungal DNA in comparison to the plant DNA in the infested plant tissue is measured.
  • RNAi vector consisting of a fusion construct with a luciferase reporter gene and the target gene fragment to be tested in sugar beet leaves. If the dsRNA construct encoded in the RNAi vector is correctly processed in the plants, the formation of dsRNA and, consequently, the formation of siRNAs should be ensured. These siRNAs should not only cause the degradation of the target gene fragment transcript but also of the reporter gene transcript fused thereto, so that a reduction in luciferase activity can be observed in a functional RNAi construct.
  • the plasmid pABM-70Sluci comprises a double CaMV 35S promoter, a multiple cloning site, the coding sequence of the gene lue from Photinus pyralis, which codes for a luciferase, separated from a modified intron PIV2 from the sugar beet gene St-LS1 (Eckes et 1986, Vancanneyt et al., 1990), another multiple cloning site, and a Nos terminator of the nopaline synthase gene from Agrobacterium tumefaciens.
  • the amplified by PCR fragment of the coding sequence region of, for example, the CTB2 gene was cloned, which was also cloned for the production of the dsRNA construct in the pRNAi vector.
  • the bombardment of transgenically stable plants transformed with an RNAi construct can serve to determine the silencing efficiency of the individual transgenic sugar beet lines, which can differ greatly, for example, depending on the place of integration of the construct.
  • transgenic sugar beet plants under field conditions were first grown in spring in vitro plants in greenhouse in multi-pot plates. Thereafter, these plants were planted in a greenhouse with wire mesh roof in grown soil, leaving the plants
  • Environmental conditions for example, are influenced by temperature, solar radiation, precipitation and humidity, which are comparable to natural field conditions are, were exposed.
  • the plants were planted in 3 plots each with 10 plants in May.
  • the beet was infested with Cercospora in July / co / a-infested
  • Inoculated leaf material from Italy (harvest Monselice 201 1). Approximately 0.5 g of crumbled leaf material per plant was inoculated. Before and after the inoculation, the plants were lightly sprayed with water and the wetting agent Silwet Gold (0.025%) with a backpack spray to better adhere the leaf meal. After inoculation the plants were covered with tent constructions for 7 days. The first score was 17 days after inoculation. The 2nd, 3rd, 4th and 5th scoring took place after 24, 32, 45 and 65 days, respectively. The criteria for scoring the infection refer to the area of the necrotic leaf surface after infection with C. beticola (0: 0% necrosis, leaf completely healthy, 1: 0.5% necrosis, 1-5 leaf spots, 2: 1% necrosis, 6-20 leaf spots, 3: 5% necroses, numerous
  • necrosis formation of larger contiguous infestation complexes
  • 8 80%
  • the partially resistant standard genotype 9756 has a multigene Cercospora resistance, which was brought into the sugar beet by Ottavio Munerati by crossing with the wild turnip. However, this genotype is difficult to handle in breeding and has a strong yield depression under non-infestation conditions, so that this genotype is unsuitable for commercial cultivation. Interestingly, the PR211 T-006 and PR21 1 -T-007 transformants show even a weaker one 45 days after infection
  • PR-167-T007 transgenic control
  • RNAi lines PR21 1 -T004, PR21 1- T006, PR21 1 -T007.
  • RNAi line 2.42 0.49 3.83 0.26 5.08 0.58 4.00 1, 79 2.33 0.52 PR21 1-T-006
  • RNAi line 2.25 0.61 4.75 1, 94 6.58 1, 66 3.33 1, 03 2.33 0.82 PR21 1-T-007
  • Phenylalanine ammonia lyase expression in sugar beet by the fungal pathogen Cercospora beticola is mediated at the core promoter of the gene. Plant Mol. Biol., 55: 835-852.
  • EP2298917 A2 (KWS SAAT AG, DE) Tissue-specific promoters

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine transgene Pflanze der Art Beta vulgaris, in deren Genom eine Nukleinsäure stabil integriert wurde, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, wobei gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.

Description

TRANSGENE PFLANZE DER ART BETA VULGARIS MIT GESTEIGERTER RESISTENZ GEGENÜBER CERCOSPORA
Die vorliegende Erfindung betrifft eine transgene Pflanze der Art Beta vulgaris mit gesteigerter Resistenz gegenüber einem Pilz der Gattung Cercospora, transgene Teile einer solchen Pflanze sowie ein Verfahren zu deren Herstellung.
Bis zu 14% der potentiellen Ertragsverluste in der Zuckerrübenproduktion gehen auf pilzliche Pathogene zurück. Wichtigste Pilzerkrankung der Zuckerrübe ist die Cercospora- Blattfleckenkrankheit. Hervorgerufen durch den pilzlichen Erreger Cercospora beticola (Sacc.) verursacht die Cercospora-Blattfleckenkrankheit hohe Ertragsverluste und wirkt sich nachteilig auf die Qualität des Ernteproduktes aus. Je nach Standort und Zeitpunkt des Epidemiebeginns können Verluste von bis zu 20 t/ha entstehen.
Als hemibiotropher Pilz weist C. beticola eine biotrophe und eine nekrotrophe
Wachstumsphase auf. Der Infektionszyklus beginnt mit Konidiosporen, die auf der
Blattoberfläche der Zuckerrüben landen und auskeimen: Nach 3 - 4 Tagen wachsen die Hyphen durch die Stomata der Blattoberfläche in das Blattinnere ein. In dieser frühen Phase der Infektion wird die induzierbare pflanzliche Pathogenabwehr der Zuckerrübe durch C. beticola reprimiert (Schmidt ei al. 2004, Schmidt ei al. 2008), so dass eine erfolgreiche Abwehr des Pilzes unterbleibt. Der Pilz wächst zunächst biotröph interzellulär, kolonisiert das Parenchym und entzieht den Blättern Nährstoffe, ohne sichtbare Symptome in der
Wirtspflanze auszulösen. Etwa 10 - 12 Tage nach der Sporenlandung kollabieren die Epidermis- und Blattparenchymzellen in der Nähe der Pilzhyphen und die typischen
Blattnekrosen bilden sich aus. Das jetzt nekrotrophe Pilzwachstum setzt sich in den
Nekrosen fort und es kommt zur Bildung von Konidiophoren mit Konidiosporen, von denen eine Sekundärinfektion und damit Ausbreitung der Krankheit ausgeht. Das Signal für diese Umstellung von der biotrophen zur nekrotrophen Lebensweise des Pilzes ist bisher unbekannt. Als Ursache für den Zellkollaps und die Freisetzung von Nährstoffen für das Pilzwachstum gilt das Toxin Cercosporin (Daub und Ehrenshaft 2000).
Eine indirekte Bekämpfung von C. beticola erfolgt derzeit durch die Wahl blattgesunder Sorten. Dieses Cercospora-resistente Germplasma, welches gegenwärtig zu Zuchtzwecken eingesetzt wird, wurde zu großen Teilen durch Auskreuzungen mit Beta vulgaris sp. maritima erhalten, um Resistenzgene in den Genpool einzubringen. Allerdings liefert die
konventionelle Pflanzenzüchtung bisher nur moderate Cercospora-Resistenz, so dass ein Anbau dieser Sorten in Kombination mit der Anwendung von Fungiziden erforderlich ist. Zudem geht die Resistenz gegenüber Cercospora mit einem Verlust der Wüchsigkeit und einer Reduktion des Zuckergehalts einher.
Eine chemische Bekämpfung von C. beticola durch Fungizide verursacht Kosten für den Landwirt und belastet die Umwelt. Wiederholte Anwendungen von Fungiziden erhöhen zudem den Selektionsdruck auf Fungizid-tolerante C. öef/co/a-Stämme. Dies steht einer nachhaltigen landwirtschaftlichen Praxis entgegen.
Aus dem Stand der Technik ist bekannt, dass Mechanismen zur Ausbildung einer
Cercospora-Resistenz an der Toxinreduktion oder der Entgiftung von Cercosporin ansetzen können. Das von Cercospora-Spezies produzierte photoaktivierte Sekundärmetabolit Cercosporin ist ein nicht-selektives Phototoxin und gilt als Pathogenitätsfaktor dieser Pilze (Daub 1982, Daub ei al. 2005).
Ein Ansatz, der auf Entgiftung von Cercosporin ausgerichtet ist, wird in WO91/05061 beschrieben. Danach werden neben einem Verfahren zur Aufreinigung von Cercosporin auch transgene Zuckerrübenpflanzen offenbart, welche in der Lage sind Cercosporin abzubauen. Beschrieben wird ein Gen aus Cercosporin-resistenten Bakterien, das über einen geeigneten Vektor in eine Pflanze eingebracht werden kann.
In WO97/35001 werden transgene Pflanzen beschrieben, die ein Genom umfassen, welches genetisches Material für die Expression eines Cercospora kikuchii Membranpumpenproteins enthält. Bei Cercospora-Befall ist die transgene Pflanze in der Lage, das akkumulierende pilzliche Toxin durch das eingebrachte Pumpenprotein über die Plasmamembran aus der Zelle herauszutransportieren. Mit diesem Verfahren wird aber nicht verhindert, das
Cercosporin zunächst in die Pflanzenzelle gelangt und dort Schäden anrichtet. Transgene Tabakpflanzen, die nach diesem Verfahren erstellt wurden, zeigen nach Cercospora nicotianae Befall lediglich eine Reduktion der Läsionengröße jedoch nicht der Läsionenzahl. Die grundsätzliche Anfälligkeit der Pflanzen gegenüber Cercospora wird durch diesen Ansatz nicht verringert (Upchurch et al. 2005).
