JP3387495B2 - 新規のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子 - Google Patents
新規のＢａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ株及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子Info
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、各々が、胞子形成中に結晶（それぞれ“Bt
I 109P 結晶”及び“Bt I 260結晶”）に封入される
結晶化タンパク質（それぞれ“Bt I 109P結晶タンパク
質”及び“Bt I 260結晶タンパク質”）を生じる、Baci
llus thuringiensisの新規の２株（“Bt I 109P株”及
び“Bt I 260株”）に関する。Bt I 109P及びBt I 260
株は、1990年４月４日に、それぞれ寄託番号5870及び58
71として、ブダペスト条約の規定に従って、Deutsche
Sammlung Ｆｒ Mikroorganismenand Zellkultrure
n（“DSM"）,Mascheroder Weg 1B,D−3300 Braunsch
weig,Federal Republic of Germanyに寄託された。
I 109P 結晶”及び“Bt I 260結晶”）に封入される
結晶化タンパク質（それぞれ“Bt I 109P結晶タンパク
質”及び“Bt I 260結晶タンパク質”）を生じる、Baci
llus thuringiensisの新規の２株（“Bt I 109P株”及
び“Bt I 260株”）に関する。Bt I 109P及びBt I 260
株は、1990年４月４日に、それぞれ寄託番号5870及び58
71として、ブダペスト条約の規定に従って、Deutsche
Sammlung Ｆｒ Mikroorganismenand Zellkultrure
n（“DSM"）,Mascheroder Weg 1B,D−3300 Braunsch
weig,Federal Republic of Germanyに寄託された。
本発明はさらに、鞘翅類（Coleoptera）に対して活性
であって、Bt I 109P又はBt I 260株をそれ自体で、あ
るいは好ましくは活性成分としてBt I 109P又はBt I 26
0結晶、結晶タンパク質、又はその活性成分を含有する
殺虫剤組成物に関する。
であって、Bt I 109P又はBt I 260株をそれ自体で、あ
るいは好ましくは活性成分としてBt I 109P又はBt I 26
0結晶、結晶タンパク質、又はその活性成分を含有する
殺虫剤組成物に関する。
本発明はさらに：
１）Bt I 109P結晶中に見いだされる殺虫性タンパク質
（“Bt I 109Pプロトキシン”）をコードするBt I 109P
株のゲノムからの“bt I 109P遺伝子";及び ２）Bt I 260結晶中に見いだされる殺虫性タンパク質
（“Br I 260プロトキシン”）をコードする、Bt I 260
株のゲノムからの“bt I 260遺伝子”に関する。
（“Bt I 109Pプロトキシン”）をコードするBt I 109P
株のゲノムからの“bt I 109P遺伝子";及び ２）Bt I 260結晶中に見いだされる殺虫性タンパク質
（“Br I 260プロトキシン”）をコードする、Bt I 260
株のゲノムからの“bt I 260遺伝子”に関する。
Bt I 109P及びBt I 260プロトキシンは、それぞれそ
れらのBt I 109P及びBt I 260結晶に封入される前にそ
れぞれそれらのBt I 109P及びBt I 260株により産生さ
れるタンパク質である。
れらのBt I 109P及びBt I 260結晶に封入される前にそ
れぞれそれらのBt I 109P及びBt I 260株により産生さ
れるタンパク質である。
本発明はさらに、それぞれBt I 109Pプロトキシン及
びBt I 260プロトキシンから（例えば、トリプシン消化
により）得られる“Bt I 109P毒素”及び“Bt I 260毒
素”に関する。Bt I 109P及びBt I 260毒素は、それぞ
れBt I 109P株及びBt I 260株により産生される、それ
ぞれBt I 109P結晶及びBt I 260結晶から遊離される殺
虫剤的活性タンパク質である。各毒素は、鞘翅類に対す
