WO2003004521A2 - Nukleotidsequenz sowie verfahren zur steigerung der krankheitsresistenz von pflanzen - Google Patents

Nukleotidsequenz sowie verfahren zur steigerung der krankheitsresistenz von pflanzen Download PDF

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WO2003004521A2
WO2003004521A2 PCT/EP2002/006822 EP0206822W WO03004521A2 WO 2003004521 A2 WO2003004521 A2 WO 2003004521A2 EP 0206822 W EP0206822 W EP 0206822W WO 03004521 A2 WO03004521 A2 WO 03004521A2
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plant
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Karl-Heinz Kogel
Katrin Besser
Gregor Langen
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Basf Plant Science Gmbh
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
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    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8282—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for fungal resistance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • the present invention relates to a nucleotide sequence and a method for increasing the disease resistance of plants.
  • plant protection measures are essential.
  • induced resistance is based on a natural mechanism that can be triggered by pathogenic or apathogenic microorganisms and herbivores and leads to increased resistance to infestation with other pathogens or pests (blR, biotically induced resistance, Hammerschmidt 1993 , van Loon e; f al. 1998).
  • the IR is an active plant process, which includes the induction and strengthening of cellular defense mechanisms by an inductor, as well as the increased willingness of the plant to respond more quickly to the attack with defense reactions (Hammerschmidt 1993; Kessmann et al. 1994).
  • SA salicylic acid
  • WO 00/71748 discloses gene fragments (ESTs) which are induced by chemical resistance inducers and which are involved in the expression of IR.
  • the focus of this application is a screening method for the general identification of chemicals which are involved in the induction of resistance.
  • Beßer et al. 2000, Molecular Plant Pathology, 1 (5): 277-286) studies on chemically induced genes in barley and their involvement in various ways of disease resistance are described.
  • a gene fragment labeled Bci-4 (312 bp) is also described here, which is neither induced by the phytohormones jasmonate or jasmonic acid methyl ester, nor by ethylene or abscisic acid or by sorbitol.
  • Bci-4 Wounding the plant or inoculating with the pathogenic fungus
  • Blumeria graminis f.sp. hordei does not induce the expression of Bci-4 in barley.
  • the latter represents a significant difference to the PR genes (p_athogen-related genes) from dicotyledonous plants.
  • Bci-4 from barley is produced solely by resistance inducers such as SA (salicylic acid), 2,6-di-chloroisonicotinic acid (DCINA) and benzo- (1, 2,3) -thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester (BTH or Bion®) activated, the last two compounds probably being SA analogues.
  • SA salicylic acid
  • DCINA 2,6-di-chloroisonicotinic acid
  • BTH or Bion® benzo- (1, 2,3) -thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester
  • the object of the present invention is to provide genes and methods by means of which the resistance of plants, advantageously of useful plants, can be increased even without the induction by chemicals towards pathogens.
  • the invention relates to an isolated nucleotide sequence coding for a Ca 2+ -binding EF-hand protein, the overexpression of which in plants causes increased resistance to disease, selected from a) a nucleotide sequence according to SEQ ID No. 1, b) a nucleotide sequence which has at least 75% identity with that in SEQ ID no. 1 shown nucleotide sequence, c) a nucleotide sequence hybridizing with a) and b), d) a nucleotide sequence complementary to a), b) or c).
  • the nucleotide sequence comes from barley (Hordeum). Since the aforementioned nucleotide sequence is a chemically inducible gene, it is also designated Bci-4 for bariey chemically induced gene.
  • an isolated nucleic acid or an isolated nucleic acid fragment is to be understood as a polymer from RNA or DNA which can be single or double-stranded and optionally contain natural, chemically synthesized, modified or artificial nucleotides.
  • DNA polymer also includes genomic DNA, cDNA or mixtures thereof.
  • Hybridizing nucleotide sequences in the sense of the invention are understood to mean oligonucleotides or polynucleotides which bind to the nucleotide sequence of Bci-4 according to the invention under standard hybridization conditions.
  • standard hybridization conditions is to be understood broadly and means stringent and less stringent hybridization conditions. Such conditions are among others in Sambrook et al.
  • hybridizing sequences includes, according to the invention, substantially similar nucleotide sequences from the group of DNA or RNA which, under known standard hybridization conditions, enter into a specific interaction (binding) with the nucleotide sequences according to the invention.
  • This also includes short nucleotide sequences with a length of, for example, 10 to 30, preferably 12 to 15 nucleotides. According to the invention, this also includes so-called primers or probes.
  • alleles are to be understood as functionally equivalent, ie essentially equivalent nucleotide sequences.
  • Functionally equivalent sequences are those sequences which, despite a different nucleotide sequence, for example due to the degeneracy of the genetic code, still have the desired functions.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described here, as well as artificial, e.g. B. obtained by chemical synthesis and possibly adapted to the codon use of the host organism nucleotide sequences.
  • functionally equivalent sequences include those which have an altered nucleotide sequence which, for example, imparts desensitivity or resistance to inhibitors to the protein.
  • a functional equivalent is also understood to mean, in particular, natural or artificial mutations in an originally isolated sequence which continue to show the desired function. Mutations include substitutions, additions, deletions, exchanges or insertions of one or more nucleotide residues.
  • sense mutations which can lead to the exchange of conserved amino acids at the protein level, but which do not lead to a fundamental change in the activity of the protein and are therefore function-neutral.
  • This also includes changes in the nucleotide sequence that affect the N- or C-terminus of a protein at the protein level, but without significantly impairing the function of the protein. These changes can even have a stabilizing influence on the protein structure.
  • artificial DNA sequences are the subject of the present invention as long as they impart the desired properties, as described above.
  • Such artificial DNA sequences can be determined, for example, by back-translating proteins created using computer-aided programs (molecular modeling) or by in vitro selection. Coding DNA sequences obtained by back-translating a polypeptide sequence according to the codon usage specific for the host organism are particularly suitable. The specific codon usage can easily be determined by a person familiar with molecular genetic methods by computer evaluations of other, already known genes of the organism to be transformed.
  • the term functional equivalent also refers to the protein encoded by the corresponding nucleotide sequence.
  • the term functional equivalent describes a protein whose Amino acid sequence with that of the reference protein (here the Ca 2+ binding EF hand protein coded by BCI-4) is homologous to a certain percentage. The percentage is at least 75%, preferably 80%, particularly preferably 90-95% and in particular 99.9%.
  • the invention also relates to an isolated nucleotide sequence of the type mentioned above, the expression of which in plants increased by a factor of about 10 to 100 times results in increased resistance to pathogens.
  • the present invention also encompasses the Ca 2+ -binding EF-hand protein encoded by a nucleotide sequence of the aforementioned type or an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 2, wherein an increased protein concentration in plants causes an increased resistance to pathogens.
  • an approx. 10 is obtained after induction with a resistance inducer (eg BTH) - Up to 100 times stronger expression (mRNA content) detected.
  • a resistance inducer eg BTH
  • the Ca 2+ -binding EF-hand protein according to the invention is distinguished in that, when expression is increased in plants, it increases the resistance to pathogens by about 20 to 90%, preferably by about 50 to 80%, particularly preferably by 70% ,
  • the resistance of the plant is determined by the decrease in the penetration frequency.
  • the penetration frequency is to be understood as the number of infection sites with successfully penetrated epidermis cells, divided by the total number of infection sites.
  • the Ca 2+ -binding EF-hand protein according to the invention advantageously brings about increased resistance to biotrophic fungi in plants.
  • An increased concentration of Ca 2+ -binding EF-hand protein preferably brings about increased resistance to powdery mildew, particularly preferably Blumeria graminis f. sp. hordei or f. sp. tritici. However, this does not rule out increased resistance to other plant pathogens.
  • the Ca 2+ -binding EF-hand protein according to the invention is also understood to mean modified forms in which there are changes in the sequence, for example at the N and / or C terminus of the polypeptide or in the range of conserved amino acids, but without the function of the protein. These changes can be made in the form of amino acid exchanges according to methods known per se.
  • a special embodiment variant of the present invention comprises variants of the polypeptide according to the invention, the activity of which is weakened or increased, for example, by amino acid exchanges compared to the respective starting protein.
  • the present invention also comprises a gene structure containing at least the coding region of the isolated nucleotide sequence of the Bci-4 gene and operatively linked regulatory nucleotide sequences.
  • An operative link is understood to mean the sequential arrangement of, for example, the promoter, coding sequence, terminator and, if appropriate, further regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • These regulatory nucleotide sequences can be of natural origin or can be obtained by chemical synthesis.
  • any promoter which can control gene expression in the corresponding host organism is suitable as the promoter.
  • this can also be a natural or synthetically produced chemically inducible promoter, by means of which the expression of the genes underlying it in the host cell can be controlled at a specific point in time. This also includes tissue-specific promoters.
  • a gene structure is produced by fusing a suitable promoter with at least one nucleotide sequence according to the invention using common recombination and cloning techniques, as described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • adapters or linkers can be attached to the fragments.
  • the (5 1 - or upstream) and / or subsequent (3 'or downstream) sequence regions preceding the coding regions are also included.
  • this includes sequence areas with a regulatory function. You can use the transcription, the RNA stability or the RNA processing and translation. Examples of regulatory sequences include promoters, enhancers, operators, terminators or translation enhancers.
  • the invention further comprises a vector containing at least one nucleotide sequence of the type mentioned at the outset, coding for a Ca 2+ -binding EF-hand protein or a gene construct of the type mentioned above, and additional nucleotide sequences for selection and / or for replication in the host cell and / or for integration into the host cell genome.