Die Cercosporin-Biosynthese wurde erstmals in C. nicotianae beschrieben. Die Inaktivierung von CnCTBI, CnCTB2, CnCTB3 oder CnCTB8 führt zu einer Feedback-Hemmung der Transkription des gesamten Genclusters und somit zur Inhibierung der Cercosporin- Biosynthese in C. nicotiana (Chen. ei al. 2007). Solche Regulationsmechanismen der Sekundärmetabolit-Gencluster wurden auch in anderen phytopathogenen Pilzen wie
Fusarium fujikuroi beschrieben (Wiemann et al. 2009). Aus dem Stand der Technik ist ferner bekannt, dass ein Ausschalten der Gene CnCTBI, CnCTB3 und CnCTB4 in C. nicotianae starken Einfluss auf die Virulenz des Pathogens hat (Choquer er al. 2005, Choquer er al. 2007, Dekkers er al. 2007). Mit Hilfe von Primern, die zur Amplifizierung von CnCTBI aus C. nicotianae genutzt worden waren, konnte in C.
beticola ein Teil des CbCTB1-Gens identifiziert und durch die Gen-Disruptionskassette aus C. nicotianae ebenfalls inaktiviert werden. Die so entstandenen Mutanten produzierten kein Cercosporin und riefen weniger und kleinere Läsionen als der Wildtyp-Stamm nach
Inokulation auf Zuckerrübenblättern hervor, die sich nach dem Kollabieren des Gewebes nicht weiter ausbreiteten. Cercospora-resistente Pflanzen basierend auf einer Manipulation der Cercosporin-Biosynthesegene wurden aber nicht erhalten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Pflanze der Art Beta vulgaris mit einer gegenüber dem Stand der Technik verbesserten Cercospora-Resistenz bereitzustellen.
Erfindungsgemäß erfolgt die Lösung der gestellten Aufgabe durch eine transgene Pflanze der Art Beta vulgaris, in deren Genom eine Nukleinsäure stabil integriert wurde, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, wobei gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora aufgenommen werden kann, so dass die
Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer
Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
Mit der vorliegenden Erfindung wurde es erstmals möglich, einen spezifischen und überraschend frühzeitigen Schutz gegenüber Cercospora zu gewährleisten. Die frühzeitige Wirkung birgt den Vorteil, dass das Toxin Cercosporin gar nicht erst in größeren Mengen in den Pflanzenzellen akkumuliert und überraschenderweise bereits das Eindringen von C. beticola in das Wirtsgewebe verhindert wird. Dadurch wird nicht nur die Bildung von
Blattläsionen, die zu erheblichen Einschränkungen der Photosyntheseleistung und zu einem ertragsmindernden Neuaustrieb führen, sondern bereits der mit der biotrophen Kolonisierung der Blätter einhergehende pflanzliche Energieverlust und die Vermehrung des Pathogens vermindert. Die vorliegende Erfindung verhindert die Ausbreitung des Pilzes auf der
Wirtspflanze und greift somit in den Lebenszyklus von Cercospora ein, so dass die erfolgreiche Vermehrung und Verbreitung des Pilzes stark eingeschränkt werden. Durch die Verwendung der transgenen Pflanzen der vorliegenden Erfindung können die Kosten für den Einsatz von Fungiziden gegen Cercospora eingespart werden. Überraschend wurde gefunden, dass eine Zuckerrübenpflanze, welche die integrierte Nukleinsäure aufweist, eine Beeinträchtigung der pilzlichen Cercosporin-Biosynthese zeigt, so dass im Falle eines Befalls der Pflanze mit Cercospora der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird. Der frühe Einfluss der für die Synthese des Phototoxins Cercosporin kodierenden Cercosporin-Biosynthesegene auf die Infektion des
hemibiotrophen Pilzes Cercopora ist unerwartet, da bisher nur bekannt war, dass die Toxinproduktion in direktem Zusammenhang mit der Abtötung des Wirtsgewebes und somit der nekrotrophen Wachstumsphase steht. Die Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass Cercosporin eine wichtige Rolle bei der Repression der pflanzlichen Pathogenabwehr in der Frühphase der Infektion spielt und eine Unterbrechung der Cercosporin-Biosynthese die volle Ausprägung der natürlichen Resistenzmechanismen der Zuckerrübe erlaubt.
Gemäß der Erfindung ist die ausgewählte Nukleinsäure, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, stabil in das Genom integriert. Vorzugsweise ist die Nukleinsäure stabil in ein Chromosom der Pflanze integriert. Sie kann aber auch in ein extra-chromosomales Element integriert vorliegen. Der Vorteil einer stabilen Integration besteht darin, dass die ausgewählte Nukleinsäure an nachfolgende Generationen der transgenen Pflanze weitergegeben werden kann.
Im Sinne dieser Anmeldung ist mit "Befall" das Zustandekommen eines Kontaktes zwischen Pathogen und Wirt gemeint. Mit einer Anheftung eines Pathogens an einen Wirt
beispielsweise einer Pilzspore auf eine Blattoberfläche einer Pflanze, setzen Mechanismen der Pathogenerkennung und der Signalweiterleitung in der pflanzlichen Wirtszelle ein.
Die Gattung Cercospora umfasst verschiedene Arten, beispielsweise die Arten arachidicola, ariminiensis, asparagi, bertoreae, beticola, bizzozeriana, canescens, carotae, chenopodii, cistinearum, cladosporioides, diazu, dulcamarae, erysimi, hayii, kikuchii, malvacearum, malvicola, medicaginis, oryzaem, personata, plantaginis, ricinella, setariae, unamunoi, violae oder zeae-maydis.
Die erfindungsgemäße Pflanze weist im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber Cercospora auf. Die Kontrollpflanze hat idealer Weise den identischen Genotyp wie die transgene Pflanze und ist unter identischen Bedingungen angezogen worden, enthält aber nicht die Nukleinsäure, die in die transgene Pflanze eingebracht wurde. Eine Steigerung der Resistenz lässt sich beispielsweise durch eine reduzierte pilzliche Biomasse auf der Wirtpflanze messen: dazu kann die pilzliche DNA mit Hilfe der
quantitativen PCR im Vergleich zur pflanzlichen DNA im befallenen pflanzlichen Gewebe bestimmt werden. Ein weiterer Ansatz zur Messung der Resistenz ist die optische Bonitur, wobei Boniturnoten von 1 (nicht anfällig) bis 9 (sehr anfällig) vergeben werden.
Der zeitliche Rahmen der "biotrophen" Wachstumsphase beträgt beispielsweise bei C.
beticola bis zu 10 Tage nach Auftreffen der Pilzspore auf die Blattoberfläche und wird neben dem Pathogen durch Umwelteinflüsse wie z.B. Luftfeuchtigkeit oder Temperatur und den pflanzlichen Wirt bestimmt. In der biotrophen Wachstumsphase wird kein Zelltod der
Wirtszellen ausgelöst. Im Verlauf der biotrophen Wachstumsphase wächst der Pilz zunächst interzellulär und kolonisiert das Parenchym. Es kommt zu einem Stoffaustausch zwischen Pilz und Pflanze, sichtbar in der späteren biotrophen Wachstumsphase durch die
Verstärkung der Zellwände der pflanzlichen Mesophyllzellen, wo beispielsweise ein
Austausch von Nukleinsäuren stattfinden kann. Das Signal für den Wechsel zwischen biotropher und sich anschließender nekrotropher Wachstumsphase ist unbekannt. Unter "nekrotropher" Wachstumsphase wird die Wachstumsphase des Pilzes verstanden, die einen Zelltod in den Wirtszellen auslöst. Mit Beginn der nekrotrophen Phase hat der Pilz die Mesophyllzellen der Pflanze kolonialisiert und es werden Nekrosen im pflanzlichen Gewebe sichtbar. An diesen Nekrosen kommt es schließlich zur Differenzierung neuer Konidiosporen.
Die transgenen Pflanzen zeigen bei Cercospora-BeteW wenige, vorzugsweise keine
Nekrosen. Idealer Weise bleiben die Blätter nahezu frei von Nekrosen und können im vollen Umfang Photosynthese betreiben. Weiterhin kann ein Neuaustrieb von Blättern unterbleiben, der mit einem unerwünschten Verbrauch der in der Wurzel eingelagerten Sucrose verbunden ist.
Die Differenzierung neuer Konidiosporen des Pilzes auf der Blattoberfläche ist stark eingeschränkt. In einer bevorzugten Ausführung ist die Vermehrung und Verbreitung des Pilzes inhibiert.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung handelt es sich bei dem Pilz um Cercospora beticola, der zu den wichtigsten und zerstörerischsten Blattpathogenen von Zuckerrübe, Roter Bete und Mangold zählt und Ertragsverluste von über 40% verursachen kann: Der Pilz produziert den Sekundärmetaboliten Cercosporin, welcher unter
Lichteinwirkung mit Sauerstoff reagiert und zur Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) führt. Die ROS rufen massive Zellschäden im Blattgewebe der befallenen Pflanze hervor, die in Form von Nekrosen sichtbar werden. Eine weiter bevorzugte Ausgestaltung der Erfindung sieht vor, dass die transgene Pflanze dadurch gekennzeichnet ist, dass die Nukleinsäure
(a) eine Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 2, 9, 11 , 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12,
(b) eine Nukleotidsequenz von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden gemäß einer der SEQ ID NOS: 2, 9, 11 , 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12,
(c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu der Nukleotidsequenz nach (a) oder (b), oder
(d) eine Kombination von Nukleotidsequenzen ausgewählt aus den Nukelotidsequenzen nach (a) - (c)
aufweist.
Die hier verwendeten Nukleinsäuren sind insbesondere gegen die Cercosporin- Biosynthesegene aus C. beticola gerichtet. Die Cercosporin-Biosynthesegene bilden ein Gencluster, das für die Biosynthese des nicht-selektiven Phototoxins Cercosporin
verantwortlich ist. Dieses Gencluster entspricht pilzlichen Sekundärmetabolit-Biosynthese- Genclustern. Pilzliche Sekundärmetabolit-Synthesegene sind solche Gene, die benachbart an einem Lokus im Genom als Cluster vorliegen und deren Transkription koordiniert reguliert wird. Im Fall der Cercosporin-Biosynthese umfasst das Gencluster die acht Gene CbCTBI, CbCTB2, CbCTB3, CbCTB4, CbCTBö, CbCTB6, CbCTB7 und CbCTB8, die für eine
Polyketidsynthase (CbCTBI ), eine O-Methyltransferase (CbCTB2), ein Protein mit C- terminaler Monooxygenase- und N-terminaler O-Methyltransferase-Aktivität (CbCTB3), drei Oxidoreduktasen (CbCTB5, CbCTB6, CbCTB7), einen MFS-Transporter (CbCTB4) und einen Zinkfinger-Transkriptionsfaktor (CbCTB8) kodieren und die durch die SEQ ID NOS: 1 - 8 repräsentiert sind.
Die in die Pflanze eingebrachte Nukleinsäure wird transkribiert, wobei die gebildete RNA, welche gegen eines oder mehrere Gene der Cercosporin-Biosynthese gerichtet ist, die Expression und die Funktion der pilzlichen C7B-Genclustergene reduzieren bzw. hemmen kann.
