DE10150676A1

DE10150676A1 - Neue chemisch-induzierbare Promotoren

Info

Publication number: DE10150676A1
Application number: DE2001150676
Authority: DE
Inventors: Karl-Heinz Kogel; Ulrich Beckhove; Uta Geldermann
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2001-10-17
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2003-04-30
Also published as: WO2003033712A1

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur chemisch-induzierbaren Expression von Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt in Pflanzen. Umfasst sind ferner neue chemisch-induzierbare Promotoren, funktionelle Äquivalente und funktionell äquivalente Teile derselben sowie Expressionskassetten und Vektoren, die diese Promotorsequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren in Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind, nach Einwirkung auf Pflanzen eine Pathogenresistenz zu induzieren.

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren zur chemisch induzierbaren Expression von Nukleinsäuresequenzen, bevorzugt in Pflanzen. Umfasst sind ferner neue chemisch-induzierbare Promotoren, funktionelle Äquivalente und funktionell äquivalente Teile derselben, sowie Expressionskassetten und Vektoren, die diese Promotorsequenzen umfassen. Die Erfindung betrifft ferner mit diesen Expressionskassetten oder Vektoren transformierte transgene Pflanzen, davon abgeleitete Kulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut, sowie die Verwendung derselben zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien. Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung dieser Expressionskassetten oder Vektoren in Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die in der Lage sind, nach Einwirkung auf Pflanzen eine Pathogenresistenz zu induzieren.
Ziel biotechnologischer Arbeiten an Pflanzen ist die Herstellung von Pflanzen mit vorteilhaften, neuen Eigenschaften zum Beispiel zur Steigerung der landwirtschaftlichen Produktivität, zur Qualitätssteigerung bei Nahrungsmitteln oder zur Produktion bestimmter Chemikalien oder Pharmazeutika.
Moderne Verfahren zur Modifikation von Pflanzen und zur Verbesserung ihrer Eigenschaften (wie beispielsweise Ertrag oder Qualität) erfordern oft die Expression bestimmter Gene. Die Möglichkeit dieser Expression hängt unter anderem von der Verfügbarkeit von Methoden (beispielsweise von geeigneten Promotoren) ab, die Expression der besagten Gene zu gewährleisten und/oder zu kontrollieren.
Promotoren sind wichtige Werkzeuge in der Pflanzenbiotechnologie, um die Expression eines bestimmten Gens in einer transgenen Pflanze zu steuern und so bestimmte Wesensmerkmale der Pflanze zu erzielen. Dabei ist es wünschenswert, auf eine möglichst breite Vielfalt von Promotoren mit unterschiedlichen Eigenschaften zurückgreifen zu können, um die Expression eines bestimmten Genes in einer bestimmten Zelle, Gewebe oder Pflanzenart optimal zu realisieren. Verschiedene Promotoren mit Aktivität in Pflanzen sind dem Fachmann bekannt. Ein Promotor kann konstitutiv, gewebespezifisch, entwicklungsabhängig oder induzierbar sein.
Konstitutive Promotoren wie beispielsweise der 35S CaMV Promotor sind unabhängig vom Entwicklungsstadium und Gewebe einer Pflanze permanent aktiv und bewirken eine kontinuierliche Expression der durch sie gesteuerten Gene. Eine solche konstitutive Expression kann sich nachteilig auf die Pflanzenqualität auswirken. Die kontinuierliche Überexpression eines Fremdproteins - auch zu Zeitpunkten wo diese gar nicht erforderlich wäre - führt zu einem unnötigen Energieverlust und damit zu reduziertem Pflanzenwuchs und Erträgen. Ferner kann die konstitutive Expression unterschiedliche Effekte zu unterschiedlichen Entwicklungsstadien bewirken und so auch nachteilige Wirkung auf die Pflanze haben. Ähnlich nachteilige Effekte der konstitutiven Expression können auch bei Expression in Gewebe- oder Zellkulturen und bei Fermentationen auftreten, wo sie zum Beispiel die Wachstumsraten negativ beeinflussen können und so die Ausbeuten reduzieren.
Gewebe- oder entwicklungsabhängige Promotoren sind jeweils nur zu ganz definierten Zeitpunkten bzw. in definierten Geweben einer Pflanze aktiv.
Zahlreiche biotechnologische Ansätze zur Optimierung von Pflanzen bedürfen keiner permanenten Expression, sondern sind - im Gegenteil - vorteilhaft unter Verwendung einer gezielt induzierbaren Expression zu realisieren. Die Induktion einer Pathogenabwehr (beispielsweise durch Expression von insektiziden oder fungiziden Proteinen) wird vorteilhafterweise erst bei Befall und bei den Befall fördernden Witterungsbedingungen getätigt. Auch sollte die Expression von Proteinen, die eine toxische Wirkung auf die Pflanze haben (z. B. Pharmaproteine etc.) erst in der adulten Pflanze induziert werden, um eine hinreichende Expression zu gewährleisten.
Unter diesen Gesichtspunkten ist es verständlich, das die Kontrolle von Zeit, Ausmaß und/oder Ort der Expression besonders wünschenswert ist.
Für diese Zwecke benötigt man induzierbare Promotoren, die eine gezielte, bedarfsorientierte Expression ermöglichen. Induzierbare Promotoren sind solche, deren Transkriptionsaktivität durch einen oder mehrere interne oder externe Induktoren reguliert wird. Induktoren können chemische Verbindungen wie beispielsweise bestimmte Metaboliten (z. B. Zucker, Alkohole), Wachstumsregulatoren, Herbizide, Pflanzenhormone, phenolischen Verbindungen, aber auch Faktoren wie Licht oder aber auch physiologischer Stress (Hitze, Salz, Sauerstoffmangel, Verwundung, toxische Elemente) sein. Indirekt kann auch die Wirkung eines Pathogens oder einer Krankheit (wie z. B. einem Virus oder Pilz) eine Induktion bewirken.
Lediglich chemisch induzierbare Promotoren ermöglichen eine Anwendung mit für die Landwirtschaft akzeptablem Aufwand. Als Induktoren der Genexpression fungieren hier bestimmte Chemikalien, die - beispielsweise durch Besprühen, Bestäuben, Ummanteln oder Beizen - auf Pflanzen oder Samen appliziert werden können. Diese Substanzen und die mit ihnen verbundenen Promotoren werden auch als "genetische Schalter" bezeichnet.
Verschiedene chemisch induzierbare Promotoren bzw. Expressionssysteme zur Verwendung in Pflanzen sind beschrieben. Beschrieben ist beispielsweise ein Alkoholdehydrogenase-Promotor, der durch Ethanol induzierbar ist (Nagao RT et al. (1986) in Miflin BJ (ed.) Oxford Surveys of Plant Molecular and Cell Biology, Vol. 3, S. 384-438, Oxford Univ Press). WO 93/21334 beschreibt das alcA/alcR Expressionsystem, das durch verschiedene Alkohole (z. B. Ethanol) induziert werden kann. Das System besteht aus zwei Komponenten: Der Promotorsequenz und dem alcR-Protein, das als Induktorprotein in Gegenwart des Alkohols den Promotor stimuliert.
Ähnlich funktionieren Systeme, bei den die Induktion durch Glucocortikoide (Schena M et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88(23): 10421-5), Ecdyson (WO 96/37609), Tetrazyklin (Weinmann P et al. (1994) Plant J 5(4): 559-69) oder Kupfer (Mett VL et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90(10): 4567-71) realisiert wird. Alle diese Ansätze haben den Nachteil, dass neben dem Promotor noch ein spezielles Induktorprotein in die Pflanze eingeführt werden muss. Dies erhöht den Arbeitsaufwand erheblich, erschwert die Zulassung der entsprechenden Pflanze und mindert gegebenenfalls Wert und/oder die Verbraucherakzeptanz. Auch kann die Befähigung zu Expression der Induktorproteine nicht in allen Pflanzenarten gewährleistet sein.
Die Effizienz einiger induzierbarer Promotoren wurde vergleichend beschrieben (Boetti H et al. (1999) Biotechnology & Bioengineering. 64(1): 1-13).
Die meisten der verwendeten Chemikalien (wie beispielsweise Kupfersalze, Alkohol, Tetrazyklin, Glucokortikoide, Ecdyson etc.) sind für eine Anwendung im Agrarbereich aus ökologischen, finanziellen oder applikationstechnischen Gründen ungeeignet und können nur unter Laborbedingungen sinnvoll genutzt werden.
Beschrieben ist ferner ein Expressionssystem basierend auf dem GST-II Promotor (Sugita K et al. (2000) Plant J 22(5): 461-9; WO 90/01294; WO 90/08826; WO 97/11189; WO 93/01294). US 5,608,143 beschreibt Promotoren, die durch substituierte Benzsulfonamide induziert werden können.
Verschiedene natürliche, niedermolekulare Verbindungen sind beschrieben, die die Genexpression in Pflanzen steuern. Diese Wachstumsregulaturen umfassen beispielsweise Ethylen, Abscisinsäure (ABA), Auxin, Jasmonsäure (JA), Salicylsäure (SA) und weitere Pflanzenhormone. Diese Faktoren spielen vor allem bei der Abwehr der Pflanze gegen Pathogene oder bei der Stressantwort ("induzierte Resistenz") eine Rolle.
Salicylsäure (SA) ist ein wichtiger Botenstoff bei der Vermittlung von systemisch erworbenen Resistenz (SAR) und der lokalen, erworbenen Resistenz (LAR) (Vernooij B et al. (1994) Plant Cell 6: 959-965; Sticher L et al. (1997) Annual Review of Phytopathology 35: 235-270).
Jasmonsäure (JA) und ihr Methylester (MeJA; JM) sind wichtige Signalstoffe bei pflanzlichen Abwehrmechanismen und haben eine darüberhinausgehende Hormonfunktion zur Steuerung des pflanzlichen Stoffwechsels (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopath 35: 235-270; Creelman RA und Mullet JE (1997) Ann Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48: 355-381). Die Biosynthese erfolgt ausgehend von Membranlipiden meist aus Linolensäure unter Einwirkung einer Lipoxygenase oder unspezifisch durch Membranperoxidierung beispielsweise während einer hypersensitiven Reaktion (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). SA antagonisiert die Produktion von JA (Penninckx IAMA (1996) Plant Cell 8: 2309-2323).
Abscisinsäure ist erforderlich für die Signaltransduktion vom Systemin zu JA (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). Ethylen kann ebenfalls SAR modulieren, steigert die Lignifikation und ist vermutlich erforderlich für die Signaltransduktion zwischen Systemin und PinII (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270).
Der Begriff der "induzierten Resistenz" umfasst eine Reihe pflanzlicher Abwehrmechanismen, bei denen jeweils durch eine Primärinfektion oder -stimulation mit einem Pathogen oder anderem Stressfaktor eine erhöhte Resistenz gegen eine nachfolgende Sekundärinfektion oder -stimulation ausgelöst wird (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270). Die Resistenz kann lokal oder systemisch ausgeprägt sein. Die systemische Resistenz umfasst die Akkumulation von Resistenzproteinen auch in Bereichen, die vom Ort der Primärinfektion oder -stimulation weiter entfernt sind. Verschiedene Klassen dieser Proteine können definiert werden: Hydrolasen, insbesonders die "pathogenesis related proteins" (PR-Proteine) (Stinzi A et al. (1993) Biochemie 75: 687-706), Defensine (Broekart WF et al. (1995) Plant Physiol 108: 1353-1358), Proteinaseinhibitoren (Schaller A und Ryan CA (1996) Bioessays 18: 27-33) und Zellwandkomponenten (insbesondere Hydroxyprolin-reiche Glycoproteine (HRGP) sowie Lignin; Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270).
Bei der systemisch erworbenen Resistenz ("Systemic acquired resistence"; SAR) erfolgt eine hypersensitive Reaktion verbunden mit der Ausbildung von nekrotischen Läsionen und einem substantiellen Anstieg des endogenen Salicylsäure (SA)-Spiegels. Infolge erlangt die Pflanze eine Resistenz gegen verschiedene Pathogene. Das Phänomen ist mit der Expression verschiedener Klassen von Genen, den sogenannten "pathogenesis-related" (PR) Genen verbunden (Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Van Loon LC et al. (1994) Plant Mol Biol Rep 12: 245-264, Stinzi A et al. (1993) Biochemie 75: 687-706). Die SAR-Reaktion wird durch endogene Botenstoffe wie Jasmonat (JA) oder Salicylsäure (SA) vermittelt. Eine exogene Applikation dieser Stoffe ist in der Lage, die entsprechenden PR-Gene zu aktivieren und eine SAR zu bewirken (Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4(6): 645-656). Ähnliche Effekte können auch durch synthetische Verbindungen wie 2,6-Dichlorisonicotinsäure (DCINA) (Vernooij et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8: 228-234) oder Benzo-[1,2,3]thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methylester (BTH) (Friedrich et al. (1996) Plant J 10(1): 61-70; Lawton et al. (1996) Plant J 10: 71-82) bewirkt werden. DCINA realisiert dies, ohne zugleich die SA Spiegel zu erhöhen, wirkt also am gleichen Ort oder unterhalb in der Signaltranduktionkette (Vernooij B et al. (1995) Mol Plant Microbe Interact 8: 228-234).
Bereits Ende der 70iger Jahre wurde gezeigt, dass Salicylsäure (SA) wie auch Acetylsalicylsäure in Tabakpflanzen eine SAR gegenüber dem Tabakmosaikvirus auslösen kann. SA kommt vermutlich in allen höheren Pflanzen als Signalsubstanz für die SAR vor. Seit einiger Zeit wird durch die Firma Syngenta das Pflanzenbehandlungsmittel BION® vertrieben, dessen aktive Substanz (Benzo[1,2,3]thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-Methylester; BTH) der SA strukturell ähnlich ist und wie diese eine SAR auslöst.
Verschiedene PR-Proteine sind für monokotyledone und dikotyledone Pflanzen beschrieben (Sticher L et al. (1997) Ann Rev Phytopathol 35: 235-270; Alexander D et al. (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90: 7327-7331; Richmond S et al. (1979) Physiol Plant Pathol 14: 329-338). Die SAR wurde im Detail in Arabidopsis untersucht. Verschiedene PR-Gene sind hier beschrieben (Uknes S et al. (1992) Plant Cell 4(6): 645-56). Charakterisiert ist der PR-1 Promotor aus Tabak (Uknes et al. (1993) Mol Plant Microbe Interact 6: 692-698), der Tabak PR-2d Promotor (Shah J und Klessig DF (1996) Plant J 10(6): 1089-101; Hennig J et al. (1993) Plant J 4(3): 481-93). US 5,614,395 beschreibt das Arabidopsis PR-1 Gen und seinen chemisch induzierbaren Promotor. WO 98/03536 beschreibt Deletionsmutanten dieses Promotors. WO 00/65039 beschreibt weitere Deletionsvarianten und Promotorelemente dieses Promotors.
Die Promotoren der PR-Gene werden im allgemeinen außer durch die Applikation von chemischen SAR-Induktoren auch indirekt beispielsweise durch Pathogenbefall und/oder Stress unter Verwendung endogener Botenstoffe wie SA induziert.
Weitere Beispiele für pathogen-induzierbare Promotoren sind der PRPl Promotor aus Kartoffel (Martini N et al. (1993) Mol Gen Genet 263: 179-186), der Fis1 Promotor (WO 96/34949), der Betv 1 Promotor (Swoboda I et al. (1995) Plant Cell and Env 18: 865-874), der Vstl Promotor (Fischer R (1994) Dissertation, Univ. Hohenheim; Schubert R et al. (1997) Plant Mol Biol 34: 417-426), der Sesquiterpenzyklase-Promotor (Yin S et al. (1997) Plant Physiol 115: 437-451) und der gstA1 Promotor (Mauch F und Dudler R (1993) Plant Physiol 2: 1193-1201).
Als chemisch induzierbare Promotoren sind diese Promotoren nur unzureichend geeignet, da sie eine nicht unerhebliche konstitutive Aktivität aufweisen und zudem ungewollt durch natürliche Pathogene anstelle des chemischen Induktors induziert werden können. Nachteilig bei der Verwendung dieser Promotoren zur transgenen Expression von anti-pathogenen Proteinen ist die Tatsache, dass die Promotoren nur reaktiv tätig werden. Die Verzögerungsphase bis zum Erreichen eines ausreichenden Abwehrpotentials kann Schäden an der Pflanze zur Folge haben, die ihren Wert und ihre Eignung als Nahrungs- oder Futtermittel beeinträchtigen.
Ein weiterer genereller Nachteil der meisten bislang identifizierten chemischen induzierbaren, pflanzlichen Promotoren ist, dass sie aus dikotylen Pflanzen isoliert wurden. Ihre Verwendbarkeit für monokotyle Pflanzen - zu denen die meisten wichtigen Ackerpflanzen wie beispielsweise die Getreidearten zählen - ist fraglich.
Die Blätter der Pflanze sind als Hauptort der Fotosynthese von besonderer Bedeutung für Qualität und Quantität des Ernteertrages. Ferner stellen sie den Interaktionsort für zahlreiche pflanzliche Erkrankungen u. a. Pilzerkrankungen und/oder Insektenfrass dar. Moleküle und Strukturen innerhalb der Blätter spielen eine wesentliche Rolle in der Abwehr mikrobieller und pathogener Angriffe aber auch bei der Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren wie Hitze, Trockenheit, UV Strahlung, Kälte etc. Durch die Koevolution von Pflanzen und Schädlingen sind die Abwehrmechanismen der Pflanze oft unzureichend. Die Einführung fremder Gene in Blattzellen könnte hier vorteilhaft sein. Nur wenige Promotoren mit Spezifität für Blätter (z. B. EP-A 917 583) sind beschrieben.
Es bestand daher die Aufgabe, Promotoren zu identifizieren, die bei einer geringen konstitutiven Expression im nicht-induzierten Zustand eine möglichst starke und schnelle Induktion infolge eine chemischen Induktion aufweisen, durch Pathogene aber möglichst nur wenig oder gar nicht aktiviert werden. Die Promotoren sollten ihre Funktion in den wichtigen Nutzpflanzen erfüllen, also möglichst eine monokotyle Ackerpflanze als Ursprung haben und zudem eine Expression in Blättern, möglichst eine blattspezifische Expression ermöglichen. Diese Aufgabe wurde durch Bereitstellung der Promotoren für das BCI-3 und das BCI-4 Gen aus Gerste gelöst (BCI = "barley chemically induced").
Der BCI-3 Promotor wird durch DCINA, BTH und schwächer durch SA induziert. Die Akkumulation von BCI-3 ist nach BTH-Induktion nur im Mesophyll und schwächer in der Epidermis nachweisbar. Durch Ethylen und ABA wurde die Expression von BCI-3 nicht beeinflusst, durch JA-Applikation und Verwundung jedoch induziert. Inokulation von Gerste mit C. sativus, dem Nicht-Wirt-Pathogen Bgt oder Blattläusen (S. avenae) hatte keinen Einfluss auf die Transkriptakkumulation. Hingegen wird BCI-3 durch Befall mit einer virulenten und avirulenten Rasse von Bgh sogar reprimiert.
Die Genexpression von BCI-4 ist nur mit den Resistenzinduktoren DCINA und BTH und - schwächer und transienter - mit SA induzierbar. Eine schwache Expression von BCI-4 wurde nach Infiltration des Pseudomonadenstammes PG4180 lokal und systemisch nachgewiesen. Alle anderen untersuchten Induktoren, verschiedenste biotische und abiotische Stressfaktoren, sowie Fungizidapplikationen oder Verwundung hatten keinen Einfluss auf die Expression von BCI-4. Dies zeigt, dass BCI-4 nicht bei allgemeinen Stressreaktionen exprimiert wird, sondern spezifisch reguliert ist. BCI-4 zeigt eine sehr geringe konstitutive Expressionsaktivität. Eine verstärkte Akkumulation von BCI-4-Transkript und -Protein in Gerstenpflanzen erfolgte ausschließlich in Blättern (mit Ausnahme des Fahnenblattes) und nur nach chemischer Induktion (BTH-Gießbehandlung), wobei die Akkumulation auf das Mesophyll begrenzt blieb.
Ein Vorteil der erfindungsgemäßen Promotoren ist, dass man gezielt die Genexpression in Pflanzen - vor allem in den wichtigen, monokotylen Ackerpflanzen - durch Applikation einer Chemikalie aktivieren kann. Eine ungewollte Aktivierung durch Pathogene kann weitestgehend ausgeschlossen werden. Die Anwendungsmöglichkeiten sind vielfach. So kann man beispielsweise gezielt quasi prophylaktisch einem drohenden Pathogenbefall vorbeugen.
Die cDNA der BCI-3 und BCI-4 Gene ist teilweise bekannt (WO 00/71748; Besser K et al. (2000) Molecular Plant Pathology 1(5): 277-286; GenBank Acc.No.: AJ250282 und AJ250283). Ein EST ("expressed sequence tag") wurde mittels eines Expressionsanalyse infolge einer Behandlung von Gerste mit SAR ("systemic acquired resistance") auslösenden Chemikalien gefunden. Neben dem BCI-3 und BCI-4 EST wurden zahlreiche weitere Sequenzen identifiziert. Überraschenderweise zeigen jedoch die erfindungsgemäßen Promotoren nur bei Stimulation mit exogen applizierten Chemikalien wie DCINA oder BTH eine starke Induktion, nicht jedoch bei Pathogenbefall. Diese Expressionsspezifität ist besonders vorteilhaft, weil so nur eine geringe Hintergrundktivität in Abwesenheit des chemischen Induktors (ausgelöst beispielsweise durch Umweltfaktoren oder Pathogenbefall) zu erwarten ist.
Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur chemisch induzierbaren transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Expressionskassette bestehend aus einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus
- a) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No: 1 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben, und
- b) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No: 2 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben
in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eine Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, und
b) die Expression der Nukleinsäuresequenz durch Behandlung des Organismus oder des Gewebes, Organs, Teils, Zellkultur oder Zelle desselben mit einem chemischen Induktor induziert wird.