  • the present invention relates to a transgenic plant and its progeny with increased resistance to a non-genetically modified plant, containing a nucleotide sequence and / or a gene structure and / or a vector of the type according to the invention in replicable form and increased number of copies.
  • the present invention also includes a method for increasing disease resistance in plants, the nucleotide sequence according to the invention coding for a Ca 2+ -binding EF-hand protein of the type described above and / or a gene construct and / or a vector of the type mentioned being replicable Transfer form into whole plants, parts of plants and / or plant cells, replicate in an increased number of copies compared to a non-transformed plant and the coded Ca 2+ -binding EF-hand protein is expressed in increased concentration.
  • nucleotide sequence and / or gene constructs and / or vectors are transferred into the plant or plant parts or cells by so-called particle bombardment and / or agrobacterial-mediated transformation.
  • nucleotide sequence coding for a Ca 2+ -binding EF-hand protein is transferred into a monocotyledonous plant. The transfer into a plant of the genus Hordeum or Triticum is preferred.
  • a particular advantage of the transgenic plant according to the invention and its progeny is that an increase in the number of copies of the nucleotide sequence according to the invention and, analogously, the presence of an increased concentration of protein encoded by the nucleotide sequence surprisingly leads to a substantially increased resistance to disease. That the gene according to the invention or the encoded protein is causally involved in the development of resistance to pathogenic pests.
  • the transgenic plant according to the invention thus has the advantage that it shows an induced resistance, although this resistance does not have to be triggered by chemicals.
  • This has the enormous advantage that unwanted side effects, such as a significant reduction in yield, such as occurs with conventional chemical-induced resistance, are now negligibly small or even excluded by the provision of the nucleotide sequences and transgenic plants according to the invention can.
  • the burden on the environment and users is reduced to zero by the application of the chemicals.
  • the transgenic plant according to the invention is further characterized in that the nucleotide sequence coding for a Ca 2+ -binding EF-hand protein is extrachromosomal and / or is stably integrated into the plant genome.
  • Appropriate procedures and aids, such as gene constructs or vectors and suitable auxiliary organisms for integrating the nucleotide sequence into the plant genome, are familiar to the person skilled in the art and are not described in detail.
  • a variant of the present invention includes transgenic plants in which the nucleotide sequence according to the invention is present in approximately 2-100, preferably approximately 5-50 and particularly preferably approximately 2-15 copies.
  • the present invention also relates to a transgenic plant which, in comparison to a non-genetically modified plant, contains an Ca 2+ -binding EF-hand protein of the type described at the outset or alleles thereof in increased concentration.
  • the increased concentration is based inter alia on an approximately 10 to 100-fold increase in expression of the gene coding for the Ca 2+ -binding EF hand protein.
  • the transgenic plant is characterized in that its resistance to pathogens is increased by 20 to 100%, preferably 50 to 80% and particularly preferably 50 to 60%, compared to a genetically unmodified plant.
  • the penetration frequency of pathogens is reduced by 20 to 100%, preferably 50 to 80% and particularly preferably by 50 to 60%.
  • a function of Bci-4 in resistance to Blumeria graminis f.sp. hordei was detected by overexpressing the Bci-4 gene in barley epidermal cells.
  • the penetration rate of attacked epidermal cells by the fungus was reduced by 20 and 50% in transformed cells in five of six experiments (see FIG. 1). Since the coexpression rate of reporter gene and test gene is 70%, the influence of the test gene is generally underestimated (Schweizer et al. 1999). Cells that only contain the test gene are not evaluated due to the lack of labeling and some of the cells that express a reporter gene do not contain a test gene.
  • the transgenic plant is more resistant to powdery mildew. There is preferably increased resistance to the phytopathogenic fungi Blumeria graminis f. sp. hordei or f. sp. tritici before. However, increased resistance to other phytopathogens cannot be excluded.
  • the transgenic plant is a useful plant, preferably a monocotyledonous useful plant.
  • Genera of barley (Hordeum) or wheat (Triticum) are particularly preferred.
  • the present invention also relates to the use of the nucleotide sequence according to the invention to increase resistance in plants.
  • the isolated nucleotide sequence can also be used as a marker gene for the phenomenon of induced resistance (cIR; chemically induced resistance) in monocotyledonous crop plants.
  • the present invention also includes the use of the Ca 2+ -binding EF-hand protein encoded by a nucleotide sequence of the type described or an amino acid sequence as shown in SEQ ID NO. 2 to increase pathogen resistance in plants.
  • the present invention is illustrated by the following examples, which, however, are not limiting:
  • the barley variety Ingrid comes from James McKey, University of Uppsala, Sweden.
  • the Pallas variety was provided by Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Copenhagen, Denmark.
  • the six-line winter barley cv. Manchuria which has no known powdery mildew resistance gene, was provided by the Institute of Biometrics, JLU G corden.
  • Conidiospores of Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. were used for the inoculation of barley plants with the real barley powdery mildew. hordei spear of breed A6 (BghA6) used.
  • BghA6 K ⁇ lster et al. 1986 was provided by the Institute for Biometry, JLU G corden. The inoculum was made in 'climate chambers under the same conditions as for plant breeding described, by transferring the conidia from infected plant material to regularly grown, seven-day-old barley plants cv. Golden Promise.
  • Bgt tritici spear
  • the seedlings were treated at different times after treatment with 1-8 conidia mm "2 of Bgh inoculated and incubated in climatic chambers or chambers.
  • DCINA 2,6-dichlorisonicotinic acid
  • DCINA 2,6-dichlorisonicotinic acid
  • DMF dimethyiformamide
  • aqueous solution (1 % DMF) adjusted to pH 7 with NaOH and applied in concentrations of 5 and 10 mg L "1 (corresponds to 0.02 and 0.04 mM, respectively) based on the soil volume.
  • Control plants were treated with WP or 1% DMF solution poured.
  • Benzo (1, 2,3) thiadiazole-7-carbothionic acid S-methyl ester (BTH, also Azibenzolar-S-methyl, CGA245704, Bion ® , Ciba-Geigy, now Syngenta, Basel, Switzerland) became a formulation of 50% more active Substance sprayed with WP in water in concentrations of 63, 100, 125 and 250 mg L "1 (corresponds to 0.3, 0.48, 0.6 or 1.2 mM) until the leaves were evenly covered by fine droplets
  • a soil application was carried out in concentrations of 20 and 50 mg L "1 (corresponds to 0.095 and 0.24 mM, respectively) based on the volume of the soil. Control plants were treated accordingly with WP solution.
  • Salicylic acid was dissolved directly in water or, after pre-dissolving in DMF in aqueous solution (1% DMF), adjusted to pH 6-7 with NaOH and in concentrations of 50 and 100 mg L "1 (corresponds to 0.36 and 0, 72 mM) applied over the floor in relation to the floor volume. Control plants were watered with water or 1% DMF solution.
  • JM jasmonic acid methyl ester
  • Abscisic acid was obtained by spraying an aqueous solution of
  • 50 ⁇ M was applied to seven day old seedlings until they were evenly covered by fine droplets. Control plants were sprayed with water. Treated plants were incubated in climatic chambers.
  • a wound was achieved by perforating the primary leaves of seven-day-old plants with 15 needles cm "2. Control plants remained uninjured and were cultivated together with the wounded in a climatic chamber. After this treatment, Bci-4 was not expressed.
  • the individual clones of the subtracted cDNA library were first checked for the size of the inserted cDNA fragments.
  • a colony PCR was carried out with primers (nested 1 and nested 2R) which are complementary to the sequence of the adapters which were ligated to the Rsal-cut cDNA fragments and thus directly flank the inserted region.
  • 5 ⁇ L of the bacterial cultures were bidistilled in 15 ⁇ L A. Denatured for 5 min at 98 ° C. and pipetted 10 ⁇ L of the denatured culture into 20 ⁇ L PCR mix.
  • the complete PCR mixture was then mixed with 7.5 ⁇ L 5x DNA application buffer, 10 ⁇ L of which were separated by gel electrophoresis in a 1.5% agarose gel with ethidium bromide (0.16 ⁇ g mL “1 ) in 1x TBE buffer a 1 kb + marker (Invitrogen, Groningen, the Netherlands) was used, and in the presence of an insert ⁇ 100 bp in size, the culture was transferred with a sterile toothpick for preservation to LB agar plates with ampicillin and incubated overnight at 37 ° C.
  • the cDNA Fragments were partially subsequently cloned either into pCR ® II-TOPO vector and transformed into TOP10 one shot cells according to the manufacturer's instructions (TOPO TA Cloning Kit Dual Promoter, Invitrogen, Groningen, Netherlands), or into pGEM-T vector (Promega, Mannheim) was cloned and transformed into DH5 ⁇ cells (Clontech, Heidelberg) by performing a colony PCR reaction (with nested 1 / 2R primer, see above) which PCR products separated in an agarose gel (see above), eluted from the gel (Quiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden), according to the manufacturer's instructions ligated into the corresponding vector and transformed into E co // cells.
  • TOPO TA Cloning Kit Dual Promoter, Invitrogen, Groningen, Netherlands or into pGEM-T vector (Promega, Mannheim) was cloned and transformed into DH5 ⁇ cells (Cl
  • the ends of the gene were generated in the 5 'and 3' direction using RACE (rapid amplification of cDNA ends) in accordance with the manufacturer's instructions for the Marathon cDNA Amplification Kit (Clontech, Heidelberg).
  • RACE rapid amplification of cDNA ends
  • the method is based on the fact that a cDNA library is created from RNA by reverse transcription. Adapters to which complementary primers exist are ligated to the ends of the most complete cDNAs possible.
