WO2006097465A2 - Verfahren zur erhöhung der pilzresistenz in transgenen pflanzen durch wirtsinduzierte unterdrückung der genexpression in pilzpathogenen - Google Patents

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Pilzresistenz in transgenen Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung von Pilzgenen, bei denen die Hemmung ihrer Expression Pilzresistenz vermittelt sowie die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines oder mehrerer Pilze homolog und/oder komplementär sind, zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz.

Description

Verfahren zur Erhöhung der Pilzresistenz in transgenen Pflanzen durch wirtsinduzierte Unterdrückung der Genexpression in Pilzpathogenen

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erhöhung der Pilzresistenz in transgenen Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Identifizierung von Pilzgenen, bei denen die Hemmung ihrer Expression in transgenen Pflanzen Pilzresistenz vermittelt sowie die Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines oder mehrerer Pilze homolog und/oder komplementär sind, zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz.

Pflanzenkrankheiten, die durch verschiedene Pathogene wie z. B. Viren, Bakterien und Pilze verursacht werden, können beim Anbau von Kulturpflanzen zu erheblichen Ernteausfällen führen, was zum einen wirtschaftliche Folgen hat, aber auch die Sicherheit der menschlichen Ernährung bedroht. So kann etwa der Befall von Getreide mit Blumeria graminis, dem Erreger des Echten Mehltaus, zu Ertragsverlusten von mehr als 30% führen.

Seit dem letzten Jahrhundert werden zur Kontrolle von Pilzerkrankungen chemische Fungizide eingesetzt. Durch den Einsatz dieser Stoffe konnte zwar das Ausmaß von Pflanzenerkrankungen reduziert werden, es ist allerdings bis heute nicht auszuschließen, dass diese Verbindungen eine schädliche Wirkung auf Mensch, Tier und Umwelt ausüben. Um langfristig den Verbrauch von herkömmlichen Pflanzenschutzmitteln auf ein Minimum zu reduzieren, ist es daher von Bedeutung, die natürliche Pathogenabwehr von verschiedenen Pflanzen gegenüber unterschiedlichen Erregern zu untersuchen und sie sich durch gentechnologische Manipulation, z. B. durch das Einführen externer Resistenzgene oder durch die Manipulation der endogenen Genexpression in den Pflanzen, zur Herstellung von pathogenresistenten Pflanzen gezielt nutzbar zu machen.

Als Resistenz bezeichnet man die Fähigkeit einer Pflanze, Befall und Besiedelung durch einen Schaderreger zu verhindern oder zumindest zu begrenzen. Die Pflanzen verfügen über ein gewisses Maß an natürlicher Resistenz, die durch die Bildung von spezifischen Ab wehrsub stanzen wie Isoprenoiden, Flavonoiden, Enzymen und reaktiven Sauerstoffverbindungen vermittelt wird.

Daher besteht ein Ansatz zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz darin, ein pflanzliches Gen, das zur Bildung dieser spezifischen Ab wehr Substanzen führt, in der Pflanze zu überexprimieren. So konnten bereits Chitinase- (WO 92/17591) und Pathogenese- verwandte Gene (WO 92/20800) sowie Gene für verschiedene oxidierende Enzyme wie etwa Glucoseoxidase (WO 95/21924) und Oxalatoxidase (WO 99/04013) in Pflanzen überexprimiert und dadurch Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz hergestellt werden.

Umgekehrt konnte aber auch gezeigt werden, dass manche pflanzliche Gene erst den Eintritt des Pilzes in die Pflanze ermöglichen. Daher besteht ein alternativer Ansatz zur Herstellung transgener Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz darin, die Expression dieser pflanzlichen Gene, die z. B. für eine Polyphenoloxidase (WO 02/061101), NADPH-Oxidase (WO 2004/009820) und das Mio-Gen (WO 00/01722) kodieren, in transgenen Pflanzen zu hemmen.

Jedoch stehen nach wie vor nicht gegen alle Pilzpathogene Resistenzgene zur Verfügung, mit denen die Pflanzen resistent gegen diese speziellen Pilze gemacht werden können. Zudem vermitteln einige der bekannten Resistenzgene nur einen zeitlich begrenzten Schutz und können daher nicht zur Herstellung einer dauerhaften Resistenz in transgenen Pflanzen verwendet werden.

Daher besteht nach wie vor ein Bedarf nach Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz und nach Verfahren zur Identifizierung von Genen, die zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz verwendet werden können.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein zu den Methoden des Standes der Technik alternatives Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem es möglich ist, transgene Pflanzen mit einer erhöhten Pilzresistenz herzustellen. Insbesondere ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Pflanzen hergestellt werden können, die eine Resistenz gegenüber einem breiten Spektrum verschiedener Pilzarten aufweisen. Ferner ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dem Gene aufgefunden werden können, die dazu verwendet werden können, transgene Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz herzustellen.

Zur Lösung dieser und weiterer Aufgaben, wie sie sich aus der Beschreibung ergeben, dienen die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind durch die Merkmale der Unteransprüche definiert.

Die Aufgaben werden durch die vorliegende Erfindung dadurch gelöst, dass ein Verfahren zur Erhöhung der Pilzresistenz in trans genen Pflanzen zur Verfügung gestellt wird, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird.

Die Aufgaben werden ebenfalls durch ein Verfahren zur Identifizierung von

Pilzgenen gelöst, bei denen die Hemmung ihrer Expression in transgenen Pflanzen Pilzresistenz vermittelt, umfassend die Schritte (a) Identifizieren geeigneter Zielgene,

(b) Herstellen von RNAi- Konstrukten für diese Zielgene in einem geeigneten Vektor,

(c) Transformieren der RNAi- Konstrukte in geeignete Testpflanzen, (d) Inokulieren der Testpflanzen mit einem geeigneten Pilz und (e) Auswerten des Pilzbefalls der

Pflanze mit einem geeigneten Auswerteverfahren.

Während bei den Verfahren des Standes der Technik, wie sie oben beschrieben wurden, ein endogen in der Pflanze vorliegendes Gen entweder überexprimiert oder gehemmt wird, so dass die Pflanze eine erhöhte Pilzresistenz entwickelt, wird bei einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung eine grundlegend andere Strategie gewählt. Es wurde nämlich überraschenderweise festgestellt, dass durch die Expression einer zu der Nukleinsäuresequenz eines Pilzgens homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz in einer Pflanze die Pilzresistenz dieser Pflanze erhöht werden kann, indem die Expression des Pilzgens gehemmt wird. Da somit das „gene silencing" im Pilz durch eine Nukleinsäuresequenz bewirkt wird, die vom Wirt des Pilzes, der Pflanze, gebildet wird, wird dieses Verfahren auch als „host-induced gene silencing" (HIGS) bezeichnet.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Erhöhung der Pilzresistenz in transgenen Pflanzen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind transgene Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und im Vergleich zum Wildtyp über erhöhte Pilzresistenz verfügen.

Ebenfalls Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von

Nukleinsäuresequenzen, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines oder mehrerer Pilze homolog und/oder komplementär sind, zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz. "Pilzresistenz" meint das Vermindern oder Abschwächen von Krankheitssymptomen einer Pflanze infolge eines Befalls durch einen Pilz. Die Symptome können vielfältiger Art sein, umfassen aber bevorzugt solche, die direkt oder indirekt zu einer Beeinträchtigung der Qualität der Pflanze, der Quantität des Ertrags, der Eignung zur Verwendung als Futter- oder Nahrungsmittel führen oder aber auch Aussaat, Anbau, Ernte oder Prozessierung des Ernteguts erschweren. Ebenso bedeutet "Pilzresistenz", dass ein Pilz in einer Pflanze ein vermindertes Wachstum und eine verminderte oder ausbleibende Weiterverbreitung zeigt.

Unter dem Begriff "erhöhte Pilzresistenz" wird erfindungsgemäß verstanden, dass die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen durch Pilze weniger stark und/oder weniger häufig befallen werden als nicht- transformierte Wildtyp - Pflanzen bzw. Pflanzenzellen, die ansonsten gleich behandelt wurden (z. B. Klima- und Anbaubedingungen, Pilzart, usw.). Bevorzugt ist der Befall mit Pilzen mindestens um den Faktor 2, besonders bevorzugt mindestens um den Faktor 3, insbesondere bevorzugt mindestens um den Faktor 5 und am meisten bevorzugt mindestens um den Faktor 10 reduziert, was sich in einer Verminderung der Ausbildung von Krankheitssymptomen äußert. Experimentell kann eine erhöhte Pilzresistenz unter anderem durch eine Verminderung der Haustorienbildung und/oder des Hyphenwachstums nachgewiesen werden. Der Begriff "erhöhte Pilzresistenz" beinhaltet dabei auch eine so genannte transiente Pilzresistenz, d.h. dass die erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen nur für einen begrenzten Zeitraum eine gegenüber dem entsprechenden Wildtyp erhöhte Pilzresistenz aufweisen.

Pilzpathogene oder pilz- ähnliche Pathogene (wie z. B. Chromista) stammen vorzugsweise aus der Gruppe umfassend Plasmodiophoramycota, Oomycota, Ascomycota, Chytridiomyceten, Zygomyceten, Basidiomycota und Deuteromyceten (Fungi imperfecti). Beispielhaft, jedoch nicht einschränkend, seien die in Tabelle 1 genannten Pilzpathogene und die mit ihnen in Zusammenhang gebrachten Erkrankungen zu nennen.

Tabelle 1 : Pflanzliche Pilzerkrankungen

Besonders bevorzugt bewirkt die Hemmung der Expression des Pilzgens eine Resistenz gegen

Plasmodiophoromycota wie Plasmodiophora brassicae (Kohlhernie, clubroot of crucifers), Spongospora subterranea (powdery scab of potato tubers), Polymyxa graminis (root disease of cereals and grasses); Oomycota wie Bremia lactucae (Falscher Mehltau an Salat), Peronospora (Falscher Mehltau) bei snapdragon (P. antirrhini), Zwiebel (P. destructor), Spinat (P. effusä), Sojabohne (P. manchuricä), Tabak ("blue mold" = Blauschimmel; P. tabacina) Alfalfa und Klee (P. trifolium), Pseudoperonospora humuli (Falscher Mehltau an Hopfen), Plasmopara (Falscher Mehltau bei Trauben) (P. viticola) und Sonnenblume (P. halstediϊ), Sclerophtohra macrospora (Falscher Mehltau bei Cerealien und Gäsern), Pythium (seed rot, seedling damping-off, and root rot and all types of plants, z.B. Wurzelbrand an Beta- Rübe durch P. debaryanum), Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule bei Kartoffel, Braunfäule bei Tomate etc.), Albugo spec. (white rust on cruciferous plants); Ascomycota wie Microdochium nivale (Schneeschimmel an Roggen und Weizen), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule v.a. bei

Weizen), Fusarium oxysporum (Fusarium- Welke an Tomate), Blumeria graminis (Echter Mehltau an Gerste (f.sp. hordei) und Weizen (f.sp. tritici)), Erysiphe pisi (Erbsenmehltau), Nectria galligena (Obstbaumkrebs), Unicnula necator (Echter Mehltau der Weinrebe), Pseudopeziza tracheiphila (Roter Brenner der Weinrebe), Claviceps purpurea (Mutterkorn an z.B. Roggen und

Gräsern), Gaeumannomyces graminis (Schwarzbeinigkeit an Weizen, Roggen u.a. Gräsern), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Pyrenophora graminea (Streifenkrankheit an Gerste), Pyrenophora teres (Netzfleckenkrankheit an Gerste), Pyrenophora tritici- repentis (Blattfleckenkrankheit (Blattdürre) an Weizen), Venturia inaequalis (Apfelschorf), Sclerotinia sclerotium

(Weißstengeligkeit, Rapskrebs), Pseudopeziza medicaginis (Klappenschorf an Luzerne, Weiß- und Rotklee);