Bevorzugt wird die Expression in Pflanzen realisiert. "Pflanze" meint dabei alle pflanzlichen Organismen wie sie weiter unten beispielhaft beschrieben sind. Besonders bevorzugt sind dabei Pflanzen, die eine Rolle im Ackerbau sowie als Futter- oder Lebensmittel spielen. Am meisten bevorzugt sind Getreidearten wie Gerste, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis und Mais.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft den BCI-3 Promotor aus Gerste gemäss SEQ ID NO: 1, die dazu komplementäre Sequenz, sowie funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalenten Teile derselben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft den BCI-4 Promotor aus Gerste gemäss SEQ ID NO: 2, die dazu komplementäre Sequenz, sowie funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalenten Teile derselben.
"Funktionell äquivalente Teile" meint Teilsequenzen der durch SEQ ID NO: 1 oder 2 beschriebenen Promotoren, die im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität wie der BCI-3 Promotor beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder der BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 aufweisen. Teilsequenzen können sich aus ein oder mehreren Teilen der durch SEQ ID NO: 1 oder 2 beschriebenen Promotoren zusammensetzen. Funktionell äquivalente Teile eines BCI-3 Promotors umfasst bevorzugt die durch SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 beschrieben Sequenzen. Funktionell äquivalente Teile eines BCI-4 Promotors umfasst bevorzugt die durch SEQ ID NO: 8 beschriebene Sequenz.
"Funktionelle Äquivalente" meint Sequenzen, die von dem BCI-3 Promotor beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder des BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 abgeleitet sind und im wesentlichen die gleiche Promotoraktivität aufweisen.
Eine Promotoraktivität wird als im "wesentlichen gleich" bezeichnet, wenn die Transkription einer bestimmten transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz unter Kontrolle eines von SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 abgeleiteten Promotors durch einen chemischen Induktor jedoch nicht oder nur schwach durch Pathogene aktiviert werden kann. Dabei ist die maximale Induktion der Expression durch einen chemischen Induktor mindestens 2mal so hoch wie die maximale Induktion durch ein Pathogen, bevorzugt mindestens 5mal so hoch, ganz besonders bevorzugt mindesten 10mal so hoch, am meisten bevorzugt mindestens 20mal so hoch.
Bevorzugt dienen dabei Dichloroisonicotinsäure (DCINA) oder Benzo[1,2,3]thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-Methylester (BTH) als chemische Induktoren. Als Pathogen ist der Gerstenmehltau (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f. sp. hordei Speer, Bgh) bevorzugt, besonders bevorzugt ist der Gerstenmehltau der Rasse A6 (BghA6). Ganz besonders bevorzugt sind als funktionell äquivalente Promotoren mit einer im wesentlichen gleichen Promotoraktivität solche zu verstehen, die eine blattspezifische, besonders bevorzugt eine Blatt-Mesophyll spezifische Expression aufweisen. "Spezifisch" heißt in diesem Zusammenhang, dass die Expression in dem bewussten Gewebe mindestens doppelt so hoch ist wie in einem beliebigen anderen Gewebe. Bevorzugt ist die Expression mindestens 5mal so hoch, ganz besonders bevorzugt mindestens 10mal so hoch.
Die absolute Expressionshöhe nach Inkubation mit dem chemischen Induktor kann sowohl nach unten als auch nach oben im Vergleich mit dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID NO: 1 oder dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID NO: 2 abweichen. Die Expressionshöhe wird dabei jeweils anhand der transkribierten mRNA oder dem infolge translatierten Protein unter ansonsten unveränderten Bedingungen gemessen. Bevorzugt sind dabei solche Promotorsequenzen, deren Expressionshöhe nach Induktion einem Vergleichswert erhalten mit dem durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 beschriebenen Promotor um nicht mehr als 50%, bevorzugt nicht mehr als 25%, besonders bevorzugt nicht mehr als 10% unterschreitet. Besonders bevorzugt sind solche Sequenzen, deren Expressionshöhe nach Induktion einen Vergleichswert erhalten mit einem der durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 beschriebenen Promotoren um mehr als 50%, bevorzugt 100%, besonders bevorzugt 500%, ganz besonders bevorzugt 1000% übersteigt. Besonders bevorzugt sind ferner solche Sequenzen, deren Expressionshöhe vor Induktion einen Vergleichswert erhalten mit einem der durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 beschriebenen Promotor nicht übersteigt oder diesen um mindestens 10% bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt mindestens 50%, am meisten bevorzugt mindestens 90% unterschreitet. Im allgemeinen wird eine Induktion nach 2 bis 72 h, bevorzugt nach 12 bis 48 h erwartet.
Als transgen zu eprimierende Nukleinsäuresequenz sind solche bevorzugt, die eine leichte Quantifizierung der Expression ermöglichen d. h. insbesondere solche deren Transkription und Translation in sogenannten Reporterproteinen resultiert (Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1): 29-44) wie beispielsweise GFP ("green fluorescence protein"; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23(5): 912-8), Chloramphenicoltransferase, Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414), β-Galactosidase oder - besonders bevorzugt - β-Glucuronidase (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907). Weitere Reportergene sind unten beschrieben.
(Ansonsten unveränderte Bedingungen bedeutet beispielsweise, dass die einzige variable Komponente, die Promotorsequenz ist. Alle anderen Parameter wie Kulturbedingungen, Art des chemischen Induktors, Zeitpunkt der Induktionsmessung oder Art der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz (z. B. Art des Reportergens) bleiben konstant. Sind keine identischen Rahmenbedingungen verfügbar, um unveränderte Bedingungen zu gewährleisten - wie es beispielsweise im Falle der Pathogenart aufgrund spezifischer Pathogen-Wirt-Wechselwirkungen sein kann - so sind solche Bedingungen zu wählen, die den jeweils anderen möglichst nahe kommen. So kann beispielsweise anstatt der Inokulation von Gerste mit dem Gerstenmehltau (Blumeria [syn Erysiphe] graminis f. sp. hordei Speer, Bgh) bei dem entsprechenden funktionellen Äquivalent zu BCI-3 oder BCI-4 aus Weizen der Weizenmehltau (Blumeria graminis f. sp. tritici Speer, Bgt) herangezogen werden.
Verschiedene chemische Induktoren können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens zum Einsatz kommen. Der Begriff des chemischen Induktors schließt vor allem Verbindungen mit einer Benzo-1,2,3-thiadiazol Grundstruktur ein und umfasst beispielhaft jedoch nicht einschränkend Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazolthiocarbonsäure, Cyanobenzo-1,2,3-thiadiazol, Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäureamid, Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäurehydrazid, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-carbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-thiocarbonsäure, 7-Cyano-benzo-1,2,3- thiadiazol, Benzo-[1,2,3]thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methylester, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-carbonsäureamid, Benzo-1,2,3- thiadiazol-7-carbonsäurehydrazid, Alkylbenzo-1,2,3-thiadiazolcarboxylate in denen die Alkylgruppe ein bis 6 C-Atome umfasst, Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-carboxylat, n-Propyl benzo-1,2,3- thiadiazol-7-carboxylat, Benzylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-carboxylat, Benzo-1,2,3-thiadiazole-7-carbonsäure-sec-butylhydrazid, sowie weitere geeignete Derivate der vorgenannten Induktoren wie beispielsweise in US 4,931,581 und US 5,229,384 beschrieben.
Weiterhin bevorzugt sind Induktoren mit einem Pyridincarbonsäure- Grundgerüst wie Isonikotinsäure und Derivate derselben, besonders bevorzugt sind Haloisonikotinsäuren wie Dichloroisonicotinsäure bevorzugt 2,6-Dichlorisonicotinsäure (DCINA) und Derivate derselben wie beispielsweise die niederen Alkylester (C1 bis C6), ganz besonders der Methylester.
Darüberhinaus sind alle Substanzen potentiell geeignet, die in Pflanzen als Induktoren von PR-Genen oder Induktoren einer SAR beschrieben worden sind, wie beispielsweise Benzoesäure, Salicylsäure(SA), Jasmonsäure oder Jasmonsäuremethylester, Polyacrylsäure sowie substituierte Derivate der vorgenannten Induktoren.
Besonders bevorzugte Induktoren sind 2,6-Dichlorisonicotinsäure (DCINA), Benzo-[1,2,3]thiadiazol-7-thiocarbonsäure-S-methylester, Salicylsäure(SA), Jasmonsäure (JA) und Jasmonsäuremethylester (JM).
Die Applikation der Induktoren kann in Reinform, in Lösung oder Suspension, als Pulver oder Staub oder aber in jeder anderen in der Landwirtschaft üblichen Formulierungsform eingesetzt werden. Dabei können feste als auch flüssige Hilfs- oder Trägerstoffe verwendet werden, mit denen der Induktor gemischt wird, um beispielsweise eine erleichterte Applikation auf die Pflanze, Gewebe, Zelle, Zellkultur, Samen o. ä. zu gewährleisten, oder um Lagerfähigkeit, Handhabung, Transport zu verbessern. Als Hilfs- oder Trägerstoffe können dabei beispielhaft Silikate, Tone, Polymere, Alkohole, Ketone, aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffe und dergleichen verwendet werden. Wird der Induktor in Form eines konventionellen "wettable powder" oder als Konzentrat einer wässrigen Suspension oder Emulsion eingesetzt, so kann die Formulierung eine oder mehr oberflächenaktive, ionische oder nicht-ionische Verbindungen ("surfactants"), "wetting" Agentien oder Emulgatoren beinhalten. Der Induktor kann einzeln oder aber auch Kombination mit anderen geeigneten Induktoren eingesetzt werden (Beispielsweise eine Kombination von DCINA und BTH). Auch kann der Induktor in Kombination mit anderen Verbindungen wie Adjuvantien, Herbiziden, Fungiziden, Insektizide oder Wachstumsregulatoren oder Düngemitteln eingesetzt werden. Als flüssige Formulierung kann der Induktor bevorzugt als Spray auf Blätter, Stengel und/oder Zweige der Pflanze oder aber auf den Samen vor der Aussaat appliziert werden. Die Menge des Induktor wird bezüglich Menge und Zeitraum an die jeweils für eine optimale Induktion erforderliche Quantität angepasst. Bei Applikation auf ganze Pflanzen werden allgemein Induktoren in einer Konzentration von 0,1 bis 1000 mg aktiver Verbindung pro Liter Bodenvolumen im Rahmen eines Bodenbehandlungsprozesses oder aber in Konzentrationen von 0,1 bis 100 mg/l aktive Verbindung pro Liter Flüssigkeit bei Sprayapplikation eingesetzt. In Zell- oder Gewebekulturen können auch geringere Konzentrationen eingesetzt werden. Im allgemeinen wird eine Induktion nach 2 bis 72 h, bevorzugt nach 12 bis 48 h erwartet.
Unter einem funktionalen Äquivalent versteht man insbesondere natürliche oder künstliche Mutationen des BCI-3 Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 oder des BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 sowie homologe Sequenzen aus anderen Pflanzengattungen und -arten, welche weiterhin eine im wesentlichen gleiche Promotoraktivität aufweisen.
Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversionen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der BCI-3 Promotorsequenz gemäss SEQ ID NO: 1 oder der BCI-4 Promotorsequenz gemäss SEQ ID NO: 2 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen Sequenz auf bestimmte regulatorische Elemente oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen, zum Beispiel weiterer regulatorischer Sequenzen, sein.
Die Eingrenzung der Sequenz auf bestimmte, essentielle regulatorische Regionen - beispielsweise auch zur Herstellung funktionell äquivalenter Teile der erfindungsgemäßen Promotorsequenzen - kann auch mit Hilfe von Suchroutine zur Suche von Promotorelementen vorgenommen werden. Oft sind in den für die Promotoraktivität relevanten Regionen bestimmte Promotorelemente gehäuft vorhanden. Diese Analyse kann beispielsweise mit Computerprogrammen wie dem Programm PLACE ("Plant Cis-acting Regulatory DNA Elements") vorgenommen werden (Higo K et al. (1999) Nucl Acids Res 27(1): 297-300). Insbesondere für das Auffinden cis-acting regulativer Elemente kann das über Internet verfügbare Programm "PlantCARE" verwendet werden (http:/ / sphinx.rug.ac.be: 8080/PlantCARE/cgi/index.html).
Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen, wie z. B. Transitionen und Transversionen, in Frage kommen, können an sich bekannte Techniken, wie in vitro-Mutagenese, "primer repair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Durch Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffüllen von Überhängen für "blunt ends" können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden. Zu analogen Ergebnissen kann man auch unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) unter Verwendung spezifischer Oligonukleotid- Primer kommen.
Funktionelle Äquivalente des BCI-3 Promotors, abgeleitet der erfindungsgemäßen BCI-3 Promotorsequenzen zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 50%, bevorzugt 60%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% zu der Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 und zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Promotoraktivität im Vergleich zu der BCI-3 Promotorsequenz gemäß SEQ-ID NO: 1 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 aus.
Funktionelle Äquivalente des BCI-4 Promotors, abgeleitet der erfindungsgemäßen BCI-4 Promotorsequenzen zum Beispiel durch Substitution, Insertion oder Deletion von Nukleotiden, haben eine Homologie von mindestens 50%, bevorzugt 60%, vorzugsweise mindestens 70%, besonders bevorzugt mindestens 80%, ganz besonders bevorzugt mindestens 90% zu der Promotorsequenz gemäss SEQ ID NO: 2 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 8 und zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Promotoraktivität im Vergleich zu der BCI-4 Promotorsequenz gemäß SEQ-ID NO: 2 oder einem funktionell äquivalenten Teil derselben, bevorzugt einem äquivalenten Teil gemäss SEQ ID NO: 8 aus.
Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuren wird die Identität der Nukleinsäuresequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12; Length Weight: 4;
Average Match: 2,912; Average Mismatch: -2,003.
Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 50% auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO: 1 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 50% aufweist.
Weitere Beispiele für die in den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren zum Einsatz kommenden Promotorsequenzen lassen sich beispielsweise aus verschiedenen Organismen, deren genomische Sequenz bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabidopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum, Solanum tuberosum, Helianthinum, durch Homologievergleiche aus Datenbanken leicht auffinden. Durch Verwendung der BCI-3 bzw. BCI-4 Gen oder cDNA-Sequenzen zur Herstellung von Sonden zur Durchmusterung genomischer Bibliotheken anderer Organismen können homologe Promotorsequenzen, umfasst als funktionelle Äquivalente, ebenfalls aufgefunden werden. So konnte im Rahmen dieser Erfindung gezeigt werden, dass auch in Weizen homologe BCI-3 und BCI-4 Gene vorhanden sind, deren Promotoren die gleichen Eigenschaften wie die erfindungsgemäßen Promotoren aus Gerste haben (s. Fig. 7 und Legende dazu).
Funktionelle Äquivalente meint ferner DNA Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit einer Nukleinsäuresequenz der beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder 2 oder den von ihnen abgeleiteten funktionell äquivalenten Teilen gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 beschriebenen oder den zu ihnen komplementären Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und die im wesentlichen die gleichen Promotoraktivitäten wie die Nukleinsäuresequenzen beschrieben durch SEQ ID NO: 1 oder 2 oder die von ihnen abgeleiteten funktionell äquivalenten Teilen gemäss SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 haben. Standardhybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al. (1989) in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 9.31-9.57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley&Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2 × SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2 × SSC bei 50°C bevorzugt bei 65°C) (20 × SSC: 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0). Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Parameter konstant gehalten und nur der andere variiert werden. Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegenwart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritt sind infolge gegeben:

1. Hybridisierungbedingungen mit zum Beispiel
- a) 4 × SSC bei 65°C, oder
- b) 6 × SSC bei 45°C, oder
- c) 6 × SSC bei 68°C, 100 µg/ml denaturierter Fischsperma-DNA, oder
- d) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA bei 68°C, oder
- e) 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 µg/ml denaturierter, fragmentierte Lachssperma-DNA, 50% Formamid bei 42°C.
- f) 50% Formamid, 4 × SSC bei 42°C, oder
- g) 50% (v/v) Formamid, 0,1% Rinderserumalbumin, 0,1% Ficoll, 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 50 mM Natriumphosphatpuffer pH 6,5, 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrate bei 42°C, oder
- h) 2 × oder 4 × SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung), oder
- i) 30% bis 40% Formamid, 2× oder 4 × SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).
2. Waschschritte mit zum Beispiel
- a) 15 mM NaCl, 1,5 mM Natriumcitrat, 0,1% SDS bei 50°C; oder
- b) 0,1 × SSC bei 65°C, oder
- c) 0,1 × SSC, 0,5% SDS bei 68°C, oder
- d) 0,1 × SSC, 0,5% SDS, 50% Formamid bei 42°C, oder
- e) 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C, oder
- f) 2 × SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