  • a primer is derived for each direction (3 'and 5' end), which is extended in the corresponding direction when amplified.
  • the ends of the cDNAs are then to be produced in hot start PCR batches, each with an outwardly directed gene-specific and an adapter primer (AP).
  • AP adapter primer
  • R ⁇ CE primer (clone 4-Q2 / Bci-4): gene-specific. Primer nested 1: 5'-GCCATCCTTGTTCCGGTCGAAAA-3 'gene specific. Primer 2: 5'-GTGGATCTTTAGCTGGAACTGGGGGC-3 'gsp2
  • Adapter primer 1 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3 '
  • PCR products were extracted from the 1x TBE agarose gel with ethidium bromide, ligated into the pGEM-T vector (Promega, Mannheim) according to the manufacturer's instructions, transformed into DH 5 ⁇ cells (Clontech, Heidelberg), and from the plasmid sequenced.
  • a possible open reading frame for the amino acid sequence (open reading frame, ORF) was derived from the sequence information.
  • RT-PCR SuperScript TM One-Step TM RT-PCR System
  • gene-specific primers which spanned the complete ORF and contained interfaces for restriction enzymes ( ⁇ '-BamHI, 3'-HindIII) at their 5 'ends , GibcoBRL TM Life Technologies TM, Düsseldorf) with 500 ng RNA from BTH-induced plants (250 mg L "1 sprayed, 24 hpt) as a template, 0.2 ⁇ M sense and antisense primers (see below) and 0.5 ⁇ l RT / Taq Mix in 1x Reaction Mix (GibcoBRL TM Life Technologies TM, Düsseldorf) performed:
  • ⁇ RT-PCR primer (clone 4-62 / ßc / -4): - ORF1 (with SJartc don)
  • the recombinant protein of a gene which is chemically inducible at the transcript level (Bci-4) is synthesized in a heterologous bacterial expression system.
  • the recombinant protein expression was carried out using the QIAexpress System Type IV according to the manufacturer's instructions (The QIAexpressionist TM, 3 d edition, Qiagen, Hilden).
  • the vector pQE 30 used has at the 5 'end in front of the multiple cloning site (MCS) a sequence which codes for six successive N-terminal histidine residues (6xHis-tag), with the aid of which the synthesized protein can subsequently be purified.
  • FIG. 1 shows the microscopic evaluation of the influence of the overexpression of Bci-4 on the interaction of barley with the powdery mildew.
  • Successful and stopped penetration events on transformed epidermis cells after bombardment with Bci-4 (plus reporter) were counted compared to bombardment of the reporter construct alone (control).
  • the photos on the right-hand side (FIGS. 1b, 1c) each show a successful penetration event in which the fungus succeeds in establishing a house torium in a transformed epidermal cell and then developing secondary mycelium (elongating secondary hyphae, ESH).
  • the green-blue staining of the transformed cells was due to the conversion of the substrate x-gluc by the co-expressed ß-glucuronidase.
  • the house door is also clearly colored green-blue, because it is surrounded by an extra-memorial matrix, which is formed from the plasma membrane of the host cell and is surrounded by the cytoplasm border of the epidermis cell, in which the dye accumulates.
  • FIG. 1Aa the penetration of the fungus was prevented by the formation of an effective papilla, the attempt at penetration was stopped and the fungus was unable to spread further on the leaf surface. It can be seen from FIG. 1B that the overexpression of Bci-4 reduces the penetration frequency of Bgh.
  • the number of interaction sites with effective papilla formation (blocked penetration attempt) and with the formation of a house torium or secondary cycle (ESH) was evaluated in comparison to control transformations (expression of reporter gene alone) (30-70 interaction sites per column).
  • the penetration rate indicates the ratio of established house stories to examined interaction points in%.

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Abstract

Die Vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca2+ -bindendes EF-hand-Protein sowie ein Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen.

Description

Nukleotidsequenz sowie Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz von Pflanzen
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Nukleotidsequenz sowie ein Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz von Pflanzen.
Das Auftreten von Pflanzenkrankheiten, beispielsweise hervorgerufen durch Viren, Bakterien oder Pilze, kann zu erheblichen Schädigungen oder sogar zum Ausfall der ganzen Pflanze führen, verbunden mit einer drastisch verringerten Menge oder Qualität des Erntegutes. Um die Ertragsverluste auf ein wirtschaftlich vertretbares Maß zu begrenzen, sind Pflanzenschutzmaßnahmen unabdingbar.
Dem Phänomen der induzierten Resistenz (IR) liegt ein natürlicher Mechanismus zu Grunde, der durch pathogene oder apathogene Mikroorganismen sowie Herbivore ausgelöst werden kann und zu einer erhöhten Resistenz gegenüber einem Befall mit anderen Pathogenen bzw. Schädlingen führt (blR, biotisch Induzierte Resistenz, Hammerschmidt 1993, van Loon e;f al. 1998). Es handelt sich bei der IR um einen aktiven pflanzlichen Prozess, der sowohl die Auslösung und Verstärkung zellulärer Abwehrmechanismen durch einen Induktor umfasst, als auch die erhöhte Bereitschaft der Pflanze beinhaltet, schneller mit Abwehrreaktionen auf den Angriff zu antworten (Hammerschmidt 1993; Kessmann et al. 1994).
Ross (1961) benutzt die Begriffe local und systemic acquired resistance (lokale und systemische erworbene Resistenz) für das oben beschriebene Phänomen. Treffender ist jedoch der Ausdruck Induzierte Resistenz, daher werden im folgenden die Abkürzungen IR bzw. sIR benutzt. Bei der IR bleibt der Effekt auf das mit dem Induktor-Pathogen inokulierte Blatt beschränkt, bei der sIR weitet sich die Resistenz auf unbehandelte Pflanzenteile wie höhere Blattetagen, den Zuwachs oder auch Wurzeln (Gessler & Kuc 1982), also systemisch, aus.
Auf den Versuchen von Ross (1961) aufbauend, wurde das Phänomen der sIR in verschiedenen Dikotyledonen wie Tabak und Gurke sehr gut charakterisiert und konnte auch in Arabidopsis thaliana, der experimentellen Modellpflanze, nachgewiesen werden (Kessmann et al. 1994). Die Ausprägung der sIR ist mit der Expression eines komplexen Sets von Genen assoziiert, zu denen PR-Gene pathogenesis-related genes und solche unbekannter Funktion gehören (Ward et al. 1991 , Uknes et al. 1992, Ryals et al. 1996). Ihre Expression variiert jedoch in Quantität und Qualität zwischen verschiedenen Pflanzenarten und Induktoren (Ryals e* al. 1996, Thomma et al. 1998, Thomma e* al. 2001 , Bostock 1999).
Eine Form der sIR ist durch die Akkumulation von Salicylsäure (SA) charakterisiert, die sowohl lokal am Ort der Infektion, als auch systemisch in distal gelegenem Gewebe z.T. durch den Transport im Phloem, beobachtet wird (SAR, Schneider et al. 1996). Dabei korreliert der endogene SA-Gehalt mit der Induktion von PR-Proteinen und der Resistenz (Enyedi et al. 1992b, Yalpani et al. 1993). Auch die exogene Applikation von SA kann sowohl Resistenz als auch ein gleiches Set von SAR-Genen wie nach Pathogenbefall induzieren (Ward et al. 1991). Die Natur des systemischen Signals zur Etablierung der SAR ist bislang allerdings nicht identifiziert.
Nahezu alle Erkenntnisse über die Induzierte Resistenz sind in dikotylen
Pflanzen gewonnen und lassen sich nicht ohne weiteres auf die Wirt- Pathogen-Interaktionen monokotyler Pflanzen übertragen. Da die bedeutendsten Nutzpflanzen jedoch monokotyledone Pflanzen sind, sind Erkenntnisse zu Resistenzmechanismen und deren Auslöser in diesem Pflanzenstamm von enormer Relevanz.
In der WO 00/71748 werden Genfragmente (ESTs) offenbart, die durch chemische Resistenzinduktoren induziert werden und an der Expression von IR beteiligt sind. Schwerpunkt dieser Anmeldung ist ein Screening- Verfahren zur generellen Identifizierung von Chemikalien, die an der Induktion von Resistenz beteiligt sind. Bei Beßer et al. (2000, Molecular Plant Pathology, 1(5): 277-286) sind Untersuchungen zu chemisch induzierten Genen in Gerste sowie deren Beteiligung an verschiedenen Wegen der Krankheitsresistenz beschrieben. Unter anderen ist hier auch ein mit Bci-4 bezeichnetes Genfragment (312 bp) beschrieben, das weder durch die Phytohormone Jasmonat oder Jasmonsäure-Methylester noch durch Ethylen oder Abscisinsäure oder durch Sorbit induziert wird. Auch die Verwundung der Pflanze oder die Inokulation mit dem pathogenen Pilz Blumeria graminis f.sp. hordei (Echter Gerstenmehltau) induziert die Expression von Bci-4 in Gerste nicht. Letzteres stellt einen wesentlichen Unterschied zu den PR- Genen (p_athogen-related genes) aus dicotyledonen Pflanzen dar. Bci-4 aus Gerste wird alleine durch Resistenzinduktoren, wie SA (Salicylsäure), 2,6-di-Chlorisonicotinsäure (DCINA) und Benzo-(1 ,2,3)-thiadiazol-7- carbothionsäure-S-methylester (BTH oder Bion®) aktiviert, wobei die beiden letzten Verbindungen wahrscheinlich SA-Analoga darstellen.