Die verwendeten Nukleinsäuren können unterschiedlich lang sein. So können die
Nukleinsäuren mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1 - 12 eine Länge von 256, 329, 359, 580, 2189, 2495, 2699, 2760, 3186, 3247, 4021 oder 8436 Nukleotiden aufweisen. Eine besonders geeignete Nukleinsäure kodiert für die O-Methyltransferase CbCTB2 mit einer Nukleotidsequenz gemäß der SEQ ID NO: 2 mit einer Länge von 2495 Nukleotiden. Bei den verwendeten Nukleinsäuren kann es sich aber auch um ein oder mehrere Fragmente einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1 - 12 handeln. Die Fragmente soilten dabei mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000 oder 2100 aufeinanderfolgende Nukleotide einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1 - 8 oder mindestens 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200
aufeinanderfolgende Nukleotide einer oder mehrerer Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 9 - 12 umfassen. Die Fragmente werden dabei vorzugsweise aus dem kodierenden Bereich der Nukleotidsequenzen gemäß den SEQ ID NOS: 1 - 8 ausgewählt, können aber auch Teile der nicht-kodierenden Bereiche umfassen wie z.B. Teile der Intronbereiche oder Teile des Promotorbereichs.
Es sind Kombinationen von zwei oder mehr Fragmenten einer Nukleotidsequenz wie etwa von der gemäß SEQ ID NO: 2 oder von verschiedenen Nukleotidsequenzen wie etwa von den gemäß der SEQ ID NOS: 2 und 8 möglich. Eine bevorzugte Kombination von
Nukleinsäuren umfasst die Nukleotidsequenzen von SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 11. Durch die Kombination mehrerer Cercosporin-Biosynthesegene oder deren Fragmente wird die Wahrscheinlichkeit vermindert, dass die Resistenz der Pflanze durch eine natürlich vorkommende Mutation in dem Pilz gebrochen wird. Die entsprechenden Nukleinsäuren können über in der Pflanzenbiotechnologie bekannte und etablierte
Transformationsverfahren gemeinsam zum Beispiel auf einem binären Vektor oder getrennt beispielsweise über Co-Transformation in eine Pflanzenzelle eingebracht werden. Es ist ebenfalls möglich, eine Kombination beispielsweise von zwei unterschiedlichen
Nukleotidsequenzen gemäß SEQ ID NOS: 2 und 4 durch Kreuzung entsprechender transgener Pflanzen nach bekannten Methoden der Pflanzenzüchtung zu erzielen.
Des Weiteren kann die in die Pflanze eingebrachte Nukleotidsequenz komplementär zu einer oder mehreren der zuvor beschriebenen Nukleotidsequenzen sein. Unter komplementär wird bezogen auf eine Nukleotidsequenz in 5'-3' Richtung eine Nukleotidsequenz in 3'-5' Richtung verstanden, deren Basen entsprechend den Basenpaarungsregeln mit den Basen der ersten Nukleotidsequenz korrespondieren.
Von der vorliegenden Erfindung erfasst sind insbesondere auch solche Nukleinsäuren, die über einige wenige, beispielsweise 1 oder 2 Nukleotide verfügen, die nicht komplementär zu der pilzlichen Zielgensequenz der Cercosporin-Biosynthesegene sind. Im Pilz auftretende Sequenzvariationen, die beispielsweise auf einer genetischen Mutation durch z.B. Addition, Deletion oder Substitution oder auf einem Polymorphismus in einem Cercospora-Stamm basieren, und welche in einer Falschpaarung über einen Bereich von 1 , 2 oder mehr Nukleotiden führen, können somit toleriert werden, sofern die von der Pflanze gebildete RNA immer noch mit der pilzlichen Zielgen interferiert.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei der gebildeten RNA um
doppelsträngige RNA zum Gen-Silencing.
Unter "gebildeter RNA" (Ribonukleinsäure) werden dabei alle Arten von Ribonukleinsäuren wie beispielsweise doppelsträngige RNA (dsRNA), small interfering RNA (siRNA), Boten- RNA (mRNA), Mikro-RNA (miRNA) oder Tranfer-RNA (tRNA) verstanden.
Die transgene Pflanze produziert ausgehend von der eingebrachten Nukleinsäure dsRNA, die durch endogene RNAi-/ Silencing-Mechanismen zu siRNAs und miRNAs prozessiert werden.
Um dsRNA zu erhalten, kann eine erste Nukleinsäure mit einer Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1 - 12 oder einem Fragment davon in sense und eine zweite
Nukleinsäure, welche diese Nukleotidsequenz in antisense Orientierung trägt, verwendet werden, wobei die beiden Nukleinsäuren durch ein Intron getrennt sind, das keine
Ähnlichkeit mit den pilzlichen CTß-Genen hat. Beispielsweise kann die Nukleinsäure gegen das pilzliche CbCTB2-Gen gerichtet sein. Bei Expression in einer pflanzlichen Zelle wird ein RNA-Transkript gebildet, welches sich aufgrund der Homologie zwischen den sense und antisense Sequenzbereichen zu einer dsRNA zusammenlagern kann. Durch die fehlende Basenpaarung im Bereich des Introns bildet die dsRNA eine hairpin-Struktur aus.
Eine dsRNA mit einer hairpin-Struktur kann auch durch eine Nukleinsäure mit einer
Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 1 - 12 in sense und einer zweiten in antisense Orientierung unterschiedlicher Länge bereitgestellt werden. Dabei kann die Nukleotidsequenz in sense Orientierung beispielsweise um 190 Nukleotide länger sein als die Nukleotidsequenz in antisense Orientierung oder vice versa.
Der Begriff "Gen-Silencing" oder Silencing beschreibt Prozesse zur Stillegung von Genen. Silencing kann z. B. auf transkriptioneller Ebene oder post-transkriptioneller Ebene ansetzen.
Der Silencing-Mechanismus geht von dsRNA wie beispielsweise hairpin RNA-Strukturen oder Genduplexen aus. Die dsRNA wird mittels einer dsRNA-spezifischen Endonuklease (Dicer) zu kurzen dsRNAs führen, die bei Einsatz längerer Nukleotidsequenzen zu kurzen dsRNAs von vorzugsweise 21 - 25 Basenpaaren prozessiert werden, ein Prozess der sowohl für "stem-loop" (Prä-miRNA) als auch für lange komplementäre dsRNA- Vorstufen ähnlich abläuft. Argonaut-Proteine als zentrale Komponenten des RNA-induzierten Silencing Complexes (RISC) binden und entwinden siRNA und miRNA, so dass der Leitstrang des Duplexes mittels Basenpaarung gezielt an die mRNA bindet und zu deren Abbau führt. RNAi mittels miRNA bezieht sich auf einen vergleichsweise ähnlichen Prozess, mit dem
Unterschied, dass die produzierte miRNA auch partiell Regionen umfasst, die nicht identisch zu den Zielgenen sind.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei der gebildeten RNA um miRNA oder siRNA.
Nach Befall einer Wirtspflanze mit Cercospora kann ein Austausch von in der Pflanze gebildeter RNA zwischen der Wirtspflanze und dem pathogenen Pilz stattfinden. In dem Pilz können diese RNAs zu einem Sequenz-spezifischen Gen-Silencing eines oder mehrere Gene des Cercosporin-Biosynthese-Genclusters führen. An diesem Prozess können auch Proteine und Proteinkomplexe wie Dicer, RISC (RNA-induzierter Silencing-Komplex) sowie die RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) beteiligt sein.
Es ist bekannt, dass in Pflanzen der siRNA-Effekt fortgeführt werden kann, wenn die RdRP neue siRNAs aus den abgebauten mRNA-Fragmenten synthetisiert. Diese sekundäre oder transitive RNAi kann das Silencing verstärken und auch zum Silencing verschiedener Transkripte führen, wenn diese hochkonservierte Sequenzen teilen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführung handelt es sich bei der Nukleotidsequenz um DNA, die mit einem Promotor operativ verknüpft ist.
Ein "Promotor" ist eine nicht-translatierte DNA-Sequenz, typischerweise stromaufwärts einer kodierenden Region, welche die Bindestelle für die RNA-Polymerase beinhaltet und die Transkription der DNA initiiert. Ein Promotor enthält spezielle Elemente, die als Regulatoren der Genexpression fungieren (z.B. c/s-regulatorische Elemente). Mit operativ verknüpft ist gemeint, dass die DNA, welche die integrierte Nukleotidsequenz umfasst, verbunden ist mit einem Promotor in einer Weise, die eine Expression dieser Nukleotidsequenz erlaubt. Als weitere Komponente kann die integrierte Nukleotidsequenz stromabwärts mit einem
Terminator-Signal verknüpft sein.
Der Promotor kann pflanzlichen, tierischen oder mikrobiellen Ursprungs oder synthetisch hergestellt sein und kann beispielsweise aus einer der folgenden Gruppe von Promotoren ausgewählt werden: konstitutiv, induzierbar, entwicklungsspezifisch, zelltypspezifisch, gewebespezifisch oder organspezifisch. Während konstitutive Promotoren unter den meisten Bedingungen aktiv sind, zeigen induzierbare Promotoren Expression infolge eines induzierenden Signals, welches beispielsweise von biotischen Stressoren wie Pathogenen oder abiotischen Stressoren wie Kälte oder Trockenheit oder Chemikalien ausgehen kann.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem Promotor um einen konstitutiven Promotor wie z.B. den CaMV 35S-Promotor. Es kann auch ein gewebespezifischer Promotor wie der C1- Promotor verwendet werden (US7.767.801 B2, EP2 298 917 A2).
Die Verwendung von zwei Promotoren, die jeweils das 3'- und das 5'-Ende des
Nukleinsäuremoleküls flankieren, ermöglicht die Expression des jeweiligen individuellen DNA-Strangs, wobei zwei komplementäre RNAs gebildet werden, die hybridisieren und eine dsRNA bilden. Zudem können die zwei Promotoren derart eingesetzt werden, dass der eine Promotor auf die Transkription einer ausgewählten Nukleotidsequenz und der zweite Promotor auf die Transkription einer zu der ersten Nukleotidsequenz komplementären Nukleotidsequenz gerichtet ist. Sofern beide Nukleotidsequenzen transkribiert werden, entsteht eine dsRNA.