Basidiomyceten wie Typhula incarnata (Typhula- Fäule an Gerste, Roggen, Weizen), Ustilago maydis (Beulenbrand an Mais), Ustilago nuda (Flugbrand an Gerste), Ustilago tritici (Flugbrand an Weizen, Dinkel), Ustilago avenae

(Flugbrand an Hafer), Rhizoctonia solani (Wurzeltöter an Kartoffeln), Sphacelotheca spp. (head smut of sorghum), Melampsora Uni (rust of flax), Puccinia graminis (Schwarzrost an Weizen, Gerste, Roggen, Hafer), Puccinia recondita (Braunrost an Weizen), Puccinia dispersa (Braunrost an Roggen), Puccinia hordei (Braunrost an Gerste), Puccinia coronata (Kronenrost an Hafer), Puccinia striiformis (Gelbrost an Weizen, Gerste, Roggen sowie zahlreichen Gräsern), Uromyces appendiculatus (Bohnenrost), Sclerotium rolfsii (root and stem rots of many plants);

Deuteromyceten (Fungi imperfecti) wie Septoria nodorum (Spelzenbräune) an Weizen {Septoria triticϊ), Pseudocercosporella herpotrichoides (Halmbruchkrankheit an Weizen, Gerste, Roggen), Rynchosporium secalis (Blattfleckenkrankheit an Roggen und Gerste), Alternaria solani (Dürrfleckenkrankheit an Kartoffel, Tomate), Phoma betae (Wurzelbrand an

Beta- Rübe), Cercospora beticola (Cercospora-Blattfleckenkrankheit an Beta- Rübe), Alternaria brassicae (Rapsschwärze an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern), Verticillium dahliae (Rapswelke und -Stengelfäule), Colletotrichum lindemuthianum (Brennfleckenkrankheit an Bohne), Phoma Ungarn - Umfallkrankheit (Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps), Botrytis cinerea (Grauschimmel an Weinrebe, Erdbeere, Tomate, Hopfen etc.).

Am meisten bevorzugt sind die durch das erfindungsgemäße Verfahren hergestellten Pflanzen resistent gegen Phytophthora infestans (Kraut- und Knollenfäule, Braunfäule bei Tomate etc.), Microdochium nivale (vormals Fusarium nivale; Schneeschimmel an Roggen und Weizen), Fusarium graminearum, Fusarium culmorum (Ährenfäule an Weizen), Fusarium oxysporum (Fusarium- Welke an Tomate), Blumeria graminis (Echter Mehltau an Gerste (f. sp. hordei) und Weizen (f. sp. tritici)), Magnaporthe grisea (rice blast disease), Sclerotinia sclerotium (Weißstengeligkeit, Rapskrebs), Septoria nodorum und Septoria tritici (Spelzenbräune an Weizen), Alternaria brassicae (Rapsschwärze an Raps, Kohl u.a. Kreuzblütlern), Phoma Ungarn (Umfallkrankheit, Schwarzbeinigkeit an Kohl; Wurzelhals- oder Stengelfäule an Raps).

Unter einem "Wildtyp" wird erfindungsgemäß der entsprechende nicht genetisch veränderte Ausgangsorganismus verstanden.

Erfindungsgemäß können transgene Pflanzen, die über eine erhöhte Pilzresistenz verfügen, dadurch hergestellt werden, dass ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanzen mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird.

"Im Wesentlichen unterbunden" bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, dass das Expressionslevel der Nukleinsäuresequenz des Pilzes in den transgenen Pflanzen auf ein Niveau reduziert ist, bei dem die Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber Pilzinfektionen zeigen bzw. nach anfänglichen Symptomen einer Pilzinfektion Anzeichen für eine Erholung aufweisen Unter "transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch solche Pflanzen verstanden, die geringe Symptome einer Pilzinfektion zeigen, die jedoch so schwach ausgeprägt sind, dass die Verwendbarkeit und Nutzbarkeit der befallenen Pflanzen nicht in Frage gestellt ist. Erfindungsgemäße Pflanzen weisen einen gegenüber Wildtyp -Pflanzen im Wesentlichen unveränderten Phänotyp auf, d.h. die Verwendung als Nutz-, Nahrungs- oder Futterpflanze usw. ist nicht in Frage gestellt. Das Expressionslevel der Nukleinsäuresequenz des Pilzes, deren Expression durch die in der transgenen Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz im Wesentlichen unterbunden wird, lässt sich in befallenen Wildtyppflanzen wie auch in den transgenen Pflanzen z. B. dadurch bestimmen, dass eine RT-PCR- Analyse oder eine Northern Blot- Analyse mit spezifischen Primern bzw. Sonden durchgeführt wird. Dem Fachmann ist klar, wie er die Sonden bzw. Primer auswählen muss, um die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes zu untersuchen. Bevorzugt ist das Expressionslevel der Nukleinsäuresequenz des Pilzes um mindestens 50%, besonders bevorzugt um mindestens 80%, insbesondere bevorzugt um mindestens 90%, ebenfalls insbesondere bevorzugt um mindestens 95% und am meisten bevorzugt um mindestens 98 oder 99% vermindert.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung bedeutet "Sequenzhomologie" bzw. "Homologie", dass die Nukleinsäuresequenz eines DNA- Moleküls zu mindestens 40%, bevorzugt zu mindestens 50%, weiter bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70% und/oder 75%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, 82%, 84%, 86% und/oder 88%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90%, 92% und/oder 94% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95%, 96%, 97%, 98% und/oder 99% zu den Nukleinsäuresequenzen eines bekannten DNA- oder RNA- Moleküls identisch ist, d.h. gleiche Nukleotide in gleicher 5'-3'-Reihenfolge aufweist.

Die Sequenzidentität wird über eine Reihe von Programmen, die auf verschiedenen Algorithmen beruhen, bestimmt. Dabei liefern die Algorithmen von Needleman und Wunsch oder Smith und Waterman besonders zuverlässige Ergebnisse. Für die Sequenzvergleiche wurde das Programm PiIeUp (Feng und Doolittle (1987) J. Mol. Evolution 25: 351 - 360; Higgins et al. (1989) CABIOS 5: 151 - 153) oder die Programme GAP und Best Fit (Needleman und Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443 - 453 und Smith und Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482 - 489) verwendet, die im GCG- Software- Paket (Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA) enthalten sind.

Die oben in Prozent angegebenen Sequenzidentitätswerte wurden mit dem Programm GAP über den gesamten Sequenzbereich mit folgenden Einstellungen ermittelt: Gap Weight: 50, Length Weight: 3, Average Match: 10000 und Average Mismatch: 0,000.

Mit dem Begriff Komplementarität wird die Fähigkeit eines Nukleinsäuremoleküls beschrieben, mit einem anderen Nukleinsäuremolekül aufgrund von

Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zu hybridisieren. Der Fachmann weiß, dass zwei Nukleinsäuremoleküle nicht über eine 100-prozentige Komplementarität verfügen müssen, um miteinander hybridisieren zu können. Bevorzugt ist eine Nukleinsäuresequenz, die mit einer anderen Nukleinsäuresequenz hybridisieren soll, zu dieser zu mindestens 40%, zu mindestens 50%, zu mindestens 60%, bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, ebenfalls besonders bevorzugt zu mindestens 90%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 95% und am meisten bevorzugt zu mindestens 98 bzw. 100% komplementär.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz kann die Suppression der Expression der Nukleinsäuresequenz eines Pilzes durch unterschiedliche Strategien erreicht werden. Die Expression der Nukleinsäuresequenz eines Pilzes kann in transgenen Pflanzen z. B. durch "silencing" im Wesentlichen unterdrückt werden. Beim silencing wird eine

Nukleinsäuresequenz, die homolog zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes und/oder dazu komplementär ist, auf die Pflanze übertragen. Um sicherzustellen, dass die Pflanzen für die übertragenen Nukleinsäuren transgen sind, wird die zu übertragende Nukleinsäure in der Regel durch einen Vektor, wie z. B. ein Plasmid auf die Pflanze übertragen, der in der Lage ist, sich innerhalb der Pflanzenzelle stabil zu replizieren oder die übertragene Nukleinsäure in das pflanzliche Genom zu integrieren.

Besonders bevorzugt kann für das silencing von Nukleinsäuresequenzen eines Pilzes das RNAi- Verfahren verwendet werden. Dabei wird ein Vektor auf die Pflanzenzelle übertragen, der in 5'-3'-Richtung die folgenden Elemente umfasst: einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor; operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die die Antisense- Sequenz einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes oder Teile davon umfasst; ein Intron umfassend Spleiß donor- und Spleißakzeptor Sequenzen; eine DNA- Sequenz, die die Sense- Sequenz der Nukleinsäuresequenz eines Pilzes oder Teile davon umfasst; sowie eine Terminationssequenz. Die Position der Antisense- und Sense- Sequenzen im Vektor kann natürlich vertauscht werden.

Werden solche Vektoren stabil auf Pflanzenzellen übertragen, entsteht bei der Transkription dieser Vektoren zunächst eine prä- mRNA, die aus einem ersten Exon, das die Antisense- Sequenz einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes oder Teile davon umfasst, einem Intron und einem zweiten Exon, das die Sense- Sequenz einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes oder Teile davon umfasst, besteht. Da durch den Spleiß- Vorgang das Intron entfernt wird, entsteht ein kontinuierliches RNA-Molekül mit Bereichen, die zueinander komplementär sind. Ein solches RNA-Molekül wird eine doppelsträngige Struktur ausbilden (Smith et al. (2000) Nature 407: 319-320).

Solche doppelsträngigen RNA- Moleküle sind in der Lage, durch Induktion des

PTGS -Systems spezifisch die mRNA von bestimmten Pilzproteinen zu silencen, so dass als Folge diese bestimmten Pilzproteine nicht mehr exprimiert werden. Welche Pilzproteine nicht mehr exprimiert werden, wird durch die entsprechende Wahl der Antisense- und Sense- Sequenzen bestimmt. Je nachdem, ob diese Antisense- und Sense- Sequenzen eine Sequenz umfassen, die für ein bestimmtes Gen spezifisch ist, oder Sequenzen umfassen, die in mehreren, für verschiedene Pilzproteine kodierenden Genen vorkommen, ist es daher möglich, entweder nur ein Pilzgen oder eine Vielzahl von Pilzgenen gleichzeitig zu silencen. Die für ein bestimmtes Protein charakteristischen Sequenzen können durch Sequenzhomologieprogramme, die z.B. unter http://www.ncbinlm.nih.gov/BLAST/ erhältlich sind, bestimmt werden. Das Auffinden von Protein- charakteristischen Sequenzen gehört dabei zum üblichen Wissen eines Fachmanns. Ebenso können mit diesen Programmen Nukleinsäuresequenzen ausgewählt werden, die Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen mehrere Pilzpathogene vermitteln. Zu diesem Zweck können Nukleinsäuresequenzen aus verschiedenen Pilzpathogenen miteinander verglichen und die zwischen den Pathogenen konservierten Sequenzabschnitte identifiziert werden, die dann zur Herstellung der transgenen Pflanzen nach dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, um mit Hilfe einer

Nukleinsäuresequenz eine erhöhte Resistenz gegen mehrere Pilzpathogene in der Pflanze zu vermitteln.

Der Fachmann weiß ebenfalls, dass verschiedene Vektoren für das RNAi- Verfahren bzw. PTGS eingesetzt werden können. Solche Vektoren können z. B. so gebaut sein, dass die Sense- und Antisense- Sequenzen jeweils von einem U6-Promotor ausgehend transkribiert werden, in der Zelle hybridisieren und das PTGS -System induzieren (Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-448; Miyagishi et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 497-500; Lee et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 500-505). Bei anderen Vektoren sind die Sense- und Antisense- Sequenzen durch eine "loop"-

Sequenz verbunden und werden von einem humanen RNAse P RNA Hl -Promo tor transkribiert. Durch Rückfaltung des "loop" können die Sense- und Antisense- Sequenzen hybridisieren, doppelsträngige RNA ausbilden und das PTGS -System induzieren (Tuschl (2002) vide supra; Paul et al. (2002) Nat. Biotechnol. 20: 505- 508; Paddison et al. (2002) Genes Dev. 16(8): 948-958; Brummelkamp et al. (2002) Science 296: 550-553).