Alterdings wäre es wünschenswert auch ohne den Einsatz von Chemikalien, die eine zusätzliche Belastung für Boden und Grundwasser sowie den Anwender darstellen, die Abwehr von Pflanzen gegenüber Schädlingen zu verbessern. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Gene und Verfahren zur Verfügung zu stellen, durch die die Resistenz von Pflanzen, vorteilhafter Weise von Nutzpflanzen, auch ohne die Induktion durch Chemikalien gegenüber Pathogenen gesteigert werden kann.
Die Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung in vorteilhafter Weise gelöst.
Gegenstand der Erfindung ist eine isolierte Nukleotidsequenz, kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand-Protein, deren Überexpression in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz bewirkt, ausgewählt aus a) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 , b) einer Nukleotidsequenz, die eine wenigstens 75 %ige Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz, c) einer mit a) und b) hybridisierenden Nukleotidsequenz, d) einer zu a), b) oder c) komplementären Nukleotidsequenz.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung stammt die Nukleotidsequenz aus Gerste (Hordeum). Da es sich bei der zuvor genannten Nukleotidsequenz um ein chemisch induzierbares Gen handelt, wird es auch mit Bci-4 bezeichnet für bariey chemically jnduced gene.
Unter einer isolierten Nukleinsäure oder einem isolierten Nukleinsäurefragment ist erfindungsgemäß ein Polymer aus RNA oder DNA zu verstehen, das einzel- oder doppelsträngig sein kann und optional natürliche, chemisch synthetisierte, modifizierte oder artifizielle Nukleotide enthalten kann. Der Begriff DNA-Polymer schließt hierbei auch genomische DNA, cDNA oder Mischungen davon ein. Unter hybridisierenden Nukleotidsequenzen im Sinne der Erfindung sind Oligo- oder Polynukleotide zu verstehen, die unter Standard- Hybridisierungsbedingungen an die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz des Bci-4 binden. Der Begriff Standard-Hybridisierungsbedingungen ist breit zu verstehen und meint stringente und weniger stringente Hybridisierungsbedingungen. Solche Bedingungen sind unter anderem bei Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press,) beschrieben. Der Begriff hybridisierende Sequenzen schließt erfindungsgemäß substanziell ähnliche Nukleotidsequenzen aus der Gruppe von DNA oder RNA ein, die unter an sich bekannten Standard-Hybridisierungsbedingungen eine spezifische Wechselwirkung (Bindung) mit den erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen eingehen. Hierzu zählen auch kurze Nukleotidsequenzen mit einer Länge von beispielsweise 10 bis 30, bevorzugt 12 bis 15 Nukleotiden. Dies umfaßt erfindungsgemäß u. a. auch sogenannte Primer oder Sonden.
Unter Allelen sind erfindungsgemäß funktionell äquivalente, d. h. im wesentlichen gleichwirkende Nukleotidsequenzen zu verstehen. Funktioneil äquivalente Sequenzen sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotidsequenz, beispielsweise durch die Degeneriertheit des genetischen Codes noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene und gegebenenfalls an den Kodon- Gebrauch des Wirtsorganismus angepaßte Nukleotid-Sequenzen. Darüber hinaus umfassen funktioneil äquivalente Sequenzen solche, die eine veränderte Nukleotidsequenz aufweisen, welche dem Protein beispielsweise eine Desensitivität oder Resistenz gegenüber Inhibitoren verleiht. Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste.
Inbegriffen sind hier auch sogenannte Sinnmutationen (sense mutations), die auf Proteinebene beispielsweise zum Austausch konservierter Aminosäuren führen können, welche aber zu keiner grundsätzlichen Veränderung der Aktivität des Proteins führen und somit funktionsneutral sind. Dies beinhaltet auch Veränderungen der Nukleotidsequenz, die auf Proteinebene den N- oder C-Terminus eines Proteins betreffen, ohne jedoch die Funktion des Proteins wesentlich zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können sogar stabilisierenden Einfluß auf die Proteinstruktur ausüben.
Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen Gegenstand der vorliegenden Erfindung, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschten Eigenschaften vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rückübersetzung von mittels computergestützten Programmen (molecular modelling) erstellten Proteinen oder durch in- vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für den Wirtsorganismus spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spezifische Kodon-Nutzung kann ein mit molekulargenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bereits bekannter Gene des zu transformierenden Organismus leicht ermitteln.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents bezieht sich auch auf das durch die entsprechende Nukleotidsequenz kodierte Protein. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der des Referenzproteins (hier des Ca2+ bindenden EF-hand-Proteins kodiert durch BCI-4) bis zu einem bestimmten Prozentsatz homolog ist. Der Prozentsatz liegt bei mindestens 75%, bevorzugt 80%, besonders bevorzugt 90-95% und insbesondere bei 99,9%.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine isolierte Nukleotidsequenz der zuvor erwähnten Art, deren um den Faktor von etwa 10- bis 100-fach gesteigerte Expression in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch das Ca2+-bindende EF-hand- Protein kodiert durch eine Nukleotidsequenz der zuvor genannten Art oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, wobei eine erhöhte Protein-Konzentration in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung wird, ausgehend von einer nur mit RT-PCR nachweisbaren, extrem schwachen konstitutiven Expression des für ein Ca +-bindendes EF-hand-Protein kodierendes Gen, nach Induktion mit einem Resistenzinduktor (z.B. BTH) eine ca. 10- bis 100-fach stärkere Expression (mRNA-Gehalt) nachgewiesen.
Das erfindungsgemäße Ca2+-bindende EF-hand-Protein zeichnet sich dabei dadurch aus, daß es bei verstärkter Expression in Pflanzen die Resistenz gegenüber Pathogenen um etwa 20 bis 90 %, bevorzugt um etwa 50 bis 80 %, besonders bevorzugt um 70% steigert. Die Resistenz der Pflanze wird dabei über die Abnahme der Penetrationsfrequenz ermittelt. Unter Penetrationsfequenz ist erfindungsgemäß die Anzahl der Infektionsstellen mit erfolgreich penetrierten Epidermiszelle zu verstehen, dividiert durch die Gesamtzahl der Infektionsstellen.
Das erfindungsgemäße Ca2+-bindende EF-hand-Protein bewirkt in vorteilhafter Weise in Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber biotrophen Pilzen. Bevorzugt bewirkt eine erhöhte Konzentration an Ca2+- bindendem EF-hand-Protein eine erhöhte Resistenz gegenüber Mehltaupilzen, besonders bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici. Eine erhöhte Resistenz gegenüber weiteren Pflanzenpathogenen ist dadurch jedoch nicht ausgeschlossen.
Unter dem erfindungsgemäßen Ca2+-bindenden EF-hand-Protein sind auch modifizierten Formen zu verstehen, bei denen Änderungen in der Sequenz, beispielsweise am N- und/oder C-Teminus des Polypeptids oder im Bereich konservierter Aminosäuren vorliegen, ohne jedoch die Funktion des Proteins zu beeinträchtigen. Diese Veränderungen können in Form von Aminosäureaustauschen nach an sich bekannten Methoden vorgenommen werden.
Eine besondere Ausführungsvariante der vorliegenden Erfindung umfaßt Varianten des erfindungsgemäßen Polypeptids, dessen Aktivität beispielsweise durch Aminosäureaustausche, verglichen mit dem jeweiligen Ausgangsprotein, abgeschwächt oder verstärkt ist. Gleiches gilt für die Stabilität des erfindungsgemäßen Proteins in den Zellen, die beispielsweise gegenüber dem Abbau durch Proteasen verstärkt oder vermindert anfällig sind.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch eine Genstruktur enthaltend wenigstens den kodierenden Bereich der isolierten Nukleotidsequenz des Bci-4-Gens sowie damit operativ verknüpfte regulatorische Nukleotidsequenzen.
Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung beispielsweise von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulatorischer Elemente derart, daß jedes der regulatorischen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Diese regulatorischen Nukleotidsequenzen können natürlichen Ursprungs sein oder durch chemische Synthese erhalten werden. Als Promotor ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Genexpression in dem entsprechenden Wirtsorganismus steuern kann. Hierbei kann es sich erfindungsgemäß auch um einen natürlichen oder synthetisch erzeugten chemisch induzierbaren Promotor handeln, durch den die Expression der ihm unterliegenden Gene in der Wirtszelle zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Hierzu zählen auch gewebespezifische Promotoren. Die Herstellung einer Genstruktur erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit wenigstens einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratury, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.
Erfindungsgemäß sind auch die den kodierenden Bereichen (Strukturgenen) vorausgehenden (51- oder upstream) und/oder nachfolgenden (3'- oder downstream) Sequenzbereiche eingeschlossen. Insbesondere sind hierin Sequenzbereiche mit regulatorischer Funktion inbegriffen. Sie können die Transkription, die RNA-Stabilität oder das RNA processing sowie die Translation beeinflussen. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind u. a. Promotoren, Enhancer, Operatoren, Terminatoren oder Translationsverstärker.
Erfindungsgemäß umfaßt ist ferner ein Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz der eingangs erwähnten Art kodierend für ein Ca2+- bindendes EF-hand-Protein oder ein Genkonstrukt der zuvor genannten Art sowie zusätzliche Nukleotidsequenzen zur Selektion und/oder zur Replikation in der Wirtszelle und/oder zur Integration in das Wirtszell- Genom.
Beispiele für vorteilhafte Vektoren im Sinne der vorliegenden Erfindung sind pPCV, (Koncz et al., PMB Manual B2, 1-22, 1994), pBIN19 (Yokubaitis et al., PMB 27, 405-409, 1995). Diese Beispiele wirken sich nicht limitierend auf die vorliegende Erfindung aus.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine transgene Pflanze und deren Nachkommen mit erhöhter Resistenz gegenüber einer nicht genetisch veränderten Pflanze, enthaltend in replizierbarer Form und erhöhter Kopienzahl eine Nukleotidsequenz und/oder eine Genstruktur und/oder einen Vektor der erfindungsgemäßen Art.