Ferner kann ein bidirektionaler Promotor eingesetzt werden, der eine Expression von zwei Nukleotidsequenzen in zwei Richtungen ermöglicht, wobei eine Nukleotidsequenz in 3'- Richtung und eine zweite Nukleotidsequenz in 5'-Richtung abgelesen wird. Sofern die beiden Nukleotidsequenzen komplementär zueinander sind, kann eine dsRNA gebildet werden.
In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung werden transgene Teile der transgenen Pflanze, insbesondere transgenen Samen und transgenen Zellen bereitgestellt.
Im Sinne dieser Anmeldung sind mit transgenen "Teilen" der transgenen Pflanze
insbesondere Samen, Wurzeln, Blätter, Blüten sowie Zellen der erfindungsgemäßen Pflanze gemeint. Dabei sind unter teilen" beispielsweise isolierte Zellen mit einer Zellwand oder Aggregate davon oder Protoplasten zu verstehen. Bei den transgenen Teilen der transgenen Pflanze handelt es sich auch um solche, die geerntet werden können, wie etwa der
Rübenkörper bei Zuckerrübe.
Zur Produktion von transgenen Samen, welche die integrierte Nukleinsäure tragen, kann die transgene Pflanze geselbstet werden. Die transgene Pflanze kann aber auch mit einer gleichen transgenen Pflanzen oder mit einer transgenen Pflanze, die eine oder mehrere andere von der Erfindung verschiedene Nukleinsäuren trägt, oder mit einer nicht-transgenen Pflanze über bekannte Methoden der Pflanzenzüchtung gekreuzt werden, um transgene Samen zu produzieren. Diese Samen können eingesetzt werden, um
Nachkommengenerationen der transgenen Pflanzen der Erfindung anzuziehen, welche die integrierte Nukleinsäure umfassen. Sofern die erfindungsgemäßen Pflanzen mit anderen transgenen Pflanzen, die statt der gesteigerten Resistenz gegenüber Cercospora
beispielsweise eine Herbizidresistenz aufweisen, gekreuzt werden, kann in den
Nachkommen ein Stack von Transgenen geschaffen werden. Auch die Erstellung von Hybriden ist möglich.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, Samen und Teilen einer Pflanze der Art Beta vulgaris, wobei die Pflanze im
Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem Befall von einem Pilz der Gattung Cercospora aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle einer Pflanze der Art Beta vulgaris mit einer Nukleinsäure transformiert und die transgenen Pflanze daraus regeneriert wird, wobei von der Nukleinsäure in der Pflanze RNA transkribiert wird und gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
Geeignete Verfahren zur Transformation von Pflanzenzellen sind in der
Pflanzenbiotechnologie bekannt. Jedes dieser Verfahren kann genutzt werden, um eine ausgewählte Nukleinsäure vorzugsweise in einem Vektor in eine Pflanzenzelle einzubringen, um eine transgene Pflanze der vorliegenden Erfindung zu erhalten.
Transformationsverfahren können direkte und indirekte Verfahren der Transformation beinhalten und sind für dikotyle und zumeist auch für monokotyle Pflanzen anwendbar.
Geeignete direkte Transformationsverfahren schließen PEG-induzierte DNA-Aufnahme, Liposomen-vermittelte Transformation, biolistische Methoden mittels Particle Bombardement, Elektroporation oder Mikroinjektion ein. Zu den indirekten Verfahren zählen beispielsweise die Agrobakterium-vermittelte Transformationstechnik oder die virale Infektion mittels viraler Vektoren.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung umfasst den Agrobakterium-vermittelten DNA-Transfer unter Verwendung binärer Vektoren. Nach der Transformation der
Pflanzenzellen, werden die Zellen auf einen oder mehrere Marker selektiert, die mit der Nukleinsäure der Erfindung in die Pflanze transformiert wurden und Gene umfassen, die vorzugsweise Antibiotika-Resistenz vermitteln, wie z.B. das Neomycinphosphotransferase ll- Gen NPTII, welches Kanamycinresistenz vermittelt.
Im Anschluss werden die transformierten Zellen zu vollständigen Pflanzen regeneriert. Nach dem DNA-Transfer und der Regeneration können die erhaltenen Pflanzen beispielsweise über quantitative PCR auf das Vorhandensein der Nukleinsäure der Erfindung überprüft werden. Resistenzprüfungen dieser Pflanzen gegenüber Cercospora in vitro und im
Gewächshaus schließen sich an. Weitere phänotypische Untersuchungen können im Gewächshaus oder im Freiland routinemäßig von entsprechend geschulten Personen durchgeführt werden. Die auf diese Weise untersuchten transformierten Pflanzen können direkt angezogen werden. Häufig werden sie als Eiterlinien in der Züchtung neuer Sorten oder in der Erzeugung von Hybriden genutzt.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden in exemplarischer Weise mit Bezug auf die Figuren und Sequenzen beschrieben:
Fig. 1 Gendisruptionsstrategie für CbCTB2 in den C. beticola Isolaten Ahlburg und Ferrara. Das CöC7ß2-Disruptionskonstrukt ist schematisch dargestellt. Die 800 bp 5'- und 3'- Fragmente von CbCTB2 wurden jeweils mit den Primern 1 (CTB2 1 F), 2 (CTB2 2R) und 3 (CTB2 3F), 4 (CTB2 4R) amplifiziert und über überlappende Sequenzbereiche mit der Hygromycin-Resistenzkassette fusioniert. Das daraus resultierende Konstrukt wurde mit Primern amplifiziert, welche die Schnittstellen Notl und Apal an das Konstrukt anfügten, so dass es nach entsprechendem Verdau in den Vektor pGEMT kloniert werden konnte.
Durch zweifache homologe Rekombination der GbCTß2-Fragmente am Genlokus des CöC7ß2-Gens kann es zur Integration der Hygromycin-Resistenzkassette in das CbCTB2- Gen kommen, so dass die Gensequenz unterbrochen wird und nicht mehr für ein
funktionales CTB2-Protein kodieren kann.
Fig. 2 Keine nachweisliche Toxin-Produktion in C. beticola \cf/?2-Disruptionsmutanten. Das aggressivere Isolat von C. beticola, Ahlburg, produziert mehr Toxin als das Isolat Ferrara. Infolge der Disruption des GbC7ß2-Gens konnte in den Actb2- Disruptionsmutanten von beiden Isolaten keine Toxinproduktion mehr detektiert werden. Kontrollstamm mit hygB- Vektor (pGEMThyg): Ferrara hyg.
Fig. 3 In vitro kultivierte Zuckerrübenpflanzen nach Behandlung mit Toxin-Extrakt von C. beticola \cto2-Disruptionsmutanten und Wildtyp. Die Zuckerrübenpflanzen zeigen verschieden starke Krankheitssymptome einen Tag nach Inokulation mit dem Toxinextrakt, welches aus Pilzmyzel von C. beticola, das auf Agarplatten kultiviert wurde, gewonnen wurde. Die Inokulation mit dem Extrakt von Wildtyp-Platten der Isolate Ahlburg und Ferrara resultiert in schwarzen nekrotischen Pflanzen, während Pflanzen nach Inokulation mit dem Extrakt gewonnen von Platten des Z\ciö2-Disruptionsmutanten- Stamms grün und gesund aussehen. Wasser: Negativ-Kontrolle.
Fig. 4 Der Z\ciö2-Disruptionsmutanten-Stamm verursacht keine Krankheitssymptome auf Zu cke rrü be n b I ättern .
Die Bilder zeigen Ausschnitte von infizierten Zuckerrübenblättern. Während der Wildtyp des Isolats Ahlburg nach 21 Tagen charakteristische nekrotische Blattflecken verursacht, zeigen die Zuckerrübenblätter infiziert mit dem Z\ciö2-Disruptionsmutanten-Stamm keine
Krankheitssymptome. Kontrollstamm mit hygB-Vektor (pGEMThyg): Ahlburg hyg.
Fig. 5 Krankheitsindex von Zuckerrüben.
Zuckerrübenpflanzen wurden mit Konidiosporen vom Wildtyp des Isolats Ahlburg und vom Z\ciö2-Disruptionsmutanten-Stamm infiziert und die Stärke der Krankheit nach 21 Tage ausgewertet. Die Zuckerrübenpflanzen infiziert mit Konidiosporen der Actb2- Disruptionsmutante zeigten keine Krankheitssymptome. Kontrollstamm mit hygB-Vektor (pGEMThyg): Ahlburg hyg.
Fig. 6 Licht- und fluoreszenzmikroskopische Analyse des Infektionsvorgangs vom Wildtyp und vom Z\ciö2-Disruptionsmutanten-Stamm.
A und B: Die Hellfeldaufnahme zeigt einen von dem Wildtyp 21 Tage nach der Infektion hervorgerufenen nekrotischen Blattfleck wie er für die Blattfleckenkrankheit typisch ist (A). Der -4cf02-Disruptionsmut.anten-St.amm ruft nach 21 Tagen keine sichtbaren Blattsymptome hervor (B).
C und D: Nachweis des rot fluoreszierenden Myzels des dsRed exprimierenden Wildtyps in dem Blattfleck (C), während der mit dem dsRed Konstrukt transformierte Actb2- Disruptionsmutanten-Stamm nur schwach auf der Blattoberfläche wächst (D).
Fluoreszenznachweis mit dem dsRed-Filtersatz des Leica MZ FL III Mikroskops.
Größenbalken: 250 [im.
Fig. 7 Infektionsprozess dokumentiert durch Fluoreszenzmikroskopie.
Für die Fluoreszenzaufnahmen wurden dsRed-Stämme vom Wildtyp und von der Actb2- Disrüptionsmutante genutzt. Fluoreszenzmikroskop: Zeiss, Hellfeld: DIC, dsRed- Fluoreszenz: dsRed-Filter, Zellwand-Autofluoreszenz: UV-Filter. A und B: Am Tag 4 nach der Inokulation waren sowohl vom Wildtyp als auch von der Disruptionsmutante Myzel und Konidiosporen auf der Blattoberfläche sichtbar.
C und D: Am Tag 4 nach der Inokulation hatte der Wildtyp (C) die Stomata erreicht und begann zu penetrieren, während die _4ctö2-Disrutptionsmutante (D) immer nur an der Blattoberfläche zu sehen war.