る高度の活性を有する。Bt I 109P及びBt I 260毒素
は、鞘翅類に対して殺虫剤的に有効なそれぞれBt I 109
P及びBt I 260プロトキシンの最小部分を表わすと考え
られる。
びBt I 260プロトキシンから（例えば、トリプシン消化
により）得られる“Bt I 109P毒素”及び“Bt I 260毒
素”に関する。Bt I 109P及びBt I 260毒素は、それぞ
れBt I 109P株及びBt I 260株により産生される、それ
ぞれBt I 109P結晶及びBt I 260結晶から遊離される殺
虫剤的活性タンパク質である。各毒素は、鞘翅類に対す
る高度の活性を有する。Bt I 109P及びBt I 260毒素
は、鞘翅類に対して殺虫剤的に有効なそれぞれBt I 109
P及びBt I 260プロトキシンの最小部分を表わすと考え
られる。
本発明はさらに、植物細胞を形質転換するのに用い得
るし、そして以下の： １）それぞれBt I 109P又はBt I 260プロトキシンの殺
虫剤的有効部分をコードするbt I 109P又はbt I 260遺
伝子（“殺虫剤的有効bt I 109P及びbt I 260遺伝子部
分”）の一部、好ましくはそれぞれBt I 109P又はbt I
260毒素をまさにコードするbt I 109P又はbt I 260遺伝
子（“切頭（truncated）bt I 109P又はbt I 260遺伝
子”）の切頭部分； ２）植物細胞における殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子部分の転写に適したプロモーター；及び ３）植物細胞における殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子を発現するのに適した3'末端転写体形成
及びポリアデニル化シグナル を含有するキメラ遺伝子に関する。このキメラ遺伝子
は、本明細書中では以後、一般的に“bt I 109P又はbt
I 260キメラ遺伝子”と呼ぶ。好ましくは、殺虫剤的に
有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分は、切頭bt I
109P又はbt I 260遺伝子と選択可能なマーカー遺伝子と
の融合を包含するハイブリッド遺伝子としてのbt I 109
P又はbt I 260キメラ遺伝子、例えばBt I 109P−NPT II
又はBt I 260−NPT II融合タンパク質をコードするneo
遺伝子（“bt I 109P−neo又はbt I 260−neoハイブリ
ッド遺伝子”）中に存在する。
るし、そして以下の： １）それぞれBt I 109P又はBt I 260プロトキシンの殺
虫剤的有効部分をコードするbt I 109P又はbt I 260遺
伝子（“殺虫剤的有効bt I 109P及びbt I 260遺伝子部
分”）の一部、好ましくはそれぞれBt I 109P又はbt I
260毒素をまさにコードするbt I 109P又はbt I 260遺伝
子（“切頭（truncated）bt I 109P又はbt I 260遺伝
子”）の切頭部分； ２）植物細胞における殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子部分の転写に適したプロモーター；及び ３）植物細胞における殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子を発現するのに適した3'末端転写体形成
及びポリアデニル化シグナル を含有するキメラ遺伝子に関する。このキメラ遺伝子
は、本明細書中では以後、一般的に“bt I 109P又はbt
I 260キメラ遺伝子”と呼ぶ。好ましくは、殺虫剤的に
有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分は、切頭bt I
109P又はbt I 260遺伝子と選択可能なマーカー遺伝子と
の融合を包含するハイブリッド遺伝子としてのbt I 109
P又はbt I 260キメラ遺伝子、例えばBt I 109P−NPT II
又はBt I 260−NPT II融合タンパク質をコードするneo
遺伝子（“bt I 109P−neo又はbt I 260−neoハイブリ
ッド遺伝子”）中に存在する。
本発明はさらに：
１）その核ゲノムが、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子部分で形質転換される植物、例えばジャ
ガイモ又はトウモロコシの細胞（“形質転換植物細