Bei einer anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen die zur Übertragung der Nukleinsäuren verwendeten Vektoren in 5'- 3'- Orientierung einen Promotor, operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die die Antisense- Sequenz der Nukleinsäuresequenz der für das Pilzgen oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst, sowie eine Terminationssequenz. Bei der Transkription dieser Sequenz in Pflanzenzellen entsteht ein RNA- Molekül, dessen Sequenz komplementär zu der für das Pilzgen oder Teile davon kodierenden Sequenz ist. Durch Hybridisierung der Antisense- Sequenz mit mRNA- Sequenzen von Pilzgenen in vivo kann daher die Expression von Pilzgenen in Pflanzenzellen unterdrückt werden.

In einer weiteren Ausführungsform umfassen die Vektoren, die zur Übertragung der Nukleinsäuren verwendet werden, in 5'- 3'- Orientierung einen Promotor, operativ daran gebunden die identische oder homologe Sequenz der für das Pilzgen oder Teile davon kodierenden Sequenz, die zu sich selbst komplementäre Abschnitte enthält, sowie eine Terminationssequenz. Bei der Transkription dieser Vektoren in der Pflanzenzelle entstehen RNA-Moleküle, die über Sequenzbereiche verfügen, die mit sich selbst hybridisieren können. Dadurch können in der Zelle doppelsträngige RNA- Moleküle auftreten, die das PTGS -Systems induzieren, was dann dazu führt, dass die mRNA der entsprechenden Pilzgene spezifisch abgebaut wird. Dieses auch als Co- Suppression bezeichnete Verfahren zum Silencing von pflanzlichen Proteinen setzt voraus, dass die mRNA des zu supprimierenden Pilzgens über Abschnitte verfügt, die zueinander komplementär sind. Solche Abschnitte können vom Fachmann durch einfache visuelle Inspektion der jeweiligen DNA- Sequenz oder durch entsprechende Sequenzprogramme wie z. B. DNAS tar der DNASTAR Inc., Madison, USA, identifiziert werden.

Bei einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zur Übertragung der Nukleinsäuren auf die Pflanzenzellen Vektoren verwendet, die in 5'- 3'- Orientierung einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor, operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die für ein Ribozym kodiert, das spezifisch die mRNA von Pilzgenen erkennt, sowie eine Terminationssequenz umfassen. Dem Fachmann ist bekannt, wie Ribozyme, die eine gegen eine bestimmte mRNA gerichtete Endonuklease- Aktivität besitzen, hergestellt werden können. Im Detail ist dies z. B. in Steinecke et al. (1992) EMBO J. 11: 1525 - 1530 beschrieben. Im Rahmen dieser Erfindung sind mit dem Begriff "Ribozym" auch solche RNA- Sequenzen gemeint, die neben dem eigentlichen Ribozym noch Führungssequenzen umfassen, die zu der mRNA der Pilzgene oder Teilen davon komplementär sind und so das mRNA- spezifische Ribozym noch gezielter zum mRNA-Substrat des Ribozyms führen.

Eine weitere Alternative zur Herstellung von transgenen Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz bietet die Übertragung von Nukleinsäuren durch Vektoren, die in 5'-3'- Orientierung einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor, operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die Antisense- Sequenzen der für das Pilzgen oder Teile davon kodierenden Sequenz sowie die für RNAse P kodierende Sequenz umfasst, sowie eine Terminationssequenz umfassen. Bei der Transkription solcher Vektoren entstehen in der Zelle RNA-Moleküle, die über eine Führungssequenz (die Antisense- Sequenz) verfügen, welche die RNAse P zur mRNA des Pilzgens führt, wodurch die Spaltung der mRNA durch RNAse P bewirkt wird (US -Patent Nr.

5,168,053). Vorzugsweise umfasst die Führungssequenz 10 bis 15 Nukleotide, die zur DNA- Sequenz des Pilzgens komplementär sind, und eine 3'-NCCA Nukleotidsequenz, wobei N vorzugsweise ein Purin ist. Die Transkripte der externen Führungssequenz binden an die Ziel-mRNA über die Ausbildung von Basenpaaren, was die Spaltung der mRNA durch die RNAse P am Nukleotid 5' von der gepaarten Region ermöglicht. Eine solche gespaltene mRNA kann nicht in ein funktionsfähiges Protein translatiert werden.

Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Nukleinsäuresequenzen gesprochen wird, die für Pilzgene oder Teile davon kodieren, dann sind damit sowohl die komplette kodierende DNA- Sequenz des jeweiligen Pilzgens als auch die komplette mRNA- Sequenz bzw. die jeweiligen Teilbereiche gemeint. Da einige der oben erwähnten Verfahren zur Herstellung von transgenen Pflanzen, die in der Lage sind, die Expression des Pilzgens signifikant zu reduzieren, darauf beruhen, dass eine spezifische Hybridisierung zwischen der endogenen mRNA des Pilzgens und den Sequenzen, die bei der Transkription der oben erwähnten Vektoren entstehen, stattfindet (wie z. B. der Antisense-Strategie), weiß der Fachmann, dass die übertragenen Nukleinsäuren nicht immer die gesamte für das Pilzgen kodierende Sequenz, unabhängig davon, ob es sich um die Sense- oder Antisense- Sequenz handelt, enthalten müssen. Vielmehr können für eine spezifische Hybridisierung bereits relativ kurze Bereiche der für Pilzgene kodierenden Sequenzen ausreichend für ein effizientes Silencing sein.

Bei Vektoren, deren Transkription zu doppelsträngigen RNA- Molekülen führt, reicht es aus, wenn die Sequenzen, die den Sequenzbereichen der mRNA eines Pilzgens entsprechen, um die 25 Nukleotide umfassen. Die übertragenen Sequenzen umfassen in der Regel zwischen 20-5000 Nukleotide, bevorzugt zwischen 100-2000 Nukleotide, besonders bevorzugt um die 250- 1000 und 400-700 Nukleotide. Es können aber auch Sequenzen verwendet werden, die zwischen 25-500 Nukleotide, zwischen 25-300 Nukleotide, zwischen 25-150 Nukleotide und zwischen 25-100 Nukleotide umfassen. Der Fachmann weiß, dass beim RNAi bzw. PTGS die zur Ausbildung von doppel- strängigen RNA- Molekülen verwendeten Sense- und Antisense-RNAs auch um die 21-23 Nukleotide mit einem charakteristischen 3'-Überhang umfassen können (Tuschl (2002) Nat. Biotechnol. 20: 446-448).

Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindung von Sense- Sequenzen gesprochen wird, dann sind damit diejenigen Sequenzen gemeint, die dem kodierenden Strang der Pilzgene entsprechen oder Teile davon umfassen. Solche Sequenzen müssen jedoch nicht zu 100% identisch mit den interessierenden Pilzgenen sein. Es genügt, wenn die Sequenzen zu den Pilzgenen derart ausreichend ähnlich sind, dass ihre Expression in pflanzlichen Zellen zu einem effizienten und spezifischen Silencing der Pilzgene in der Zelle z. B. durch RNA interference oder Co-Suppression führt. Es sollte ausreichen, wenn diese Sequenzen zu mindestens 50% identisch sind, bevorzugt zu mindestens 60%, besonders bevorzugt zu mindestens 70%, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% und am meisten bevorzugt zu mindestens 95% identisch sind. Bei solchen Identitätsgraden wird erfindungsgemäß davon gesprochen, dass die Sequenzen zueinander homolog sind bzw. eine Homologie aufweisen. Die Abweichungen zu der für Pilzgene oder Teile davon kodierenden Sequenz können dabei durch Deletion, Addition, Substitution und/oder Insertion entstanden sein. Dem Fachmann ist natürlich klar, dass mit abnehmender Identität die Wahrscheinlichkeit steigt, dass mehrere Pilzgene gesilenct werden. Sequenzen, deren Identitäts- bzw. Homologiegrad so gering ist, dass die Expression endogener Proteine der transgenen Pflanze gesilenct wird, sind für das erfindungsgemäße Verfahren nicht ausreichend spezifisch und nicht geeignet, da sie in den Stoffwechsel der Pflanze eingreifen können. Wenn entsprechend von Antisense- Sequenzen gesprochen wird, dann sind erfindungsgemäß diejenigen Sequenzen gemeint, die dem nicht kodierenden DNA- Strang der Pilzgene entsprechen. Auch diese Sequenzen müssen natürlich nicht hundertprozentig identisch mit der Sequenz des nicht- kodierenden DNA- Strangs des jeweiligen Pilzgens sein, sondern können die oben genannten Homologiegrade aufweisen. Dieser Sachverhalt kommt auch in dem Umstand zum Ausdruck, dass Antisense- Sequenzen, die definitionsgemäß zu der mRNA eines Gens komplementär sind, nicht zu 100% komplementär zu dieser mRNA sein müssen. Sie können z. B. auch zu mindestens 50% komplementär, bevorzugt zu mindestens 60% komplementär, besonders bevorzugt zu mindestens 70% komplementär, weiterhin besonders bevorzugt zu mindestens 80% komplementär, insbesondere bevorzugt zu mindestens 90% komplementär und am meisten bevorzugt zu mindestens 95%, 98% und/oder 99% komplementär sein. Wie oben ausgeführt, ist es ausreichend, wenn die Antisense- Sequenzen in der Lage sind, spezifisch mit der mRNA des jeweiligen interessierenden Pilzgens, aber nicht mit der endogenen mRNA der transgenen Pflanze, zu hybridisieren. Die Hybridisierung einer Antisense- Sequenz mit einer mRNA- Sequenz des Pilzes findet typischerweise in vivo unter zellulären Bedingungen oder in vitro statt.

Insbesondere umfasst die Nukleinsäuresequenz des Pilzes, deren Expression durch Interaktion mit der in der Pflanze transkribierten Nukleinsäuresequenz gehemmt wird, eine Sequenz mit der SEQ ID Nr. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 oder 23 und/oder DNA-Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzeπ, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer solchen Nukleotidsequenz hybridisieren. Am meisten bevorzugt werden Sequenzen mit den SEQ ID Nrn. 8, 9, 10, 11, 24, 25, 26, 27, 28 oder 29 verwendet, um RNAi- Kon strukte herzustellen, die, wenn sie in der Pflanze transkribiert werden, die Expression des Pilzgens hemmen.

Der Begriff "Hybridisierung unter stringenten Bedingungen" bedeutet im Zusammenhang dieser Erfindung, dass die Hybridisierung in vitro unter Bedingungen durchgeführt wird, die stringent genug sind, um eine spezifische Hybridisierung zu gewährleisten. Stringente in vzYro-Hybridisierungsbedingungen sind dem Fachmann bekannt und können der Literatur entnommen werden (z. B. Sambrook und Russell (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3. Auflage, CoId Spring Harbour Laboratory Press, CoId Spring Harbour, NY). Der Begriff "spezifische Hybridisierung" bezieht sich auf den Umstand, dass ein Molekül unter stringenten Bedingungen präferentiell an eine bestimmte Nukleinsäuresequenz, die Zielsequenz, bindet, wenn diese Teil einer komplexen Mischung von z. B. DNA- oder RNA-Molekülen ist, aber nicht oder zumindest wesentlich reduziert an andere Sequenzen.