E: Ein Blattquerschnitt zeigt 21 Tage nach der Inokulation Hyphen des Wildtyps, die zwischen den Blattparenchymzellen im Blatt wachsen.
F: Ein Blattquerschnitt zeigt 21 Tage nach der Inokulation mit _4ctö2-Disruptionsmutanten- Stamm, dass die Hyphen der Cercosporin-defizienten Transformante lediglich auf der Epidermis aber nicht im Parenchym nachweisbar sind. Die Hyphen des Actb2- Disruptionsmutanten-Stamm waren nicht fest mit der Cuticula assoziert und konnten leicht verschoben werden.
G: Ein Querschnitt durch eine vom Wildtyp hervorgerufene Läsion 21 Tage nach der Inokulation. Zahlreiche Hyphen wachsen in der Nekrose. Die Abnahme der blauen
Autofluoreszenz der Zellwand weist auf den Abbau des Wirtsgewebes hin.
H: Ein Querschnitt durch ein mit dem _4ctö2-Disruptionsmutanten-Stamm inokuliertes Blatt 21 Tage nach der Inokulation zeigt eine starke blaue Autofluoreszenz der pflanzlichen Zellwand aber keine kolonisierenden Pilzhyphen. Größenbalken: A und B = 100 pm, C-H = 20 pm. Abkürzungen: e extracellular space, ec epidermis cell, ew epidermal cell wall, h hyphae, mc mesophyll cell, s stomata, sp stomatal pore.
Fig. 8 Schematische Darstellung des Cercosporin-Biosynthese-Genclusters aus C.
beticola.
Fig. 9 pABM_70Sluci-Vektor (Fig. 9 A) und der darauf basierende pABM_70Sluci- dsRNA.CTB8 (Fig. 9 B) zur Expression eines Fusions-Konstrukts bestehend aus einem Luciferase-Reportergen und dem zu testenden Gen-Fragment.
Fig. 10 Binäres Ti-Plasmid p95N_RNAi_CTB2, das für die Agrobakterien-vermittelte
Transformation eingesetzt wurde.
Fig. 1 1 Plasmid pRNAi, das für die Konstruktion der sense-intron-antisense-Fragmente eingesetzt wurde.
Fig. 12 Diagnostische PCR zur Überprüfung der Transgenität der Zuckerrüben (PR211 ) nach
Transformation mit dem binären Vektor_p95N_CTB2.
A: Nachweis des NPTII-Gens (553 bp) (Primer Bo2299x Bo2300) B: Nachweis des sense-Fragments (412 bp) (S 892 5'- GATTGATGTGATATCTCCACTGACGTAAGGG-3' x S 1670 5'-
TCATAAAGGTTCTTCAGAGTGATTGACCAA-3') und des antisense_Fragments (406 bp) (Primer S1 172 5'- TTCTCGAGAAATGGTTAAACGAATCGAAGCGGAC-3' x x S1671 5'- TGTACAAAAGCGTCAACTTGACTTCATGTG -3').
Marker: Tracklt™ 1 Kb DNA Ladder, Invitrogen. 3DC4156: Negativ-Kontrolle: DNA aus untransformierter Zuckerrübe des Genotyps 3DC4156. Positiv-Kontrolle (Pos. Ko.): DNA des in Zuckerrübe transformierten Plasmids p95N_RNAi_CTB2.
Fig. 13 Relative Luciferase-Aktivität in transgenen Zuckerrübenlinien des Genotyps 3DC4156 mit stabiler Integration des RNAi-Konstrukts gegen das Gen CTB2 aus C. beticola nach Beschuss mit dem Vektor pABM-70Sluci_dsRNA.CTB2. 3DC Kontrolle: nicht transgene Kontrolle des Zuckerrübengenotyps 3DC4156, RNAi-Linien 4-7: transgene
Zuckerrübenlinien PR211-T-004, PR21 1-T-005, PR21 1-T-006 und PR21 1 -T-007.
Bevorzugte Nukleinsäuren weisen Nukleotidsequenzen oder Fragmente hiervon aus der folgenden Gruppe auf:
SEQ ID NO: 1 Nukleotidsequenz der Polyketid-Synthase (CbCTBI )
SEQ ID NO: 2 Nukleotidsequenz der O-Methyltransferase (CbCTB2)
SEQ ID NO: 3 Nukleotidsequenz, die für ein Protein mit dualer Funktion einer
O-Methyltransferase (N-Terminus) und einer Monooxygenase (C- Terminus) kodiert (CbCTB3)
SEQ ID NO: 4 Nukleotidsequenz des MFS-Transporter (CbCTB4)
SEQ ID NO: 5 Nukleotidsequenz der FAD/FMN-abhängigen Oxidoreduktase
(CbCTB5)
SEQ ID NO: 6 Nukleotidsequenz der NADPH-abhängige Oxidoreduktase (CbCTB6)
SEQ ID NO: 7 Nukleotidsequenz der FAD/FMN-abhängigen Oxidoreduktase
(CbCTB7)
SEQ ID NO: 8 Nukleotidsequenz des Zinkfinger-Transkriptionsfaktor (CbCTB8)
SEQ ID NO: 9 Fragment der Nukleotidsequenz der O-Methyltransferase (CbCTB2 555.
81θ)
SEQ ID NO: 10 Fragment der Nukleotidsequenz des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors
(CbCTB8 1651 -1979)
SEQ ID NO: 1 1 Fragment der Nukleotidsequenz der O-Methytransferase (CbCTB2 1483.
184l ) SEQ ID NO: 12 Fragment der Nukleotidsequenz des Zinkfinger-Transkriptionsfaktors
(CbCTB8 2066-2645)
Gendisruption von CbCTB2 im C. £>ef/co/a-lsolat Ahlburg
Das Gen CbCTB2 wurde über Gendisruption mit Hilfe des Fusions-PCR-Ansatzes über doppelte homologe Rekombination zerstört (Fig. 1 ). Mittels Fusions-PCR wurde ein
Konstrukt generiert, das ca. 800 bp des 3'-Endes des CbCTB2-Gens, die Hygromycin- Resistenzkassette und ca. 800 bp des 5 -Endes des C£>CTß2-Gens enthält. Fusions-PCR ist eine Methode zur Klonierung mehrerer Fragmente (Szewczyk ei al. 2006). Die Hygromycin- Resistenzkassette wurde mit dem Restriktionsenzym Smal aus dem Vektor pGEMThyg (Le Thi Thu Giang, Universität Hamburg) geschnitten, die CbC7ß2-Fragmente wurden mit den Primern CTB2 1 F (5'-CGCTAGATTTAGGTGTTGGA-3'), CTB2 2R (5'- aqatqccaaccqaacaaqaqctqtcccccGCAATCTTTCTTCCTATGCT-3'), und CTB2 3F (5'- caatqctacatcacccacctcqctcccccCGTTTCCAAGTCCAAGATCTG-3'), CTB2 4R (5'- CTCTTTCGTCCCTCGTATCTC-3') aus genomischer DNA von C. beticola amplifiziert.
Primer wurden anhand der Sequenz von C. nicotiana (accession number DQ991505) entworfen. In der Fusion-PCR-Reaktion wurden ohne Primer gleiche Mengen der CbCTB2- Fragmente und der Hygromycin-Resistenzkassette fusioniert. Das PCR-Programm umfasste: Denaturierung bei 95 °C für 5 Minuten, Denaturierung bei 95 °C für 1 Minute, Annealing im Gradient von 55 °C bis 60 °C für 1 Minute, Extension bei 72 °C für 5 Minuten, 20-fache Wiederholung der Schritte 2 - 4, finale Extension bei 72 °C für 10 Minuten. Das entstandene PCR-Produkt wurde mit Hilfe der Primer CTB2 5F ( 5 ' -AACCTCCTTTGCGTATTCTC-3 ' ) und CTB2 6R (5'-ATGTTTCCGAGTTCTTGATGTG-3') amplifiziert, in den Vektor pGEMT kloniert und mittels der Restriktionsenzyme Noü und Apa\ herausgeschnitten, deren Schnittstellen mit Hilfe der Primer an das Fragment angehängt wurden. Für Klonierungsarbeiten wurde der E. coli Stamm XL1 -blue (Stratagene, LaJolla, CA) genutzt.
Zur Transformation von C. beticola wurden Protoplasten vorbereitet wie beschrieben in Jenczmionka ei al. 2003 und die PEG-vermittelte Transformation wurde durchgeführt wie zuvor beschrieben (Proctor ei al. 1995). Puffer wurden angefertigt wie im Protokoll für die Transformation von C. nicotiana beschrieben (Chung et al. 2002).
Zwei Transformanten (1070.4 und 1070.8) wurden für weitere Analysen ausgewählt. Die .4cifc>2-Transforrnanten sind überraschenderweise weiß, während der Wildtyp graues Myzel bildet. Die Transformante 1070.4 wurde für die Transformation mit dem Vektor pll99dsRed (Nakimi et al. 2001 ) genutzt, welche in fluoreszierende Transformanten resultiert. Aus diesen wurde die fluoreszierende Transformante 1080.1 für weitere Analysen ausgewählt. Gendisruption von CbCTB2 im C. beticola-\so\at Ferrara
Das Gen CbCTB2 des C. beticola- Isolates Ferrara wurde, wie für das Isolat Ahlburg beschrieben, mittels Gendisruption mit Hilfe des Fusions-PCR-Ansatzes über doppelte homologe Rekombination zerstört. Zwei Transformanten (1029.16 und 1029.27) wurden für weitere Analysen ausgewählt. Die Transformante 1029.16 wurde für die Transformation mit dem Vektor pll99dsRed genutzt, welche in fluoreszierende Transfomanten resultiert. Aus diesen wurde die fluoreszierende Transformante 1071.9 für weitere Analysen ausgewählt.