Die vorliegende Erfindung umfaßt auch ein Verfahren zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen, wobei die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand-Protein der zuvor beschriebenen Art und/oder ein Genkonstrukt und/oder ein Vektor der genannten Art in replizierbarer Form in ganze Pflanzen, Pflanzenteile und/oder Pflanzenzellen übertragen, im Vergleich zu einer nicht- transformierten Pflanze in erhöhter Kopienzahl repliziert und das kodierte Ca2+-bindende EF-hand-Protein in erhöhter Konzentration zur Expression gebracht wird.
Verfahren zur Herstellung solcher erfindungsgemäßen trangenen Pflanzen gehören zur gängigen Laborpraxis. In einer vorteilhaften Variante der vorliegenden Erfindung werden die Nukleotidsequenz und/oder Genkonstrukte und/oder Vektoren durch sogenanntes ,particle bombardment' und/oder Agrobakterien-vermittelte Transformation in die Pflanze oder Pflanzenteile oder Zellen übertragen. In einer Variante des vorliegenden Verfahrens wird die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand-Protein in eine monokotyledone Pflanze übertragen. Bevorzugt erfolgt die Übertragung in eine Pflanze der Gattung Hordeum oderTriticum.
Ein besonderer Vorteil der erfindungsgemäß transgenen Pflanze und deren Nachkommen ist, das eine Erhöhung der Kopienzahl der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz und analog das Vorliegen einer erhöhten Konzentation an durch die Nukleotidsequenz kodierten Proteins überraschender Weise zu einer wesentlich gesteigerten Krankheitsresistenz führt. D.h. das erfindungsgemäße Gen bzw. das kodierte Protein ist kausal an der Ausbildung der Resistenz gegenüber pathogenen Schädlingen beteiligt.
Die erfindungsgemäße transgene Pflanze weist somit den Vorteil auf, daß sie eine induzierte Resistenz zeigt, wobei diese Resistenz jedoch nicht durch Chemikalien ausgelöst werden muß. Dies bringt den enormen Vorteil mit sich, das ungewollte Nebeneffekte, wie z.B. eine erhebliche Ertragsminderung, wie sie bei der herkömmlichen durch Chemikalien induzierten Resistenz stets auftritt, nun durch die Bereitstellung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen und transgenen Pflanzen vernachlässigbar klein werden oder sogar ausgeschlossen werden können. Zudem wird die Belastung für Umwelt und Anwender durch das Ausbringen der Chemikalien auf Null reduziert.
Die erfindungsgemäß transgene Pflanze zeichnet sich ferner dadurch aus, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand- Protein extrachromosomal vorliegt und/oder stabil in das pflanzliche Genom integriert ist. Entsprechende Vorgehensweisen und Hilfsmittel, wie Genkonstrukte oder Vektoren und geeignete Hilfsorganismen zur Integration der Nukleotidsequenz in das pflanzliche Genom sind dem Fachmann geläufig und werden nicht näher ausgeführt.
In einer Variante der vorliegenden Erfindung sind transgene Pflanze umfaßt, in denen die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz in ca. 2-100, bevorzugt ca. 5-50 und besonders bevorzugt ca. 2-15 Kopien vorliegt.
Ferner ist auch eine transgene Pflanze Gegenstand der vorliegenden Erfindung, enthaltend im Vergleich zu einer nicht-genetisch veränderten Pflanze ein Ca2+-bindendes EF-hand-Protein der eingangs erläuterten Art oder Allele davon in erhöhter Konzentration. Die erhöhte Konzentration beruht dabei u.a. auf einer etwa 10- bis 100-fach gesteigerten Expression des für das Ca2+-bindende EF-hand-Protein kodierenden Gens.
Die transgene Pflanze zeichnet sich erfindungsgemäß dadurch aus, daß ihre Resistenz gegenüber Pathogenen im Vergleich zu einer genetisch nicht veränderten Pflanze um 20 bis 100 %, bevorzugt 50 bis 80 % und besonders bevorzugt um 50 bis 60 % erhöht ist.
D.h. das in der erfindungsgemäßen transgenen Pflanze die Penetrationsfrequenz von Pathogenen um 20 bis 100 %, bevorzugt 50 bis 80 % und besonders bevorzugt um 50 bis 60% reduziert ist. Eine Funktion von Bci-4 bei der Resistenz gegenüber Blumeria graminis f.sp. hordei konnte durch die Überexpression des Bci-4 Gens in Gerstenepidermiszellen nachgewiesen werden. Die Penetrationsrate attackierter Epidermiszellen durch den Pilz wurde in transformierten Zellen in fünf von sechs Experimenten um 20 bzw. 50 % reduziert (s. Figur 1). Da die Coexpressionsrate von Reportergen und Testgen bei 70 % liegt, wird der Einfluss des Testgens prinzipiell unterschätzt (Schweizer et al. 1999). Zellen, die nur das Testgen enthalten, werden aufgrund fehlender Markierung nicht ausgewertet und ein Teil der Zellen, die ein Reportergen exprimaren, enthalten kein Testgen.
Die transgene Pflanze ist verstärkt gegenüber Mehltaupilzen resistent. Bevorzugt liegt eine gesteigerte Resistenz gegenüber den phytopathogenen Pilzen Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici vor. Jedoch ist eine gesteigerte Resistenz gegenüber anderen Phytopathogenen nicht ausgeschlossen.
In einer vorteilhaften Variante der Erfindung ist die transgene Pflanze eine Nutzpflanze, bevorzugt eine monokotyledone Nutzpflanze. Besonders bevorzugt sind Gattungen von Gerste (Hordeum) oder Weizen (Triticum).
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz zur Steigerung der Resistenz in Pflanzen. Dabei kann die isolierte Nukleotidsequenz auch als Markergen für das Phänomen der Induzierten Resistenz (cIR; chemisch induzierte Resistenz) in monokotyledonen Nutzpflanzen genutzt werden. Die vorliegende Erfindung umfaßt auch die Verwendung des Ca2+-bindenden EF-hand-Proteins kodiert durch eine Nukleotidsequenz der beschriebenen Art oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 zur Steigerung der Pathogenresistenz in Pflanzen. Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, die jedoch nicht limitierend sind:
Allgemeine Methoden
Allgemeine DNA- und Klonierungstechniken, Sequenzierung, PCR, Northem-Blots, Western-Blots sowie die Kultivierung von Mikroorganismen sind gängige Labormethoden und u.a. in Sambrook et al. (Molecular cloning. A laboratory manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratory Press) beschrieben.
Die Behandlung von Pflanzenmaterial ist ebenfalls gängige Laborpraxis und u.a. in Beßer et al., 2000 beschrieben.
Pflanzenmaterial Es wurden Gerstenpflanzen (Hordeum vulgäre L.) der Sorten (cv.) Ingrid, Manchuria, Pallas und Golden Promise und Weizenpflanzen (Triticum aestivum L.) cv. Kanzler verwendet. Die Gerstensorte Ingrid stammt von James McKey, University of Uppsala, Schweden. Die Sorte Pallas wurde von Lisa Munk, Department of Plant Pathology, Royal Veterinary and Agricultural University, Kopenhagen, Dänemark zur Verfügung gestellt. Die sechszeilige Wintergerste cv. Manchuria, die kein bekanntes Resistenzgen gegen Echten Mehltau besitzt, wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen, bereitgestellt. Der Winterweichweizen cv. Kanzler, ebenfalls ohne bekanntes Resistenzgen gegen Echten Mehltau, wurde von der Saatzucht Engelen-Büchling oHG, Büchlingen/Oberschneiding, bezogen. Weitere Angaben zu Weizensorten sind bei Breown, J. K. M. et al. (1991) beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf das zuvor genannte Pflanzenmaterial beschränkt. Das 12-36 h im Dunkeln auf feuchtem Filterpapier vorgekeimte Saatgut wurde, wenn nicht anders beschrieben, zu je 5 Körnern an den Rand eines Vierkanttopfes (8x8 cm) in Fruhstorfer Erde vom Typ P ausgelegt, mit Erde bedeckt und regelmäßig mit Leitungswasser gegossen. Alle Pflanzen wurden in Klimaschränken oder -kammern bei 16-18 °C, 50-60 % relativer Luftfeuchte und einer Lichtperiode von 16 h mit 3000 bzw. 5000 lux (50 bzw. 60 μE s"1 m"2) 5-8 Tage lang kultiviert und im Keimlingsstadium in den Versuchen verwendet. Bei Experimenten, in denen Applikationen an Primärblättern durchgeführt wurden, waren diese vollständig entwickelt.
Pflanzen, die bis zur Entwicklung von Ähren kultiviert werden sollten, wurden einzeln in Fruhstorfer Erde LD 80 getopft, regelmäßig gegossen, bei Bedarf in größere Töpfe umgetopft und im Gewächshaus zusätzlich beleuchtet. Für die Untersuchung verschiedener Blattgewebe wurde zu verschiedenen Erntezeitpunkten die Epidermis der abaxialen Blattspreite von Gerstenprimärblättern abgezogen und getrennt vom restlichen Blattgewebe (Mesophyll und Epidermis der adaxialen Blattspreite) in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70 °C aufbewahrt.