Stringente Bedingungen sind von den Umständen abhängig. Längere Sequenzen hybridisieren spezifisch bei höheren Temperaturen. Generell werden stringente Bedingungen so ausgewählt, dass die Hybridisierungstemperatur circa 5⁰C unter dem Schmelzpunkt (T_m) für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und einem definierten pH liegt. Die T_m ist die Temperatur (bei einem definierten pH- Wert, einer definierten Ionenstärke und einer definierten Nukleinsäurekonzentration), bei der 50% der zu der Zielsequenz komplementären Moleküle zu der Zielsequenz im Gleichgewichtszustand hybridisieren. Typischerweise sind stringente

Bedingungen solche, bei denen die Salzkonzentration mindestens ungefähr 0,01 bis 1,0 M Natriumionenkonzentration (oder Konzentration eines anderen Salzes) bei einem pH zwischen 7,0 und 8,3 und die Temperatur mindestens 3O⁰C für kurze Moleküle (d.h. z. B. 10 bis 50 Nukleotide) beträgt. Zusätzlich können stringente Bedingungen die Zugabe von Stoffen wie z. B. Formamid, das die Hybride destabilisiert, umfassen. Bei einer Hybridisierung unter stringenten Bedingungen, wie hier verwendet, bleiben gewöhnlich Nukleotidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, aneinander hybridisiert. Vorzugsweise sind die stringenten Bedingungen derart gewählt, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, bevorzugt mindestens etwa 70% und besonders bevorzugt mindestens etwa 75% oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Ein bevorzugtes, nicht- einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind Hybridisierungen in 6 x

Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45⁰C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1% SDS bei 50 bis 65⁰C. Die Temperatur schwankt beispielsweise unter Standardhybridisierungsbedingungen je nach dem Typ der Nukleinsäure zwischen 42⁰C und 58⁰C in wässrigem Puffer mit einer Konzentration von 0,1 bis 5 x SSC (pH 7,2).

Falls organisches Lösungsmittel, z. B. 50% Formamid, im oben genannten Puffer vorliegt, liegt die Temperatur unter Standardbedingungen bei etwa 42⁰C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA: DNA- Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 2O⁰C bis 45⁰C, vorzugsweise 3O⁰C bis 45⁰C. Vorzugsweise sind die Hybridisierungsbedingungen für DNA:RNA-Hybride zum Beispiel 0,1 x SSC und 3O⁰C bis 55⁰C, vorzugsweise zwischen 45⁰C bis 55⁰C. Die vorstehend genannten Hybridisierungstemperaturen sind beispielsweise für eine Nukleinsäure mit etwa 100 Basenpaaren Länge und einem G/C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid bestimmt. Der Fachmann weiß, wie die erforderlichen

Hybridisierungsbedingungen anhand von Lehrbüchern, wie den vorstehend erwähnten oder den folgenden Lehrbüchern Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), Harnes und Higgins (Hrsgb.) 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (Hrsgb.) 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, bestimmt werden können.

Typische Hybridisierungs- und Waschpuffer haben z. B. folgende Zusammensetzung:

Prähybridisierungslösung:

0,5 % SDS

5x SSC

50 mM NaPO₄, pH 6,8

0,1% Na-Pyrophosphat

5x Denhardt's Lösung

100 μg/ml Lachssperma- DNA

Hybridisierungslösung: Prähybridisierungslsg.

IxIO⁶ cpm/ml Sonde (5-10 min 95⁰C)

2Ox SSC: 3 M NaCl

0,3 M Natriumeitrat ad pH 7 mit HCl

5Ox Denhardt's Reagenz 5 g Ficoll

5 g Polyvinylpyrrolidon 5 g Rinderserumalbumin ad 500 ml A. dest.

Eine typische Verfahrensweise für die Hybridisierung sieht folgendermaßen aus: Optional: Blot 30 min in Ix SSC/ 0, 1 % SDS bei 65⁰C waschen

Prähybridisierung: mindestens 2 h bei 50-55⁰C

Hybridisierung: über Nacht bei 55-6O⁰C

Waschen: 05 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybndisierungstemp

30 min 2x SSC/ 0,1% SDS Hybridisierungstemp

30 min Ix SSC/ 0,1% SDS Hybndisierungstemp

45 min 0,2x SSC/ 0,l% SDS 65⁰C

5 min 0,Ix SSC Raumtemperatur

Der Fachmann weiß, dass die genannten Lösungen und das dargestellte Protokoll je nach Anwendung modifiziert werden können oder müssen.

Die im Verfahren verwendeten Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung molekularbiologischer Standardtechniken und der hier bereit gestellten Sequenzinformation isoliert werden. Auch können mit Hilfe von Vergleichsalgorithmen, wie sie z. B. auf der NCBI-Homepage unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov zu finden sind, beispielsweise eine homologe Sequenz oder homologe, konservierte Sequenzbereiche auf DNA- oder Aminosäureebene identifiziert werden. Wesentliche Teile dieser Sequenz oder die gesamte homologe Sequenz können als Hybridisierungssonde unter Verwendung von Standardhybridisierungstechniken (wie z. B. beschrieben in Sambrook et al., vide supra) zur Isolierung weiterer im Verfahren nützlicher Nukleinsäuresequenzen aus anderen Organismen durch das Screening von cDNA- und/oder genomischen Banken verwendet werden. Überdies lässt sich ein Nukleinsäuremolekül durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei Oligonukleotidprimer auf der Basis der in Datenbanken angegebenen Sequenzen oder von Teilen davon verwendet werden (z. B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend die vollständige Sequenz oder einen Teil davon, durch Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz erstellt worden sind). Zum Beispiel lässt sich mRNA aus Zellen isolieren (z. B. durch das Guanidiniumthiocyanat- Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294 - 5299) und daraus mittels reverser Transkriptase (z. B. Moloney- MLV- Reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku Amerika, Inc., St. Petersburg, FL) cDNA herstellen. Eine Nukleinsäure kann unter Verwendung von cDNA oder alternativ von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern mittels Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA- Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die sich zur Amplifikation der gewünschten Sequenz eignen, können durch Standardsyntheseverfahren, beispielsweise mit einem automatischen DNA- Synthesegerät, hergestellt werden.

In einer Ausführungsform werden mehrere rekombinante Nukleinsäuremoleküle umfassend jeweils eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon interagiert, so dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die

Pflanze eingebracht. Dadurch kann die Expression mehrerer Pilzgene gleichzeitig in der Pflanze gehemmt werden und der transgenen Pflanze eine erhöhte Resistenz gegen verschiedene Pilzpathogene vermittelt werden. Die Vektoren, die zum Silencing von Pilzgenen verwendet werden, umfassen neben der zu übertragenden Nukleinsäuresequenz weitere regulatorische Elemente. Welche konkreten regulatorischen Elemente diese Vektoren enthalten müssen, hängt dabei jeweils von der Methode ab, die mit diesen Vektoren durchgeführt werden soll. Über welche regulatorischen Elemente und auch anderen Elemente diese Vektoren verfügen müssen, ist dem Fachmann, der mit den verschiedenen oben erwähnten Verfahren zum Herstellen von transgenen Pflanzen, in denen die Expression eines Proteins unterbunden wird, vertraut ist, bekannt.

Typischerweise handelt es sich bei den regulatorischen Elementen, die die Vektoren enthalten, um solche, die die Transkription und, falls erwünscht, Translation in der Pflanzenzelle gewährleisten.

So können die zu übertragenden Nukleinsäuresequenzen beispielsweise unter Kontrolle von in Pflanzenzellen funktionellen Promotoren stehen. Bei diesen Promotoren kann es sich um konstitutive, aber auch induzierbare oder gewebe- bzw. entwicklungsspezifische Promotoren handeln.

Typischerweise wird man als Promotor für Vektoren den konstitutiven 35S-Promotor verwenden. Darüber hinaus können natürlich auch weitere Promotoren verwendet werden, die aus unterschiedlichen Quellen wie z. B. aus Pflanzen oder Pflanzen viren erhalten werden und für die Expression von Genen in Pflanzen geeignet sind. Die Auswahl des Promotors wie auch anderer regulatorischer Sequenzen bestimmen dabei das räumliche und zeitliche Expressionsmuster und damit auch das Silencing der Pilzgene in transgenen Pflanzen. Neben weiteren konstitutiven Promotoren wie beispielsweise dem Actin Promotor (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2:163-171) und dem Ubiquitin Promotor (Binet et al. (1991) Plant Science 79:87-94) kommen als gewebespezifische Promo toren die Promotoren der Phosphoenolpyruvat-Carboxylase aus Mais (Hudspeth et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:579) oder der Fructose-l,6-bisphosphatase aus Kartoffel

(WO 98/18940), die blattspezifische Expression vermitteln, in Frage. Es können auch Verwundungs-, Licht- oder Pathogen- induzierte sowie andere entwicklungsabhängige Promotoren oder Kontroll Sequenzen verwendet werden (Xu et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:573-588; Logemann et al. (1989) Plant Cell 1:151-158; Stockhaus et al. (1989) Plant Cell 1:805-813; Puente et aL (1996) EMBO J. 15:3732- 3734; Gough et al. (1995) Mol. Gen. Genet. 247:323-337). Eine Zusammenfassung von verwendbaren Kontrollsequenzen findet sich z. B. in Zuo et al. (2000) Curr. Opin. Biotech. 11:146-151.

Geeignete Promotoren umfassen auch Promotoren, die eine Expression lediglich in photo synthetisch aktiven Geweben garantieren, wie z. B. der ST- LSl- Promo tor (Stockhaus et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7943-7947; Stockhaus et al. (1989) EMBO J. 8:2445-2451). Ebenfalls verwendet werden können Promotoren, die während der Pflanzentransformation, der Pflanzenregeneration oder bestimmten Stadien dieser Prozesse aktiv sind, wie z. B. zellteilungsspezifische Promotoren wie der Histon H3-Promotor (Kapros et al. (1993) In Vitro Cell Dev. Biol. Plant 29:27- 32) oder das chemisch induzierbare Tet-Repressor- System (Gatz et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237). Weitere geeignete Promotoren können der Literatur, z. B. Ward (1993, Plant Mol. Biol. 22:361-366), entnommen werden. Gleiches gilt für induzierbare und zell- bzw. gewebespezifische Promotoren, wie Meristemspezifische Promotoren, die ebenfalls in der Literatur beschrieben worden sind und im Rahmen der Erfindung ebenfalls geeignet sind. Weitere induzierbare Promotoren umfassen pilzinduzierbare Promotoren wie den GAFP-2 Promotor (Sa et al. (2003) Plant Cell Rep. 22:79-84), der z. B. durch den Pilz Trichoderma viride induziert wird, oder den PAL- Promo tor, der durch Inokulation mit Pyricularia oryzae induziert wird (Wang et al. (2004) Plant Cell Rep. 22:513-518).

Darüber hinaus ist der Durchschnittsfachmann in der Lage, mittels Routine metho den weitere geeignete Promotoren zu isolieren. So kann der Fachmann mit Hilfe gängiger molekularbiologischer Methoden, z. B. Hybridisierungsexperimenten oder DNA- Protein-Bindungsstudien, Speicherorgan- spezifische regulatorische

Nukleinsäurelemente identifizieren. Dabei wird z. B. in einem ersten Schritt aus Speicherorgangewebe des gewünschten Organismus, aus dem die regulatorischen Sequenzen isoliert werden sollen, die gesamte poly (A)⁺- RNA isoliert und eine cDNA-Bank angelegt. In einem zweiten Schritt werden mit Hilfe von cDNA- Klonen, die auf poly(A)⁺-RNA-Molekülen aus einem Nicht- Speicherorgangewebe basieren, aus der ersten Bank mittels Hybridisierung diejenigen Klone identifiziert, deren korrespondierende poly(A)⁺-RNA-Moleküle lediglich im Gewebe des Speicherorgans akkumulieren. Anschließend werden mit Hilfe dieser so identifizierten cDNAs Promo toren isoliert, die über Speicherorgan- spezifische regulatorische Elemente verfügen. Dem Fachmann stehen darüber hinaus weitere auf PCR basierende Methoden für die Isolierung geeigneter Speicherorgan- spezifischer Promotoren zur Verfügung.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich um den Promotor des Klasse I Patatin-Gens B33 aus Kartoffel. Weiterhin bevorzugte Promotoren sind solche, die insbesondere in Früchten aktiv sind. Hierzu zählen beispielsweise der Promotor eines Poly galacturonase- Gens, z. B. aus Tomate, der während der Reife von Tomatenfrüchten Expression vermittelt (Nicholass et al. (1995) Plant Mol. Biol. 28:423-435), der Promotor einer ACC-Oxidase, z. B. aus Apfel, der in transgenen Tomaten Reife- und Fruchtspezifität vermittelt (Atkinson et al. (1998) Plant Mol. Biol. 38:449-460), oder der 2A11-Promotor aus Tomate (van Haaren et al. (1991) Plant Mol. Biol. 17:615-630).