Funktionelle Äquivalente umfassen - neben solchen die "still" sind d. h. die Promotoraktivität unverändert lassen - auch solche Promotorvarianten, deren Funktion, verglichen mit dem Ausgangspromotor, abgeschwächt oder verstärkt ist.
Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer funktioneller Äquivalente umfasst bevorzugt die Einführung von Mutationen in die BCI-3 Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO: 1 oder die BCI-4 Promotorsequenz gemäß SEQ ID NO: 2 oder die von diesen abgeleitete funktionell äquivalente Teile gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8.
Eine Mutagenese kann ungerichtet ("random") erfolgen, wobei die mutagenisierten Sequenzen anschließend bezüglich ihrer Promotoraktivität nach einer "trial-by-error" Prozedur durchmustert werden. Alternativ können Teilsequenzen, die für die Promotoreigenschaften des BCI-3 oder BCI-4 Promotors verantwortlich sind identifiziert werden (z. B. unter Verwendung von obengenannten Computeralgorithmen). In diese oder ähnliche Teilsequenzen können andere verwandte oder nicht-verwandte Nukleinsäuresequenzen (zum Beispiel Promotorsequenzen) eingeführt werden. Analog können nicht-essentielle Sequenzen deletiert werden ohne die Promotoraktivität signifikant zu beeinträchtigen.
Verfahren zur Mutagenisierung von Nukleinsäuresequenzen sind dem Fachmann bekannt und schließen beispielhaft die Verwendung von Oligonukleotiden mit einer oder mehr Mutationen im Vergleich zu der zu mutierenden Region ein (z. B. im Rahmen einer "Site-specific mutagenesis"). Typischerweise kommen Primer mit ungefähr 15 bis ungefähr 75 Nukleotiden oder mehr zum Einsatz, wobei bevorzugt ca. 10 bis ca. 25 oder mehr Nukleotidreste an beiden Seiten der zu verändernden Sequenz lokalisiert sind. Details und Durchführung besagter Mutageneseverfahren sind dem Fachmann geläufig (Kunkel et al. (1987) Methods Enzymol 154: 367-382; Tomic et al. (1990) Nucl Acids Res 12: 1656; Upender, Raj, Weir (1995) Biotechniques 18(1): 29-30; US 4,237,224). Eine Mutagenese kann auch durch Behandlung von beispielsweise Vektoren, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten, mit mutagenisierenden Agentien wie Hydroxylamin realisiert werden.
Als funktionell äquivalent sind ferner auch solche Sequenzen zu betrachten, die sich aus Sequenzen sowohl des BCI-3 Promotors gemäß SEQ ID NO: 1 und des BCI-4 Promotors gemäß SEQ ID NO: 2 oder Teilsequenzen derselben, bevorzugt Teilsequenzen gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 zusammensetzen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expressionskassetten, die eine der erfindungsgemäßen Promotorsequenzen umfassen. Beansprucht sind bevorzugt Expressionskassetten zur transgenen Expression von Nukleinsäuren enthaltend

a) den BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No: 1 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben, oder
b) den BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No: 2 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben

"Transgen" meint in Bezug auf eine Expressionskassette, einen Vektor oder einen Organismus alle solche durch gentechnische Methoden zustandegekommene Konstruktionen, in denen sich entweder

a) der Promotor des BCI-3 Gens gemäß SEQ ID No: 1 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben, bevorzugt ein funktionell äquivalentes Teil gemäß SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7, bzw. der Promotor des BCI-4 Gens gemäß SEQ ID No: 2 oder ein funktionelles Äquivalent oder funktionell äquivalentes Teil desselben, bevorzugt ein funktionell äquivalentes Teil gemäß SEQ ID NO: 8, oder
b) die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz, oder
c) (a) und (b)

Im Rahmen der erfindungsgemässen Expressionskassette kann die Expression der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz zur Bildung von sense-RNA oder anti-sense RNA führen. Die sense-RNA kann infolge in bestimmte Polypeptide translatiert werden. Mit der anti-sense-RNA kann beispielsweise die Expression bestimmter Gene herunterreguliert werden.
Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung einer der erfindungsgemäßen Promotoren und einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz und ggf. weiterer regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der transgenen Expression der Nukleinsäuresequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen zu sense oder anti-sense RNA, erfüllen kann. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz hinter (d. h. am 3'-Ende) der erfindungsgemäßen Promotorsequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotorsequenz und der transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.
Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Verknüpfung von Promotor und zu exprimierender Nukleinsäuresequenz, integriert in einem Vektor vorliegen und durch - beispielsweise Transformation - in ein pflanzliches Genom insertiert werden.
Unter einer erfindungsgemäßen Expressionskassette sind aber auch solche Konstruktionen zu verstehen, bei denen einer der erfindunsgsgemäßen Promotoren zum Beispiel über eine gezielte homologe Rekombination oder eine zufällige Insertion in ein Wirtsgenom eingeführt wird, dort regulatorische Kontrolle über mit ihm dann funktionell verknüpfte Nukleinsäuresequenzen übernimmt und die transgene Expression derselben steuert. Durch Insertion des Promotors - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - vor eine für ein bestimmtes Polypeptid kodierende Nukleinsäure erhält man eine erfindungsgemässe Expressionskassette, die die Expression des bestimmten Polypeptides infolge einer chemischen Induktion steuert. Ferner kann die Insertion des Promotors auch derart erfolgen, dass antisense-RNA zu der für ein bestimmtes Polypeptid kodierenden Nukleinsäure exprimiert wird. Damit wird die Expression des bestimmten Polypeptides infolge einer chemischen Induktion herunterreguliert oder ausgeschaltet.
Analog kann auch eine transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz - zum Beispiel durch eine homologe Rekombination - hinter einen endogenen, natürlichen erfindungsgemäßen Promotor (z. B. den BCI-3 oder BCI-4 Promotor) platziert werden, wodurch man ebenfalls eine erfindungsgemässe Expressionskassette erhält.
Erfindungsgemäss sind ferner Vektoren, die die oben beschriebenen Expressionskassetten enthalten. Vektoren sind rekombinante DNA- Sequenzen, in die die erfindungsgemäßen Expressionskassetten zum Zwecke der Isolation, Vermehrung und Transformation in einen geeigneten Wirt insertiert werden können. Bevorzugt können die Vektoren in einem Wirt wie E.coli vermehrt werden und eignen sich zur Transformation pflanzlicher Zellen oder von Agrobacterium. Vektoren können beispielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobacterium sein.
Die in den erfindungsgemässen Expressionskassetten oder Vektoren enthaltenen Nukleinsäuresequenzen können mit weiteren genetischen Kontrollsequenzen neben einem erfindungsgemäßen Promotor verknüpft sein.
Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen ist breit zu verstehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassette, des Vektors oder eines mit vorgenannten transformierten Wirtsorganismus haben.
Genetische Kontrollsequenzen modifizieren zum Beispiel die Transkription und Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemässen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen der erfindunsgsgemäßen Promotoren und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressionsteuernden Eigenschaften modifizieren können. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasserstress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Biol Chem 266(26): 17131-17135) und Hitzestress (Schöffl F et al. (1989) Mol Gen Genet 217(2-3): 246-53) beschrieben.
Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E.coli Bakterien ermöglichen.
Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen, bevorzugt des BCI-3 oder BCI-4 Gens aus Gerste. Auch Sequenzen aus anderen Pflanzenarten, wie beispielsweise das Actin-1 oder Actin-2 Intron. Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression heterologer Gene verstärken können. Beispielhaft für solche Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15: 8693-8711). Andere 5'-untranslatierte Sequenzen können die Gewebsspezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15: 435-440.). Die unter SEQ ID NO: 1 und 2 angegebene Nukleinsäuresequenzen enthalten jeweils die 5'-untranslatierte Region bis vor das ATG-Startcodon des BCI-3 bzw. BCI-4 Proteins.
Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte "enhancer Sequenzen" funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Bei der homologen Rekombination kann zum Beispiel der natürliche Promotor eines bestimmten Gens gegen einen erfindungsgemäßen Promotor ausgetauscht werden. Methoden wie die cre/lox- Technologie erlauben eine gewebespezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B. Methods. 1998; 14(4): 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.
Der einzuführende Promotor kann mittels homologer Rekombination vor das transgen zu exprimierende Zielgen platziert werden, indem der Promotor mit DNA-Sequenzen verknüpft wird, die zum Beispiel zu endogenen Sequenzen homolog sind, die dem Leseraster des Zielgens vorgelagert sind. Derartige Sequenzen sind als genetische Kontrollsequenzen zu verstehen. Nachdem eine Zelle mit dem entsprechenden DNA-Konstrukt transformiert wurde, können die beiden homologen Sequenzen interagieren und so die Promotorsequenz an dem gewünschten Ort vor dem Zielgen plazieren, so dass die Promotorsequenz nun in funktioneller Verknüpfung mit dem Zielgen steht und eine erfindungsgemässe Expressionskassette bildet. Die Auswahl der homologen Sequenzen bestimmt den Insertionsort des Promotors. Hierbei kann die Expressionskassette durch homologe Rekombination mittels einer einfachen oder einer doppelten reziproken Rekombination generiert werden. Bei der einfach reziproken Rekombination wird nur eine einzelne Rekombinationssequenz verwendet und es erfolgt Insertion der gesamten eingeführten DNA. Bei der doppelt-reziproken Rekombination ist die einzuführende DNA durch zwei homologe Sequenzen flankiert und es erfolgt die Insertion des flankierten Bereiches. Letzteres Verfahren ist geeignet, um wie oben beschrieben den natürlichen Promotor eines bestimmten Gens gegen einen erfindunsgsgemäßen Promotor auszutauschen und so den Expressionsort und -zeitpunkt dieses Gens zu modifizieren. Die funktionelle Verknüpfung stellt eine erfindungsgemässe Expressionskassette dar.
Homologe Rekombination ist ein relativ seltenes Ereignis in höheren Eukaryoten, vor allem in Pflanzen. Zufällige Integrationen in das Wirtsgenom überwiegen. Eine Möglichkeit die zufällig integrierten Sequenzen zu entfernen und so Zellklone mit einer korrekten homologen Rekombination anzureichern, besteht in der Verwendung eines sequenzspezifischen Rekombinationssystems wie in US 6,110,736 beschrieben. Eine Vielzahl von sequenzspezifischen Rekombinationssystemen kann verwendet werden, beispielhaft sind das Cre/lox-System, das FLP/FRT System, die Gin Rekombinase, die Pin Rekombinase aus E.coli und das R/RS System des pSR1 Plasmids genannt. Bevorzugt sind das P1 Cre/lox und das FLP/FRT System. Hier interagiert die Rekombinase (Cre oder FLP) spezifisch mit ihren jeweiligen Rekombinationssequenzen (34 bp lox-Sequenz bzw. 47 bp FRT-Sequenz), um die zwischengelagerten Sequenzen zu deletieren oder zu invertieren. Das FLP/FRT und cre/lox Rekombinasesystem wurde bereits in pflanzlichen Systemen angewendet (Odell et al. (1990) Mol Gen Genet 223: 369-378).
Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, insbesondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACHS entsprechen (Gielen et al. (1984) EMBO J 3: 835 ff) oder funktionelle Äquivalente davon. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequenzen sind der OCS (Octopin- Synthase)-Terminator und der NOS (Nopalin-Synthase)-Terminator.
Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung bzw. einer erfindungsgemässen Expressionskassette kann mittels gängiger Rekombinations- und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW (1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (NY) und in Ausubel FM et al. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience oder Gelvin et al. (1990) In: Plant Molecular Biology Manual beschrieben sind. Zwischen den erfindungsgemäßen Promotor und die zu exprimierende Nukleinsäuresequenz können aber auch weitere Sequenzen positioniert werden, die zum Beispiel die Funktion eines Linkers mit bestimmten Restriktionsenzymschnittstellen oder eines Signal- bzw. Transitpeptides haben. Auch kann die Insertion von Sequenzen zur Expression von Fusionsproteinen führen.
Die Herstellung einer erfindungsgemässen Expressionskassette erfolgt beispielsweise durch Fusion eines erfindungsgemäßen Promotors mit einer zu exprimierenden Nukleotidsequenz, sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal.
Die erfindungsgemässen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können weitere Funktionselemente enthalten. Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der erfindungsgemässen Expressionskassetten, Vektoren oder transgenen Organismen haben. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien zu nennen:

a) Selektionsmarker, die eine Resistenz gegen einen Metabolismusinhibitor wie 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456), Antibiotika oder Biozide, bevorzugt Herbizide, wie zum Beispiel Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin, oder Phosphinotricin etc. verleihen. Besonders bevorzugte Selektionsmarker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen. Beispielhaft seien genannt: DNA Sequenzen, die für Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) kodieren und Glutaminsynthaseinhibitoren inaktivieren (bar und pat Gen), 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasegene (EPSP Synthasegene), die eine Resistenz gegen Glyphosat® (N-(phosphonomethyl)glycin) verleihen, das für das Glyphosat® degradierende Enzyme kodierende gox Gen (Glyphosatoxidoreduktase), das deh Gen (kodierend für eine Dehalogenase, die Dalapon inaktiviert), Sulfonylurea- und Imidazolinon inaktivierende Acetolactatsynthasen (ALS) oder Acetohydroxysäuresynthasen (AHAS) sowie bxn Gene, die für Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme kodieren. Der Selektionsmarker erlaubt eine Selektion der transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84).
b) Reportergene, die für leicht quantifizierbare Proteine kodieren und über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes gewährleisten (Schenborn E und Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13(1): 29-44).
- 1. β-Glucuronidase (GUS) oder das uidA Gen, das ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate kodiert (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6: 3901-3907).
- 2. R-Locus Gen: Kodiert ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine direkte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al. (1988) In: Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11: 263-282). Besonders vorteilhaft sind die Gene des R-Genkomplexes aus Mais. Der R-Genkomplex kodiert ein Protein, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten in den meisten Samen und Pflanzengeweben reguliert. Mais kann ein bis vier R-Allele aufweisen, die die Pigmentation in einer entwicklungs- und gewebeabhängigen Weise regulieren. Die transgene Expression eines R-Gens in einer Zelle führt zur Bildung eines rotes Pigmentes. Maislinien die dominante Allele der Gene der Anthocyaninbiosynthesewege tragen (C2, A1, A2, Bz1 und Bz2), aber ein rezessives Allel des R-Locus besitzen, würden bei Transformation und transgener Expression eine rote Pigmentation ergeben. Beispielhaft kann die Linie Wisconsin 22 verwendet werden, die das rg-Stadler Allel und TR112 enthält, ein K55 Derivat, das r-g, b, P1 ist. Alternative kann der Genotyp verwendet werden, solange die C1 und R Allele gemeinsam eingeführt werden.
- 3. β-Lactamasegen (Sutcliffe (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75: 3737-3741): Kodiert ein Enzym für verschiedene chromogene Substrate (z. B. PADAC, eine chromogenes Cephalosporin).
- 4. xylE Gen (Zukowsky et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80: 1101-1105): Kodiert eine Catecholdioxygenase, die chromogene Catechole umsetzen kann.
- 5. Alpha-Amylase Gen (Ikuta et al. (1990) Bio/technol. 8: 241-242).
- 6. Tyrosinasegen (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129: 2703-2714): Kodiert für ein Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.
- 7. β-Galactosidasegen, kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen.
- 8. Luciferase (lux) Gen (Ow et al. (1986) Science, 234: 856-859; Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10: 324-414) erlaubt Bioluminescenzdetektion. Luciferasen wie beispielsweise die "firefly luciferase" ermöglichen eine Quantifizierung unter Verwendung von Röntgenfilmen, Scintillationszählern, Fluorescenzspektrophometern, sensitiven, photonenzählenden Kameras oder Luminometern. Dazu kommen chromogene Substrate und andere Hilfsstoffe zum Einsatz. Das System kann zur Durchmusterung von Populationen angewendet werden.
- 9. Aequoringen (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3): 1259-1268): Kann in der Calcium-sensitiven Bioluminescenzdetektion verwendet werden.
- 10. GFP ("green fluorescent protein"; Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6: 325-330; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques. 23(5): 912-8; Sheen et al. (1995) Plant Journal 8(5): 777-784; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6): 2122-2127; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12): 5888-5893; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16: 267-271; WO 97/41228). Die GFP-Expression in einer Pflanze oder Zelle kann infolge Illumination mit Licht bestimmter Wellenlängen visualisiert werden.
- 11. Chloramphenicolacetyltransferase, Neomycinphosphotransferase (NPT), Nopalinsynthase (NOS), Octopinsynthase (OCS) können ebenfalls als Markerproteine verwendet werden.
c) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in zum Beispiel E.coli gewährleisten. Beispielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
d) Elemente, die für eine Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation erforderlich sind, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

Abhängig von der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz ermöglichen sich zahlreiche vorteilhafte Anwendungsformen für die erfindungsgemäßen Promotoren, Vektoren, Expressionskassetten oder mit denen transformierte Organismen. Dem Fachmann sind zahlreiche Möglichkeiten der Verwendung bekannt. Neben der Verbesserung pflanzlichen Eigenschaften (z. B. Nährstoffgehalt oder -zusammensetzung, Geschmack, Ertrag etc.) können beispielsweise auch andere vorteilhafte Eigenschaften wie männliche oder weibliche Sterilität, erhöhte Stresstoleranz und/oder Resistenz (gegen z. B. Trockenheit, Hitze, Salz, Kälte, Frost, erhöhte Feuchtigkeit, oxidativen Stress etc.) erzielt werden. Die infolge genannten Anwendungen und Nukleinsäuresequenzen sind daher beispielhaft und nicht einschränkend zu verstehen.

1. Induktion einer Pathogenresistenz

Die natürlichen Abwehrmechanismen einer Pflanze gegen Pathogene sind oft unzureichend. Die Einführung fremder Gene aus Pflanzen, Tieren oder mikrobiellen Quellen kann die Abwehr verstärken. Beispiel sind der Schutz gegen Insektenfrass in Tabak durch Expression des Bacillus thuringiensis Endotoxin (Vaeck et al. (1987) Nature 328: 33-37) oder der Schutz des Tabaks gegen Pilzbefall durch Expression einer Chitinase aus der Bohne (Broglie et al. (1991) Science 254: 1194-1197). Bisherige Ansätze basierten auf einer konstitutive Überexpression dieser Gene. Wünschenswerterweise sollten aber diese Abwehrstoffe aber erst dann exprimiert werden, wenn die Notwendigkeit infolge eines Pathogenbefalls besteht. Eine konstitutive Überexpression - auch bei fehlendem Bedarf - kann sich nachteilig auf Wachstum, Ertrag und andere Eigenschaften der Pflanze auswirken. Außerdem kann es durch eine konstitutive Expression verstärkt zum Abschalten des Transgens kommen ("gene silencing").
Eine transgene Expression bestimmter Polypeptide kann zu einer erhöhten Resistenz gegen Befall durch Bakterien und Pilze führen. Bevorzugt ist die Expression von sogenannten "Peptidantibiotika", "Pathogenesis related" (PR) Proteinen, Toxinresistenz, sowie von Proteinen, die die Wirt-Pathogen Interaktion betreffen. Bevorzugte Peptid-Antibiotika zählen zur Klasse der Cecropine oder Magainine und inhibieren das Wachstum verschiedener Bakterien- und Pilzarten. Die Expression von PR-Genen kann ebenfalls eine Resistenz gegen Schädlinge verleihen. Diese Gene werden natürlicherweise infolge eines Schädlingsbefalls induziert und sind in verschiedene Klassen unterteilt (Bol et al. (1990) Annu Rev Phytopath 28: 113-138). Zu den PR-Proteinen zählen β-1,3-Glucanasen, Chitinasen, Osmotin und weitere Proteine. Andere Proteine zeigen eine fungizide Wirkung wie beispielsweise UDA (stinging nettle lectin) und Hevein (Broakaert et al. (1989) Science 245: 1100-1102; Barkai-Golan et al. (1978) Arch Microbiol 116: 119-124). Verschiedene pflanzliche Erkrankungen werden durch Phytotoxine verursacht. Enzyme, die derartige Toxine abbauen, können vorteilhaft zur Bekämpfung derartiger Erkrankungen eingesetzt werden. Auch die Veränderung struktureller Eigenschaften der Pflanze - wie beispielsweise Wachsgehalt oder Stärke der Cuticula - können vorteilhaft bei der Abwehr von Pathogenen sein, indem sie das Eindringen derselben in das pflanzliche Gewebe verhindern. Eine Resistenz gegen z. B. Pilze, Insekten, Nematoden und Krankheiten kann durch gezielte Absonderung oder Anreicherung bestimmter Metaboliten oder Proteine erreicht werden. Beispielhaft seien genannt Glucosinolate (Nematodenabwehr), Lysozyme aus nichtpflanzlichen Quellen wie zum Beispiel T4 Lysozym oder Lysozm aus verschiedenenen Säugern, Arcelin, α-Amylaseinhibitor, RNAsen oder Ribozyme sowie weitere unten aufgeführte Nukleinsäuresequenzen oder Proteine.
Dem Fachmann ist eine Vielzahl von Proteinen bekannt, deren rekombinante Expression zur Abwehr von Pathogenen vorteilhaft sind (u. a. Dunwell JM (2000) J Exp Bot 51 Spec No: 487-96).