Pathogene und Schädlinge
Blumeria graminis
Für die Inokulation von Gerstenpflanzen mit dem Echten Gerstenmehltaupilz wurden Konidiosporen von Blumeria [syn Erysiphe] graminis f.sp. hordei Speer der Rasse A6 (BghA6) verwendet. BghA6 (Kφlster et al. 1986) wurde vom Institut für Biometrie, JLU Gießen zur Verfügung gestellt. Die Nachzucht des Inokulums erfolgte in' Klimakammern bei gleichen Bedingungen, wie für die Pflanzenanzucht beschrieben, durch Übertragung der Konidien von befallenem Pflanzenmaterial auf regelmäßig angezogene, sieben Tage alte Gerstenpflanzen cv. Golden Promise.
Für die Inokulation mit dem Echten Weizenmehltaupilz wurden Konidien von Blumeria graminis f.sp. tritici Speer (Bgt) verwendet. Bei Bgt handelte es sich um ein Feldisolat aus Aachen, das vom IPAZ Gießen, von Weizen isoliert und dem Institut zur Verfügung gestellt wurde. In Klimakammern bzw. -schränken wurde das Isolat unter den in 2.1 genannten Bedingungen auf Weizen cv. Kanzler erhalten.
Behandlung des Pflanzenmaterials
Inokulation
Blumeria graminis
Primärblätter sieben Tage alter Keimlinge wurden durch Abschütteln der Konidien befallener Pflanzen in einem Inokulationsturm mit 1-8 Konidien mm"2 von BghAQ oder Bgt (Feldisolat) inokuliert und in Klimaschränken bzw. -kammern inkubiert. Bei Versuchen, in denen die Mehltaukolonien zur Bestimmung der Befallsdichte ausgezählt werden sollten, wurden die
Primärblätter vor der Inokulation mit der adaxialen Seite nach oben mit Hilfe von Klebestreifen auf Tabletts fixiert. Mit Kontrollpflanzen wurde bis auf das Abschütteln von Sporen ebenso verfahren (moc/cfSchein]-
Behandlung). Zur Auswertung 6-7 dpi (days post inoculation) wurden
Segmente inokulierter und moc/c-behandelter Primärblätter auf 0,5%igen
Wasseragar mit 20 mg L"1 Benzimidazol gelegt. Zur Überprüfung einer resistenzinduzierenden Wirkung verschiedener
Behandlungen wurden die Keimlinge zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Behandlung mit 1-8 Konidien mm"2 von Bgh inokuliert und in Klimaschränken bzw. -kammern inkubiert.
Applikation chemischer Resistenzinduktoren
Alle Behandlungen mit chemischen Resistenzinduktoren wurden, wenn nicht anders beschrieben, bei Gerste an 5-8 Tage alten Keimlingen durchgeführt. Behandelte Pflanzen (je 5 in einem Topf) wurden in Klimaschränken oder -kammern weiter kultiviert.
2,6-Dichlorisonikotinsäure (DCINA, CGA41396, Ciba-Geigy, jetzt Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 25 % aktiver Substanz mit wettable powder (WP) oder nach Vorlösen der Reinsubstanz mit Dimethyiformamid (DMF) in wässriger Lösung (1 % DMF) mit NaOH auf pH 7 eingestellt und in Konzentrationen von 5 und 10 mg L"1 (entspricht 0,02 bzw. 0,04 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert. Kontrollpflanzen wurden mit WP- oder 1 %iger DMF- Lösung gegossen.
Benzo(1 ,2,3)thiadiazol-7-carbothionsäure-S-methylester (BTH, auch Azibenzolar-S-methyl, CGA245704, Bion®, Ciba-Geigy, jetzt Syngenta, Basel, Schweiz) wurde als Formulierung von 50 % aktiver Substanz mit WP in Wasser in Konzentrationen von 63, 100, 125 und 250 mg L"1 (entspricht 0,3, 0,48, 0,6 bzw. 1,2 mM) gesprüht, bis die Blätter gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Eine Bodenapplikation erfolgte in Konzentrationen von 20 und 50 mg L"1 (entspricht 0,095 bzw, 0,24 mM) bezogen auf das Bodenvolumen. Kontrollpflanzen wurden entsprechend mit WP-Lösung behandelt. Salicylsäure (SA) wurde direkt in Wasser gelöst oder nach Vorlösen in DMF in wässriger Lösung (1 % DMF) mit NaOH auf pH 6-7 eingestellt und in Konzentrationen von 50 und 100 mg L"1 (entspricht 0,36 bzw. 0,72 mM) bezogen auf das Bodenvolumen über den Boden appliziert. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser oder 1 %iger DMF-Lösung gegossen.
Applikation von Phvtohormonen
Behandlung mit Jasmonsäuremethylester (JM) erfolgte in Glaspetrischalen durch 'Floaten' von Primärblättern sieben Tage alter Pflanzen auf einer
Lösung von 45 μM JM in Klimakammern. Kontrollblätter wurden auf
Wasser 'gefloatet'.
Abscisinsäure (ABA) wurde durch Sprühen einer wässrigen Lösung von
50 μM auf sieben Tage alte Keimlinge appliziert, bis sie gleichmäßig von feinen Tröpfchen bedeckt waren. Kontrollpflanzen wurden mit Wasser besprüht. Behandelte Pflanzen wurden in Klimakammern inkubiert .
Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen wurden auf angefeuchtetem
Filterpapier in gasdichten Erlenmeyerkolben mit Ethylengas in
Konzentrationen von 0,001, 1 , 10 und 100 μL L"1 (entspricht 0,028, 28, 280 bzw. 2800 μM) im Klimaschrank inkubiert. Kontrollblätter wurden mit
Luft begast. Nach dieser Behandlung erfolgte keine Expression von Bci-4.
Applikation von Sorbit
Durch 'Floaten' von Primärblättern sieben Tage alter Keimlinge auf 1 M Sorbit-Lösung kann über den dabei entstehenden osmotischen Stress der endogene Jasmonatgehalt in Gerste erhöht werden (Lehmann et al. 1995). Zur Überprüfung des erhöhten Jasmonatgehaltes behandelter Blätter wurde die Genexpression von Jip-23 (jasmonatlnduziertes Protein 23, Ortel et al. 1999; Hause et al. 1999) in Gelblot Analysen nachgewiesen. Die entsprechende Sonde wurde vom Institut für Pflanzenbiochemie, Halle, zur Verfügung gestellt. Kontrollblätter wurden unter sonst gleichen Bedingungen in Klimakammern auf Wasser 'gefloatet'. Nach dieser Behandlung erfolgte keine Expression von Bci-4. Verwundung
Eine Verwundung wurde durch Perforation der Primärblätter sieben Tage alter Pflanzen mit 15 Nadeln cm"2 erreicht. Kontrollpflanzen blieben unverletzt und wurden zusammen mit den Verwundeten im Klimaschrank weiter kultiviert. Nach dieser Behandlung erfolgte keine Expression von Bci-4.
Erzeugung einer subtrahierten cDNA Bank
Zur Erzeugung dieser cDNA-Bank wurden fünf Tage alte Gerstenpflanzen der Mutante A89 (Beßer et al., 2000) mit 5 mg L"1 DCINA bezogen auf das Bodenvolumen bzw. mit WP als Kontrolle begossen. Aus den Primärblättern wurde nach 12, 24 und 48 h Gesamt-RNA nach Dudler et al. (1991) extrahiert und jeweils gleiche RNA-Mengen von DCINA- bzw. WP-Proben der verschiedenen Erntezeitpunkte vereinigt. Nach Isolierung von poly(A)+-RNA mit Hilfe des Dynabeads mRNA Purification Kit (Dynal, Hamburg) und reverser Transkription der mRNA wurde eine suppressive Subtrakionshybridisierung (SSH, Diatchenko et al. 1996) durchgeführt (PCR-Sele ™ cDNA Subtraction Kit, Clontech, Heidelberg). Dabei wurde doppelsträngige cDNA von nicht-induzierten Kontrollpflanzen mit der DCINA-induzierter Pflanzen nach Rsa/-Restriktionsverdau und Adapterligation hybridisiert. Die cDNA-Fragmente differentiell exprimierter Gene standen dann für eine nachfolgende Suppressions-PCR als template zur Verfügung, in der sie unter Angleichung der Anzahl selten und häufig vorhandener Fragmente angereichert wurden. Die so gewonnenen PCR-Produkte subtrahierter cDNA-Fragmente wurden über T/A-Klonierung in pTAdv-Vektoren ligiert und in TOP 10F' E co//-Zellen transformiert (Clontech, Heidelberg). In der anschließenden Blau/Weiss- Selektion (α-Komplementierung defekter ß-Galactosidase, Sambrook et al. 1989) wurden insgesamt 1680 Bakterienkolonien mit integrierten cDNA- Fragmenten identifiziert und nach vierstündigem Schütteln bei 37 °C in LB-Medium mit Ampicillin und 10 % Dimethylsulfoxid (DMSO) bei -20 °C gelagert.
Identifizierung differentiell exprimierter Gene
Kolonie-PCR
Die einzelnen Klone der subtrahierten cDNA-Bank wurden zunächst auf die Größe der inserierten cDNA-Fragmente hin überprüft. Dazu wurde eine Kolonie-PCR mit Primern (nested 1 und nested 2R) durchgeführt, die komplementär zu der Sequenz der Adapter sind, die an die Rsal- geschnittenen cDNA-Fragmente ligiert wurden, und somit den inserierten Bereich direkt flankieren. Jeweils 5 μL der Bakterienkulturen wurden in 15 μL A. bidest. 5 min bei 98 °C denaturiert und 10 μL der denaturierten Kultur zu 20 μL PCR-Mix pipettiert. Die Amplifikation erfolgte dann in 1x PCR-Puffer (Silverstar, Eurogentec, Heidelberg) mit 1,5 mM MgCI2, je 0,2 mM dNTP, je 0,4 μM Primer (s.u.) und 0,5 u Taq-Polymerase (Silverstar, Eurogentec, Heidelberg) als Endkonzentration im PCR-Ansatz (30 μL).