Auch im Fall von Frucht- spezifischen Promotoren kann der Fachmann weitere geeignete Promotoren der Literatur entnehmen oder, wie oben für Speicherorganspezifische Promotoren beschrieben, mittels Routineverfahren isolieren.

Der Fachmann weiß, dass die Verwendung von induzierbaren Promotoren die Herstellung von Pflanzen und Pflanzenzellen erlaubt, die die erfindungsgemäßen Sequenzen nur transient exprimieren und damit transient silencen. Eine solche transiente Expression erlaubt die Herstellung von Pflanzen, die nur eine transient erhöhte Pilzresistenz zeigen. Solch eine transient erhöhte Resistenz kann z. B. dann wünschenswert sein, wenn die Gefahr einer Pilzkontamination droht und die

Pflanzen deswegen nur für einen bestimmten Zeitraum resistent gegen den Pilz sein müssen. Weitere Situationen, in denen eine transiente Resistenz wünschenswert ist, sind dem Fachmann bekannt. Dem Fachmann ist darüber hinaus auch bekannt, dass er durch die Verwendung nicht stabil in Pflanzenzellen replizierender Vektoren, die die entsprechenden Sequenzen zum Silencing von Pilzgenen tragen, eine transiente Expression und damit ein transientes Silencing und eine transiente Resistenz erzielen kann.

Die erfindungsgemäßen Vektoren können als regulatorische Elemente auch noch z. B. Enhancer- Elemente umfassen, ferner können sie Resistenzgene,

Replikationssignale und weitere DNA- Bereiche enthalten, die eine Propagation der Vektoren in Bakterien wie z. B. E. coli ermöglichen. Die regulatorischen Elemente umfassen auch Sequenzen, die eine Stabilisierung der Vektoren in den Wirtszellen bewirken. Insbesondere umfassen solche regulatorischen Elemente Sequenzen, die eine stabile Integration des Vektors in das Wirtsgenom der Pflanze oder eine autonome Replikation des Vektors in den Pflanzenzellen ermöglichen. Solche regulatorischen Elemente sind dem Fachmann bekannt.

Bei den so genannten Terminationssequenzen handelt es sich um Sequenzen, die sicherstellen, dass die Transkription bzw. die Translation ordnungsgemäß beendet wird. Sollen die übertragenen Nukleinsäuren translatiert werden, handelt es sich bei ihnen typischerweise um Stopcodons und entsprechende regulatorische Sequenzen; sollen die übertragenen Nukleinsäuren nur transkribiert werden, handelt es sich in der Regel um poly- A- Sequenzen.

Erfindungsgemäß sind mit Vektoren Plasmide, Cosmide, Viren und andere in der Gentechnik gängige Vektoren gemeint, mit denen Nukleinsäuremoleküle auf Pflanzen bzw. Pflanzenzellen übertragen werden können.

Zur Vorbereitung der Einführung fremder Gene in höhere Pflanzen bzw. deren Zellen stehen eine große Anzahl von Klonierungsvektoren zur Verfügung, die ein Replikations signal für E. coli und ein Markergen zur Selektion transformierter Bakterienzellen enthalten. Beispiele für derartige Vektoren sind pBR322, pUC- Serien, M 13mp- Serien, pACYC184 usw. Die gewünschte Sequenz kann an einer passenden Restriktionsschnittstelle in den Vektor eingeführt werden. Das erhaltende Plasmid wird für die Transformation von E. coli- Zellen verwendet. Transformierte E. coli- Zellen werden in einem geeigneten Medium gezüchtet und anschließend geerntet und lysiert. Das Plasmid wird wiedergewonnen. Als Analysemethode zur Charakterisierung der gewonnenen Plasmid- DNA werden im Allgemeinen Restriktions analysen, Gelelektrophoresen und weitere biochemisch- molekularbiologische Methoden eingesetzt. Nach jeder Manipulation kann die Plasmid-DNA gespalten und gewonnene DNA- Fragmente können mit anderen DNA- Sequenzen verknüpft werden. Jede Plasmid- DNA- Sequenz kann in das gleiche oder andere Plasmide kloniert werden. Standardverfahren zur Klonierung können Sambrook et al., 2001 (Molecular cloning: A laboratory manual, 3rd edition, CoId Spring Harbor Laboratory Press) entnommen werden.

Für die Einführung von DNA in eine pflanzliche Wirtszelle steht eine Vielzahl bekannter Techniken zur Verfügung, wobei der Fachmann die jeweils geeignete Methode ohne Schwierigkeiten ermitteln kann. Diese Techniken umfassen die Transformation pflanzlicher Zellen mit T-DNA unter Verwendung von Agrobacterium tumefaciens oder Ag robacterium rhizo genes als Transformationsmittel, die Fusion von Protoplasten, den direkten Gentransfer isolierter DNA in Protoplasten, die Elektroporation von DNA, die Einbringung von DNA mittels der biolistischen Methode sowie weitere Möglichkeiten. Dabei können sowohl stabile als auch transiente Transformanten erzeugt werden.

Bei der Injektion und Elektroporation von DNA in Pflanzenzellen werden per se keine speziellen Anforderungen an die verwendeten Plasmide gestellt. Ähnliches gilt für den direkten Gentransfer. Es können einfache Plasmide wie beispielsweise pUC- Derivate verwendet werden. Sollen aber aus derartig transformierten Zellen ganze Pflanzen regeneriert werden, ist die Anwesenheit eines selektierbaren Markergens notwendig. Dem Fachmann sind die gängigen Selektionsmarker bekannt und es stellt für ihn kein Problem dar, einen geeigneten Marker auszuwählen. Gebräuchliche Seklektionsmarker sind solche, die den transformierten Pflanzenzellen Resistenz gegenüber einem Biozid oder einem Antibiotikum wie Kanamycin, G418,

Bleomycin, Hygromycin, Methotrexat, Glyphosat, Streptomycin, Sulfonyl- Harnstoff, Gentamycin oder Phosphinotricin und dergleichen vermitteln. Je nach Einführungsmethode gewünschter Gene in die Pflanzenzelle können weitere DNA- Sequenzen erforderlich sein. Werden beispielsweise für die Transformation der Pflanzenzelle das Ti- oder Ri- Plasmid verwendet, so muss mindestens die rechte Begrenzung, häufig jedoch die rechte und linke Begrenzung der im Ti- und Ri- Plasmid enthaltenen T-DNA als Flankenbereich mit den einzuführenden Genen verbunden werden.

Werden für die Transformationen Agrobakterien verwendet, muss die einzuführende DNA in spezielle Plasmide kloniert werden, und zwar entweder in einen intermediären oder in einen binären Vektor. Die intermediären Vektoren können aufgrund von Sequenzen, die homolog zu Sequenzen in der T-DNA sind, durch homologe Rekombination in das Ti- oder Ri- Plasmid der Agrobakterien integriert werden. Dieses enthält außerdem die für den Transfer der T-DNA notwendige vir- Region. Intermediäre Vektoren können nicht in Agrobakterien replizieren. Mittels eines Helferplasmids kann der intermediäre Vektor auf Agrobacterium tumefaciens übertragen werden (Konjugation). Binäre Vektoren können sowohl in E. coli als auch in Agrobakterien replizieren. Sie enthalten ein Selektionsmarker-Gen und einen Linker oder PoIy linker, welche von der rechten und linken T- DNA- Grenzregion eingerahmt werden. Sie können direkt in die Agrobakterien transformiert werden (Holsters et al. (1978) Molecular and General Genetics 163: 181-187). Das als Wirtszelle dienende Agrobakterium soll ein Plasmid, das eine vir- Region trägt, enthalten. Die vir- Region ist für den Transfer der T-DNA in die Pflanzenzelle notwendig. Zusätzlich kann T-DNA vorhanden sein. Das derartig transformierte Agrobakterium wird zur Transformation von Pflanzenzellen verwendet.

Die Verwendung von T-DNA für die Transformation von Pflanzenzelle ist intensiv untersucht und ausreichend in EP 120 515 beschrieben worden. Für den Transfer der DNA in die Pflanzenzelle können Pflanzen- Explantate zweckmäßigerweise mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kultiviert werden. Aus dem infizierten Pflanzenmaterial (beispielsweise Blattstücke, Stengelsegmente, Wurzeln, aber auch Protoplasten oder Suspensions-kultivierte Pflanzenzellen) können dann in einem geeignetem Medium, welches Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierter Zellen enthalten kann, wieder ganze Pflanzen regeneriert werden. Die Regeneration der Pflanzen erfolgt nach üblichen Regenerationsmethoden unter Verwendung bekannter Nährmedien. Die so erhaltenen Pflanzen bzw. Pflanzenzellen können dann auf Anwesenheit der eingeführten DNA untersucht werden.

Andere Möglichkeiten der Einführung fremder DNA unter Verwendung des biolistischen Verfahrens oder durch Protoplasten- Transformation sind dem Fachmann bekannt (vgl. L. Willmitzer (1993) Transgenic Plants in: Biotechnology, A Multi- Volume Comprehensive Treatise (Herausgeber: HJ. Rehm et al.), Band 2, 627-659, VCH Weinheim, Deutschland).

Während die Transformation dikotyler Pflanzen bzw. derer Zellen über Ti-Plasmid- Vektorsysteme mit Hilfe von Agrobacterium tumefaciens schon seit längerer Zeit wohl etabliert ist, können mittlerweile auch monokotyle Pflanzen bzw. deren Zellen mittels auf Agrobakterien basierender Vektoren transformiert werden (siehe u.a. Chan et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22: 491-506).

Alternative Systeme zur Transformation von monokotylen Pflanzen bzw. deren Zellen sind die Transformation mittels des biolistischen Ansatzes (Wan und Lemaux (1994) Plant Physiol. 104: 37-48; Vasil et al. (1993) Bio/Technology 11: 1553-1558; Ritala et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24: 317-325; Spencer et al. (1990) Theor. Appl. Genet. 79: 625-631), die Pro toplasten- Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern.

Die transformierten Zellen wachsen innerhalb der Pflanze in der üblichen Weise (siehe auch McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die resultierenden Pflanzen können normal angezogen werden und mit Pflanzen, die die gleiche transformierte Erbanlage oder andere Erbanlagen besitzen, gekreuzt werden. Die daraus entstehenden hybriden Individuen besitzen die entsprechenden phänotypischen Eigenschaften.

Es sollten zwei oder mehrere Generationen angezogen werden, um sicherzustellen, dass das phänotypische Merkmal stabil beibehalten und vererbt wird. Auch sollten Samen geerntet werden, um sicherzustellen, dass der entsprechende Phänotyp oder andere Eigenarten erhalten geblieben sind.

Ebenso können nach üblichen Methoden transgene Linien bestimmt werden, die für die neuen Nukleinsäuremoleküle homozygot sind und ihr phänotypisches Verhalten hinsichtlich einer vorhandenen bzw. nicht vorhandenen Pathogen- Responsivität untersucht und mit dem von hemizygoten Linien verglichen werden.

Selbstverständlich können Pflanzenzellen, die die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle enthalten, auch als Pflanzenzellen (einschließlich Protoplasten, Kalli, Suspensionskulturen und dergleichen) weiterkultiviert werden.