Die -_icflb2-Disruptionsmutante zeigt eine reduzierte Toxin-Produktion
Die Toxin Produktion wurde auf PDA-Platten (Potato Dextrose Agar) pH 5,6 im Licht gemessen. Cercosporin wurde in 5 N KOH extrahiert wie beschrieben in Chung (2003). Die Platten wurden mit C. öef co/a-Konidiosporen inokuliert und unter Tageslicht für 2 Wochen bei Raumtemperatur inkubiert. Der Agar wurde in kleine Stücke geschnitten und mit KOH in einem Becherglas über Nacht überdeckt. Die Agarstücke wurde abgefiltert. Die Absorption des Filtrat wurde spektroskopisch gemessen (Ultrospec 3000, Pharmacia Biotech) bei 480 nm. Eine Standardkurve diente zur Berechnung der Cercosporin-Konzentration. Ausgehend von einer 5 mM Cercosporin Stammlösung konnte die Cercosporin-Konzentration anhand des Molekulargewichtes von 534,51 g/Mol berechnet werden. Jede Messung wurde 3x mit drei verschiedenen Extraktionen durchgeführt. Wie in Fig. 2 ersichtlich, zeigt Ahlburg höhere Toxin-Konzentrationen als Ferrara, was die stärkere Aggressivität dieses Isolats erklären mag. Im ^ci02-Disruptionsmutanten-Stamm wurde kein Toxin gebildet. Transformanten mit dem Leervektor pGEMThyg, (Le Thi Thu Giang, Universität Hamburg) dienten als
Kontrollstämme.
CbCTB2 ist essentiell für die Pathogenität von Cercospora beticola
In w'fro-Zuckerrübenpflanzen, die in das Wildtyp-Extrakt aus C. beticola getaucht worden waren, starben nach einem Tag, während in wfro-Zuckerrübenpflanzen, die in Wasser oder in das Extrakt des .4cf62-Disruptionsmutanten-Stamms getaucht worden waren, keine Krankheitssymptome aufwiesen (Fig. 3). Diese Daten zeigen, dass dem Kulturextrakt des /!\ci02-Disruptionsmutanten-Stamms eine Schlüsselkomponente fehlt, die den Zelltod der Wirtspflanze auslöst. Das Experiment wurde 3x mit jeweils fünf Pflanzen pro Kulturextrakt durchgeführt. Für weitere Infektionsanalysen wurden Zuckerrübenpflanzen in Kulturschränken bei 18 °C unter Langtagbedingungen (16 h Licht) angezogen. Zur Konidiosporenproduktion wurden PDA-Platten (pH 5,6) mit gleichen Teilen Myzel inokuliert, das zuvor im Waring-Mixer zerkleinert worden war, und für zwei Wochen im Tageslicht inkubiert. Ungefähr eine Platte wurde zur Infektion von einer Zuckerrübenpflanze genutzt. Die Konidien wurden vorsichtig von der Myzeloberfläche unter Zugabe von sterilem Wasser mit Hilfe eines Spatels abgekratzt. Das abgekratzte Material wurde nacheinander durch ein Haushaltsieb, eine Lage Miracloth und einem 200 m Wilson-Sieb filtriert, um das gesamte Agarmaterial
abzutrennen. Der Konidientiter wurde auf 20.000 Konidien/ml mit Hilfe des Fuchs- Rosenthal Hemocytometer eingestellt. Zehn Wochen alte Zuckerrübenpflanzen wurden sowohl von der Blattoberseite als auch von der Blattunterseite komplett mit der Konidiosporensuspension eingesprüht. Auf jede Pflanze wurden 50 ml Suspension gesprüht. Die Pflanzen wurden für zehn Tage mit einem Folienzelt abgedeckt und inkubiert bei 18 h Licht (20 000 lux, 400-600 nm = 4000 - 6000 K) mit 24° C Tages- und 18 ° C Nachttemperatur. Die Folie wurde nach 10 Tagen entfernt.
Die Analysen zeigten, dass der .4ctö2-Disruptionsmutanten-Stamm keine Läsionen auf Blättern hervorrief und die gesamte Pflanze auch drei Wochen nach der Infektion noch gesund wirkte. Beide Wildtyp-Stämme der Isolate Ferrara und Ahlburg hingegen riefen starke Infektionen und Nekrosen hervor, die schließlich zum Tod der Pflanzen führten (Fig. 4). Diese Ergebnisse zeigen, dass CbCTB2 essentiell für die Pathogenität von C. beticola ist. Dieses Ergebnis war unerwartet, da Cercosporin als photoaktiviertes ROS-produzierendes Toxin bislang als ursächlich für das Auftreten von Nekrosen in der nekrotischen Phase der Infektion diskutiert wurde nicht jedoch als Voraussetzung für die frühe, biotrophe Phase.
Der Krankheitsindex von Zuckerrübenpflanzen wurde durch Zählung der prozentualen befallenen Blattoberfläche berechnet (Rossi und Battilani 1989). Für jeden Pilzstamm wurden 25 drei Monate alte Zuckerrübenpflanzen für den Infektionstest eingesetzt. Die Stärke der Krankheit wurde nach 21 Tagen ausgewertet. Pflanzen infiziert mit Konidiosporen der .4cf02-Disruptionsmutante zeigten keine Krankheitssymptome, während Pflanzen nach Infektion mit dem Wildtypstamm einen Krankheitsindex von 4 auf einer Skala von 1 - 9 aufwiesen (Fig. 5). Nach 24 Tagen zeigten aber auch 12% der Blätter, die mit dem Actb2- Disruptionsmutanten-Stamm infiziert worden waren, vereinzelt Läsionen (Krankheitsindex 1 ). Histologische Analysen dieser Läsionen zeigten, dass sich der Stamm allerdings noch nicht im pflanzlichen Gewebe ausgebreitet hatte. Die Läsionen waren im Durchmesser 2 - 3 mm groß und wurden auch 21 Tage nach Inokulation nicht größer. Der .cto2-Disruptionsmutanten-Stamm ist in der Penetration der Wirtspflanzenblätter beeinträchtigt
Zur Fluoreszenzmikrospkopie wurde der \ctö2-dsRed-Reporterstamm aus der
Transformation des \ciö2-Disruptionsmutanten-Stamms mit pll99dsRed (Namiki ei al. 2001 ) genutzt. Mikroskopiebilder wurden mit Hilfe des Stereofluoreszenz-Mikroskops (Leica MZ FLUI) mit dem Filter für DSRed (556 nm) durchgeführt (Fig. 6). Diese histologischen
Analysen wurden durchgeführt, um den Infektionsprozess im ^ciö2-Disruptionsmutanten- Stamm auf Zellebene zu beobachten. Unter Ausnutzung fluoreszierenden Reportergene wurden pilzliche Hyphen unter dem Mikroskop detektiert. Die ctf^-Disruptionsmutanten- Stämme 1070.4 and 1029.16 der Isolate Ahlburg und Ferrara wurden zur Transformation mit dem dsRed-Gen ausgewählt. Actb2-dsRed 1080.1 Ahlburg wurde für weitere Analysen genutzt. Der C. öei/'co/a-DsRed-Reporterstamm diente als Wildtyp-Kontrollstamm.
Fluoreszenz-Mikroskopie der adaxialen und abaxialen Blattoberfläche sowie Dünnschnitt- Präparate zu verschiedenen Zeitpunkten der Infektion zeigten, dass der Wildtyp nach 4 Tagen begann, durch die Stomata in das Blatt einzudringen und im Folgenden interzellulär zu wachsen, um 14 Tage nach der Infektion Nekrosen zu verursachen. Actb2-dsRed 1080.1 Ahlburg hingegen stoppte an der Epidermis und hat das Wirtsgewebe nicht penetriert. Der Wildtyp hatte sich nach 21 Tagen schon stark im Blattgewebe ausgebreitet als nekrotische Läsionen auf der Blattoberfläche sichtbar wurden. Der Actb2-Stamm hatte das Wachstum zu diesem Zeitpunkt bereits eingestellt und starb offenbar an der Blattoberfläche (Fig 6 und 7). Dieser frühe Einfluss eines Sekundärmetabolitclustergens auf die Infektion eines
hemibiotrophen Pilzes ist unerwartet, da die Toxinproduktion in direktem Zusammenhang mit der Abtötung des Wirtsgewebes und somit mit der nekrotrophen Wachstumsphase steht. Die Wirkung der von CbCTB2 kodierten O-Methyltransferase auf die erfolgreiche Penetration des Wirtsgewebes liegt somit darin, die Abwehrreaktion der Pflanze auf das Pathogen abzuschwächen, um dessen Eindringen zu ermöglichen.. Dies könnte durch ein Intermediat der Cercosporin-Biosynthese gewährleistet werden, welches als Effektor die Abwehrreaktion des Wirts herunterreguliert. Außerdem könnte die O-Methyltransferase auf weitere
Signalkaskaden einwirken, die eine Suppression der pflanzlichen Abwehr bewirken und somit das biotrophe Wachstum ins Wirtsgewebe ermöglichen. Des Weiteren mag die Cercosporin-Biosynthese Einfluss auf die oxidative Stressantwort des Pilzes haben: Wenn die Expression Redox-regulierender Gene (in)direkt durch die Cercosporin-Biosynthese hochreguliert wird, ist der Pilz zu Beginn der Infektion in„Alarmbereitschaft" und kann so potentiellen Schäden des Toxins und besonders Schäden durch die Abwehrreaktionen der Pflanze entgegenwirken. Transientes Testsvstem für die RNAi-Vektoren in Zuckerrübenblättern
Es wurde ein transientes Testsystem nach Birch et al. (2010) für die RNAi-Vektoren, welche für RNA kodieren, die gegen die pilzlichen Cercosporin-Biosynthesegene gerichtete ist und die im Fall eines Befalls der Zuckerrübenpflanzen von C. beticola aufgenommen werden, entwickelt. Mittels Co-Bombardement werden ein auf ein Cercosporin-Biosynthesegen abzielender RNAi-Vektor zusammen mit einem Fusion-Konstrukt bestehend aus einem Luciferase-Reportergen und dem zu testenden Cercosporin-Biosynthesegen-Fragment transient in Zuckerrübenblättern exprimiert. Wird das im RNAi-Vektor kodierte dsRNA- Konstrukt prozessiert, sollte die Bildung von dsRNA und daraus resultierend die Bildung von siRNAs gewährleistet sein. Diese siRNAs sollen nicht nur den Abbau des Cercosporin- Biosynthesegen-Fragment-Transkripts sondern auch des daran fusionierten Reportergen- Transkripts bewirken, so dass bei einem funktionalen RNAi-Konstrukt eine Reduktion der Luciferaseaktivität beobachtet werden kann. Das Plasmid pABM-70Sluci umfasst einen CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, die kodierende Sequenz des Gens lue aus Photinus pyralis, das für eine Luciferase kodiert, getrennt von einem modifizierten Intron PIV2 aus dem Kartoffel-Gen St-LS1 (Eckes et al. 1986, Vancanneyt et al. 1990), eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen CaMV 35S-Terminator. In dieses Plasmid pABM- 70Sluci wird das mittels PCR amplifizierte Fragment des kodierenden Sequenzbereiches des Q C7B8-Gens kloniert, das auch zur Herstellung des dsRNA-Konstruktes in den pRNAi- Vektor kloniert wurde. Als PCR-Template dient der Vektor pRNAi_CTB8-3, der nur das sense-Fragment enthält. Das PCR-Produkt wird mit den Restriktionsenzymen Hindill und Sali geschnitten und in den Vektor pABM-70Sluci (Fig.9 A) kloniert. Dieser wird ebenfalls mit den Restriktionsenzymen Hindill und Sali geschnitten und der 5.9 kb große Vektoranteil über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend isoliert. Der Ligationsansatz wird in E. coli Stamm XL1-blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert. Der Vektor pABM_70Sluci- dsRNA.CTB8 (Fig. 9 B) kann zur transienten Zuckerrübentransformation mittels
Partikelbeschuss genutzt werden.