胞”）；及び ２）その核ゲノムが、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子部分を含有し、鞘翅類に耐性である、形
質転換植物細胞から再生されるか又はそのように再生さ
れた植物から産生される植物（“形質転換植物”）に関
する。
t I 260遺伝子部分で形質転換される植物、例えばジャ
ガイモ又はトウモロコシの細胞（“形質転換植物細
胞”）；及び ２）その核ゲノムが、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はb
t I 260遺伝子部分を含有し、鞘翅類に耐性である、形
質転換植物細胞から再生されるか又はそのように再生さ
れた植物から産生される植物（“形質転換植物”）に関
する。
本発明はさらに、好ましくはエレクトロポレーション
によりbt I 109P又はbt I 260遺伝子の全部又は一部を
保有するベクターで形質転換されるB.thuringiensis
（“Bt"）株に関する。
によりbt I 109P又はbt I 260遺伝子の全部又は一部を
保有するベクターで形質転換されるB.thuringiensis
（“Bt"）株に関する。
発明の背景
B.thuringiensis（“Bt"）は、胞子形成時に内因性結
晶を産生するグラム陽性細菌である。結晶は、昆虫の幼
虫に対して特異的に毒性であるタンパク質から成る。３
つの異なるBt病原型（Bt pathotype）：即ち、鱗翅
類、例えばチョウやガの幼虫に対して活性な病原型A;あ
る種の双翅類、例えばカ及びブユに対して活性な病原型
B;及び鞘翅類、例えばカブトムシに対して活性な病原型
Ｃが記載されている（Ellar et al.,1986）。
晶を産生するグラム陽性細菌である。結晶は、昆虫の幼
虫に対して特異的に毒性であるタンパク質から成る。３
つの異なるBt病原型（Bt pathotype）：即ち、鱗翅
類、例えばチョウやガの幼虫に対して活性な病原型A;あ
る種の双翅類、例えばカ及びブユに対して活性な病原型
B;及び鞘翅類、例えばカブトムシに対して活性な病原型
Ｃが記載されている（Ellar et al.,1986）。
その結晶が鞘翅類に対して毒性であるBt株は、Bt te
nebrionisとして（米国特許第4,766,203号；欧州特許出
願公開（“EP"）第149,162号）、Bt Ｍ−７又はBt Sa
n Diegoとして（EP213,818;米国特許第4,771,131
号）、並びにBtS1として（欧州特許出願（“EPA"）第88
402115.5号）として記載されている。鞘翅類に対して毒
性である他の２株、BtPGS I 208及びBtPGS I 245も記載
されている（PCT出願公開WO90/09445）。
nebrionisとして（米国特許第4,766,203号；欧州特許出
願公開（“EP"）第149,162号）、Bt Ｍ−７又はBt Sa
n Diegoとして（EP213,818;米国特許第4,771,131
号）、並びにBtS1として（欧州特許出願（“EPA"）第88
402115.5号）として記載されている。鞘翅類に対して毒
性である他の２株、BtPGS I 208及びBtPGS I 245も記載
されている（PCT出願公開WO90/09445）。
慣用的水中発酵法を用いて大規模にBt胞子を生産し得
るという事実は、Bt細菌を、殺虫剤組成物供給源として
商業的に魅力のあるものにする。
るという事実は、Bt細菌を、殺虫剤組成物供給源として
商業的に魅力のあるものにする。
殺虫性タンパク質をコードするいくつかのBt株から得
られる遺伝子断片は、植物を昆虫耐性にするために、こ
れまで植物ゲノム中に同定され、組み込まれていた。し
かしながら、植物におけるこのようなBt遺伝子断片の発
現を得る方法は、簡単ではない。植物細胞中での殺虫性
タンパク質の最適発現を達成するためには、その標的昆
虫に対して実質的な毒性を保持するBtプロトキシンの水
溶性部分をコードするように特異的方法で各Bt遺伝子断
片を遺伝子操作する必要があることが判明した（EPA863
00291.1及びEPA88402115.5;1986年１月22日出願の米国
特許出願第821,582号）。
られる遺伝子断片は、植物を昆虫耐性にするために、こ
れまで植物ゲノム中に同定され、組み込まれていた。し
かしながら、植物におけるこのようなBt遺伝子断片の発
現を得る方法は、簡単ではない。植物細胞中での殺虫性
タンパク質の最適発現を達成するためには、その標的昆
虫に対して実質的な毒性を保持するBtプロトキシンの水