Die oben dargestellten Vektoren können auf Pflanzenzellen auf verschiedene Weise übertragen werden. Ob die Vektoren in linearer oder zirkulärer Form vorliegen müssen, hängt von der jeweiligen Anwendung ab. Dem Fachmann ist bekannt, ob und wann er entsprechende linearisierte Vektoren verwenden kann oder nicht. Erfindungsgemäß umfasst der Begriff transgene Pflanze sowohl die Pflanze in ihrer Gesamtheit, als auch alle Pflanzenteile, in denen die zu Pilzgenen homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenzen transkribiert werden. Bei solchen Pflanzenteilen kann es sich um Pflanzenzellen handeln, um Pflanzensamen, um Blätter, um Blüten und um Pollen. Mit "transgener Pflanze" ist erfindungsgemäß auch das Vermehrungsmaterial von erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen gemeint wie z. B. Samen, Früchte, Stecklinge, Knollen, Wurzelstücke etc., wobei dieses Vermehrungsmaterial ggf. oben beschriebene transgene Pflanzenzellen enthält, sowie transgene Teile dieser Pflanzen wie Protoplasten, Pflanzenzellen und Kalli.

Bei der Herstellung von transgenen Pflanzen bieten sich verschiedene Methoden und Möglichkeiten an, wie bereits oben ausgeführt worden ist. Generell können Pflanzen bzw. Pflanzenzellen mit Hilfe herkömmlicher gentechnologischer Transformationsmethoden derart modifiziert werden, dass die neuen

Nukleinsäuremoleküle in das pflanzliche Genom integriert werden, d.h. dass stabile Transformanten erzeugt werden und die überführten Nukleinsäuremoleküle mit dem pflanzlichen Genom repliziert werden. Je nach dem verwendeten Vektorsystem können erfindungsgemäß auch transgene Pflanzen hergestellt werden, bei denen die zu übertragenden Nukleinsäuren in der Pflanzenzelle bzw. der Pflanze als selbstständig replizierendes System enthalten sind. Die zur Übertragung der Pflanzen verwendeten Vektoren müssen dann entsprechend über DNA- Sequenzen verfügen, die die Replikation von zur Übertragung verwendeten Plasmiden innerhalb der Zelle ermöglichen.

Unter einer transgenen Pflanze bzw. Pflanzenzelle im Sinne der Erfindung ist wie oben ausgeführt zu verstehen, dass die Pflanze Nukleinsäuresequenzen enthält, die natürlicherweise nicht in der Pflanze auftreten, sondern homolog und/oder komplementär zu Teilen des Pilzgenoms sind. Diese Nukleinsäuresequenzen sind nicht in der Lage, mit endogenen Pflanzensequenzen zu interagieren und deren Expression zu beeinflussen.

Beispiele für monokotyle Pflanzen sind Pflanzen, die zu den Gattungen Avena (Hafer), Triticum (Weizen), Seeale (Roggen), Hordeum (Gerste), Oryza (Reis), Panicum, Pennisetum, Setaria, Sorghum (Hirse), Zea (Mais) und dergleichen gehören.

Dikotyle Nutzpflanzen umfassen unter anderem Baumwolle, Leguminosen wie Hülsenfrüchte und insbesondere Alfalfa, Sojabohne, Raps. Canola, Tomate, Zuckerrübe, Kartoffel, Sonnenblume, Zierpflanzen sowie Bäume. Weitere Nutzpflanzen können Obst (insbesondere Äpfel, Birnen, Kirschen, Weintrauben, Citrus, Ananas und Bananen), Ölpalmen, Tee-, Kakao- und Kaffeesträucher, Tabak, Sisal sowie bei Heilpflanzen Rauwolfia und Digitalis umfassen. Besonders bevorzugt sind die Getreide Weizen, Roggen, Hafer, Gerste, Reis, Mais und Hirse, sowie die dikotylen Pflanzen Zuckerrübe, Raps, Soja, Tomate, Kartoffel und Tabak. Weitere Nutzpflanzen können dem US-Patent Nr. 6,137,030 entnommen werden.

Bevorzugte Pflanzen sind Tagetes, Sonnenblume, Arabidopsis, Tabak, Roter Pfeffer, Soja, Tomate, Aubergine, Paprika, Möhre, Kartoffel, Mais, Salate und Kohlarten, Getreide, Alfalfa, Hafer, Gerste, Roggen, Weizen, Triticale, Hirse, Reis, Luzerne, Flachs, Baumwolle, Hanf, Brassicacaeen wie beispielsweise Raps oder Canola, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Nuss- und Weinspezies oder Holzgewächse wie beispielsweise Espe oder Eibe.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen transgenen Pflanzen und der von ihnen abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Teile und transgene Vermehrungsmaterialien zur Herstellung von Nahrungs- und Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung von Pilzgenen, bei denen die Hemmung ihrer Expression in transgenen Pflanzen Pilzresistenz vermittelt, umfassend die Schritte:

(a) Identifizieren geeigneter Zielgene,

(b) Herstellen von RNAi- Konstrukten für diese Zielgene in einem geeigneten Vektor,

(c) Transformieren der RNAi- Konstrukte in geeignete Testpflanzen,

(d) Inokulieren der Testpflanzen mit einem geeigneten Pilz und

(e) Auswerten des Pilzbefalls der Pflanze mit einem geeigneten Auswerteverfahren.

Die mit einem solchen Verfahren identifizierten Pilzgene können zum einen dazu dienen, rekombinante Nukleinsäuremoleküle zu bilden, die die homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenzen enthalten und in einer transgenen Pflanze exprimiert werden können, was wie oben beschrieben zur Erhöhung der Pilzresistenz in der transgenen Pflanze führt. Die mit dem oben beschriebenen Verfahren identifizierten Pilzgene können aber auch als neue Angriffspunkte für Fungizide dienen. Außerdem eignen sich derartig identifizierte Pilzgene auch zur Entwicklung RNA-basierter Medikamente gegen Pilzkrankheiten des Menschen, wie z. B. cutane Mykosen oder Schleimhautmykosen.

Unter "Zielgenen" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung solche Pilzgene verstanden, bei denen eine Aussicht darauf besteht, dass ihre Hemmung zu einer Pilzresistenz führen kann. Die Identifizierung solcher Zielgene kann unter anderem durch Genomanalyse des jeweiligen Pilzgenoms erfolgen. Bevorzugt erfolgt das Identifizieren geeigneter Zielgene durch die Untersuchung zur differentiellen Expression in Pflanzengeweben wie der Epidermis, die mit dem Pilz infiziert wurden oder uninfiziert gelassen wurden. Ebenfalls sollte durch einen geeigneten Sequenzvergleich sicher gestellt werden, dass ein geeignetes Zielgen oder eine dazu homologe Sequenz nicht endogen in der zu verwendenden Pflanze vorkommt, da anderenfalls auch endogen in der Pflanze stattfindende Prozesse gehemmt werden könnten, was unerwünscht ist. Durch einen Sequenzvergleich mit dem Genom anderer Pilzarten als dem im Experiment zur Identifizierung der Zielgene verwendeten Pilz lässt sich herausfinden, ob die Hemmung der Expression des identifizierten Zielgens eine erhöhte Resistenz gegenüber nur einer Pilzart oder einer ganzen Reihe von Pilzarten vermitteln wird.

In einerm "RNAi- Konstrukt" liegen die in Schritt (a) des Verfahrens identifizierten Zielgene in einem rekombinanten Nukleinsäuremolekül vor, das in 5'-3'-Richtung die folgenden Element umfasst: einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor; operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die die Antisense- Sequenz der für das Zielgen oder Teile davon kodierenden Sequenz umfasst; ein Intron umfassend eine Spleißdonor- und eine Spleißakzeptorsequenz; eine DNA- Sequenz, die die Sense- Sequenz, der für das jeweilige Zielgen oder Teile davon kodierenden DNA- Sequenz umfasst; sowie eine Terminationssequenz. Um eine Vielzahl solcher RNAi- Konstrukte in möglichst wenigen Schritten zu bilden, werden die Zielgene bevorzugt nicht durch Klonierung, sondern durch homologe Rekombination, wie sie etwa mit dem GATEWAY^®- System (Invitrogen) oder dem BD Creator™ System (BD Biosciences Clontech Co.) möglich ist, in den Vektor eingeführt. Natürlich eignen sich aber auch die herkömmlichen Klonierungsmethoden wie Restriktionsverdau und anschließende Ligation für das Herstellen der RNAi- Konstrukte, die aber erheblich zeitaufwendiger als die homologe Rekombination sind. Das Transformieren der Testpflanzen mit der RNA- Bibliothek kann durch jede bekannte Transformationsmethode erfolgen, z. B. eignen sich die biolistische Methode, die Agrobacterium- vermittelte Transformation, die Protoplasten- Transformation, die Elektroporation von partiell permeabilisierten Zellen sowie die Einbringung von DNA mittels Glasfasern. Die jeweils am besten geeignete Methode zur Transformation hängt von der verwendeten Testpflanze ab. Bevorzugt werden die Testpflanzen durch die biolistische Transformation transformiert, weil dieser Ansatz besonders schnell und effektiv zu einer Transformation mit einer Vielzahl von verschiedenen rekombinanten Nukleinsäuremolekülen führt.

Die Auswahl geeigneter Testpflanzen hängt von dem zu testenden Pilz ab. Die verwendeten Testpflanzen müssen für diesen verwendeten Pilz empfänglich sein, also als Wirtspflanze für diesen Pilz dienen können, und der Pilzbefall muss sich durch einfache Methoden nachweisen lassen. Bevorzugt handelt es sich bei den Testpflanzen um Weizen- oder Gerste- Pflanzen, die z. B. mit dem Mehltaupilz Blumeria graminis inokuliert werden. Unter "Inokulieren" versteht man das Inkontaktbringen der Pflanze mit dem Pilz, mit dem die Pflanze infiziert werden soll, oder den infektiösen Teilen davon, unter Bedingungen, unter denen der Pilz in eine Wildtyp -Pflanze eindringen kann.

Der Pilzbefall der Pflanze lässt sich anschließend mit einem geeigneten Auswerteverfahren auswerten. Dazu eignet sich vor allem die visuelle Auswertung, bei der die ausgebildeten Pilzstrukturen in der Pflanze detektiert und quantifiziert werden. Um die erfolgreich transformierten Zellen zu identifizieren, wird bevorzugt zusammen mit dem RNAi-Konstrukt ein Reportergen wie z.B. das ß-Glucuronidase- (GUS)-Gen aus E. coli, ein Fluoreszenzgen wie etwa das Green- Fluorescence- Protein (GFP)-Gen aus Aequoria victoria, das Luziferase-Gen aus Photinus pyralis oder das ß-Galaktosidase-(lacZ)-Gen aus E. coli, dessen Expression in den Pflanzenzellen durch einfache Verfahren nachgewiesen werden kann, in einem geeigneten Vektor kotransformiert. Optional können die ausgebildeten Pilzstrukturen zur besseren Bestimmung durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, angefärbt werden, z. B. durch Coomassie- oder Trypanblau- Färbung.

Die mit Hilfe des oben beschriebenen Verfahrens identifizierten Pilzgene können dazu verwendet werden, transgene Pflanzen mit erhöhter Pilzresistenz herzustellen, indem ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird.

Die beispielhafte Identifizierung von Pilzgenen, die sich im Verfahren der vorliegenden Erfindung eignen, und deren Verwendung zur Erhöhung der Pilzresistenz in transgenen Pflanzen wird nun im Folgenden dargestellt. Die nachfolgenden Beispiele sollen nicht als beschränkend aufgefasst werden. Der Inhalt sämtlicher in dieser Patentanmeldung zitierten Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichten Patentanmeldungen ist hier durch Bezugnahme aufgenommen.