Der Temperaturzyklus der Amplifikation verlief in einem Thermocycler (Perkin Eimer 9700):
3 min 94 °C Denaturierung
15 s 94 °C Denaturierung
35x 30 s 68 °C Primeranlagerung (annealing)
60 s 72 °C Primerverlängerung (DNA- Synthese)
5 min 72 °C Komplettierung der DNA- Doppelstränge
00 4 °C Abbruch der Reaktion
♦ nested 1 -Primer: 5'-TCGAGCGGCCGCCCGGGCAGG-3'
♦ nested 2R- Primer: 5'-AGCGTGGTCGCGGCCGAGGT-3'
Der komplette PCR-Ansatz wurde anschließend mit 7,5 μL 5x DNA- Auftragspuffer versetzt, wovon 10 μL im 1 ,5 %igen Agarosegel mit Ethidiumbromid (0,16 μg mL"1) in 1x TBE-Puffer gelelektrophoretisch aufgetrennt wurden. Als Größenstandard diente ein 1 kb+-Marker (Invitrogen, Groningen, Niederlande). Bei Vorhandensein eines inserts ≥ 100 bp Größe wurde die Kultur mit einem sterilen Zahnstocher zur Erhaltung auf LB-Agarplatten mit Ampicillin übertragen und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die cDNA-Fragmente wurden z.T. nachträglich entweder in pCR®ll-TOPO- Vektor umkloniert und in TOP10 one shot-Ze\\en nach Herstellerangaben transformiert (TOPO TA Cloning Kit Dual Promoter, Invitrogen, Groningen, Niederlande), oder in pGEM-T-Vektor (Promega, Mannheim) kloniert und in DH5α-Zellen (Clontech, Heidelberg) transformiert. Dazu wurde eine Kolonie-PCR-Reaktion (mit nested 1/2R-Primem, s.o.) durchgeführt, die PCR-Produkte im Agarosegel aufgetrennt (s.o.), aus dem Gel eluiert (Quiaquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden), laut Herstellerangaben in den entsprechenden Vektor ligiert und in E co//-Zellen transformiert.
Erzeugung eines füll lenpth-Klons
Ausgehend von dem ursprünglich in der SSH identifizierten cDNA- Fragment wurden die Enden des Gens in 5'- und 3'-Richtung mittels RACE (rapid ampllfication of cDNA ends) entsprechend der Herstellerangaben des Marathon cDNA Ampllfication Kit (Clontech, Heidelberg) erzeugt. Die Methode beruht darauf, dass eine cDNA-Bank durch reverse Transkription aus RNA erstellt wird. An die Enden der möglichst vollständigen cDNAs werden Adapter ligiert, zu denen komplementäre Primer existieren. Ausgehend von dem bekannten cDNA-Fragment wird für jede Richtung (3'- und 5'-Ende) ein Primer abgeleitet, der bei einer Amplifikation in die entsprechende Richtung verlängert wird. In hot start PCR-Ansätzen mit jeweils einem nach außen gerichteten genspe∑ifischen und einem Adapter-Primer (AP) sollen dann die Enden der cDNAs hergestellt werden. Es wurden 5 μL der verdünnten adapterligierten cDNA-Bank mit je 0,2 mM dNTP, 0,2 μM AP1, je 0,2 μM genspezifische sense- oder artf/sense-Primer und 1x Advantage cDNA Polymerase PCR Mix in 1x cDNA PCR Reaction Buffer (Clontech, Heidelberg) für die touch down PCR angesetzt:
30 s 94 °C Denaturierung
5x 5 s 94 °C Denaturierung
4 min 72 °C Primeranlagerung (annealing)/- Verlängerung
5x 5 s 94 °C Denaturierung
4 min 70 °C Primeranlagerung (annealing)/- Verlängerung
20x 5 s 94 °C Denaturierung
4 min 68 °C Primeranlagerung (annealing)!- Verlängerung
5 min 68 °C Komplettierung der DNA- Doppelstränge
00 4 °C Abbruch der Reaktion
♦ RΛCE-Primer (Klon 4-Q2/Bci-4): genspezif. Primer nested 1 : 5'-GCCATCCTTGTTCCGGTCGAAAA-3' ngspl genspezif. Primer 2: 5'-GTGGATCTTTAGCTGGAACTGGGGGC-3' gsp2
Adapter-Primer 1 : 5'-CCATCCTAATACGACTCACTATAGGGC-3'
AP1
Die PCR-Produkte wurden nach gelelektrophorefischer Trennung aus dem 1x TBE-Agarosegel mit Ethidiumbromid extrahiert, gemäß Herstellerangaben in den pGEM-T-Vektor ligiert (Promega, Mannheim), in DH5α-Zellen (Clontech, Heidelberg) transformiert, und vom Plasmid sequenziert. Aus den Sequenzinformationen wurde ein mögliches offenes Leseraster für die Aminosäuresequenz (open reading frame, ORF) abgeleitet. Mit Hilfe genspezifischer Primer, die den kompletten ORF umspannten und an ihren 5'-Enden Schnittstellen für Restriktionsenzyme (δ'-BamHI, 3'- Hindlll) enthielten, wurde eine unabhängige RT-PCR (SuperScript™ One- Step™ RT-PCR System, GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) mit 500 ng RNA von BTH-induzierten Pflanzen (250 mg L"1 gesprüht, 24 hpt) als template, je 0,2 μM sense- und antisense- Primer (s.u.) und 0,5 μl RT/Taq Mix in 1x Reaction Mix (GibcoBRL™ Life Technologies™, Karlsruhe) durchgeführt:
30 min 55 °C cDNA-Synthese durch reverse Transkription
2 min 94 °C Denaturierung des RNA/cDNA Hybrids
15 s 94 °C Denaturierung
25x 30 s 65 °C Primeranlagerung (annealing)
60 s 72 °C Primerverlängerung (DNA-Synthese)
7 min 72 °C Komplettierung der DNA- Doppelstränge
00 4 °C Abbruch der Reaktion
♦ RT-PCR-Primer (Klon 4-62/ßc/-4): - ORF1 (mit SJartc don)
5-Ende mit BamHI: 5'-TAGGATCCATGCCCGGTCATCGACAATC-3' 3'-Ende mit Hindlll: 5'-AAGCTTCTCTCACTCTAAACTAGCACCAAG-3, -ORF2
(ohne Startcodon) 5'-Ende mit BamHI: δ'-TAGGATCCCCCGGTCATCGACAATC-S' 3'-Ende mit Hindlll: S'-AAGCTTCTCTCACTCTAAACTAGCACCAAG-S' Die Produkte wurden nach Gelextraktion und A-tailing kloniert, transformiert und die Sequenz überprüft.
Herstellung von Antikörpern
Zur Gewinnung von Antikörpern wird das rekombinante Protein eines auf Transkriptebene chemisch induzierbaren Gens (Bci-4) in einem heterologen bakteriellen Expressionssystem synthetisiert. Die rekombinante Proteinexpression wurde mit Hilfe des QIAexpress System Type IV nach Herstellerangaben (The QIAexpressionist™, 3d edition, Qiagen, Hilden) durchgeführt. Der verwendete Vektor pQE 30 besitzt am 5'-Ende vor der multiple cloning site (MCS) eine Sequenz, die für sechs aufeinanderfolgende N-terminale Histidin-Reste kodiert (6xHis-tag), mit deren Hilfe das synthetisierte Protein anschließend aufgereinigt werden kann.
Übertragung des chemisch induzierbaren Gens (Bci-4) in monocotyledone Pflanzen
Die (stabile) Übertragung einer Gens in Getreide ist Stand der Technik und u.a. bei Repellin et al. (Plant Cell, Tissue and Organ Culture 64, 159- 183, 2001) beschrieben.