1.1. Nukleinsäuresequenzen die eine Resistenz oder Toleranz gegen Insekten vermitteln

Beispielhaft seien zu nennen:
Bacillus thuringiensis Kristalltoxin-Gene (Bt-Gene; Watrud et al. (1985) In: Engineered Organisms and the Environment). Bt-Gene verleihen eine Resistenz gegen Lepidopteran oder Coleopteran Parasiten, wie beispielsweise den Maiszünsler (European Corn Borer (ECB)). Verschiedenen BT-Gene kodierend für vollständige oder verkürzte ("truncated") BT-Proteine sind beschrieben. Ferner sind BT-Gene beschrieben, bei denen die kodierende Sequenz hinsichtlich einer optimierten Expression in Nutzpflanzen angepasst wurde. Verfahren zu Herstellung derartigen künstlicher Gene sind dem Fachmann bekannt (US 5,500,365; US 5,689,052). Beispiele für derartig modifizierte Bt Toxigene schließen das synthetische Bt CryIA(b) Gen (Perlak et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 3324-3328) und das synthetische CryIA(c) Gen (WO 95/06128) ein. Zahlreiche dem Fachmann geläufige Beispiele für bevorzugte Bt-Gene sind beispielsweise unter der Internet-Adresse http: / / epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/index.html beschrieben.
Proteaseinhibitoren können ebenfalls eine Resistenz gegen Insektenbefall gewähren (Johnson et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86: 9871-9875). Besonders bevorzugt ist das Proteaseinhibitor-II Gen (pinII) aus Tomate oder Kartoffel. Ganz besonders bevorzugt ist eine kombinierte Koexpression eines pinII-Gens mit einem Bt-Gen. Bevorzugt ist ferner der "cowpea trypsin inhibitor" (CpTI; Hilder VA et al. (1989) Plant Mol Biol 13(6): 701-10).
Bevorzugt sind ferner Gene, die für Enzyme oder Kofaktoren kodieren, die eine Inhibition des Verdauungssystem von Insekten bewirken. Beispielhaft seinen Oryzacystatin und Amylaseinhibitoren (z. B. aus Weizen oder Gerste) genannt.
Lectine (Phytohemagglutinine) sind multivalente Kohlenhydrat-bindende Proteine mit der Fähigkeit rote Blutzellen verschiedener Spezies zu agglutinieren. Lectine haben insektizide Wirkung gegen eine Reihe von Schädlingen (Murdock et al. (1990) Phytochemistry 29: 85-89; Czapla and Lang (1990) J Econ Entomol 83: 2480-2485). Vorteilhaft einzusetzende Lectingene schließen Phytohemagglutinin, Schneeglöckchenlectin, Gersten- und Weizenkeimagglutinin (WGA), sowie Reisagglutinine ein (Gatehouse et al. (1984) J Sci Food Agric 35: 373-380), wobei WGA besonders bevorzugt ist.
Gene die die Produktion kleiner oder größerer Polypeptide mit insektizider Wirkung (z. B. lytische Peptide, Peptidhormone, Toxine oder Gifte) steuern sind ebenfalls umfasst. Beispiele sind die Juvenilhormon-Esterase (Hammock et al. (1990) Nature 344: 458-461) oder Verbindungen, die die Verpuppung von Insekten durch Inhibition der Expression oder der Aktivität der Ecdysteroid-UDP-glucosyltransferase beeinträchtigen. Vorteilhaft verwendbar sind auch Gene die für Avermectin kodieren (Avermectin und Abamectin; Campbell WC (ed.), In: Avermectin and Abamectin, 1989. Ikeda et al. (1987) J Bacteriol 169: 5615-5621), sowie Gene kodierend für Ribosomeninaktivierende Proteine (RIPs).
Enzyme, die die Integrität der Insektenhülle beeinträchtigen, sind ebenfalls bevorzugt. Beispielhaft umfasst sind Gene, die für Chitinasen (wie z. B. die chit42 Endochitinase aus Trichoderma harzianum; GenBank Acc.-No.: S78423) oder Glucanasen, Proteasen oder Lipasen kodieren, als auch Gene, die für die Produktion von Nikkomycin (Inhibitor der Chitinsynthese) verantwortlich sind.
Weiterhin sind Gene bevorzugt, die die Qualität der Pflanze als Insektennahrung reduzieren. Eine insektizide Wirkung kann durch Veränderung der Sterolzusammensetzung erzielt werden. Auch Lipoxygenase sind natürliche, pflanzliche Enzyme, denen die Eigenschaft zugeordnet werden kann, die Eignung einer Pflanze als Insektennahrung zu vermindern.
Erreichen einer Insektenabwehr oder -anlockung zum Beispiel durch erhöhte Freisetzung flüchtiger Duft- oder Botenstoffe durch zum Beispiel Enzyme der Terpenbiosynthese. Bevorzugt ist die Expression von Enzyme mit einer Funktion in der Biosynthese von Alkaloiden wie Benzophenanthridinalkaloiden und Indolealkaloiden sowie von Enzyme der Terpenbiosynthese wie Monoterpene und Sesquiterpene.
Modifikation der Wachsesterbildung oder der Zusammensetzung der eingelagerten Oligosaccharide zur Verbesserung des Schutzes gegen Umwelteinflüsse oder zur Verbesserung der Verdaubarkeit beim Einsatz in Futter- oder Nahrungsmitteln. Beispielhaft sein die Überexpression der Endoxyloglucantransferase genannt. Bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für die Endoxyloglucantransferase (EXGT-A1) aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc. No: AF163819) kodieren.
Abwehr von Pathogenen durch Expression von Phenylammonialyasen und anderen Enzyme des Phenylpropanoidweges, die für die Biosynthese einer Vielzahl von Verbindungen basierend auf dem Phenylpropan-Grundgerüst verantwortlich sind wie z. B. Lignin, Phytoalexine, Pterocarpone, Furanocoumarine. Ebenso bevorzugt ist die Expression von Isoflavon-2-hydroxylasen sowie von Enzymen mit einer Funktion in der Ligninpolymerisation wie anionische Peroxidasen. Ferner bevorzugt ist die Expression von Zellwandproteinen wie Glycinhydroxyprolinreiche-Proteine (z. B. Exlensine).

1.2. Nukleinsäuresequenzen, die eine Resistenz oder Toleranz gegen gegen Viren vermitteln

Die transgene Expression bestimmter Gene kann eine Resistenz gegen Virusbefall gewähren. So kann beispielsweise der Virusbefall durch Expression viraler Hüllproteine verhindert werden (Cuozzo et al. (1988) Bio/Technology, 6: 549-553; Hemenway et al. (1988) EMBO J 7: 1273-1280; Abel et al. (1986) Science 232: 738-743). Auch die Expression von antisense Nukleinsäuresequenzen bestimmter viraler Gene (z. B. Gene des viralen Replikationsapparates) ist geeignet. Neben reinen antisense Ansätzen könne auch Ribozyme vorteilhaft eingesetzt werden. Weitere Ansätze umfassen die Verwendung von Satelliten-Viren.

2. Resistenz gegen abiotische Stressfaktoren bzw. Steigerung der Qualität und/oder Quantität des Ernteertrages

Eine Steigerung der Qualität und/oder Quantität des Ernteertrages (z. B. erhöhte Menge an Früchten oder Samen), Beeinflussung der wachstumsgeschwindigkeit zu schnellerem oder langsameren Wuchs, Ermöglichung des Wachstums außerhalb der üblichen Wachstumszeit, Resistenz gegen widrige Witterungsbedingungen (Hitze, Trockenheit, Nässe, Kälte, Frost) sind beispielhaft als vorteilhafte Eigenschaften zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche Verfahren, Proteine etc. bekannt, mit deren Hilfe diese Eigenschaften erzielen kann. Beispielhaft seien zu nennen:
Verbesserter Schutz des pflanzlichen Embryos gegen abiotische Stressfaktoren wie Trockenheit, Hitze, oder Kälte zum Beispiel durch Überexpression von dem "antifreeze polypeptides aus Myoxocephalus Scorpius (WO 00/00512), Myoxocephalus octodecemspinosus, dem Arabidopsis thaliana Transkriptionsaktivator CBF1, Glutamatdehydrogenasen (WO 97/12983, WO 98/11240), einem späten Embryogenesegen (LEA) zum Beispiel aus Gerste (WO 97/13843), Calcium-abhängigen Proteinkinasegenen (WO 98/26045), Calcineurinen (WO 99/05902), Farnesyltransferasen (WO 99/06580), Pei ZM et al., Science 1998, 282: 287-290), Ferritin (Deak M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 192-196), Oxalatoxidase (WO 99/04013; Dunwell JM Biotechnology and Genetic Engeneering Reviews 1998, 15: 1-32), DREB1A-Faktor (dehydration response element B 1A; Kasuga M et al., Nature Biotechnology 1999, 17: 276-286), Genen der Mannitol- oder Trehalosesynthese wie der Trehalosephosphatsynthase oder der Trehalosephosphatphosphatase (WO 97/42326), oder durch Inhibition von Genen wie der Trehalase (WO 97/50561). Besonders bevorzugt sind Nukleinsäuren, die für den transkriptionellen Aktivator CBF1 aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc.-No.: U77378) oder das "antifreeze protein" aus Myoxocephalus octodecemspinosus (GenBank Acc.-No.: AF306348) oder funktionelle Äquivalente derselben kodieren.

3. Induktion einer Resistenz gegen Herbizide, Antibiotika oder andere Biozide

Verschiedene Beispiele für Nukleinsäuresequenzen, die derartige Resistenz verleihen sind oben beschrieben. Die Kombination dieser Sequenzen mit einem der erfindungsgemäßen Promotoren ist besonders vorteilhaft, da so die Resistenz lediglich im Bedarfsfall (nach Induktion mit einem chemischen Induktor) und nicht konstitutiv erzeugt werden kann. Die konstitutive Expression hat neben den nachteiligen Auswirkungen auf den Energiehaushalt der Pflanze weitere potentiell negative Konsequenzen bei der Zulassung unter Verbraucherakzeptanz. Eine Expression der Resistenz ist unter praktischen Gesichtspunkten - im Labor - nur bei der Herstellung einer transgenen Pflanze (Verwendung der Resistenz als Selektionsmarker) oder - in der Landwirtschaft - nur während des Einsatzes von Herbiziden erforderlich. Vor allem im letzteren Fall wäre die Kombination von Herbizid und chemischen Induktor in einer Formulierung als vorteilhafte Anwendung zu sehen.

4. Induktion der Expression von Reporter- oder Markergenen

Verschiedene Nukleinsäuresequenzen, die als Reporter oder Markergen fungieren können, sind oben beschrieben. Die Kombination dieser Sequenzen mit den erfindungsgemäßen Promotoren ist eine besonders bevorzugte Ausführungsform, ermöglicht sie doch - beispielsweise im Rahmen der Durchmusterung von chemischen Substanzbibliotheken - die Identifizierung weiterer chemischen Induktoren. Aufgrund des Expressionsverhaltens der BCI-3 und BCI-4 Gene kann vermutet werden, dass chemische Induktoren dieser Gene zugleich auch eine SAR induzieren. Solche chemischen Verbindungen sind außerordentlich interessante Verbindungen zum Einsatz in der Landwirtschaft. Ähnlich dem BION© haben sie das Potential, nach Applikation auf die Pflanze eine Resistenz gegen Pathogene zu induzieren.
Ein Gegenstand der Erfindung umfasst daher Verfahren zur Identifizierung von Pathogenresistenz-induzierenden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Expressionskassette bestehend aus einem Reportergen in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus
- a) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No: 1 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben, und
- b) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No: 2 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben
in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eine Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, und
b) der Organismus oder das Gewebe, Organ, Teil, Zellkultur oder Zelle desselben mit einer chemischen Verbindung ausgewählt aus einer Bibliothek chemischer Verbindungen behandelt wird, und
c) die Induktion der Expression des Reportergens gemessen wird.

Besonders vorteilhaft ist bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Promotoren mit den oben beschriebenen Nukleinsäuren und Verfahren, die Möglichkeit die gewünschten Eigenschaften zu einer bestimmten Zeit in einem bestimmten Ausmaß und in einem bestimmten Organ der Pflanze zu erzielen. Die Effizienz einer Pathogenresistenz (gg. Krankheiten oder Insekten) kann durch zeitliche Steuerung der Expression gesteigert werden (Uknes et al. (1992) Plant Cell 4: 645-656; Ward et al. (1991) Plant Cell 3: 1085-1094; Gould (1988) Bioscience 38: 26-33). Besonders die chemisch induzierbare Regulation von Entwicklungsprozessen wie Homeosis, Keimen, Seitentriebbildung ("tillering"), Aussprießen ("sprouting"), Blühen, Anthesis, Fruchtreifung oder Welken bietet zahlreiche vorteilhafte Anwendungsformen.
Dem Fachmann ist bekannt, dass viele vorteilhafte Effekte nicht nur durch Expression von Fremd-Proteinen, sondern auch durch Reprimierung endogener Proteine erzielt werden können. Die Verfahren zur Reprimierung der Expression endogener Gene sind dem Fachmann geläufig. Beispielhaft jedoch nicht einschränkend seien zu nennen:

I. Expression von antisense-Nukleinsäuresequenzen

Eine "antisense" Nukleinsäure meint zunächst eine Nukleinsäuresequenz die ganz oder teilweise zu zumindest einem Teil des "sense"-Stranges ein zu reprimierenden Zielproteins komplementär ist. Dem Fachmann ist bekannt, dass er alternative cDNA oder das korrespondierendes Gen als Ausgangsmatrize für entsprechende antisense-Konstrukte verwenden kann. Bevorzugt ist die "antisense" Nukleinsäure komplementär zu dem kodierenden Bereich des Zielproteins oder einem Teil desselben. Das "antisense" Nukleinsäure kann aber auch zu der nicht-kodierenden Region oder einem Teil derselben komplementär sein. Ausgehend von der Sequenzinformation zu einem Zielprotein, kann eine antisense Nukleinsäure unter Berücksichtigung der Basenpaarregeln von Watson und Crick in der dem Fachmann geläufigen Weise entworfen werden. Die antisense Nukleinsäure umfasst in einer bevorzugten Ausführungsform α-anomere Nukleinsäuremoleküle. α-Anomere Nukleinsäuremoleküle bilden besondere doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in denen im Unterschied zu den normalen β-Einheiten die Stränge parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al. (1987) Nucleic Acids Res 15: 6625-6641).
Vorteilhaft kann die antisense-Strategie mit einem Ribozym- Verfahren gekoppelt werden. Ribozyme sind katalytisch aktive RNA Sequenzen, die gekoppelt an die antisense Sequenzen, die Zielsequenzen katalytisch spalten (Tanner NK (1999) FEMS Microbiol Rev 23 (3): 257-75). Dies kann die Effizienz einer anti-sense Strategie erhöhen. Die Expression von Ribozymen zur Verminderung bestimmter Proteine ist dem Fachmann bekannt (EP 291 533, EP 321 201, EP 360 257). Geeignete Zielsequenzen und Ribozyme können zum Beispiel wie bei Steinecke (Ribozymes, Methods in Cell Biology 50, Galbraith et al. eds, Academic Press, Inc. (1995), 449-460) beschrieben, durch Sekundärstrukturberechnungen von Ribozym- und Ziel-RNA sowie durch deren Interaktion bestimmt werden (Bayley CC et al. (1992) Plant Mol Biol 18(2): 353-361; Lloyd AM and Davis RW et al. (1994) Mol Gen Genet 242(6): 653-657). Beispielhaft sind "hammerhead"-Ribozyme zu nennen (Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591). Bevorzugte Ribozyme basieren auf Derivaten der Tetrahymena L-19 IVS RNA (US 4,987,071; US 5,116,742). Weitere Ribozyme mit Selektivität für eine L119 mRNA können selektioniert werden (Bartel D und Szostak JW (1993) Science 261: 1411-1418).

II. Kosuppression

Durch Expression einer sense-RNA die homolog zu der eines endogenen Transkriptes ist, kann ebenfalls die Expression des entsprechenden endogenen Proteins vermindert werden (Kosuppression). In Tabak, Tomate und Petunie ist demonstriert worden, dass die Expression von sense-RNA zu einem endogenen Gen, die Expression desselben vermindern oder ausschalten kann, ähnlich wie es für antisense Ansätze beschrieben wurde (Goring et al. (1991) Proc Natl Acad Sci USA 88: 1770-1774; Smith et al. (1990) Mol Gen Genet 224: 447-481; Napoli et al. (1990) Plant Cell 2: 279-289; Van der Krol et al. (1990) Plant Cell 2: 291-99). Dabei kann eingeführte Konstrukt das zu vermindernde Gen ganz oder nur teilweise repräsentieren. Die Möglichkeit zur Translation ist nicht erforderlich. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (EP 465 572; EP 647 715; US 5,283,184; US 5,231,020).