Beispiele Beispiel 1: Herstellung von RNAi- Konstrukten

In cDNA-Array- Analysen mit cDNA aus Gerstenblattepidermis, die mit dem Mehltaupilz Blumeria graminis für bestimmte Zeiträume inokuliert wurde bzw. nicht inokuliert wurde (Kontrolle) wurden differentiell exprimierte Gene identifiziert (Zierold et al. (2005) Mol. Plant Pathol.: in press). 13 EST-Klone, die differentiell exprimiert waren und hohe Sequenzhomologie zu pilzlichen Genen aufwiesen, wurden ausgewählt und mit diesen RNAi- Konstrukte hergestellt. Dazu wurden diese EST-Klone mit dem Vektorprimer MVR-26 (5' CTCACTAAAGGGAACAAAAGCTGGAG 3') als „forward primer" und

Primern, die spezifisch für den jeweiligen EST- Klon sind, bzw. für HO15I23 dem universellen Primer M13-21 PE, als „reverse primer" amplifiziert, um Fragmente mit einer Länge von etwa 500 Basenpaaren zu erhalten.

Die EST- spezifischen Primer wiesen die folgenden Sequenzen auf:

HO16G03 5' CTGGGAATTTTTCGGCTTTG 3'

HO05G22 5' TATCCTCGCAAATCTTGGCA 3'

HO03O15 5' CCGAGTTCATCACAAAACCG 3' HO13022 5' CAGGTGGACGACGTAGGAGA 3'

HO14D22 5' CGCTGGGTCATCTTGACTGT 3'

HO08J20 5' CATGATCAAGGGTGGGTGAC 3'

HO08B23 5' GCTGAATTACCATTGCGGTG 3'

HO09I03 5' TGACCCAGCCTAGACCAGTG 3' HO15I23 5' ACGACGTTGTAAAACGACGGCCAG 3'

HO14N21 5' CTCGAATTTGCCGAGAAGGT 3'

HO15J13 5' CGAATCGCCACACCAAGAAT 3'

HOl1N21 5' CCGCAAATGCGTCTATTGTC 3' HO14K06 5'GCCGAGCATAGTCTGAACGA 3'

HO11N21-300 5'CCGCAAATGCGTCTATTGTC 3'

HO07E08 5'CAGCACGATCATGGTACACG 3'

HO06F11 5ΑAGAACATTCAAGCCGGGAG 3'

HO09P14-300 5'CCGCAAATGCGTCTATTGTC 3'

HO04M11 5'GTCGATTCGGTTTCAGCAGC 3'

HO06C14 5'TGCAACCCATAAGCCAAGAA 3'

Zur Amplifizierung der DNA der EST- Klone wurde folgender Ansatz verwendet:

Die verwendeten PCR- Bedingungen waren wie folgt:

30 Zyklen

Die Sequenzen der durch Amplifizierung der EST- Klone HO15I23, HO14N21, HO15J13, HO11N21, HO09P14-300, HO04M11, HO07E08, HO06C14, HO06F11 und HO14K06 erhaltenen PCR- Produkte sind in den SEQ ID Nrn. 8, 9, 10, 11, 24,

25, 26, 27, 28 und 29 gezeigt.

Anschließend wurden die PCR- Produkte aufgereinigt, indem jede PCR- Reaktion mit 30 μl H₂O aufgefüllt wurde und diese anschließend mit dem Qiagen Minelut UF96- well kit aufgereinigt wurde. Die PCR- Produkte wurden anschließend mit 20 μl H₂O eluiert. Diese aufgereinigten PCR- Produkte wurden anschließend in den pIPKTA38- Vektor, der eine multiple Klonierungs stelle zwischen zwei

Rekombinaseerkennungssequenzen enthält und ein Derivat des pENTR Y- Vektors von Invitrogen darstellt, kloniert. Dazu wurde zunächst folgendes Ligatio nsgemisch hergestellt:

Von diesem Ligationsgemisch wurden 6 μl in jede Vertiefung einer 96 Vertiefung PCR- Platte gegeben und 4 μl auf gereinigtes PCR- Produkt zugegeben. Dieses Gemisch wurde bei 25⁰C für eine Stunde inkubiert, bevor die Reaktion abgestoppt wurde, indem das Gemisch für 10 min. auf 65⁰C erhitzt wurde. Anschließend wurden 5 μl des Swal- Gemischs (siehe unten) zu jeder Vertiefung zugegeben, um die religierten Vektormoleküle nachzuschneiden.

Dieser Ansatz wurde für eine Stunde bei 25⁰C inkubiert, bevor kompetente E. coli- Zellen in 96- Vertiefung- Platten mit den Ligationsprodukten transformiert wurden. Die Transformation und die anschließende Minipräparation der DNA erfolgte nach Standardprotokollen im 96- Vertiefung-Platten- Format. Anschließend wurden die PCR- Produkte, die in dem Vektor pIPKTA38 -Vektor vorlagen, durch homologe Rekombination in den RNAi- Vektor pIPKTA30 eingeführt, um die RNAi- Konstrukte herzustellen. Dazu wurde folgender Reaktionsansatz verwendet:

Dieser Reaktionsansatz wurde bei Raumtemperatur über Nacht oder für mindestens 6 Stunden inkubiert. Anschließend wurden die so erhaltenen pIPKTA30- Plasmide wiederum nach Standardprotokollen in E. co/z-Zellen transformiert, bevor die Korrektheit der Klonierung durch die Präparation der Plasmid- DNA und einen Kontrollverdau bestätigt wurde. Ein Flussdiagramm, das die oben beschriebenen Schritte zur Herstellung der RNAi- Konstrukte zeigt, ist in Abb. 1 dargestellt.

Beispiel 2: Transformation der Pflanzen

Die Gerstezellen, in denen der Effekt der in Bsp. 1 hergestellten RNAi- Konstrukte auf die Pilzresistenz getestet werden sollte, wurden mit Hilfe der biolistischen Methode mit jeweils einem RNAi- Konstrukt transformiert. Dazu wurden zunächst 50 mg Biorad Goldpartikel mit 1 ml sterilem H₂O gemischt, gevortext und für 30 sek. mit Ultraschall behandelt. Danach wurden diese Partikel abzentrifugiert und wiederum mit 1 ml sterilem H₂O gewaschen, gevortext und für 30 Sekunden mit Ultraschall behandelt. Dieser Schritt wurde anschließend mit 100% Ethanol wiederholt, bevor die Goldpartikel im Inkubator getrocknet wurden und in 1 ml 50% Glycerin steril aufgenommen und auf eine Konzentration von 25 mg/ml mit 50% Glycerin verdünnt wurden.

Die Beschichtung der so präparierten Goldpartikel erfolgte mit 7 μg des Reportergens (pUbiGUS; Schweizer et al. (1999) Plant J. 20: 541-552) und 7 μg des leeren Kontrollvektors pIKTA30 oder des Vektors, der das RNAi- Konstrukt enthielt, die mit 87,5 μl Goldpartikel (25 mg/ml in 50% Glycerin) gemischt wurden.

Anschließend wurden 87,5 μl 1 M Ca(NO₃)₂ pH 10 unter Vortexen tröpfchenweise zugegeben. Die Partikelsuspension wurde für 10 min. bei Raumtemperatur stehen gelassen, bevor sie kurz abzentrifugiert wurde. Der Überstand wurde mit einer Pipette abgenommen und verworfen und das Pellet mit 1 ml 100% Ethanol gewaschen, bevor 30 μl Ethanol zugegeben wurden und das Pellet darin resuspendiert wurde.

Die Beschichtungssuspension bestehend aus der DNA und dem Goldpartikel wurde für 10 sek. mit Ultraschall behandelt, bevor jeweils 3 μl dieser Suspension auf jeden Makrocarrier aufgetragen und für 2-5 Minuten trocknen gelassen wurden. Die Transformation erfolgte mit einem Heliumdruck von 1100 psi und einem Vakuum von 27,5 mm Hg. Dazu wurden die Primärblätter von Gerste abgeschnitten und mit der adaxialen Seite nach oben auf Phytoagar- Petrischalen (0,5 bis 1% Agarose und 50 μl Benzimidazol (40 mg/ml in Ethanol)) gelegt, wo sie beschossen wurden. Die beschossenen Blätter wurden 4 Stunden in leicht geöffneten Petrischalen inkubiert und dann bis zur Inokulation mit dem Pilz bei 2O⁰C an einem Nordfenster gelagert. Drei Tage nach Beschuss wurden die Blätter in große Petrischalen umgelegt, die 1% Phytoagar mit 20 ppm Benzimidazol enthielten. Die Blätter wurden mit Mehltau (Blumeria graminis hordei) inokuliert (Dichte ca. 200 Konidien/mm²). Zur Inokulation wurden möglichst frische Konidien verwendet, d.h. entweder von älteren Pflanzen, die 24 bis 48 Stunden vor der Inokulation geschüttelt wurden oder von frischen Pflanzen, die 7 Tage zuvor inokuliert wurden. Bis zur GUS -Färbung wurden die Blätter bei 20°C und Tageslicht (keine direkte Sonneneinstrahlung) gelagert.

Beispiel 3: Auswertung des Pilzbefalls

Zur Anfärbung der transformierten Zellen wurde zunächst eine GUS -Färbung durchgeführt. Dazu wurden die Blätter etwa 40 Stunden nach der Inokulation mit dem Pilz in 10 ml GUS -Färbelösung überführt und mit dieser gemischt. Die Röhrchen wurden dann zur Vakuuminfiltration in eine Saugflasche gestellt und 2 bis 3 Mal Vakuum angelegt. Die Infiltration war vollständig, wenn die Blätter durchsichtig wurden und absanken. Die Röhrchen wurden dann mit 14 ml der Färbelösung aufgefüllt, gut verschlossen und über Nacht bei 37⁰C inkubiert.

GUS - Färbelö sung

100 mM Na- Phosphat- Puffer, End.-pH 7,0 10 mM Na-EDTA 1,4 mM K-hexacyanoferrat(II)

1,4 mM K-hexacyanoferrat(III) 0,1% Triton X-100 20% Methanol 1 mg/ml X-Gluc.

Zur Anfärbung der Pilzstrukturen kann ggf. eine Coomassie-Färbung durchgeführt werden. Dazu wird die GUS -Färbelösung nach der Übernacht- Inkubation vorsichtig abgegossen und die Röhrchen mit 8 ml Coomassie- Lösung befüllt. Die Blätter werden für 5 min. bei Raumtemperatur mit der Färbelösung inkubiert, bevor die Färbelösung abgegossen und die Proben 2 Mal mit destilliertem Wasser gespült werden.

Coomassie -Lö sung

Für 500 ml:

• 1,5 g Coomassie R 250 (0,3%) in 250 ml Methanol lösen

• 37,5 g Trichloressigsäure (7,5%) in H₂O vorlösen

• Beide Lösungen mischen und mit H₂O auf Endvolumen von 500 ml auffüllen • Coomassie-Färbelösung durch Papierfilter in Blaukappen-FL. filtrieren

Falls keine Coomassie-Färbung durchgeführt wird, werden die Blätter nach der GUS-Färbung für 5 min. in Entfärbelösung gebadet (7,5% TCA, 50% Methanol) und anschließend mit destilliertem Wasser gespült.

Die Blätter wurden nach der GUS- und ggf. der Coomassie-Färbung vorsichtig aus dem Röhrchen entnommen und mit der adaxialen Seite nach oben auf den Objektträger gelegt. Pro Objektträger wurden 200 μl destilliertes Wasser zugegeben und das Deckglas vorsichtig aufgelegt. Anschließend wurde der Pilzbefall der Pflanze mikroskopisch ausgewertet (vgl. Abb. 3).

Zur Quantifizierung des Pilzbefalls wurde der haustoriale Index (HI) der GUS- positiven, also transformierten, Zellen nach folgender Formel berechnet: HI = Anzahl der Haustorien / Anzahl GUS -gefärbte Zellen x 100 Relativer HI (%) = HI Testgen / HI Kontrolle x 100

Der relative HI von mit 11 getesteten RNAi- Konstrukten transformierten Gerstezellen ist in Abb. 4 dargestellt.