Dieses transiente Testsystem kann nicht nur zur Validierung der generellen Funktionalität der RNAi-Konstrukte dienen, sondern außerdem genutzt werden, um verschiedene
Sequenzbereiche eines Genes auf deren Silencing-Effekt zu untersuchen und schließlich die besten Sequenzbereiche eines Gens für ein optimales Silencing auszuwählen.
Die Luciferase-Aktivitätsbestimmungen werden mit Hilfe des Dual Luciferase® Reporter Assays (Promega, Mannheim) durchgeführt (Schmidt et al. 2004).
Erstellung des binären Vektors zur Transformation von Zuckerrübe Ausgehend von dem Plasmid pCBCTB2_1 -246, in das mittels PCR amplifizierte kodierende Sequenzbereiche des C/?C7ß2-Gens kloniert wurden, wurde ein Sequenzbereich (Position 555 - 810 bp; vgl. SEQ ID NO: 9) von 256 bp über die im Vektor enthaltenen Xhol und Smal Restriktionsenzymschnittstellen ausgeschnitten und in den Vektor pRNAi (Fig. 13) kloniert. Dieser Vektor enthält einen CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, das zweite Intron aus dem Gen AtAAP6, das in Arabidopsis thaliana für eine Aminosäurepermease kodiert, eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen CaMV 35S-Terminator. Der Vektor wurde mit Xhol und Ecl136ll geschnitten und der 4.098 kb große Vektoranteil über Agarosegelelektrophorese aufgetrennt und anschließend isoliert. Der Ligationsansatz wurde in E. coli Stamm XLI-blue (Stratagene, LaJolla, CA) transformiert. In das Plasmid pRNAi_CTB2_sense wurde das CbC 7ß2-Fragment von 256 bp nun in antisense
Orientierung kloniert. Dazu wurde das Fragment erneut aus dem Plasmid pCBCTB2_1 -246 mit Xhol und Smal geschnitten und in den mit Smal - Sali geschnittenen und damit folglich linearisierten Vektor pRNAi_ CTB2_sense ligiert. Das Genfragment sense-intron-antisense CbCTB2 (RNAi-CTB2) wurde aus dem Vektor pRNAi-CTB2 geschnitten und in den Vektor pAM kloniert. Dazu wurden sowohl pAM als auch pRNAi-CTB2 mit Hindill geschnitten und ligiert, so dass das Plasmid pAM_CTB2 entsteht. Aus dem Vektor pAM wurde das RNAi- CTB2-Fragment mittels Sfil-Verdau und Ligation in der Vektor p95N integriert, der zur Zuckerrübentransformation genutzt wurde (Fig. 10).
Transformation und Regeneration der transqenen Zuckerrübenpflanzen
Der binäre Vektor wurde in den Agrobacterium tumefaciens Stamm GV3101 nach An (1987) transformiert. Die Selektion rekombinanter A. tumefaciens Klone erfolgte unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin (50 mg/l).
Die Transformation der Zuckerrüben erfolgte nach Lindsey et at. (1991 ) unter Verwendung des Antibiotikums Kanamycin.
Nach ca. 12 - 16 Wochen können die regenerierten Sprosse mittels PCR auf die
Anwesenheit des transformierten Konstrukts überprüft und so auf das Vorhandensein der Nukleinsäure der Erfindung überprüft werden. Die Verwendung der Primer Bo2299 (5'- GTGGAGAGGCTATTCGGTA-3') und Bo2300 (5'-CCACCATGATATTCGGCAAG-3') führte zu der Amplifikation eines 553 bp großen DNA-Fragments aus dem bakteriellen NPTII-Gen, das für die Neomycinphosphotransferase kodiert, welche die Resistenz der Pflanzen gegenüber Kanamycin ermöglicht (Fig. 12). Die PCR wurde unter Verwendung von 10 ng genomischer DNA, einer Primerkonzentration von 0,2 μΜ bei einer Annealingtemperatur von 55 °C in einem Multicycler PTC-200 (MJ Research, Watertown, USA) durchgeführt. Die Vermehrung der nach PCR positiv-getesteten Sprosse erfolgt auf MS + 0,1 mg/l BAP + 250 (500) mg/l Timentin + 200mg/l Paromomycin. Zur Bewurzelung werden die Sprosse auf MS + 6,25 mg/l NAA umgesetzt.
Messung der Resistenzsteiqerung in den transgenen Pflanzen
Um die Resistenzsteigerung zu analysieren, werden die transgenen Zuckerrüben zum einen unter in vitro Bedingungen mit einem transgenen Stamm des Blattfleckenerregers C. beticola der Zuckerrübe infiziert. Dieser Stamm exprimiert ein Gen, welches für das Grün
fluoreszierende Protein GFP kodiert, das fluorimetrisch nachgewiesen werden kann und so zur Quantifizierung der pilzlichen Biomasse dient. Jeweils 4 Pflanzen einer transgenen Zuckerrübenlinie werden in eine Suspension von C. beticola Myzelfragmenten (400.000 Fragmente/ml) und 4 Pflanzen zu Kontrollzwecken in verdünnten Albani-Gemüsesaft getaucht. Infizierte Pflanzen und Kontrollpflanzen werden anschließend bei 25 °C und 16 h Beleuchtung in einem Kulturschrank inkubiert. Infiziertes und nichtinfiziertes Blattmaterial wird 1 , 2, 3, 4 und 6 - 7 Tage nach der Inokulation abgenommen und die GFP-Fluoreszenz mit dem GFP Quantification Kit (Cell Biolabs Inc., CA) wie oben beschrieben quantifiziert.
Die erhöhte Pilzresistenz der transgenen Pflanzen wird zum anderen bei
Pilzresistenzprüfungen unter Gewächshausbedingungen, wie sie nachfolgend für die Resistenzprüfung der Zuckerrüben gegenüber C. beticola beschrieben wird, beobachtet. Für die Infektion von Zuckerrüben mit dem Blattfleckenerreger C. beticola werden neben den transgenen Zuckerrübenpflanzen Zuckerrüben des für die Transformation verwendeten Genotyps 3DC4156 als Kontrollpflanzen im Gewächshaus angezogen. Zwei Wochen vor der geplanten Inokulation werden Gemüsesaftplatten (40% Albani-Gemüsesaft) mit dem aggressiven C. beticola Isolat Ahlburg beimpft und bei 25 °C inkubiert. Unmittelbar vor der Inokulation wird der pilzbewachsene Agar mit Hilfe eines Objektträgers und etwas Wasser abgekratzt. Die Konzentration an Myzelfragmenten und Pilzsporen wird mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt. Die Inokulumdichte wird durch Verdünnen mit Wasser auf eine Konzentration von 20.000 Fragmente/ml eingestellt. Pro zu untersuchender Linie werden 30 Pflanzen durch Besprühen mit der Myzelsuspension inokuliert und die Pflanzen randomisiert im Gewächshaus aufgestellt. Die Resistenzprüfung erfolgt zum einen über eine optische Bonitur, wobei Boniturnoten von 1 (nicht anfällig) - 9 (sehr anfällig) vergeben werden, zum anderen über eine Quantifizierung der pilzlichen Biomasse mit Hilfe der quantitativen PCR, bei der der Anteil der pilzlichen DNA im Vergleich zur pflanzlichen DNA im befallenen pflanzlichen Gewebe gemessen wird. Testsystem für die RNAi-Vektoren in transgenen Zuckerrübenblättern
Es wurde ein Testsystem nach Birch et at. (2010) entwickelt, um die Funktionalität der RNAi- Vektoren gegen ausgewählte Zielgensequenzen von C. beticola in den transgenen
Zuckerrübenpflanzen zu überprüfen. Mittels Bombardement wurde ein Vektor bestehend aus einem Fusion-Konstrukt mit einem Luciferase-Reportergen und dem zu testenden Zielgen- Fragment in Zuckerrübenblättern exprimiert. Wird in den Pflanzen das im RNAi-Vektor kodierte dsRNA-Konstrukt richtig prozessiert, sollte die Bildung von dsRNA und daraus resultierend die Bildung von siRNAs gewährleistet sein. Diese siRNAs sollen nicht nur den Abbau des Zielgen-Fragment-Transkripts sondern auch des daran fusionierten Reportergen- Transkripts bewirken, so dass bei einem funktionalen RNAi-Konstrukt eine Reduktion der Luciferaseaktivität beobachtet werden kann. Das Plasmid pABM-70Sluci umfasst einen doppelten CaMV 35S-Promotor, eine multiple Klonierungsstelle, die kodierende Sequenz des Gens lue aus Photinus pyralis, das für eine Luciferase kodiert, getrennt von einem modifizierten Intron PIV2 aus dem Zuckerrüben-Gen St-LS1 (Eckes et at. 1986, Vancanneyt ei al. 1990), eine weitere multiple Klonierungsstelle sowie einen Nos-Terminator des Nopalin Synthase-Gens aus Agrobacterium tumefaciens. In dieses Plasmid pABM-70Sluci (vgl. Fig. 9A) wurde das mittels PCR amplifizierte Fragment des kodierenden Sequenzbereiches beispielsweise des CTB2-Gens kloniert, das auch zur Herstellung des dsRNA-Konstruktes in den pRNAi-Vektor kloniert wurde. Der Beschuss transgener stabil mit einem RNAi-Konstrukt transformierter Pflanzen kann dazu dienen, die Silencing-Effizienz der einzelnen transgenen Zuckerrübenlinien zu bestimmen, die sich beispielsweise abhängig vom Integrationsort des Konstruktes stark unterscheiden kann.