Transiente Überexpression von Bci-4 in Gerstenblättern
In einem von Schweizer et al. (1999) auf der Grundlage erster transienter Expressionssysteme in Gerste (Nelson & Bushnell 1997, Shirasu et al. 1999) entwickelten transienten Transformationssystems zur Überprüfung einer Genfunktion im Pathosystem Gerste - Echter Gerstenmehltau wurde der Einfluss von BCI-4 auf die Interaktion mit Bgh untersucht. Primärblattsegmente suszeptibler Gerstenpflanzen cv. Pallas, Golden Promise und Ingrid wurden mit dem ORF von Bci-4 und einem Reportergen (UidA für ß-Glucuronidase [GUS] oder GFP, für das grün fluoreszierende Protein [GFP]) cotransformiert (Schweizer et al. 1999). Insgesamt erfolgte in je drei Versuchen eine Cotransformation durch Partikelbeschuss von Bci-4 mit UidA bzw. GFP. Für Bci-4 wurden Konstrukte mit ORF1 (open reading frame mit Startcodon) und ORF2 (open reading frame ohne erstes Startcodon) in pGY1 hergestellt, so dass einmal das funktionale Protein (ORF1), und einmal ein verkürztes Protein (ORF2, kein Signalpeptid, EF-hand Motiv direkt N-terminal) entstehen konnte. Vier Stunden nach Beschuss der Blattsegmente wurden diese mit BghAG dicht inokuliert und für 48 h bei Raumtemperatur inkubiert. Die Interaktionen der transformierten Epidermiszellen wurden bei Coexpression von GFP anschließend in vivo unter Fluoreszenzanregung mikroskopisch ausgewertet. Mit ß-Glucuronidase cotransformierte Blätter wurden mit einer Substratlösung (x-gluc) inkubiert, anschließend entfärbt und danach im Durchlicht mikroskopiert. In Figur 1 ist die mikroskopische Auswertung des Einflusses der Überexpression von Bci-4 auf die Interaktion von Gerste mit dem Echten Mehltaupilz dargestellt. Es wurden erfolgreiche und abgestoppte Penetrationsereignisse an transformierten Epidermiszellen nach Beschuss mit Bci-4 (plus Reporter) im Vergleich zu Beschuss des Reporterkonstruktes alleine (Kontrolle) ausgezählt. In den Photos auf der rechten Seite (Figur 1b, 1c) ist jeweils ein erfolgreiches Penetrationsereignis abgebildet, in dem es dem Pilz gelingt, ein Haustorium in einer transformierten Epidermiszelle zu etablieren und daraufhin sekundäres Mycel (elongating secondary hyphae, ESH) auszubilden. Die grünblaue Färbung der transformierten Zellen erfolgte aufgrund der Umsetzung des Substrates x-gluc durch die coexprimierte ß- Glucuronidase. Das Haustorium ist ebenfalls deutlich grünblau gefärbt, da es von einer extrahaustorialen Matrix umgeben ist, die aus der Plasmamembran der Wirtszelle gebildet und vom Cytoplasmasaum der Epidermiszelle, in dem der Farbstoff akkumuliert, umgeben wird. In der auf der linken Seite abgebildeten Interaktion (Figur 1Aa) wurde das Eindringen des Pilzes durch die Bildung einer effektiven Papille verhindert, der Penetrationsversuch wurde abgestoppt und der Pilz war nicht in der Lage, sich weiter auf der Blattoberfläche auszubreiten. Aus Figur 1B geht hervor, dass die Überexpression von Bci-4 die Penetrationsfrequenz von Bgh reduziert. In den Versuchen mit den Gerstensorten cv. Pallas und Golden Promise (Figur 1[1] und 1[2]) reduzierte die Akkumulation des funktionalen Proteins BCI-4 (ORF1) bei Coexpression von ß- Glucuronidase (GUS) die Anzahl der erfolgreich etablierten Haustorien durch verstärkte Abwehrreaktionen der attackierten Zellen (Papillenbildung) um ca. 50 % im Vergleich zur Kontrolle (Expression von ß-Glucuronidase). In drei Experimenten mit cv. Ingrid (Figur 1[3]-[5]) wurde die Penetrationsrate durch Bci-4 (ORF1) jeweils um ca. 20 % im Vergleich zur Kontrolle (Expression von ß-GIucuronidase, GUS [3] oder grün fluoreszierendem Protein, GFP [4] und [5]) reduziert. In einem Versuch blieb der Anteil abgewehrter Pilzattacken unverändert (Figur 1[6]). Die Überexpression des um das Signalpeptid verkürzten BCI-4-Proteins (ORF2) wurde in einem Experiment mit untersucht (Figur 1[5]), hatte jedoch keinen Einfluss auf die Interaktion von Gerste cv. Ingrid mit Bgh.
In der Beschreibung zitierte Literatur:
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Beschreibung zu den Figuren:
Figur 1 : Einfluss von Bci-4 auf die Interaktion von Gerste mit Bgh.
In Primärblattsegmenten von Gersten pflanzen cv. Pallas (1), Golden Promise (2) und Ingrid (3-6) wurde BCI-4 (ORF1) und ein am N-Terminus verkürztes BCI-4-Protein (ORF2*) jeweils mit einem Reporterprotein (ß- Glucuronidase: GUS oder das grün fluoreszierende Protein: GFP), bzw. ein Reporterkonstrukt alleine als Kontrolle exprimiert. Die transiente Transformation von Epidermiszellen wurde in sechs unabhängigen Experimenten (1-6) mittels Partikelbeschuss intakter Blätter durchgeführt. Die Auswertung der Interaktionsstellen von Pilz und transformierten Zellen erfolgte 48 hpi nach Inokulation mit BghNδ (Schweizer et al. 1999). Die Anzahl der Interaktionsstellen mit effektiver Papillenbildung (abgewehrter Penetrationsversuch) und mit Ausbildung eines Haustoriums bzw. Sekundärmycel (ESH) wurde im Vergleich zu Kontrolltransformationen (Expression von Reportergen alleine) ausgewertet (30-70 Interaktionstellen pro Säule). Die Penetrationsrate gibt das Verhältnis von etablierten Haustorien zu untersuchten Interaktionsstellen in % an.

Claims

Ansprüche:
1. Isolierte Nukleotidsequenz, kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand- Protein, deren Überexpression in Pflanzen eine erhöhte Krankheitsresistenz bewirkt, ausgewählt aus e) einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID No. 1 , f) einer Nukleotidsequenz, die eine wenigstens 75 %ige Identität mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Nukleotidsequenz, g) einer mit a) und b) hybridisierenden Nukleotidsequenz, h) einer zu a), b) oder c) komplementären Nukleotidsequenz.
2. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß sie aus Hordeum stammt.
3. Isolierte Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 2 oder 3, deren um den Faktor von etwa 10- bis 100-fach gesteigerte Expression in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber Pathogenen bewirkt.
4. Ca2+-bindendes EF-hand-Protein kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine erhöhte
Konzentration in Pflanzen eine gesteigerte Resistenz gegenüber
Pathogenen bewirkt.
5. Ca2+-bindendes EF-hand-Protein gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es bei verstärkter Expression in Pflanzen die Resistenz gegenüber Pathogenen um etwa 20 bis 90 %, bevorzugt um etwa 50 bis 80 %, besonders bevorzugt um 70% steigert.
6. Ca2+-bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß es in Pflanzen eine erhöhte Resistenz gegenüber biotrophen Pilzen bewirkt.
7. Ca2+-bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es eine erhöhte Resistenz -gegenüber Mehltaupilzen, bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici bewirkt.
8. Genstruktur enthaltend wenigstens den kodierenden Bereich der isolierten Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 sowie damit operativ verknüpfte regulatorische Nukleotidsequenzen.
9. Vektor enthaltend wenigstens eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 8 sowie zusätzliche
Nukleotidsequenzen zur Selektion und/oder zur Replikation in der Wirtszelle und/oder zur Integration in das Wirtszell-Genom.
10. Transgene Pflanze und deren Nachkommen mit erhöhter Krankheitsresistenz im Vergleich zu einer nicht genetisch veränderten
Pflanze, enthaltend in replizierbarer Form und erhöhter Kopienzahl eine Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 und/oder eine Genstruktur gemäß Anspruch 8 und/oder einen Vektor gemäß Anspruch 9.
11. Transgene Pflanze gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand- Protein extrachromosomal vorliegt und/oder stabil in das pflanzliche Genom integriert ist.
12. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz in 2-100, bevorzugt 5-50 und besonders bevorzugt 2-15 Kopien vorliegt.
13. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, enthaltend im Vergleich zu einer nicht-genetisch veränderten Pflanze ein Ca2+- bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der Ansprüche 4 bis 7 kodiert durch eine Nukleoitdsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 in erhöhter Konzentration.
14. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß ihre Resistenz gegenüber Pathogenen im Vergleich zu einer genetisch nicht veränderten Pflanze um etwa 20 bis 100 %, bevorzugt etwa 50 bis 80% und besonders bevorzugt um etwa 50 bis 60% erhöht ist.
15. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Penetrationsfrequenz von Pathogenen um ca. 20 bis 100%, bevorzugt um ca. 50 bis 80% und besonders bevorzugt um ca. 50 bis 60% reduziert ist.
16. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß sie verstärkt gegenüber biotrophen Pilzen resistent ist.
17. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß sie verstärkt gegenüber Mehltaupilzen, bevorzugt Blumeria graminis f. sp. hordei oder f. sp. tritici resistent ist.
18. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Nutzpflanze ist.
19. Transgene Pflanze gemäß einem der Ansprüche 10 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß sie eine monokotyledone Pflanze, bevorzugt der
Gattung Hordeum oder Triticum ist.
20. Verfahren zur Steigerung der Pathogenresistenz in Pflanzen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 kodierend für ein Ca2+-bindendes EF-hand-Protein gemäß einem der
Ansprüche 4 bis 7 und/oder ein Genkonstrukt gemäß Anspruch 8 und/oder ein Vektor gemäß Anspruch 9 in replizierbarer Form in ganze Pflanzen, Pflanzenteile und/oder Pflanzenzellen übertragen, im Vergleich zu einer nicht-transformierten Pflanze in erhöhter Kopienzahl repliziert und das kodierte Ca2+-bindende EF-hand-Protein in erhöhter
Konzentration zur Expression gebracht wird.
21. Verfahren gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, daß die N Nuukklleeoottiiddsseeqquueennzz kkooddiieerreenndd ffüürr eeiinn CCaa22++--bbiinnddeendes EF-hand-Protein in eine monokotyledone Pflanze übertragen wird.
22. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 20 oder 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die Nukleotidsequenz kodierend für ein Ca2+- bindendes EF-hand-Protein in eine Pflanze der Gattung Hordeum oder Triticum übertragen wird.
23. Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen.
24. Verwendung der isolierten Nukleotidsequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3 als Markergen für induzierte Resistenz in monokotyledonen Nutzpflanzen.
25. Verwendung des Ca2+-bindenden EF-hand-Proteins kodiert durch eine Nukleotidsequenz gemäß Anspruch 1 oder eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 2 zur Steigerung der Krankheitsresistenz in Pflanzen.
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