溶性部分をコードするように特異的方法で各Bt遺伝子断
片を遺伝子操作する必要があることが判明した（EPA863
00291.1及びEPA88402115.5;1986年１月22日出願の米国
特許出願第821,582号）。
発明の要約
本発明に従って、病原型Ｃの２つの新規のBt株、即ち
Bt I 109P及びBt I 260株が提供される。胞子形成中に
それぞれの株によって産生されるBt I 109P及びBt I 26
0結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、及び毒素、並
びにBt I 109P及びBt I 260プロトキシンの殺虫剤的有
効部分は、各々殺虫活性を有し、したがって、一般に鞘
翅類に対する、特にAgelastica alni、Diabrotica lu
teola、Haltica tombacina、Anthonomus grandis、Te
nebrio molitor、Diabrotica undecimpunctata、Trib
oleum castaneum、Dicladispa armigera、Trichispa
serica、Oulema oryzae、Colaspis brunnea、Lisso
rhorptrus oryzophilus、Phyllotreta cruciferae、P
hyllotreta striolata、Psylliodes punctulata、Ent
omoscelis americana、Meligethes aeneus、Ceutoryn
chus sp.、Psylliodes chrysocephala、及びPhyllotr
eta undulataに対する、そして特に、経済的に重要な
作物の主な害虫であるコロラドポテトカブトムシLeptin
otarsa decemlineataに対する殺虫剤組成物中に処方し
得る。
Bt I 109P及びBt I 260株が提供される。胞子形成中に
それぞれの株によって産生されるBt I 109P及びBt I 26
0結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、及び毒素、並
びにBt I 109P及びBt I 260プロトキシンの殺虫剤的有
効部分は、各々殺虫活性を有し、したがって、一般に鞘
翅類に対する、特にAgelastica alni、Diabrotica lu
teola、Haltica tombacina、Anthonomus grandis、Te
nebrio molitor、Diabrotica undecimpunctata、Trib
oleum castaneum、Dicladispa armigera、Trichispa
serica、Oulema oryzae、Colaspis brunnea、Lisso
rhorptrus oryzophilus、Phyllotreta cruciferae、P
hyllotreta striolata、Psylliodes punctulata、Ent
omoscelis americana、Meligethes aeneus、Ceutoryn
chus sp.、Psylliodes chrysocephala、及びPhyllotr
eta undulataに対する、そして特に、経済的に重要な
作物の主な害虫であるコロラドポテトカブトムシLeptin
otarsa decemlineataに対する殺虫剤組成物中に処方し
得る。
さらに本発明に従って、植物細胞ゲノムを、殺虫剤的
に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分、好ましく
は切頭bt I 109P又はbt I 260遺伝子で形質転換する。
この形質転換は、bt I 109P又はbt I 260キメラ遺伝子
を用いて実施するのが好ましい。その結果形質転換され
た植物細胞を用いて、植物組織のいくつか又は全部の植
物細胞が:1）それらのゲノム中の安定挿入物として殺虫
剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分を含有
し、並びに２）そのそれぞれのBt I 109P又はBt I 260
プロトキシン、好ましくはそのそれぞれのBt I 109P又
はBt I 260毒素の殺虫剤的有効部分を産生することによ
り殺虫剤的有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分を
発現し、それにより植物を鞘翅類に対して耐性にする形