III. "double-stranded RNA Interference" (dsRNAi)

Ganz besonders bevorzugt ist das Verfahren der Genregulation mittels doppelsträngiger RNA ("double-stranded RNA interference"). Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann bekannt und im Detail beschrieben (z. B. Matzke MA et al. (2000) Plant Mol Biol 43: 401-415; Fire A. et al (1998) Nature 391: 806-811; WO 99/32619; WO 99/53050; WO 00/68374; WO 00/44914; WO 00/44895; WO 00/49035; WO 00/63364). Auf die in den angegebenen Zitaten beschriebenen Verfahren und Methoden wird ausdrücklich Bezug genommen. Hier wird durch gleichzeitige Einbringung von Strang- und Gegenstrang eine hocheffiziente Unterdrückung nativer Gene bewirkt.
Dem Fachmann ist ferner bekannt, dass er die Genexpression auch unter Verwendung künstlicher Transkriptionsfaktoren beispielsweise vom Typ der Zinkfingerproteine regulieren kann (Beerli RR et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 97(4): 1495-1500). Diese Faktoren lagern sich in den regulatorischen Bereichen der zu exprimierenden oder zu reprimierenden endogenen Gene an und bewirken, je nach Gestaltung des Faktors, eine Expression oder Repression des endogenen Gens.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Organismen, transformiert mit wenigstens einer erfindungsgemässen Expressionskassette oder einem erfindungsgemässen Vektor, sowie Zellen, Zellkulturen, Gewebe, Teile - wie zum Beispiel bei pflanzlichen Organismen Blätter, Wurzeln usw. - oder Vermehrungsgut abgeleitet von solchen Organismen.
Unter Organismus, Ausgangs- oder Wirtsorganismen werden prokaryotische oder eukaryotische Organismen, wie beispielsweise Mikroorganismen oder pflanzliche Organismen verstanden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Bakterien, Hefen, Algen oder Pilze.
Bevorzugte Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Agrobacterium, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis. Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemässen Konstrukte befähigt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobacterium und insbesondere der Art Agrobacterium tumefaciens.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 beschriebene Pilze.
Als transgene Organismen bevorzugte Wirts- oder Ausgangsorganismen sind vor allem Pflanzen. Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niedrigerer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen sind ferner die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut und Kulturen, zum Beispiel Zell- oder Kalluskulturen. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in einem frühen Entwicklungsstadium.
Einjährige, mehrjährige, monocotyledone und dicotyledone Pflanzen sind bevorzugte Wirtsorganismen für die Herstellung transgener Pflanzen. Die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen sind insbesondere ausgewählt unter monokotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel Getreidearten der Gattung Gramineae (wie Reis, Mais, Weizen), insbesondere Weizen, Gerste, Hirse, Roggen, Triticale, Mais, Reis oder Hafer sowie dem Zuckerrohr. Ferner sind die erfindungsgemässen transgenen Pflanzen insbesondere ausgewählt unter dikotylen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel

- Brassicacae (Cruciferae) wie Raps, Kresse, Arabidopsis, Rübe, Blumenkohl, Broccoli, Kohlarten oder Canola,
- Leguminosae wie Soja, Alfalfa, Erbse, Luzerne, Bohnengewächsen oder Erdnuss
- Solanaceae wie Kartoffel, Tabak, Tomate, Aubergine oder Paprika,
- Umbelliferae wie Karotte oder Sellerie.
- Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes, Salat oder Calendula,
- Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini,
- Rubiaceae wie Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch)
- Theaceae wie Camillia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch)
- Sterculiaceae wie Theobroma cacao (Kakaostrauch)

Besonders bevorzugt sind Arabidopsis thaliana, Nicotiana tabacum, Tagetes erecta, Calendula officinalis sowie alle Gattungen und Arten, die als Nahrungs- oder Futtermittel zum Einsatz kommen, wie die beschriebenen Getreidearten, oder sich zur Herstellung von Ölen eignen, wie Ölsaaten (wie zum Beispiel Raps), Nussarten, Soja, Sonnenblume, Kürbis und Erdnuss.
Pflanzliche Organismen im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen oder Cyanobakterien, sowie Moose.
Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella.
Die Herstellung eines transformierten Organismus oder einer transformierten Zelle erfordert, dass die entsprechende DNA (z. B. eine der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren) in die entsprechende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (siehe auch Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185: 527-537). So kann die DNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bombardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt werden. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylenglycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protoplastenfusion mit anderen DNA- enthaltenden Einheiten wie Minicells, Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zur Einführung von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Solche und weitere Verfahren sind beschrieben u. a. bei Bilang et al. (1991) Gene 100: 247-250; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228: 104-112; Guerche et al. (1987) Plant Science 52: 111-116; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75: 30-36; Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73; Howell et al. (1980) Science 208: 1265; Horsch et al. (1985) Science 227: 1229-1231; DeBlock et al. (1989) Plant Physiology 91: 694-701; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds.) Academic Press Inc. (1988); und Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds.) Academic Press Inc. (1989).
Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone, die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung und die Mikroinjektion.
Neben diesen "direkten" Transformationstechniken kann eine Transformation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes durchgeführt werden (Horsch RB et al. (1985) Science 225: 1229; Marton L (1984) Cell Culture and Somatic Ceil Genetics of Plants 1: 514-521). Diese Stämme enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agrobacterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzenzelle integriert.
Die Agrobacterium vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die direkten Transformationstechniken sich für jeden Zelltyp eignen.
In einer vorteilhaften Ausführungsform wird die Einführung der Expressionskassette mittels Plasmidvektoren realisiert. Bevorzugt sind solche Vektoren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.
Im Falle von Injektion oder Elektroporation von DNA in pflanzliche Zellen sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Einfache Plasmide wie die der pUC-Reihe können verwendet werden. Sollen vollständige Pflanzen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist er erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektionierbares Markergen befindet.
Transformationstechniken sind für verschiedene monokotyle und dikotyle pflanzliche Organismen beschrieben. Ferner stehen verschiedene mögliche Plasmidvektoren für die Einführung fremder Gene in Pflanzen zur Verfügung, die in der Regel einen Replikationsursprung für eine Vermehrung in E.coli und ein Markergen für eine Selektion transformierter Bakterien enthalten. Beispiele sind pBR322, pUC Reihe, M13mp Reihe, pACYC184 etc.
Die Expressionkassette kann in den Vektor über eine geeignete Restriktionsschnittstelle eingeführt werden. Das entstandene Plasmid wird zunächst in E.coli eingeführt. Korrekt transformierte E.coli werden selektioniert, gezüchtet und das rekombinante Plasmid mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewonnen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen.
Transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können von untransformierten selektioniert werden, wenn ein selektionierbarer Marker Bestandteil der eingeführten DNA ist. Als Marker kann beispielhaft jedes Gen fungieren, dass eine Resistenz gegen Antibiotika oder Herbizide zu verleihen vermag. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentrationen eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp abtöten. Beispiel sind das bar Gen, dass Resistenz gegen das Herbizid Phosphinotricin verleiht (Rathore KS et al. (1993) Plant Mol Biol 21(5): 871-884), das nptII Gen, dass Resistenz gegen Kanamycin verleiht, das hpt Gen, das Resistenz gegen Hygromycin verleiht, oder das EPSP-Gen, das Resistenz gegen das Herbizid Glyphosat verleiht.
Je nach Methode der DNA-Einführung können weitere Gene auf dem Vektorplasmid nützlich sein. Werden Agrobacterium verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvektor (englisch: shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Wenn zum Beispiel ein Ti oder Ri Plasmid zur Transformation verwendet werden soll, ist zumindest die rechte Begrenzung, meistens jedoch die rechte und die linke Begrenzung der Ti oder Ri Plasmid T-DNA als flankierende Region mit der einzuführenden Expressionskassette verbunden. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet. Binäre Vektoren können sowohl in E.coli als auch in Agrobacterium replizieren. Sie enthalten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begrenzungssequenz. Sie können direkt in Agrobacterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163: 181-187). Das Selektionsmarkergen erlaubt eine Selektion transformierter Agrobakteria und ist zum Beispiel das nptII Gen, das eine Resistenz gegen Kanamycin verleiht. Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobacterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich. Ein so transformiertes Agrobacterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden.
Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP 120516; Hoekema, In: The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V; Fraley RT et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80(15): 4803-7. and An et al. (1985) EMBO J 4: 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBIN19 (Clontech Laboratories, Inc. USA).
Für den Transfer der DNA auf die pflanzliche Zelle werden pflanzliche Explantate mit Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes kokultiviert. Ausgehend von infiziertem Pflanzenmaterial (z. B. Blatt-, Wurzel- oder Stengelteile, aber auch Protoplasten oder Suspensionen von Pflanzenzellen) können ganze Pflanzen unter Verwendung eines geeigneten Mediums, dass zum Beispiel Antibiotika oder Biozide zur Selektion transformierten Zellen enthalten kann, regeneriert werden. Die erhaltenen Pflanzen können dann auf die Präsenz der eingeführten DNA, hier der erfindungsgemässen Expressionskassette, durchmustert werden. Sobald die DNA in das Wirtsgenom integriert ist, ist der entsprechende Genotyp in der Regel stabil und die entsprechende Insertion wird auch in den Nachfolgegenerationen wiedergefunden. In der Regel enthält die integrierte Expressionskassette einen Selektionsmarker, der der transformierten Pflanze eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Beispiel ein Herbizid) oder ein Antibiotikum wie Kanamycin, G 418, Bleomycin, Hygromycin oder Phosphinotricin etc. verleiht. Der Selektionsmarker erlaubt die Selektion von transformierten Zellen von untransformierten (McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5: 81-84). Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.
Die genannten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus (1991) Ann Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42: 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu transformieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12: 8711).
Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen aus. Aus diesen noch undifferenzierten Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.
Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nukleinsäuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermehrung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektionsmethoden ermittelt werden.
Erfindungsgemäss sind ferner von den oben beschriebenen transgenen Organismen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte.
Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemässe, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futtermittel verwendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der oben beschriebenen erfindungsgemässen, transgenen Organismen und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile - wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs- oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.
Bevorzugt ist ferner ein Verfahren zur rekombinanten Herstellung von Pharmazeutika oder Feinchemikalien in Wirtsorganismen wobei ein Wirtsorganismus mit einer der oben beschriebenen Expressionskassetten transformiert wird und diese Expressionskassette ein oder mehrere Strukturgene enthält, die für die gewünschte Feinchemikalie kodieren oder die Biosynthese der gewünschten Feinchemikalie katalysieren, der transformierte Wirtsorganismus gezüchtet wird und die gewünschte Feinchemikalie aus dem Züchtungsmedium isoliert wird. Dieses Verfahren ist für Feinchemikalien wie Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und synthetische Geschmacks-, Aroma- und Farbstoffe breit anwendbar. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Vitaminen und Vitaminvorstufen insbesonders Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden. Die Züchtung der transformierten Wirtsorganismen sowie die Isolierung aus den Wirtsorganismen bzw. aus dem Züchtungsmedium erfolgt mit dem Fachmann bekannten Verfahren. Die Produktion von Pharmazeutika, wie zum Beispiel Antikörpern oder Vakzinen ist beschrieben bei Hood EE und Jilka JM (1999) Curr Opin Biotechnol 10(4): 382-6; Ma JK Vine ND (1999) Curr Top Microbiol Immunol 236: 275-92. Sequenzen

Abbildungen

Die folgenden Abbildungen zeigen in-situ Hybridisierungen von unterschiedlichen pflanzlichen Organen zu unterschiedlichen Entwicklungszeitpunkten:
Fig. 1 Überblick über die BCI-3 Promotor-Reporter- Konstrukte, die für den transienten Assay verwendet wurden.
Fig. 2 Induktion der BCI3-Promotoraktivität durch BTH (BION). Ausgewertet wurden 8 Blattseqmente pro Experiment. Auf der y-Achse ist die Anzahl der GFP positiven Zellen [GFP] angegeben. Auf der y-Achse sind zum einen der gesamte BCI3-Promotor (BCI3-Prom 1700) sowie die verschiedenen Deletionsvarianten (BCI3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) aufgeführt. Angegeben sind jeweils die Ergebnisse bei mit BTH behandelten Blättern (weiße Balken) bzw. unbehandelten Blättern (schwarze Balken). Transformation mit dem pGFP Leervektor ergab keine GFP positiven Zellen. Die hohe Hintergrundaktivität bei unbehandelten Zellen ist vermutlich auf die Verletzung der Zellen infolge des Beschusses mit den Wolframpartikeln zurückzuführen (s. u.).
Fig. 3 Induktion der BCI3-Promotoraktivität durch Jasmonat (JA). Ausgewertet wurden 8 Blattseqmente pro Experiment. Auf der y-Achse ist die Anzahl der GFP positiven Zellen [GFP] angegeben. Auf der y-Achse sind zum einen der gesamte BCI3-Promotor (BCI3-Prom 1700) sowie die verschiedenen Deletionsvarianten (BCI3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) aufgeführt. Angegeben sind jeweils die Ergebnisse bei mit JA behandelten Blättern (weiße Balken) bzw. unbehandelten Blättern (schwarze Balken). Transformation mit dem pGFP Leervektor ergab keine GFP positiven Zellen. Die hohe Hintergrundaktivität bei unbehandelten Zellen ist vermutlich auf die Verletzung der Zellen infolge des Beschusses mit den Wolframpartikeln zurückzuführen (s. u.).
Fig. 4 Repression der BCI3-Promotoraktivität durch Sorbitol. Ausgewertet wurden 8 Blattseqmente pro Experiment. Auf der y-Achse ist die Anzahl der GFP positiven Zellen [GFP] angegeben. Auf der y-Achse sind zum einen der gesamte BCI-3 Promotor (BCI3-Prom 1700) sowie die verschiedenen Deletionsvarianten (BCI3-Prom 300; BCI3-Prom 600; BCI3-Prom 900; BCI3-Prom 1200) aufgeführt. Angegeben sind jeweils die Ergebnisse bei mit Sorbitol behandelten Blättern (weiße Balken) bzw. unbehandelten Blättern (schwarze Balken). Transformation mit dem pGFP Leervektor ergab keine GFP positiven Zellen. Die hohe Hintergrundaktivität bei unbehandelten Zellen ist vermutlich auf die Verletzung der Zellen infolge des Beschusses mit den Wolframpartikeln zurückzuführen (s. u.).
Fig. 5 Analyse der BCI-3 und BCI-4 Promotoreigenschaften durch Northernblot Analysen.

A: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach DCINA- Applikation

Fünf Tage alte Gerstenkeimlinge der Mutante A89 wurden mit 5 mg/l DCINA bezogen auf das Bodenvolumen oder mit der Leerformulierung WP gegossen. Primärblätter wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) geerntet und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (10 µg RNA pro Spur) wurde die Expression der BCI-Gene in Northern- Blot-Analysen untersucht. Rechts ist die jeweilige abgeschätzte Transkriptgröße in Kilobasenpaaren (kb) angegeben. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.

B: Transkriptakkumulation der BCI-Gene in Epidermis und Mesophyll nach BTH-Applikation

Sechs Tage alte Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit 20 mg/l BTH bezogen auf das Bodenvolumen oder mit der Leerformulierung WP gegossen. Primärblätter wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) geerntet, die abaxiale Epidermis vom restlichen Blatt (Mesophyll) getrennt. Nach gelelektrophoretischer Trennung (6,8 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Fluorescein- (BCI-4) oder radioaktiv markierten (BCI-3) Sonden unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromidvermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV- Licht überprüft.

C: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach SA-Applikation

Sieben Tage alte Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit 100 mg/l SA bezogen auf das Bodenvolumen oder mit Wasser (H₂O) gegossen. Primärblätter der Gerstenpflanzen wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) geerntet und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (9 bis 10 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.

D: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach JM-Applikation

Primärblattsegment sieben Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden auf 45 µM Jasmonsäuremethylester (JM) oder Wasser (H₂O) "gefloatet". Blattproben wurden zu den auf der x-Achse angegebenen angegebenen Zeitpunkten (Stunden nach Induktion) entnommen und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (9 bis 10 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.
Fig. 6 Analyse der BCI-3 und BCI-4 Promotoreigenschaften durch Northernblot Analysen.

A: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach Sorbitapplikation

Primärblattsegmente sieben Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid (I) wurden auf 1 M Sorbit (S) oder Wasser (K) "gefloatet". Blattproben wurden nach 48 h entnommen und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (10 µg RNA pro Spur) wurden Northern Blots mit Transkript- oder DNA-Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV- Licht überprüft. BCI-4 zeigte nach Sorbitbehandlung keine differentielle Expression.

B: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach Verwundung der Primärblätter

Primärblätter sieben Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit Nadeln perforiert, Kontrollblätter blieben unverletzt. Nach Extraktion von Gesamt-RNA, gelelektrophoretischer Trennung (9 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA Transkript- oder DNA-Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft. BCI-4 zeigte nach Verwundung keine differentielle Expression, BCI-3 hingegen eine schnelle und langanhaltende Induktion.

C: Transkriptakkumulation von BCI-4 in DCINA induzierten und Bgh inokulierten Primärblättern

Sieben Tage alte Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit 10 mg/l DCINA, bzw. mit der Leerformulierung WP gegossen und drei Tage später mit BghA6 oder mock-inokuliert (Zeitpunkt der Inokulation). Nach Extraktion von Gesamt- RNA aus Primärblättern, gelelektrophoretischer Trennung (10 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Transkriptsonden von BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.

D: Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach Injektion verschiedener Bakterien

Primär- und Sekundärblätter vierzehn Tage alter Gerstenkeimlinge cv. Ingrid wurden mit Suspensionen von Pseudomonas syringae pv. tomato (DC), P. s. pv. syringae (Pss), P. s. pv. glycinea (PG), Bacillus subtilis (Bs), bzw. mit 5 mM MgSO4 (K) infiltriert. Die Blattproben wurden zu den angegeben Zeitpunkten geerntet und in oberen (o), mittleren (m) und unteren (u) Bereich infiltrierter Blätter sowie nicht-infiltrierte Blätter (systemisch, s) unterteilt. Nach Extraktion von Gesamt-RNA, gelelektrophoretischer Trennung (10 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit radioaktiv markierten Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter stringenten Bedingungen hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft. BCI-4 zeigte nach Verwundung keine differentielle Expression.
Fig. 7 Analyse der BCI-3 und BCI-4 Promotoreigenschaften in Weizen durch Northernblot Analysen.
Untersucht wurde die Transkriptakkumulation der BCI-Gene nach BTH-Applikation oder Echtem Weizenmehltaupilz (Bgt)-Inokulation von Weizenpflanzen. Vierzehn Tage alte Weizenpflanzen cv. Kanzler wurden mit 100 mg/l BTH (BTH) oder zur Kontrolle mit der Leerformulierung WP (K) besprüht, bzw. mit Echtem Weizenmehltaupilz (Bgt) inokuliert. Sekundärblätter wurden zu den angegebene Zeitpunkten (dpt/dpi) geerntet und Gesamt-RNA extrahiert. Nach gelelektrophoretischer Trennung (ca. 10 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit Sonden von BCI-3 und BCI-4 unter weniger stringenten (60°C) Bedingungen hybridisiert als Gerstenproben. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV- Licht überprüft. Man erkennt eine starke, schnelle Induktion von BCI-3 und BCI-4 infolge der BTH Applikation, die nicht infolge einer Pathogen (Bgh) Infektion zu beobachten ist.
Fig. 8 Gewebespezifische Expression von BCI-4
Folgende Gewebe wurden im Laufe der Entwicklung von Gerstenpflanzen cv. Ingrid geerntet: Embryo ("E", ein Tag vorgekeimt), Wurzel ("Wurzel", 10 Tage nach Aussaat), Primärblatt ("1. Bl."), Sekundärblatt ("2. Bl."), Quartärblatt ("4. Bl.", Beginn der Bestockung)), Fahnenblatt ("Fa.Bl.", 4 Monate nach Aussaat), Halm und Ähre ("Halm", "Ähre", Beginn des Ährenschiebens, 4 Monate nach Aussaat).
Jeweils drei Tage vor der Ernte erfolgte eine Gießbehandlung mit 20 mg/l BTH ("+") bezogen auf das Bodenvolumen, oder keine Behandlung ("-"). Interzelluläre Waschflüssigkeit (IWF) wurde zwei Tage nach der Applikation von 20 mg/l BTH ("+"), bzw. der äquivalenten Menge der Leerformulierung (WP, "-") bezogen aus das Bodenvolumen aus sieben Tagen alten Gerstenpflanzen cv. Ingrid gewonnen. Nach Extraktion von Gesamt-RNA, gelelektrophoretischer Trennung (10,5 µg RNA pro Spur) und Herstellung von Northern Blots wurde die mRNA mit BCI-4 Sonde hybridisiert. Die gleichmäßige RNA-Beladung des Gels wurde anhand Ethidiumbromid-vermittelter Fluoreszenz der ribosomalen RNA unter UV-Licht überprüft.

Beispiele

Allgemeine Methoden

Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E.coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt. Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor oder einem ABI-310 Sequencers (ABI) nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467).