In verschiedenen transgenen Zuckerrübenlinien (PR21 1-T-004, PR21 1-T-006, PR211-T- 007), in deren Genom ein RNAi-Konstrukt gegen das C7S2-Gen aus C. beticola stabil integriert wurde, konnte eine deutliche Reduktion der Luciferaseaktivität gemessen werden (Fig. 13). Als Kontrolle dienten Zuckerrübenpflanzen des für die Transformation verwendeten Genotyps 3DC4156.
Messung der Resistenz in transgenen Zuckerrübenpflanzen unter Freilandbedinqungen Für den Resistenztest der transgenen Zuckerrübenpflanzen unter Freilandbedingungen wurden die transgenen Pflanzen im Frühjahr zunächst aus in vitro Pflanzen im Gewächshaus in Multitopfplatten angezogen. Danach wurden diese Pflanzen in ein Gewächshaus mit Maschendrahtdach in gewachsenem Boden ausgepflanzt, so dass die Pflanzen
Umweltbedingungen beeinflusst beispielsweise durch Temperatur, Sonneneinstrahlung, Niederschlag und Luftfeuchtigkeit, welche mit natürlichen Feldbedingungen vergleichbar sind, ausgesetzt waren. Die Pflanzen wurden in je 3 Parzellen mit jeweils 10 Pflanzen im Mai ausgepflanzt. Die Zuckerrüben wurden im Juli mit Cercospora bef/co/a-befallenem
Blattmaterial aus Italien (Ernte Monselice 201 1 ) inokuliert. Es wurden ca. 0,5 g zerbröseltes Blattmaterial pro Pflanze inokuliert. Vor und nach der Inokulation wurden die Pflanzen mit einer Rückenspritze leicht mit Wasser und dem Benetzungmittel Silwet Gold (0,025%) besprüht, damit das Blattmehl etwas besser anhaftet. Nach der Inokulation wurden die Pflanzen mit den Zeltkonstruktionen für 7 Tage abgedeckt. Die 1. Bonitur erfolgte 17 Tage nach Inokulation. Die 2., 3., 4 und 5. Bonitur erfolgte nach 24, 32, 45 bzw. 65 Tagen. Die Kriterien zur Bonitur der Infektion beziehen sich auf die Fläche der nekrotischen Blattfläche nach Befall mit C. beticola (0: 0 % Nekrosen, Blatt vollkommen gesund; 1 : 0,5 % Nekrosen, 1-5 Blattflecken; 2: 1 % Nekrosen, 6-20 Blattflecken; 3: 5 % Nekrosen, zahlreiche
Blattflecken > 20; 4: 10 % Nekrosen, erste Blattflecken fließen zusammen; 5: 20 %
Nekrosen, Bildung größerer zusammenhängender Befallskomplexe; 6: 40 % Nekrosen, befallene Blattfläche = 40 %; 7: 60 % Nekrosen, befallene Blattfläche = 60 %; 8: 80 %
Nekrosen, meist nur noch an Rest der Blattbasis grün; 9: 100 % Nekrosen, Blatt vollkommen abgestorben)..
In verschiedenen transgenen Zuckerrübenlinien (PR21 1 -T-004, PR211-T-006, PR211 -T- 007), die durch Transformationen in den Zuckerrübengenotypen 3DC4156 entstanden sind, konnte ein reduzierter Re-Infektionsgrad dieser Pflanzen im Verlauf der Infektion mit C.
beticola im Vergleich zum Transformationsgenotyp 3DC4156, der als Kontrolle genau wie die transgenen Pflanzen angezogen, ausgepflanzt und infiziert worden war, bestimmt werden. Als weitere Kontrollen wurden der partiell resistente Standardgenotyp 9756 sowie eine transgene Linie, die ein Reportergen FP635 exprimiert, im Experiment mitgeführt. Der reduzierte Infektionsgrad der PR21 1 Transformanten spiegelte sich durch eine stark reduzierte Ausbreitung des Pathogens und Neuinfektion der Pflanzen in den Parzellen und damit durch eine deutlich verringerte Ausbreitungsfähigkeit des Pathogens auf diesen Pflanzen wieder (siehe Boniturnoten 45 Tage nach Infektion und später: 3DC4156
(Kontrolle): 7,83; PR211-T-004: 6, PR21 1 -T-006: 4, PR21 1-T-007: 3,33) (Tabelle 1 ).
Der partiell resistente Standardgenotyp 9756 weist eine multigene Cercospora Resistenz auf, die durch Ottavio Munerati durch Kreuzung mit der Wildrübe in die Zuckerrübe gebracht wurde. Dieser Genotyp ist jedoch züchterisch schwierig zu handhaben und weist eine starke Ertragsdepression unter Nichtbefallbedingungen auf, so dass dieser Genotyp für den kommerziellen Anbau ungeeignet ist. Interessanterweise zeigen die PR211 -T-006 und PR21 1 -T-007 Transformanten 45 Tage nach der Infektion sogar einen schwächeren
Cercospora Befall als der partiell resistente Standardgenotyp 9756. Tabelle 1. Optische Bonitur nach Infektion transgener Zuckerrübenpflanzen mit C. beticola unter Freilandbedingungen. MW: Mittelwert der Boniturdaten von 3 x 10 Pflanzen pro Zeitpunkt; StabW: Standardabweichung; 3DC4156: nicht-transgene Kontrolle
(Transformationsgenotyp); 9756: nicht-transgene Kontrolle (partiell resistenter
Standardgenotyp); PR-167-T007: transgene Kontrolle; RNAi-Linien: PR21 1 -T004, PR21 1- T006, PR21 1 -T007.
17 dpi 24 dpi 32 dpi 45 dpi 65 dpi
MW StabW MW StabW MW StabW MW StabW MW StabW
Kontrolle 1 ,83 0,26 4,50 1 ,22 6,33 0,82 7,83 0,26 3,67 1 ,03 3DC4156
Kontrolle 1 ,17 0,41 2,00 1 ,00 3,00 1 ,52 4,25 1 ,67 3,17 0,41 9756
Kontrolle 1 ,67 0,26 3,17 0,41 5,58 0,49 7,58 0,49 4,33 0,52 PR167-T-007
RNAi-Linie 2,08 0,20 4,42 0,92 6,58 0,66 6,00 0,84 3,83 0,41 PR21 1-T-004
RNAi-Linie 2,00 0,55 4,17 1 ,47 5,92 1 ,07 7,92 0,20 3,00 1 ,55 PR211-T005
RNAi-Linie 2,42 0,49 3,83 0,26 5,08 0,58 4,00 1 ,79 2,33 0,52 PR21 1-T-006
RNAi-Linie 2,25 0,61 4,75 1 ,94 6,58 1 ,66 3,33 1 ,03 2,33 0,82 PR21 1-T-007
Durch die beschriebenen Versuche konnte nicht nur die Funktionalität der RNAi-Konstrukte in transgenen Zuckerrübenpflanzen in Bezug auf das Silencing der Zielgensequenz in diesen transgenen Pflanzen (PR21 1-T-004, PR21 1-T-006, PR21 1 -T-007) sondern auch eine erhöhte Resistenz in diesen Pflanzen gegenüber C. beticola demonstriert werden.
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Claims

ANSPRÜCHE
1. Transgene Pflanze der Art Beta vulgaris, in deren Genom eine Nukleinsäure stabil integriert wurde, von der in der Pflanze RNA transkribiert wird, wobei gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
2. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pilz um Cercospora beticola handelt.
3. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure
(a) eine Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 2, 9, 1 1 , 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12,
(b) eine Nukleotidsequenz von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden gemäß einer der SEQ ID NOS: 2, 9, 11 , 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12,
(c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu der Nukleotidsequenz nach (a) oder (b), oder
(d) eine Kombination von Nukleotidsequenzen ausgewählt aus den Nukelotidsequenzen nach (a) - (c)
aufweist.
4. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um doppelsträngige RNA zum Gen-Silencing handelt.
5. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um miRNA oder siRNA handelt.
6. Transgene Pflanze nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Nukleotidsequenz um DNA handelt, die mit einem Promotor operativ verknüpft ist.
7. Transgene Teile der transgenen Pflanze nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere transgene Samen und transgene Zellen.
8. Verfahren zu Herstellung einer transgenen Pflanze, Samen und Teilen einer Pflanze der Art Beta vulgaris, wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber einem Befall von einem Pilz der Gattung Cercospora aufweist,
dadurch gekennzeichnet, dass eine Zelle einer Pflanze der Art Beta vulgaris mit einer Nukleinsäure transformiert und die transgene Pflanze daraus regeneriert wird, wobei von der Nukleinsäure in der Pflanze RNA transkribiert wird und gebildete RNA im Falle eines Befalls der Pflanze mit einem Pilz der Gattung Cercospora von diesem aufgenommen werden kann, so dass die Cercosporin-Biosynthese in dem Pilz derart beeinträchtigt wird, dass der Pilz in seiner biotrophen Wachstumsphase gehemmt wird und die Pflanze im Vergleich zu einer Kontrollpflanze eine gesteigerte Resistenz gegenüber dem Pilz aufweist.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pilz um Cercospora beticola handelt.
10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Nukleinsäure
(a) eine Nukleotidsequenz gemäß einer der SEQ ID NOS: 2, 9, 11 , 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12,
(b) eine Nukleotidsequenz von mindestens 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden gemäß einer der SEQ ID NOS: 2, 9, 1 1 , 1 , 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10 oder 12,
(c) eine Nukleotidsequenz, die komplementär ist zu einer der Nukleotidsequenzen nach (a) oder (b),
(d) eine Kombination von Nukleotidsequenzen ausgewählt aus den Nukleotidsequenzen nach (a) - (c)
aufweist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um doppelsträngige RNA zum Gen-Silencing handelt.
12. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der gebildeten RNA um miRNA oder siRNA handelt.
13. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der
Nukleotidsequenz um DNA handelt, die mit einem Promotor operativ verknüpft ist.
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