質転換植物を生産し得る。本発明の形質転換植物細胞は
さらに、再生のために、このような殺虫性Btタンパク質
を産生するのに用い得る。
に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分、好ましく
は切頭bt I 109P又はbt I 260遺伝子で形質転換する。
この形質転換は、bt I 109P又はbt I 260キメラ遺伝子
を用いて実施するのが好ましい。その結果形質転換され
た植物細胞を用いて、植物組織のいくつか又は全部の植
物細胞が:1）それらのゲノム中の安定挿入物として殺虫
剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分を含有
し、並びに２）そのそれぞれのBt I 109P又はBt I 260
プロトキシン、好ましくはそのそれぞれのBt I 109P又
はBt I 260毒素の殺虫剤的有効部分を産生することによ
り殺虫剤的有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分を
発現し、それにより植物を鞘翅類に対して耐性にする形
質転換植物を生産し得る。本発明の形質転換植物細胞は
さらに、再生のために、このような殺虫性Btタンパク質
を産生するのに用い得る。
さらに本発明に従って、殺虫剤的に有効なbt I 109P
又はbt I 260遺伝子部分、好ましくは切頭bt I 109P又
はbt I 260遺伝子で植物細胞ゲノムを形質転換すること
により、鞘翅類に対して植物を耐性にさせる方法が提供
される。これに関しては、植物細胞がbt I 109P又はbt
I 260キメラ遺伝子で形質転換されるのが好ましい。
又はbt I 260遺伝子部分、好ましくは切頭bt I 109P又
はbt I 260遺伝子で植物細胞ゲノムを形質転換すること
により、鞘翅類に対して植物を耐性にさせる方法が提供
される。これに関しては、植物細胞がbt I 109P又はbt
I 260キメラ遺伝子で形質転換されるのが好ましい。
さらに本発明に従って、Bt I 109P及びBt I 260プロ
トキシン、このようなプロトキシンの殺虫剤的有効部
分、そしてBt I 109P及びBt I 260毒素、並びにbt I 10
9P及びbt I 260遺伝子、殺虫剤的に有効なbt I 109P及
びbt I 260遺伝子部分、切頭bt I 109P及びbt I 260遺
伝子、そしてキメラbt I 109P及びbt I 260遺伝子が提
供される。
トキシン、このようなプロトキシンの殺虫剤的有効部
分、そしてBt I 109P及びBt I 260毒素、並びにbt I 10
9P及びbt I 260遺伝子、殺虫剤的に有効なbt I 109P及
びbt I 260遺伝子部分、切頭bt I 109P及びbt I 260遺
伝子、そしてキメラbt I 109P及びbt I 260遺伝子が提
供される。
さらに本発明に従って、好ましくはエレクトロポレー
ションにより、Bt I 109P又はBt I 260プロトキシンの
全部又は殺虫剤的有効部分をコードするbt I 109P又はb
t I 260遺伝子の全部又は一部を保有するベクターでBt
株は形質転換される。
ションにより、Bt I 109P又はBt I 260プロトキシンの
全部又は殺虫剤的有効部分をコードするbt I 109P又はb
t I 260遺伝子の全部又は一部を保有するベクターでBt
株は形質転換される。
さらに本発明に従って、殺虫剤組成物、及び殺虫剤組
成物を用いて鞘翅類を防除する方法が提供されるが、こ
の場合、殺虫剤組成物はBt I 260又はBt I 109P株、結
晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素及び／又は殺
虫剤的有効プロトキシン部分を包含する。
成物を用いて鞘翅類を防除する方法が提供されるが、こ
の場合、殺虫剤組成物はBt I 260又はBt I 109P株、結
晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素及び／又は殺
虫剤的有効プロトキシン部分を包含する。
発明の詳細な説明
本発明に従って、慣用的方法により、それぞれ寄託番
号5870としてDSMに寄託されたBt I 109P株、及び寄託番
号5871としてDSMに寄託されたBt I 260株から、Bt I 10
9P及びBt I 260プロトキシンを単離し得る。例えば、Bt
I 109P及びBt I 260結晶は、それらのそれぞれの株の