Beispiel 1

Pflanzen, Pathogene und Inokulation

Die Gerstensorte Ingrid (Hordeum vulgare L. cv Ingrid)stammt von James McKey, University of Uppsala, Schweden. Die Gerstensorte Golden Promise wurden von Paul Schulze-Lefert, Max-Planck-Institut für Züchtungsforschung, Köln, zur Verfügung gestellt.
Das 12 bis 36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wurde, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8 × 8 cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen wurden in Klimaschränken oder -kammern bei 16 bis 18°C, 50 bis 60% relativer Luftfeuchte und einem 16-stündigen Licht/8-stündigen Dunkelheitszyklus mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 µmols-¹m-² Photonenflussdichte) 5 bis 8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt wurden, waren diese vollständig entwickelt. Pflanzen, die bis zur Entwicklung von Ähren kultiviert werden sollten, wurden einzeln in Fruhstorfer Erde LD 80 getopft, regelmäßig gegossen, bei Bedarf in größere Töpfe umgetopft und im Gewächshaus zusätzlich beleuchtet.
Für die Untersuchung verschiedener Blattgewebe wurde zu verschiedenen Erntezeitpunkten die Epidermis der abaxialen Blattspreite von Gerstenprimärblättern abgezogen und getrennt vom restlichen Blattgewebe (Mesophyll und Epidermis der adaxialen Blattspreite) in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70°C aufbewahrt.
Für die Inokulation von Gerstenpflanzen mit dem Echten Gerstenmehltaupilz wurden Konidiosporen von Blumeria [syn Erysiphe] graminis f. sp. hordei Speer der Rasse A6 (BghA6) verwendet (Wiberg A (1974) Hereditas 77: 89-148). Dieser wurde vom Jörn Pons-Kühnemann, Institut für Biometrie, JLU Gießen bereitgestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgte in Klimakammern zu den gleichen Bedingungen, wie sie oben für die Pflanzen beschrieben sind, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, 7 Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise bei einer Dichte von 100 Konidia/mm².
Die Inokulation mit BghA6 erfolgte unter Verwendung von 7 Tagen alten Keimlingen durch Abschütteln der Konidien bereits befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit ca. 1 bis 8 Konidien/mm (soweit nicht anders angegeben).
Für die Inokulation mit dem Echten Weizenmehltaupilz wurden Konidien von Blumeria graminis f. sp. tritici Speer (Bgt) verwendet. Bei Bgt handelte es sich um ein Feldisolat aus Aachen, das 1995 von Uli Beckhove, Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ) Gießen, von Weizen isoliert und dem Institut zur Verfügung gestellt wurde. In Klimakammern bzw. -schränken wurde das Isolat unter den oben genannten Bedingungen auf Weizen cv. Kanzler (Saatzucht Engelen-Büchling oHG, Büchlingen/Oberschneiding) erhalten.
Cochliobolus sativus Drechsler ex Dastur (anamorph: Bipolaris sorokiniana [Sacc. in Sorok.] Shoemaker) Feldisolat KN1 aus Banaras, Indien, wurde von Jagdish Kumar, Indian Council of Agricultural Research, Karnal, Indien, im April 1999 isoliert und zur Verfügung gestellt. Ein anderes Cochliobolus sativus Feldisolat aus Bangladesh (Drechslera sorokiniana' 01) der Kulturensammlung des Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ) wurde von Ismail Hossain, Department of Plant Pathology, Agricultural University Mymensingh, Mymensingh, Bangladesh, 1998 von Weizen isoliert und dem Institut zur Verfügung gestellt. Beide Isolate wurden auf PDA (potato-dextrose-agar, Merck, Darmstadt) bei 25°C im Dunkeln kultiviert und alle drei bis vier Wochen auf frischen Agar überimpft. Durch Inkubation der Kulturplatten bei RT und Tageslicht kam es zur Sporulation.
Von natürlich mit Rhynchosporium secalis Heinsen ex A.B. Frank befallenen Pflanzen einer japanischen Gerstenmischkultur wurden die jüngsten Blätter mit starken Symptomen Ende April 1999 im Freiland (Versuchsfeld Weilburger Grenze, Institut für Pflanzenzüchtung, JLU Gießen) geerntet.
Kulturen von Pseudomonas syringae pv. tomato (DC3000), Pseudomonas syringae pv. glycinea (PG4180), Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss61) und Bacillus subtilis (Bs) wurden auf Kings B-Agar bei 4°C im Dunkeln erhalten. Bacillus subtilis stammte aus der Kulturensammlung des Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ), Gießen, Deutschland. Die Pseudomonas Stämme wurden von Ina Budde und Matthias Ullrich, Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg, zur Verfügung gestellt. King's B-Medium 10 g Difco Proteose Pepton #3 (Becton Dickinson, Sparks, USA)
1,5 g K₂HPO₄
15 g Glycerin
ad 1 L mit dest. Wasser, pH 7,0 mit HCl, autoklaviert
5 mM MgSO₄ King's B-Agar King's B-Medium (s. o.) mit 1,5% Agar-Agar (Serva, Heidelberg), autoklaviert.
Blattlausbefall von Gerste wurde mit der Großen Getreideblattlaus (Sitobion avenae F.) hervorgerufen, die von Stefan Vidal, Institut für Pflanzenpathologie, Georg-August-Universität Göttingen, zur Verfügung gestellt wurde. Die Nachzucht der Läuse erfolgte auf Gerstenpflanzen cv. Ingrid im Käfig unter Zusatzlicht bei ca. 25°C.

Blumeria gramins

Primärblätter sieben Tage alter Keimlinge wurden durch Abschütteln der Konidien befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit 1 bis 8 Konidien/mm² von BghA6 oder Bgt (Feldisolat) inokuliert und in Klimaschränken bzw. -kammern wie oben beschrieben inkubiert.

Beispiel 2

RNA-Extraktion und Konzentrationsbestimmung

Gesamt RNA wurde aus 8 bis 10 primären Blattsegmenten (Länge 5 cm) mittels "RNA Extraction Buffer" (AGS, Heidelberg, Germany) extrahiert.
Dazu wurden die zentrale Primärblattsegment von 5 cm Länge geerntet und in flüssigem Stickstoff in Mörsern homogenisiert. Das Homogenisat wurde bis zur RNA-Extraktion bei -70°C gelagert.
Aus dem tiefgefrorenen Blattmaterial wurde mit Hilfe eines RNA- Extraktions-Kits (AGS, Heidelberg) Gesamt-RNA extrahiert. Dazu wurden 200 mg des tiefgefrorenen Blattmaterials in einem Mikrozentrifugenröhrchen (2 mL) mit 1,7 mL RNA-Extraktionspuffer (AGS) überschichtet und sofort gut durchmischt. Nach Zugabe von 200 µL Chloroform wurde erneut gut gemischt und bei Raumtemperatur 45 min auf einem Horizontalschüttler bei 200 U/min geschüttelt. Anschließend wurde zur Phasentrennung 15 min bei 20000 g und 4°C zentrifugiert, die obere wäßrige Phase in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und die untere verworfen. Die wäßrige Phase wurde erneut mit 900 µL Chloroform gereinigt, indem 3mal für 10 sec homogenisiert und erneut zentrifugiert (s. o.) und abgehoben wurde. Zur Fällung der RNA wurde dann 850 µL 2-Propanol hinzugegeben, homogenisiert und für 30 bis 60 min auf Eis gestellt. Im Anschluss daran wurde für 20 min zentrifugiert (s. o), vorsichtig der Überstand dekantiert, 2 mL 70%iges Ethanol (-20°C) hinzu pipettiert, durchmischt und erneut 10 min zentrifugiert. Der Überstand wurde dann wiederum dekantiert und das Pelet vorsichtig mit einer Pipette von Flüssigkeitsresten befreit, bevor es an einem Reinluftarbeitsplatz im Reinluftstrom getrocknet wurde. Danach wurde die RNA in 50 µL DEPC-Wasser auf Eis gelöst, durchmischt und 5 min zentrifugiert (s. o.). 40 µl des Überstandes wurden als RNA-Lösung in ein neues Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei -70°C gelagert.
Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bestimmt. Dazu wurde die RNA-Lösung 1 : 99 (v/v) mit destilliertem Wasser verdünnt und die Extinktion (Photometer DU 7400, Beckman) bei 260 nm gemessen (E_260nm = 1 bei 40 µg RNA/mL). Gemäß der errechneten RNA- Gehalte wurden die Konzentrationen der RNA-Lösungen anschließend mit DEPC-Wasser auf 1 µg/µL angeglichen und im Agarosegel überprüft.
Zur Überprüfung der RNA-Konzentrationen im horizontalen Agarosegel (1% Agarose in 1 × MOPS-Puffer mit 0,2 µg/mL Ethidiumbromid) wurde 1 µL RNA-Lösung mit 1 µL 10 × MOPS, 1 µL Farbmarker und 7 µL DEPC-Wasser versetzt, nach Ihrer Größe bei 120 V Spannung im Gel in 1 × MOPS-Laufpuffer über 1,5 h aufgetrennt und unter UV-Licht fotographiert. Eventuelle Konzentrationsunterschiede der RNA-Extrakte wurden mit DEPC-Wasser ausgeglichen und die Anpassung erneut im Gel überprüft.
DEPC-Wasser: Bidestilliertes Wasser, 0,1% [w/v] DEPC (Diethylpyrocarbonat), mind. 2 h rühren, über Nacht bei 37°C inkubieren, anschließend autoklavieren.

Beispiel 3

Northern-Blot Analyse

Zur Vorbereitung des Northern-Blottings wurde die RNA im Agarosegel unter denaturierenden Bedingungen aufgetrennt. Ein Teil RNA- Lösung (entsprechend 6 bis 15 µg RNA) wurde dazu mit gleichem Volumen Probenpuffer (mit Ethidiumbromid) gemischt, 5 min bei 94°C denaturiert, 5 min auf Eis gestellt, kurz zentrifugiert und aufs Gel aufgetragen. Das 1 × MOPS-Gel (1,5% Agarose, ultra pure) enthielt 5 Volumenprozent konzentrierte Formaldehydlösung (36,5% [v/v]). Die RNA wurde bei 100 V 2 h lang aufgetrennt und anschließend geblottet.
Das Northern-Blotting erfolgte als aufwärtsgerichteter RNA-Transfer im Kapillarstrom. Das Gel wurde dazu zunächst 30 min in 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) geschwenkt und zurechtgeschnitten. Ein Whatmanpapier wurde so vorbereitet, dass es auf einer horizontalen Platte auflag und auf 2 Seiten in eine Wanne mit 25 mM Natriumhydrogen/dihydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) ragte. Auf dieses Papier wurde das Gel aufgelegt, wobei nicht bedeckte Teile des Whatmanpapiers mit einer Plastikfolie abgedeckt wurden. Das Gel wurde dann mit einer positiv geladenen Nylonmembran (Boehringer-Mannheim) luftblasenfrei abgedekt, wonach die Membran wiederum mit saugfähigem Papier in mehreren Lagen etwa 5 cm hoch bedeckt wurde. Das saugfähige Papier wurde noch mit einer Glasplatte und einem 100 g Gewicht beschwert. Das Blotting erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Die Membran wurde kurz in A. bidest. geschwenkt und zur RNA-Fixierung mit einer Lichtenergie von 125 mJ im Crosslinker (Biorad) W-Licht bestrahlt. Die Überprüfung des gleichmäßigen RNA-Transfers auf die Membran erfolgte auf der W-Lichtbank.
Zur Detektion von Gersten mRNA wurden 10 µg Gesamt-RNA aus jeder Probe über ein Agarosegel aufgetrennt und mittels Kapillartransfer auf eine positiv-geladene Nylonmembran geblottet. Die Detektion erfolgte mit dem DIG-Systeme.
Zur Überprüfung einer differentiellen Genexpression in Northern- Analysen wurden mRNA Sonden ausgehend von den BCI-3 (GenBank Acc.-No: AJ250282) und BCI-4 (GenBank Acc.-No.: AJ250283) cDNA Sequenzen hergestellt indem zunächst die in dem Vektor pGEMT enthaltenen cDNA-Fragmente so vom Plasmid amplifiziert wurden, dass jeweils am 3'-Ende der Sequenz eine Polymerase-Bindestelle vorlag, von der ausgehend anschließend der antisense-Strang durch in vitro-Transkription mittels einer T7 oder SP6 RNA Polymerase mit markierten UTPs synthetisiert werden konnte. In der PCR-Reaktion wurden als Primer M13reverse und M13universal Primer verwendet. Die Markierung der Sonde erfolgte mit Digogygenin oder Fluoreszein bzw. radioaktiv.
Das Insert der einzelnen Vektor wurde über PCR mit flankierenden Standard-Primern (M13 fwd und rev) amplifiziert. Die Reaktion lief dabei mit folgenden Endkonzentrationen in einem Gesamtvolumen von 50 µL PCR-Puffer (Silverstar) ab:
M13-fwd: 5'-GTAAAACGACGGCCAGTG-3' (SEQ ID NO: 9)
M13-Rev: 5'-GGAAACAGCTATGACCATG-3' (SEQ ID NO: 10)
10% Dimethylsulfoxid (v/v)
je 2 ng/µL Primer (M13 forward und reversed)
1,5 mM MgCl₂,
0,2 mM dNTPs,
4 Units Taq-Polymerase (Silverstar),
2 ng/µL Plasmid-DNA.
Die Amplifikation verlief in einem Thermocycler (Perkin-Elmar 2400) temperaturgesteuert:
94°C: 3 min Denaturierung
30 Zyklen mit:
94°C 30 sek (Denaturierung)
58°C 30 sek (Annealing),
72°C 1,2 min (Extension),
72°C: 5 min abschließende Extension
4°C: Kühlung bis zur Weiterverarbeitung
Der Erfolg der Reaktion wurde im 1%igen Agarosegel überprüft. Die Produkte wurden anschließend mit einem "High Pure PCR-Product Purification Kit" (Boehringer-Mannheim) aufgereinigt. Man erhielt etwa 40 µL Säuleneluat, das erneut im Gel überprüft und bei -20°C gelagert wurde.
Das Amplifikat wurde mit dem High Pure PCR-Product Purification Kit (Boehringer, Mannheim) nach Herstellerangaben aufgereingt und je 4 µL als Template für die Reaktion mit der entsprechenden DNA- abhängigen RNA-Polymerase (SP6- oder T7-Polymerase) eingesetzt. 4 µl gereinigtes PCR-Produkt wurden mit 2 µL Transskriptionspuffer, 2 µl NTP-Markierungsmix, 2 µl-NTP-Mix und 10 µl DEPC-Wasser versetzt. Anschließend wurden 2 µL der T7-RNA-Polymeraselösung zu pipettiert. Die Reaktion wurde dann 2 h bei 37°C durchgeführt und anschließend mit DEPC-Wasser auf 100 µL aufgefüllt. Die RNA-Sonde wurde im Ethidiumbromidgel detektiert und bei -20°C gelagert.
Der Reaktionsansatz (20 µL) für nicht-radioaktive Sonden wurde mit 1 × Digoxigenin- oder Fluorescein-RNA-Labeling Mix (Boehringer, Mannheim), der für radioaktive Sonden mit je 1 mM ATP, GTP und CTP, sowie 25 µCi a ³²P UTP, jeweils mit 40 u RNase-Inhibitor (Boehringer, Mannheim) und 40 u RNA-Polymerase in 1 × Transkriptionspuffer (Boehringer, Mannheim) 2 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion für die nicht-radioaktive Markierung wurde durch Zugabe von 80 µL DEPC-Wasser abgestoppt und das Ergebnis im Agarosegel überprüft. Der Ansatz für die radioaktive Markierung wurde mit 30 µL DEPC-Wasser versetzt, die Sonde über MicroSpin G-25 Säulen(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg) aufgereinigt, und die Anzahl der radioaktiven Zerfälle in einem Aliquot gemessen (cpm, Multipurpose Scintillation Counter, Coulter LS6500, Beckman, München).
Die RNA Polymerisation, die Hybridisierung und die Immunodetektion wurden weitestgehend nach Angaben des Herstellers des Kits zur nicht-radioaktiven RNA-Detektion durchgeführt (DIG System User's Guide, DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim, Kogel et al. (1994) Plant Physiol 106: 1264-1277).
Zur Vorbereitung der Hybridisierung wurden die Membranen zunächst 3 × 20 min bei 68°C in 2 × SSC (Salt, Sodiumcitrate), 0,1% SDS- Puffer (Sodiumdodecylsulfate) geschwenkt. Die Membranen wurden anschließend an die Innenwand auf 68°C vorgeheizter Hybridisierungsröhren (Hybaid, Heidelberg) angelegt und 30 min mit 10 mL Dig-Easy-Hybridisierungspuffer im vorgeheizten Hybridisierungsofen inkubiert. Währenddessen wurden 10 µL Sondenlösung in 80 µL Hybridisierungspuffer bei 94°C für 5 min denaturiert, anschließend auf Eis gestellt und kurz zentrifugiert. Zur Hybridisierung wurde die Sonde dann in 10 mL 68°C warmem Hybridisierungspuffer überführt, und der Puffer in der Hybridisierungsröhre durch diesen Sondenpuffer ersetzt. Die Hybridisierung erfolgte dann ebenfalls bei 68°C über Nacht.
Vor Immundetektion von RNA-RNA Hybriden wurden die Blots stringent zweimal für jeweils 20 min in 0.1% (w/v) SDS, 0.1 × SSC bei 68°C gewaschen.
Zur Immunodetektion wurden die Blots zunächst zweimal für 5 min bei RT in 2 × SSC, 0,1% SDS geschwenkt. Anschließend erfolgten 2 stringente Waschschritte bei 68°C in 0,1 × SSC, 0,1% SDS für je 15 min. Die Lösung wurde anschließend durch Waschpuffer ohne Tween ersetzt. Es wurde 1 min geschüttelt und die Lösung durch Blockingreagenz ausgetauscht. Nach weiteren 30 min Schütteln wurden 10 µL Anti-Fluoreszein-Antikörperlösung hinzugefügt und weitere 60 min geschüttelt. Es folgten zwei 15 minütige Waschschritte in Waschpuffer mit Tween. Die Membran wurde anschließend 2 min in Substratpuffer äquilibriert und nach Abtropfen auf eine Kopierfolie überführt. Auf der "RNA-Seite" der Membran wurde dann ein Gemisch aus 20 µL CDP-Star™ und 2 mL Substratpuffer gleichmäßig verteilt. Im Anschluss wurde die Membran mit einer zweiten Kopierfolie abgedeckt und an den Rändern mit Hitze luftblasenfrei und wasserdicht verschweißt. Die Membran wurde dann in einer Dunkelkammer für 10 min mit einem Röntgenfilm bedeckt und dieser anschließend entwickelt. Je nach Stärke der Lumineszenzreaktion wurde die Belichtungszeit variiert.
Durch Exposition eines Röntgenfilms (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) mit der eingeschweißten Membran wurde die Akkumulation des Transkriptes durch Schwärzung des Filmes nach dessen Entwicklung sichtbar (Entwickler G 153 A, Schnellfixierbad G 354, Agfa, Röntgen Bender, Baden-Baden).
Wenn nicht extra gekennzeichnet waren die Lösungen im Lieferumfang des Kits enthalten (DIG-Luminescence detection Kit, Boehringer-Mannheim). Alle anderen wurden aus folgenden Stammlösungen durch Verdünnung mit autoklaviertem, destilliertem Wasser hergestellt. Alle Stammlösungen wurden, wenn nicht anders spezifiziert, mit DEPC (wie DEPC-Wasser) angesetzt und anschließend autoklaviert.