Interessanterweise weisen die beiden cDN A- Fragmente HO11N21 und HO15J13, deren RNAi- Kon strukte die Wirtsanfälligkeit von Gerste gegenüber Blumeria graminis signifikant reduzieren, hochsignifikante Homologien auf Proteinebene zu pilzlichen ß-l,3-Glucanosyltranferasen auf, sind aber zueinander auf DNA- Ebene nur wenig homolog, so dass ein „Cross-Silencing" der Glucanosyltransferasegene durch je ein RNAi- Konstrukt ausgeschlossen werden kann. Der relative haustoriale Index von Gerstezellen, die mit weiteren RNAi- Konstrukten transformiert wurden, ist in Abbildung 6 aufgeführt. Alle in Abbildung 6 genannten RNAi- Konstrukte führen zu einer signifikant reduzierten Haustorienbildung in transient transformierten Gerstenepidermiszellen im Vergleich zu Zellen, die mit dem leeren RNAi- Vektor transformiert wurden.

Zusätzlich wurde der Pilzbefall auch durch die Messung des Hyphenwachstums in den Zellen, die mit dem RNAi- Konstrukt transformiert worden waren, im Vergleich zu den Kontrollzellen bestimmt. Dazu wurden die Zellen wie oben beschrieben transformiert, mit B. graminis inokuliert und die transformierten Zellen durch eine GUS-Färbung identifiziert. Die Hyphenlänge wurde 48 Stunden nach der Inokulation bestimmt. Als kurze Hyphen gelten solche, die kürzer als die fünffache Konidienlänge sind.

Die Ergebnisse mit dem RNAi- Konstrukt pIKTA30-HO15J13 sind in Abbildung 5 dargestellt.

Im Vergleich zu den Kontrollzellen, die mit dem Leervektor transformiert worden waren, zeigen die mit pIKTA30-HO15J13 transformierten Zellen einen deutlich erhöhten Prozentsatz an kurzen Hyphen, was auf eine erhöhte Pilzresistenz der mit dem RNAi- Konstrukt transformierten Pflanzen hindeutet.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1: Herstellung der RNAi- Konstrukte (Flussdiagramm) I, PCR Amplifikation von cDNA Fragmenten interessierender

Pilzgene; IIa, Ligation der PCR Fragmente in den Zwischenvektor pIPKTA38 in Anwesenheit der Restriktionsendonuklease Swal, die die Religation des Vektors verhindert; IIb, Nachschneiden aller religierten Vektormoleküle; III, Rekombination der klonierten cDNA Fragmente in den RNAi Vektor pIPKTA30 mittels LR Klonase.

Abb. 2: Testen der RNAi- Konstrukte in transgenen Pflanzen (Flussdiagramm)

Abb. 3: Mikroskopische Auswertung des Pilzbefalls von Gerstezellen, die mit einem leeren RNAi- Vektor (a) oder dem RNAi-Konstrukt pIKTA30_HOHN21 (b) transformiert und mit Blumeria graminis inokuliert wurden. In (a) kann der Pilz ein Haustorium bilden und auf der Blattoberfläche mit sekundären, elongierten Hyphen wachsen, während in (b) die Besiedelung der Gerstezelle bereits während des Penetrationsstadiums durch das RNAi-Konstrukt gestoppt wird.

Abb. 4: Effekte der RNAi- Konstrukte auf die Anfälligkeit von Gerste gegenüber Mehltau {Blumeria graminis). Mittelwerte aus 3-5 unabhängigen Experimenten + SD sind gezeigt. Rote Säulen markieren statistisch signifikante Resistenz- Effekte mit p<0,05.Die mit den RNAi- Konstrukten pIKTA30-H011N21, pIKTA30- HO14N21 und pIKTA30-HO15J13 transformierten Gerstezellen zeigen eine statistisch signifikant reduzierte Anfälligkeit gegenüber Blumeria graminis.

Abb. 5: Hyphenwachstum von B. graminis in transient mit dem RNAi- Konstrukt pIKTA30-HO15J13 transformierten Gerstenzellen und

Kontrollzellen, die mit dem leeren RNAi- Vektor transformiert wurden. Es wurde das Hyphenwachstum in 30 Kontrollzellen (TA 30) und 33 transformierten Zellen (HO15J13) untersucht.

Abb. 6: Verminderte Haustorienbildung von B. graminis induziert durch

RNAi- Konstrukte gegen Pilzgene, die in Gerstenepidermiszellen transient exprimiert wurden. Alle getesteten RNAi- Konstrukte führen zu einer signifikanten Reduktion der Haustorienbildung.

Claims

Ansprüche

1. Verfahren zur Erhöhung der Pilzresistenz in transgenen Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, dass ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär ist und die in der Pflanze transkribiert wird, so dass bei Infektion der Pflanze mit diesem Pilz die in der Pflanze transkribierte Nukleinsäuresequenz mit der homologen und/oder komplementären Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon derart interagiert, dass die

Expression der Nukleinsäuresequenz des Pilzes im Wesentlichen unterbunden wird, in die Pflanze eingebracht wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in der Pflanze exprimierte Nukleinsäuresequenz mindestens zu 50%, bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu 90, 92 oder 94% und am meisten bevorzugt zu mindestens 96, 98 oder 99% homolog zu einer Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die in der Pflanze exprimierte Nukleinsäuresequenz mindestens zu 50%, bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu 90, 92 oder 94% und am meisten bevorzugt zu mindestens 96, 98 oder 99% komplementär zu einer Nukleinsäuresequenz des Pilzes oder Teilen davon ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Nukleinsäuresequenz, die homolog und/oder komplementär zu der Nukleinsäuresequenz des Pilzes ist, 20 bis 5000 Nukleotide, bevorzugt 100 bis 2000 Nukleotide, besonders bevorzugt 250 bis 1000 Nukleotide und am meisten bevorzugt 400 bis 700 Nukleotide umfasst.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden die identische oder homologe Antisense- Sequenz der für das Pilzgen kodierenden Sequenz oder Teile davon,

(c) ein Intron umfassend Spleißdonor- und Spleißakzeptorsequenzen, (d) die identische oder homologe Sense- Sequenz der der für das Pilzgen kodierenden Sequenz oder Teile davon, und (e) eine Terminationssequenz.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden die homologe Antisense- Sequenz der für das Pilzgen kodierenden Sequenz, und

(c) eine Terminationssequenz.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktions fähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden die identische oder homologe Antisense- Sequenz der für das Pilzgen kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz über selb st- komplementäre

Bereiche verfügt, und

(c) eine Terminationssequenz.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die zu der für die mRNA des Pilzgens oder Teilen davon kodierenden Sequenz komplementär ist,

(c) eine DNA- Sequenz, die für Ribonuklease P kodiert, und

(d) eine Terminationssequenz.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Promotor ein konstitutiver Promo tor ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Promotor ein induzierbarer Promotor ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei der Promo tor ein gewebespezifischer Promotor ist.

12. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Nukleinsäuresequenz des Pilzes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus (i) DNA- Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die SEQ ID Nr.

1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 oder 23 oder Fragmente davon umfassen, und/oder (ii) DNA- Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von (i) hybridisieren.

13. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei mehr als ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül wie in den vorangehenden Ansprüchen beschrieben in die Pflanze eingebracht wird.

14. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die transgenen Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegen Mehltau zeigen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei es sich bei dem Mehltau um Blumeria graminis handelt.

16. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei es sich bei den transgenen Pflanzen um dikotyledone Pflanzen handelt.

17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei es sich bei den transgenen Pflanzen um monokotyledone Pflanzen handelt.

18. Verfahren nach Anspruch 17, wobei es sich bei den Pflanzen um Getreidepflanzen, insbesondere um Weizen oder Gerste handelt.

19. Transgene Pflanzenzelle mit erhöhter Pilzresistenz, hergestellt nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18.

20. Transgene Pflanzenzelle, enthaltend ein rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolo g und/oder komplementär ist.

21. Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 19 oder 20, wobei die zu der Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homologe Nukleinsäuresequenz in der Pflanze mindestens zu 50%, bevorzugt zu mindestens 60%, ebenfalls bevorzugt zu mindestens 70%, besonders bevorzugt zu mindestens 80%, insbesondere bevorzugt zu 90, 92 oder 94% und am meisten bevorzugt zu mindestens 96, 98 oder 99% homolog zu einer Nukleinsäure oder Teilen davon ist.

22. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die Nukleinsäuresequenz, die homolog und/oder komplementär zu der Nukleinsäuresequenz des Pilzes ist, 50 bis 5000 Nukleotide, bevorzugt 100 bis 2000 Nukleotide, besonders bevorzugt 250 bis 1000 Nukleotide und am meisten bevorzugt 400 bis 700 Nukleotide umfasst.

23. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor, (b) operativ daran gebunden die identische oder homologe Antisense- Sequenz der für das Pilzgen kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz an ihrem 3'-Ende vom Spleißosom erkennbare 3'-Exon-Sequenzen aufweist,

(c) ein Intron,

(d) die identische oder homologe Sense- Sequenz der der für das Pilzgen kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz an ihrem 5'-Ende vom Spleißosom erkennbare 5'-Exon-

Sequenzen aufweist, und

(e) eine Terminationssequenz.

24. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden die identische oder homologe Antisense- Sequenz der für das Pilzgen kodierenden Sequenz, und (c) eine Terminationssequenz.

25. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst: (a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden die identische oder homologe Antisense- Sequenz der für das Pilzgen kodierenden Sequenz, wobei die Sequenz über selb st- komplementäre Bereiche verfügt, und

(c) eine Terminationssequenz.

26. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 22, wobei das rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst:

(a) einen in Pflanzen funktionsfähigen Promotor,

(b) operativ daran gebunden eine DNA- Sequenz, die zu der für die mRNA des Pilzgens oder Teilen davon kodierenden Sequenz komplementär ist,

(c) eine DNA- Sequenz, die für Ribonuklease P kodiert, und

(d) eine Terminationssequenz.

27. Transgene Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 26, wobei die homologe Nukleinsäuresequenz des Pilzes ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus

(i) DNA- Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die SEQ ID No. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22 oder 23 oder Fragmente davon umfassen, und/oder (ii) DNA- Sequenzen umfassend Nukleotidsequenzen, die unter stringenten Bedingungen mit einem komplementären Strang einer Nukleotidsequenz von (i) hybridisieren.

28. Transgene Pflanze, enthaltend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 19 bis 27.

29. Verfahren zur Identifizierung von Pilzgenen, bei denen die Hemmung ihrer Expression in transgenen Pflanzen Pilzresistenz vermittelt, umfassend die

Schritte:

(a) Identifizieren geeigneter Zielgene,

(b) Herstellen von RNAi- Konstrukten für diese Zielgene in einem geeigneten Vektor, (c) Transformieren der RNAi- Konstrukte in geeignete Testpflanzen,

(d) Inokulieren der Testpflanzen mit einem geeigneten Pilz und

(e) Auswerten des Pilzbefalls der Pflanze mit einem geeigneten Auswertererfahren.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei die geeigneten Zielgene oder

Teile davon vor dem Herstellen der RNAi- Konstrukte zu cDNA amplifiziert werden.

31. Verfahren nach Anspruch 30, wobei die RNAi- Konstrukte durch ortsspezifische Rekombination der cDNA in den geeigneten Vektor hergestellt werden.

32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 31, wobei die Testpflanzen durch die biolistische Methode transformiert werden.

33. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 32, wobei es sich bei dem geeigneten Pilz um Mehltau handelt.

34. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 bis 33, wobei die Auswertung des Pilzbefalls durch visuelle Inspektion der Pflanzen erfolgt.

35. Verwendung von Nukleinsäuresequenzen, die zu einer Nukleinsäuresequenz eines Pilzes homolog und/oder komplementär sind, zur Herstellung von pilzresistenten transgenen Pflanzen.