胞子形成培養物から単離し（MahillonとDelcour,198
4）、次いで、Ｈfteら（1986）の方法によりそれぞれ
のプロトキシンをこれらの結晶から単離し得る。プロト
キシンを用いて、慣用的方法で、これらのプロトキシン
に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を調
製し得る（Ｈfte et al,1988）。次に、Bt I 109P
プロトキシンのプロテアーゼ消化により（例えばトリプ
シン消化により）Bt I 109P毒素を得る。Bt I 260毒素
は、Bt I 260プロトキシンのプロテアーゼ消化により
（例えばトリプシン消化により）得られる。
号5870としてDSMに寄託されたBt I 109P株、及び寄託番
号5871としてDSMに寄託されたBt I 260株から、Bt I 10
9P及びBt I 260プロトキシンを単離し得る。例えば、Bt
I 109P及びBt I 260結晶は、それらのそれぞれの株の
胞子形成培養物から単離し（MahillonとDelcour,198
4）、次いで、Ｈfteら（1986）の方法によりそれぞれ
のプロトキシンをこれらの結晶から単離し得る。プロト
キシンを用いて、慣用的方法で、これらのプロトキシン
に特異的なモノクローナル又はポリクローナル抗体を調
製し得る（Ｈfte et al,1988）。次に、Bt I 109P
プロトキシンのプロテアーゼ消化により（例えばトリプ
シン消化により）Bt I 109P毒素を得る。Bt I 260毒素
は、Bt I 260プロトキシンのプロテアーゼ消化により
（例えばトリプシン消化により）得られる。
bt I 109P及びbt I 260遺伝子も、慣用的方法で、そ
れらのそれぞれの株から単離し得る。例えば、bt I 109
P又はbt I 260遺伝子は、米国特許出願第821,582号、及
び欧州特許出願第86300291.1号及び欧州特許出願第8840
2115.5号（これらの記載内容は、参考として本明細書中
に含めるものとする）に記載された手法を用いて、その
それぞれのBt I 109P又はBt I 260株中で確認される。
好ましくは、bt I 109P及びbt I 260遺伝子は:1つ又は
それ以上の制限酵素を用いてそれらのそれぞれのBt I 1
09P及びBt I 260株から全DNAを消化し；そのようにして
産生されたDNA断片を５〜10KbのDNA画分にサイズ分画
し；このような画分をクローニングベクターに連結し；
大腸菌（E.coli）をクローニングベクターで形質転換し
て；クローンを好適なDNAプローブでスクリーニングす
ることによって確認する。DNAプローブは、１）鞘翅類
に対する別の結晶プロトキシンをコードするbt遺伝子、
例えば、欧州特許出願第88402115.5号に及びＨfteら
（1987）により記載されたbt13遺伝子の高度保存領域か
ら、又は２）その配列が固定化プロトキシンの気相シー
ケンシングにより確定されるそれぞれbt I 109P又はbt
I 260遺伝子によりコードされるプロトキシンのＮ−末
端アミノ酸配列に基づいて構築される（EPA88402115.
5）。
れらのそれぞれの株から単離し得る。例えば、bt I 109
P又はbt I 260遺伝子は、米国特許出願第821,582号、及
び欧州特許出願第86300291.1号及び欧州特許出願第8840
2115.5号（これらの記載内容は、参考として本明細書中
に含めるものとする）に記載された手法を用いて、その
それぞれのBt I 109P又はBt I 260株中で確認される。
好ましくは、bt I 109P及びbt I 260遺伝子は:1つ又は
それ以上の制限酵素を用いてそれらのそれぞれのBt I 1
09P及びBt I 260株から全DNAを消化し；そのようにして
産生されたDNA断片を５〜10KbのDNA画分にサイズ分画
し；このような画分をクローニングベクターに連結し；
大腸菌（E.coli）をクローニングベクターで形質転換し
て；クローンを好適なDNAプローブでスクリーニングす
ることによって確認する。DNAプローブは、１）鞘翅類
に対する別の結晶プロトキシンをコードするbt遺伝子、
例えば、欧州特許出願第88402115.5号に及びＨfteら
（1987）により記載されたbt13遺伝子の高度保存領域か
ら、又は２）その配列が固定化プロトキシンの気相シー
ケンシングにより確定されるそれぞれbt I 109P又はbt
I 260遺伝子によりコードされるプロトキシンのＮ−末
端アミノ酸配列に基づいて構築される（EPA88402115.