- DEPC-Wasser: Destilliertes Wasser wird über Nacht bei 37°C mit Diethylpyrokarbonat (DEPC, 0,1%, w/v) behandelt und anschließend autoklaviert.
- 10 × MOPS-Puffer: 0,2 M MOPS (Morpholin-3-propansulfonsäure), 0,05 M Natriumacetat, 0,01 M EDTA, pH mit 10 M NaOH auf pH 7,0 eingestellt, 1% [v/v] DEPC, autoklavieren. Geringer konzentrierter MOPS-Puffer wurde aus der stock-Lösung entsprechend mit autoklaviertem DEPC-Wasser verdünnt.
- 20 × SSC (Natriumchlorid-Natriumcitrat, Salt-Sodiumcitrate): 3 M NaClo, 0.3 M triNatriumcitrat × 2 H₂O, pH mit 4 M HCl auf pH 7,0 eingestellt.
- 1% SDS (Natriumdodecylsufat, Sodiumdodecylsulfate)Natriumdodecylsulfat (w/v), ohne DEPC
- RNA-Probenpuffer: 760 µL Formamid, 260 µL Formaldehyd, 100 µL Ethidiumbromid (10 mg/mL in DEPC-Wasser), 80 µL Glycerol, 80 µL Bromphenolblau (gesättigt), 160 µL 10 × MOPS, 100 µL Wasser.
- 10 × Waschpuffer ohne Tween: 1,0 M Maleinsäure, 1,5 M NaCl; ohne DEPC, mit NaOH (fest, ca. 77 g) und 10 M NaOH auf pH 7,5 einstellen.
- Waschpuffer mit Tween: aus Waschpuffer ohne Tween mit Tween (0,3%, v/v)
- 10 × Blockingreagenz: 50 g Blockingpulver (Boehringer-Mannheim) in 500 mL Waschpuffer ohne Tween suspendieren.
- Substratpuffer: 100 mM Tris (Trishydroxymethylamino-methan), 150 mM NaCl mit 4 M HCl auf pH 9,5 einstellen.
- 10 × Farbmarker: 50% Glycerol (v/v), 1,0 mM EDTA pH 8,0, 0,25% Bromphenolblau (w/v), 0,25% Xylencyanol (w/v).

Für radioaktive Northern-Analysen erfolgte die Prähybridisierung der Membran mindestens 30 min in 10 mL 1 × Hybridisierungspuffer. Für die Hybridisierung wurde jeweils ein Volumen der Sonde entsprechend ca. 300000-400000 cpm/mL nach Denaturierung in Hybridisierungs-Puffer (5 min bei 90°C) in einer Hybridisierungsröhre eingesetzt. Anschließend wurde erst 2 × 5 min mit 2 × SSC, 0,1% SDS in der Röhre und dann solange mit 0,1 × SSC, 0,1% SDS im Wasserbad bei Hybridisierungstemperatur gewaschen, bis kein radioaktiver Hintergrund mehr mit dem Handmonitor zu detektieren war. Die Membranen wurden in Frischhaltefolie geschlagen oder in Plastikbeutel eingeschweißt und mit einem Röntgenfilm (Kodak X-OMAT AR, Röntgen Bender, Baden-Baden) oder einem Phosphorscreen (Kodak Imaging Screen-K, Bio-Rad, München) exponiert. Die Röntgenfilme wurden nach variabler Expositionszeit entwickelt (s. o.), die Phosphorscreens im Phosphorimager (Molecular Imager FX, Bio-Rad, München) ausgelesen und mit dem Programm Quantity One-4.1.1 (Bio- Rad, München) in einer Auflösung von 200 µm dokumentiert.
5 × Hybridisierungspuffer: 1% BSA (bovine serum albumin) (w/v), 1% Polyvinylpyrrolidon 10 bis 40 kDa (w/v), 1% Ficoll 1400000 (w/v), 250 mM TrisCl pH 7,5 (0,8 M Stammlösung, autoklaviert), 0,5% Tetra-Na-diphosphat-Decahydrat (w/v), 5% SDS (sodiumdodecylsulfate) (w/v), sterilfiltriert (0,45 µm), mit autoklav. Wasser auffüllen. 1 × Hybridisierungspuffer wird aus 5 × Hybridisierungspuffer mit DEPC-Wasser verdünnt.
Membranen, die bereits mit einer Sonde hybridisiert worden waren, konnten durch "strippen" erneut für eine Hybridisierung mit einer weiteren Sonde verwendet werden. Digoxigenin- oder Fluoresceinmarkierte Sonden wurden durch Waschen in A. bidest. (1 min bei RT) und anschließende Inkubation der Membranen mit aufgekochtem 0,1%igem SDS (w/v) (10 min bei RT) entfernt. Radioaktiv markierte Sonden wurden durch Waschen in 1% SDS (w/v), 50% Formamid (v/v) für 20 bis 40 min bei 80°C vollständig von den Membranen gelöst.

Beispiel 4

Klonierung des Promotors der BCI-3 Gens aus Gerste

Der Promotor des BCI-3 Gens aus Gerste wurde mittels der inversen Polymerasekettenreaktion (iPCR) ausgehend von genomischer DNA aus Gerste (Sorte Ingrid) isoliert. Zur Gewinnung der genomischen DNA wurden 400 bis 500 mg Blattmaterial (cv. Ingrig WT) mit flüssigen Stickstoff gemörsert und die genomische DNA dann mit Nucleobond- Säulen AXG 500 (Macherey & Nagel) extrahiert.
Vor der PCR wurden zunächst jeweils 750 ng genomische DNA (aus der Gerstensorte cv. Ingrid) mit den Restriktionsendonukleasen EcoRV, NcoI, RsaI, Eco91I oder BamHI (MBI Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) geschnitten. Dazu wurde in einem Gesamtvolumen von 100 µl die DNA mit 30 units Enzym im Puffer nach Herstellerangaben für 4 h bei 37°C inkubiert. Im Anschluss folgte eine Fällung der DNA mit 0,1 Volumen 3 M Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumen Ethanol über Nacht bei -20°C. Nach Zentrifugation (30 min, 14.000 rpm (20.000 g), 4°C) wurde das Pellet mit Ethanol (70%) gewaschen, getrocknet und in 50 µl H₂O resuspendiert. Für den anschließenden Ligationsansatz in einem Gesamtvolumen von 400 µl wurde zu den 50 µl geschnittener DNA noch 310 µl H₂O, 40 µl 10 × Ligationspuffer und 1 µl T4 Ligase [3 Weiss units/µl] (Promega) hinzugegeben. Dieser Ansatz wurde über Nacht bei 4°C inkubiert. Anschließend wurde die Ligase bei 65°C für 10 min inaktiviert. An die Ligation schloss sich wieder eine Fällung mit 0,1 Volumen Natriumacetat-Puffer (pH 5,2) und 2,5 Volumen Ethanol an. Nach Zentrifugation (30 min, 14000 rpm (20000 g), 4°C) wurde das Pellet mit Ethanol (70%) gewaschen, getrocknet und in 80 µl H₂O resuspendiert. 3 µl hiervon wurde für die iPCR als Template verwendet.
Die iPCR wurde als Standard-PCR durchgeführt. Dazu wurde zunächst im ersten Schritt eine PCR unter Verwendung des Primerpaars 1 (SEQ ID NO: 3 und 4) mit Pfu-Polymerase (Promega) durch geführt. Das Amplifikat wurde in einem zweiten Schritt unter Verwendung des innenliegenden ("nested") Primerpaars 2 (SEQ ID NO: 5 und 6) mit der Taq-Polymerase erneut amplifiziert. Nachfolgend wurde das PCR-Produkt in pGEM-T (Promega) einkloniert und sequenziert. Von der Sequenzinformation ausgehend wurden die Primerpaare 3 und 4 abgeleitet. Für die nächste PCR wurden - wieder unter Einsatz der verdauten, ligierten genomischen DNA - die Primer-Paare 3 und 4 wie oben beschrieben eingesetzt und das PCR-Produkt in pGEM-T (Promega) einkloniert und sequenziert. Von der Sequenzinformation ausgehend wurden die Primerpaare 5 und 6 abgeleitet. Für die nächste PCR wurden - wieder unter Einsatz der verdauten, ligierten genomischen DNA - die Primer-Paare 5 und 6 wie oben beschrieben eingesetzt. Das PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel isoliert und in den pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim, Deutschland) mittels T-Überhang-Ligation kloniert. Die cDNAs wurden ausgehend von der Plasmid-DNA unter Verwendung des "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Deutschland) sequenziert. Primerpaar 1

Primerpaar 2

Primerpaar 3

Primerpaar 4

Primerpaar 5

Primerpaar 6

Zusammensetzung des PCR-Ansatzes (25 µl) 3,00 µl Template
2,50 µl 10 × Puffer (Pfu- bzw. Taq-Puffer)
2,50 µl dNTP's [2 mM of each]
0,75 µl MgCl₂
1,25 µl 5'-Primer (10 µmol/µL)
1,25 µl 3'-Primer (10 µmol/µL)
0,15 µl Pfu- bzw. Taq-Polymerase

PCR-Programm

Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 1,0 min 95°C, 0,5 min 70°C und 3,0 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C.
Die Sequenz des BCI-3 Promotors wurde mit Hilfe des Computer- Programms Genedoc alignt aus den jeweils erhaltenen Sequenzen zusammengesetzt und ist unter SEQ ID NO: 1 wiedergegeben. Die gesamte Promotorsequenz wurde unter Verwendung der untengenannten PCR-Bedingungen amplifiziert. Dabei kamen nachfolgende Primer zum Einsatz:

Zusammensetzung des PCR-Ansatzes 3,00 µl Template
2,50 µl 10 × Puffer
2,50 µl dNTP's [2 mM of each]
0,75 µl MgCl₂
1,25 µl BCI3-5 (10 µmol/µL)
1,25 µl BCI3-3 (10 µmol/µL)
0,15 µl 0,2 µl QiagenTAG (5 u/µL)

PCR-Program

Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 62°C und 2 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C.
Das PCR-Produkt über T-Überhangsligation in pGEM-T (Promega) kloniert.

Beispiel 5

Herstellung von Deletionsvarianten des BCI-3 Promotors

Die Deletionsvarianten wurden mit Hilfe von PCR (Standard-PCR) hergestellt. Hierfür dienten Primer mit Schnittstellen (unterstrichene Bereiche = Schnittstellen), um so das umklonieren zu erleichtern. Folgende Primer wurden verwendet:

Zusammensetzung des PCR-Ansatzes 3,00 µl Template
2,50 µl 10 × Puffer
2,50 µl dNTP's [2 mM of each]
0,75 µl MgCl₂
1,25 µl 5'-Primer (10 µmol/µL)
1,25 µl 3'-Primer (10 µmol/µL)
0,15 µl 0,2 µl QiagenTAG (5 u/µL)

PCR-Programm

Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 58°C und 2 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C. Die PCR-Produkte wurden dann in pGEM-T kloniert.

Beispiel 6

Klonierung des BCI-4 Promotors

Die Sequenz des BCI-4 Promotors wurde mit Hilfe eines BCI4-BAC (BAC-Nr. 266D20; zur Verfügung gestellt durch IPK, Gatersleben, Deutschland) aufgeklärt. Der BAC-Klon wurde unter Verwendung der BCI-4 cDNA als Sonde in der dem Fachmann vertrauten Weise in einer genomischen Gersten BAC-Bibliothek identifiziert. Durch Anwendung der Methode des Primerwalkings wurde schließlich die Sequenz des BCI-4 Promotors ermittelt, die in SEQ ID NO: 2 dargestellt ist.
Für die Sequenzierung wurden nachfolgende Primer verwendet:
Dabei wurde aus den Sequenzinformationen die unter Verwendung des einen Primers (z. B. OPN1) erhalten wurden, jeweils der nachfolgende Primer (z. B. OPN2) abgeleitet.
Die Sequenz des BCI-4 Promotors wurde mit Hilfe des Computer- Programms Genedoc alignt aus den jeweils erhaltenen Sequenzen zusammengesetzt und ist unter SEQ ID NO: 2 wiedergegeben. Die gesamte Promotorsequenz wurde unter Verwendung der unten genannten PCR-Bedingungen amplifiziert. Dabei kamen nachfolgende Primer zum Einsatz:

Zusammensetzung des PCR-Ansatzes 3,00 µl Template
2,50 µl 10 × Puffer
2,50 µl dNTP's [2 mM of each]
0,75 µl MgCl₂
1,25 µl BCI4-5 (10 µmol/µL)
1,25 µl BCI4-3 (10 µmol/µL)
0,15 µl 0,2 µl QiagenTAG (5 u/µL)

PCR-Programm

Anfangsdenaturierung für 4 min bei 95°C. 35 Zyklen mit 0,5 min 95°C, 0,5 min 58°C und 1 min 72°C. Abschließende Extention von 5 min bei 72°C.
Das PCR-Produkt wurde aus einem Agarosegel isoliert und in den pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim, Deutschland) mittels T-Überhang-Ligation kloniert. Die cDNAs wurden ausgehend von der Plasmid-DNA unter Verwendung des "Thermo Sequenase Fluorescent Labeled Primer Cycle Sequencing Kit" (Amersham, Freiburg, Deutschland) sequenziert.
Das PCR-Produkt über T-Überhangsligation in pGEM-T (Promega) kloniert und sequenziert.

Beispiel 7

Konstruktion der Promotor-Reporter-Konstrukte

Aus dem Plasmid pGY1-GFP (Vektor auf pUC18-Basis, CaMV 35S- Promoter/Terminator-Kassette mit insertiertem GFP-Gen; Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; zur Verfügung gestellt von Dr. P. Schweizer, Institut für Pflanzengenetik IPK, Gatersleben, Deutschland) wurde das GFP-Gen mit dem Restriktionsenzym KpnI herausgeschnitten und in den Vektor pUC18 ligiert. Die gewünschte Orientierung des Reportergens wurde mit Hilfe von Restriktionsverdaus bestimmt. Der Vektor erhielt die Bezeichnung pGFP.
Der BCI-4 Promotor wurde als NcoI/PstI-Fragment aus pGEM-T ausgeschnitten. Dabei wurde zunächst mit NcoI verdaut und die NcoI- Site wurde mit Hilfe des Klenow-Fragments aufgefüllt. Folgender Ansatz wurde dazu zusammenpipettiert: 16 µl DNA (aus dem Gel eluiert), 2 µl T4 Ligations-Puffer, 1 µl dNTP'S [2 mM], 1 µl Klenow-Fragment. Dieser Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert. Danach wurde die Reaktion bei 65°C für 10 min gestoppt. Anschließend wurde mit PstI verdaut und das so erhaltene Fragment in den mit PstI und SmaI verdauten pGFP (s. u.) ligiert.
Die verschiedenen BCI-3 Promotorsequenzen wurden aus den pGEMT- Vektoren mit dem BCI-3 Promotor bzw. den BCI-3 Promotor Deletionsvarianten mit HindIII und PstI herausgeschnitten, über ein Gel gereinigt und in den HindIII/PstI-verdauten pGFP Vektor insertiert. Die verschiedenen Konstrukte sind schematisch in Fig. 1 dargestellt.

Beispiel 9

Induktion des BCI-3 und BCI-4 Promoters

Die Induktion des BCI-3 Promotors, der Deletionsvarianten und des BCI-4 Promotors wurde unter Verwendung verschiedener Stimuli untersucht. Die Induktion wurde entweder mittels Northern-Blotanalyse unter Detektion der endogenen BCI-3 bzw. BCI-4 mRNA realisiert, oder unter Verwendung der oben beschriebenen Promotor- Reporter-Konstrukte gezeigt.
Alle Behandlungen wurden an 5 bis 8 Tage alten Gerstenkeimlingen (cv. Ingrid WT) durchgeführt. Behandelte Pflanzen (je 5 in einem Topf) wurden in Klimaschränken oder -kammern weiter kultiviert (s. o).

a) DCINA-Induktion: 2,6-Dichlorisonikotinsäure (DCINA, CGA41396, Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 25% aktiver Substanz mit wettable powder (WP) oder nach Vorlösen der Reinsubstanz mit Dimethylformamid (DMF) in wässriger Lösung (1% DMF) mit NaOH auf pH 7 eingestellt und in Konzentrationen von 5 und 10 mg/l (entspricht 0,02 bzw. 0,04 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert. Kontrollpflanzen wurden mit WP- oder 1%iger DMF-Lösung gegossen.
b) Benzo(1,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester (BTH, auch Azibenzolar-S-methyl, CGA245704, Bion®, Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 50% aktiver Substanz mit WP in Wasser in Konzentrationen von 63, 100, 125 und 250 mg/l (entspricht 0,3, 0,48, 0,6 bzw. 1,2 mM) gesprüht, bis die Blätter gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Eine Bodenapplikation erfolgte in Konzentrationen von 20 und 50 mg/l (entspricht 0,095 bzw. 0,24 mM) bezogen auf das Bodenvolumen. Pflanzen wurden außerdem durch "Floaten" von Blattsegmenten auf einer Lösung von 5 mg/l induziert. Als Kontrolle wurden gleiche Behandlungen mit wettable powder (WP), der Leerformulierung durchgeführt.
c) Salicylsäure-Induktion: Salicylsäure (SA) wurde direkt in Wasser gelöst oder nach Vorlösen in DMF in wässriger Lösung (1% DMF) mit NaOH auf pH 6 bis 7 eingestellt und in Konzentrationen von 50 und 100 mg/l (entspricht 0,36 bzw. 0,72 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser oder 1%iger DMF- Lösung gegossen.
d) Ethylen-Induktion: Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen wurden auf angefeuchtetem Filterpapier in gasdichten Erlenmeyerkolben mit Ethylengas in Konzentrationen von 0,001, 1, 10 und 100 µL/l (entspricht 0,028, 28, 280 bzw. 2800 µM) im Klimaschrank inkubiert (s. o). Kontrollblätter wurden mit Luft begast.
e) Abscisinsäure (ABA) Induktion: ABA wurde durch Sprühen einer wässrigen Lösung von 50 µM auf sieben Tage alte Keimlinge appliziert, bis sie gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser besprüht. Behandelte Pflanzen wurden in Klimakammern inkubiert. (s. o).
f) JA Induktion: Die Induktion mit dem Phytohormon Jasmonat (JA) (Sigma) erfolgte durch "Floaten" von Blattsegmenten auf einer Lösung von 45 µM JA in Klimakammern. Kontrollblätter wurden auf Wasser "gefloatet". Behandlung mit Jasmonsäuremethylester (JM) erfolgte in Glaspetrischalen durch "Floaten" von Primärblättern sieben Tage alter Pflanzen auf einer Lösung von 45 µM JM in Klimakammern (s. o). Kontrollblätter wurden auf Wasser "gefloatet".
g) Sorbit-Induktion: Sorbit-Induktion erfolgte durch "Floaten" von Blattsegmenten bzw. von Primärblättern sieben Tage alter Keimlinge für 4 h auf einer 1 M Sorbit-Lösung (Fluka). Danach wurden die Blätter über Nacht auf Wasser "gefloatet". Kontrollblätter wurden auf Wasser "gefloatet".
h) Für die Inokulation mit Cochliobolus-Konidien wurde von Kulturplatten mit sporulierendem Pilz vorsichtig Oberflächenmycel abgeschabt, durch Mull gefiltert und eine Suspension in 0,02%iger wässriger Tween20-Lösung hergestellt. Nach Besprühen von Blattsegmenten sieben Tage alter Pflanzen mit 20000 Konidien/ml wurden diese auf 0,5%igen Wasseragar mit 20 bis 40 mg/l Benzimidazol ausgelegt und in verschlossenen Schalen im Klimaschrank bei 25°C und 16 h Lichtperiode bis zur Aufarbeitung der Blattsegmente inkubiert. Alternativ wurde eine Sprühinokulation sieben Tage alter Gerstenpflanzen mit 60.000 bis 90.000 Konidien/ml durchgeführt und die Pflanzen anschließend in befeuchteten und verschlossenen durchsichtigen Plastikboxen (60 × 40 × 36 cm) in einer Klimakammer bei 23°C, 70% relativer Luftfeuchte und 16 h Lichtperiode bis zur Aufarbeitung der Blätter gehalten.
i) Die Inokulation mit Bakterien erfolgte durch Druckinfiltration von max. 100 µl der Bakteriensuspensionen mittels einer Infiltrationszange (Hagborg WAF (1970) Can J Bot 48: 1135-1136.) in Primär- und Sekundärblätter sieben bzw. vierzehn Tage alter Pflanzen. Dazu wurde Kings B-Medium (s. o.) mit den verschiedenen Stämmen angeimpft und über Nacht bei 28°C im Dunkeln geschüttelt. Nach Pelletieren der Suspension und zweimaligem Waschen mit dem Infiltrationsmedium (5 mM MgSO₄) wurden die Bakterien in diesem resuspendiert und auf eine optische Dichte OD_600nm, von 0,2 (entspricht ca. 10⁷ Bakterien) eingestellt. Zur Kontrolle wurde das Infiltrationsmedium alleine infiltriert. Die Pflanzen wurden anschließend in Klimaschränken gehalten (s. o.). Bezüglich der Bakterien wurden Versuche mit Pseudomonas syringae pv. tomato (DC3000), Pseudomonas syringae pv. glycinea (PG4180), Pseudomonas syringae pv. syringae (Pss61) und Bacillus subtilis (Bs) durchgeführt. Bacillus subtilis stammte aus der Kulturensammlung des Instituts für Phytopathologie und Angewandte Zoologie (IPAZ), Giessen, Deutschland, die verschiedenen Pseudomonas Stämme wurden von Ina Budde und Matthias Ullrich, Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie, Marburg, zur Verfügung gestellt.
j) Zur Simulation eines Blattlausbefalls wurden Primärblätter acht Tage alter Keimlinge mit je drei ungeflügelten L4-Stadien von Sitobion avenae F. besetzt und in Käfigen bei 25°C und 16 h Lichtperiode gehalten.
k) Eine Verwundung wurde durch Perforation der Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen mit 15 Nadeln/cm² erreicht. Kontrollpflanzen blieben unverletzt und wurden zusammen mit den Verwundeten im Klimaschrank weiter kultiviert (s. o.).

Beispiel 10

Transiente Transformation

Zur Bestimmung der Induzierbarkeit des BCI-3 und BCI-4 Promoters bzw. der Deletionsvarianten des BCI-3 Promotors wurden die einzelnen Konstrukte mit Hilfe von Particle Bombardment in chemisch induzierte Gerstenblätter (cv. Ingrid WT) geschossen. 24 h danach wurden GFP-Zellen in den Blattsegmenten ausgezählt.
Wolframpartikel mit einem Durchmesser von 1,1 µm (Partikeldichte 25 mg/ml) wurden mit Plasmid-DNA beschichtet. Dazu wurden pro Schuss 1 µg Reporterplasmid zur Beschichtung verwendet (Verfahren nach Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54; Schweizer P et al. (2000) Plant J 2000 24: 895-903). Für Microcarrier-Präparation wurden 55 mg Wolframpartikel (M 17, Durchmesser 1,1 µm; Bio-Rad, München) zweimal mit 1 ml autoklaviertem destilliertem Wasser und einmal mit 1 mL absolutem Ethanol gewaschen, getrocknet und in 1 ml 50%igem Glycerin aufgenommen (ca. 50 mg/ml Stammlösung). Die Lösung wurde mit 50%igem Glycerin auf 25 mg/ml verdünnt, vor Gebrauch gut gemischt und im Ultraschallbad suspendiert. Zur Microcarrier-Beschichtung wurden pro Schuss 1 µg Plasmid, 12,5 µl Wolframpartikel-Suspension (25 mg/ml), 12,5 µl 1 M Ca(NO₃)₂-Lösung (pH 10) tropfenweise unter ständigem Mischen zusammengegeben, 10 min bei RT stehengelassen, kurz zentrifugiert und 20 µl vom Überstand abgenommen. Der Rest mit den Wolframpartikel wird resuspendiert (Ultraschallbad) und ins Experiment eingesetzt.
Es wurden ca. 4 cm lange Segmente von Gerstenprimärblättern verwendet. Die Gewebe wurden auf 0,5% Phytagar (GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) mit 20 µg/ml Benzimidazol in Petrischalen (6,5 cm Durchmesser) gelegt und direkt vor dem Partikelbeschuss an den Rändern mit einer Schablone mit einer rechteckigen Aussparung von 2,2 cm × 2,3 cm abgedeckt. Die Schalen wurden nacheinander auf den Boden der Vakuumkammer (Schweizer P et al. (1999) Mol Plant Microbe Interact 12: 647-54) gestellt, über dem ein Nylonnetz (Maschenweite 0,2 mm, Millipore, Eschborn) als Diffusor auf einer Lochplatte eingeschoben war (5 cm über dem Boden, 11 cm unterhalb des Macrocarriers, s. u.), um Partikelklumpen zu zerstreuen und den Partikelstrom abzubremsen. Der oben an der Kammer angebrachte Macrocarrier (Plastik-Sterilfilterhalter, 13 mm, Gelman Sciences, Swinney, UK) wurde je Schuss mit 5,8 µL DNA-beschichteten Wolframpartikeln (312 µg Wolframpartikel; Microcarrier, s. u.) beladen. Mit einer Membranvakuumpumpe (Vacuumbrand, Wertheim) wurde der Druck um 0,9 bar in der Kammer reduziert und die Wolframpartikel mit 9 bar Heliumgasdruck auf die Oberfläche des Pflanzengewebes geschossen. Sofort danach wurde die Kammer belüftet. Vor dem Schießen eines anderen Plasmids wurde der Macrocarrier jeweils gründlich mit Wasser gereinigt. 24 h nach dem Beschuss wurden GFP-Zellen in den Blattsegmenten ausgezählt.
Zusätzlich wurden als Kontrollen auch der Leervektor pUC18 mit einkloniertem GFP (über die KpnI-Schnittstelle) in induzierte Gerstenblätter geschossen und unter dem Mikroskop nach GFP-Zellen gesucht.

Beispiel 11

Induzierbarkeit des BCI-3 und BCI-4 Promoters anhand von Northern-Blot Experimenten

Der BCI-3 Promotor wird durch DCINA, BTH und schwächer durch SA induziert (Fig. 5, A, B, C). Die Akkumulation von BCI-3 war nach BTH-Induktion in Northern Blot-Analysen nur im Mesophyll nachweisbar, weitere Untersuchungen mit der sensitiveren Nachweismethode der RT-PCR zeigten jedoch eine Induzierbarkeit auch in der Epidermis. Durch Ethylen und ABA wurde die Expression von BCI-3 nicht beeinflusst, durch JA-Applikation (Fig. 5, D) und Verwundung (Fig. 6, B) jedoch induziert. Im Gegensatz zur Induktion durch JA-Applikation wurde BCI-3 bei erhöhtem endogenen JA-Gehalt nach Sorbitbehandlung reprimiert (Fig. 6, A). Dieser gegensätzliche Effekt war nicht nur auf Transkriptebene sichtbar, sondern auch in den Expressionsstudien mit BCI-3-Promoter:GFP-Reporter Konstrukten. Nach transienter Transformation von Gerstenblättern wurde die GFP-Fluoreszenz durch exogenes JM verstärkt und durch endogen erhöhte JA-Gehalte reprimiert. Der Anstieg des endogenen JA-Gehaltes durch "Floaten" auf Sorbit wird durch starken osmotischen Stress hervorgerufen, der zusätzlich einen Anstieg des ABA- Gehaltes verursacht, so dass andere Mechanismen als die Akkumulation von JA zur Repression von BCI-3 führen könnten. Während die Inokulation von Gerste mit C. sativus, Infiltration des toxischen Kulturfiltrates des Pilzes, die Inokulation mit dem Nicht-Wirt- Pathogen Bgt sowie der Schädling S. avenae keinen Einfluss auf die Transkriptakkumulation hatte, wurde BCI-3 durch Befall mit einer virulenten und avirulenten Rasse von Bgh reprimiert. Diese Repression könnte ebenso wie bei der Sorbitbehandlung (s. o.) Ausdruck eines geänderten Stoffwechsels in der Interaktion mit dem biotrophen Pathogen sein, der aber wahrscheinlich nicht im Zusammenhang mit Resistenz steht, da die Expression von BCI-3 auch in der kompatiblen Interaktion reprimiert wurde. Die Genexpression nach Infiltration mit Bakterien war nur in einem von zwei durchgeführten Experimenten geringfügig aktiviert und scheint daher nicht in kausalem Zusammenhang mit Bakterien zu stehen (Fig. 6, D).
Die Genexpression von BCI-4 ist nur mit den Resistenzinduktoren SA, DCINA und BTH induzierbar ((Fig. 5, A, B, C), wobei die schwächere und transiente Expression nach SA-Applikation mit der geringeren Ausprägung der Resistenz korrelierte. Nach JM-Applikation konnte nur in einem Genotyp eine transiente und schwache Transkriptakkumulation detektiert werden, die daher wahrscheinlich nicht kausal mit der JM-Applikation verknüpft ist, zumal bei endogen erhöhtem JA-Gehalt ebenfalls keine Akkumulation erfolgte. Eine schwache aber reproduzierbare Expression von BCI-4 wurde nach Infiltration des Pseudomonadenstammes PG4180 lokal und systemisch nachgewiesen und korrelierte mit einer Resistenzinduktion gegenüber Bgh. Alle anderen untersuchten Induktoren, verschiedenste biotische und abiotische Stressfaktoren, sowie Fungizidapplikationen hatten keinen Einfluss auf die Expression von BCI-4. Dies zeigt, dass BCI-4 nicht bei allgemeinen Stressreaktionen exprimiert wird, sondern spezifisch reguliert ist. BCI-4 zeigt eine sehr geringe konstitutive Expressionsaktivität. Eine verstärkte Akkumulation von BCI-4-Transkript und -Protein in Gerstenpflanzen erfolgte ausschließlich in Blättern (mit Ausnahme des Fahnenblattes) und nur nach chemischer Induktion (BTH-Gießbehandlung) (s. Fig. 8), wobei die Akkumulation auf das Mesophyll begrenzt blieb, wie Northern- und Western-Analysen zeigen konnten. Eine Aktivierung der Expression in kompatiblen oder inkompatiblen Interaktionen mit dem Echten Gerstenmehltaupilz konnte auf Transkriptebene (Northern-Analyse, RT-PCR) nicht nachgewiesen werden. In der durch das Resistenzgen Mlg-vermittelten Interaktion mit Bgh konnte BCI-4 weder auf Protein- noch auf Transkriptebene (RT-PCR) in Epidermis oder Mesophyll detektiert werden. Ging der Inokulation jedoch eine chemische Induktion voraus, so wurde die BCI-4-Expression acht Stunden nach der Inokulation zusätzlich erhöht (priming), was auf eine Bedeutung von BCI-4 in der Interaktion mit dem Pathogen, bzw. für Abwehrreaktionen hindeuten könnte (Fig. 6, C). Eine entsprechende induzierbare BCI-4 Promotoraktivität konnte auch in Weizen detektiert werden. Auch hier war - völlig analog zu der Situation in Gerste - der Promotor durch BTH aber nicht durch Weizenmehltau (Bgt) induzierbar. Tabelle 1 Expressionsprofil von BCI-4

Tabelle 2 Expressionsprofil von BCI-3 und BCI-4

Beispiel 12

Expressionsverhalten von BCI-3-Promotor und BCI-3 Promotordeletionsvarianten

In Funktionsanalysen zeigte sich, dass der Promotor in jasmonat- und bioninduzierten Gerstenpflanzen eine höhere Aktivität aufwies verglichen mit Kontrollen (unbehandelter, beschossene Blätter). In Kontrollen beidenen eine Transfektion mit dem pGFP-Leervektor durchgeführt wurde, wurde kein GFP-Fluoreszenz detektiert. Die Tatsache, dass sowohl bei behandelten als auch bei unbehandelten Blattsegmenten eine recht hohe Hintergrundaktivität zu beobachten ist, ist vermutlich auf die Tatsache zurückzuführen, dass der BCI-3 Promotor (im Unterschied zum BCI-4 Promotor) durch Verwundung aktivierbar ist und eine solche zwangsläufig bei jeder erfolgreich mittels Partikel-Beschuss transfizierten Zelle auftritt. Stabile Transfektionselemente werden hier deutliche Ergebnisse zeigen.
Interessant ist auch die Wirkung von Sorbitol (= Erhöhung des endogenen Jasmonatspiegels), das die Bildung von endogenem Jasmonat in der Pflanze hervorruft. Hierdurch wird der BCI-3 Promotor heruntergeregelt, wie auch schon in Northern Studien für das Gen BCI3 gezeigt wurde (s. o.). Nach Sorbitolinduktion wurde eine geringere BCI-3 Promotoraktivität nachgewiesen als in den Kontrollen (Fig. 4). Exogen appliziertes Jasmonat oder BTH bewirkt eine hohe BCI-3 Promotorresponsivität, die durch Partikel Bombardment im Transienten Assay und Anzahl der GFP-Zellen gemessen wurde (Fig. 2 und Fig. 3). Es ist zu sehen, dass auch das 300 bp-Fragment noch eine hohe Aktivität aufweist. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verfahren zur chemisch induzierbaren transgenen Expression von Nukleinsäuresequenzen, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Expressionskassette bestehend aus einer transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus

a) dem BCI-3 Promotor gemäß SEQ ID No: 1 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben, und

b) dem BCI-4 Promotor gemäß SEQ ID No: 2 oder einem funktionellen Äquivalent oder funktionell äquivalenten Teil desselben

in einen Organismus oder in ein Gewebe, Organ, Teil, eine Zellkultur oder Zelle desselben eingebracht wird, und

b) die Expression der Nukleinsäuresequenz durch Behandlung des Organismus oder des Gewebes, Organs, Teils, Zellkultur oder Zelle desselben mit einem chemischen Induktor induziert wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-3 Promotors durch SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6 oder 7 beschrieben ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-4 Promotors durch SEQ ID NO: 8 beschrieben ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Organismus ein pflanzlicher Organismus ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der chemische Induktor ausgewählt ist aus der Verbindungen mit einer Benzo-1,2,3-thiadiazol (BTH) Grundstruktur, Pyridincarbonsäure Grundstruktur, Haloisonikotinsäuren

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der chemische Induktor ausgewählt ist aus der Gruppe der Verbindungen bestehend aus Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazolthiocarbonsäure, Cyanobenzo-1,2,3- thiadiazol, Benzo-1,2,3-thiadiazolcarbonsäureamid, Benzo- 1,2,3-thiadiazolcarbonsäurehydrazid, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-carbonsäure, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-thiocarbonsäure, 7-Cyano-benzo-1,2,3-thiadiazol, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-carbonsäureamid, Benzo-1,2,3-thiadiazol-7-carbonsäurehydrazid, Alkylbenzo-1,2,3-thiadiazolcarboxylate in denen die Alkylgruppe ein bis 6 C-Atome umfasst, Methylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7-carboxylat, n-Propyl benzo-1,2,3- thiadiazol-7-carboxylat, Benzylbenzo-1,2,3-thiadiazol-7- carboxylat, Benzo-1,2,3-thiadiazole-7-carbonsäure-sec-butylhydrazid, Dichloroisonicotinsäure (DCINA), Dichloroisonicotinsäuremethylester, Benzoesäure, Salicylsäure(SA), Acetylsalicylsäure und Polyacrylsäure, sowie Derivaten der vorgenannten.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker, Reportergene und Genen die eine Resistenz gegen Pathogene oder biotischen oder abiotischen Stress verleihen.

8. Nukleinsäuresequenz kodierend für den BCI-3 Promotor aus Gerste gemäß SEQ ID No: 1, funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalenten Teile desselben.

9. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 8, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-3 Promotors durch SEQ ID NO: 4, 5, 6 oder 7 beschrieben ist.

10. Nukleinsäuresequenz kodierend für den BCI-4 Promotor aus Gerste gemäß SEQ ID No: 2, funktionelle Äquivalente oder funktionell äquivalenten Teile desselben.

11. Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 10, wobei das funktionell äquivalente Teil eines BCI-4 Promotors durch SEQ ID NO: 8 beschrieben ist.

12. Transgene Expressionskassette enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11.

13. Transgene Expressionskassette nach Anspruch 12, wobei die Nukleinsäuresequenz mit einer weiteren, transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionell verknüpft ist.

14. Transgene Expressionskassette nach einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz

a) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierten Proteins ermöglicht, oder

b) die Expression eines von besagter Nukleinsäuresequenz kodierter sense oder anti-sense-RNA ermöglicht.

15. Expressionskassette nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei die transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz ausgewählt ist aus der Gruppe von Nukleinsäuren kodierend für Selektionsmarker, Reportergene, Genen die eine Resistenz gegen Pathogene, biotischen oder abiotischen Stress verleihen und Genen, die das Wachstum von Pflanzen verändern.

16. Transgener Vektor enthaltend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11 oder eine Expressionskassette gemäss den Ansprüchen 12 bis 15.

17. Transgener Organismus transformiert mit einer Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, einer Expressionskassette gemäß einem der Ansprüchen 12 bis 15 oder einem Vektor gemäß Anspruch 16.

18. Transgener Organismus nach Anspruch 17 ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen und pflanzlichen Organismen.

19. Transgener Organismus nach einem der Ansprüche 17 oder 18 ausgewählt aus den monokotylen oder dikotylen Pflanzen.

20. Transgener Organismus nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die Pflanze Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Mais, Reis, Weizen oder Triticale ist.

21. Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut abgeleitet von einem transgenen Organismus nach den Ansprüchen 17 bis 20.

22. Verwendung eines transgenen Organismus nach einem der Ansprüche 17 bis 20 oder von diesem abgeleitete Zellkulturen, Teile oder transgenes Vermehrungsgut nach Anspruch 21 zur Herstellung von Nahrungs-, Futtermitteln, Saatgut, Pharmazeutika oder Feinchemikalien.

23. Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Feinchemikalien Enzyme, Vitamine, Aminosäuren, Zucker, gesättigte oder ungesättigte Fettsäuren, natürlicher oder synthetische Geschmacks-, Aroma- oder Farbstoffe sind.

24. Verwendung von Nukleinsäuresequenzen gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, Expressionskassetten gemäß einem der Ansprüchen 12 bis 15, Vektoren gemäß Anspruch 16 oder transgenen Organismen gemäß einem der Ansprüche 17 bis 20 in Verfahren zur Identifizierung von Pathogenresistenzinduzierenden Verbindungen.

25. Verfahren zur Identifizierung von Pathogenresistenz-induzierenden Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Expressionskassette bestehend aus einem Reportergen in funktioneller Verknüpfung mit einem chemisch induzierbaren Promotor ausgewählt aus der Gruppe der Sequenzen bestehend aus

b) der Organismus oder das Gewebe, Organ, Teil, Zellkultur oder Zelle desselben mit einer chemischen Verbindung ausgewählt aus einer Bibliothek chemischer Verbindungen behandelt wird, und

c) die Induktion der Expression des Reportergens gemessen wird.