5）。
あるいは、Bt I 109P又はBt I 260株の全DNAから調製
された５〜10Kb断片を、好適な発現ベクター中に連結
し、大腸菌（E.coli）中で形質転換し得る。次に、毒素
に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を用い
て、Bt I 109P又はBt I 260毒素の発現のために、慣用
的コロニーイムノプローブ法（French et al,1986）
により、コロニーをスクリーニングし得る。
された５〜10Kb断片を、好適な発現ベクター中に連結
し、大腸菌（E.coli）中で形質転換し得る。次に、毒素
に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体を用い
て、Bt I 109P又はBt I 260毒素の発現のために、慣用
的コロニーイムノプローブ法（French et al,1986）
により、コロニーをスクリーニングし得る。
そのようにして確認されたbt I 109P及びbt I 260遺
伝子を、次に、慣用的方法（MaxamとGilbert,1980）で
各々シーケンシングして、DNA配列を得る。サザーンブ
ロットにおけるハイブリダイゼーションは、これらの遺
伝子が、鞘翅類に対する活性を有するプロトキシン及び
毒素をコードする前記の遺伝子（ＨfteとWhiteley,19
89）とは異なることを示す。
伝子を、次に、慣用的方法（MaxamとGilbert,1980）で
各々シーケンシングして、DNA配列を得る。サザーンブ
ロットにおけるハイブリダイゼーションは、これらの遺
伝子が、鞘翅類に対する活性を有するプロトキシン及び
毒素をコードする前記の遺伝子（ＨfteとWhiteley,19
89）とは異なることを示す。
そのプロトキシンの殺虫剤的有効部分をコードする各
々の遺伝子の殺虫剤的有効部分、及びまさしくその毒素
をコードする配列決定された遺伝子の各々の切頭部分
は、慣用的方法で、遺伝子がシーケンシングされた後に
各遺伝子が作られる。Bt I 109P及びBt I 260プロトキ
シン及び毒素のアミノ酸配列はさらに、それらのそれぞ
れのbt I 109P及びbt I 260遺伝子、並びに切頭bt I 10
9P及びbt I 260遺伝子から確定される。“殺虫剤有効部
分”、あるいはbt I 109P又はbt I 260遺伝子の“部
分”という用語は、それぞれのBt I 109P又はBt I 260
プロトキシンより少ないアミノ酸を有するがしかし依然
として鞘翅類に対して毒性であるポリペプチドをコード
するDNA配列を意味する。bt I 109P又はbt I 260遺伝子
のこのような部分は、プロトキシンの少なくとも１つの
トリプシン切断部位に向かって切頭されたBt I 109P又
はBt I 260プロトキシンをコードし得る（米国特許出願
第821,582号；欧州特許出願第86300291.1号）。
々の遺伝子の殺虫剤的有効部分、及びまさしくその毒素
をコードする配列決定された遺伝子の各々の切頭部分
は、慣用的方法で、遺伝子がシーケンシングされた後に
各遺伝子が作られる。Bt I 109P及びBt I 260プロトキ
シン及び毒素のアミノ酸配列はさらに、それらのそれぞ
れのbt I 109P及びbt I 260遺伝子、並びに切頭bt I 10
9P及びbt I 260遺伝子から確定される。“殺虫剤有効部
分”、あるいはbt I 109P又はbt I 260遺伝子の“部
分”という用語は、それぞれのBt I 109P又はBt I 260
プロトキシンより少ないアミノ酸を有するがしかし依然
として鞘翅類に対して毒性であるポリペプチドをコード
するDNA配列を意味する。bt I 109P又はbt I 260遺伝子
のこのような部分は、プロトキシンの少なくとも１つの
トリプシン切断部位に向かって切頭されたBt I 109P又
はBt I 260プロトキシンをコードし得る（米国特許出願
第821,582号；欧州特許出願第86300291.1号）。
大腸菌及び植物中でbt I 109P又はbt I 260の全部又
は殺虫剤的有効部分を発現するために、好適な制限部位
を導入し、各遺伝子又は遺伝子部分の側面（flanking）
に位置させる。これは、十分公知の手法を用いた特定部
位の突然変異誘発により実施し得る（Stanssens et a
l.,1987;Stanssens et al.,1989）。
は殺虫剤的有効部分を発現するために、好適な制限部位
を導入し、各遺伝子又は遺伝子部分の側面（flanking）
に位置させる。これは、十分公知の手法を用いた特定部
位の突然変異誘発により実施し得る（Stanssens et a
l.,1987;Stanssens et al.,1989）。
そのそれぞれのBt I 109P又はBt I 260プロトキシン
の殺虫剤的有効部分をコードする殺虫剤的に有効なbt I
109P又はbt I 260遺伝子部分は、慣用的方法で、単一
植物細胞の核ゲノム中に安定に挿入され、そのようにし
て形質転換された細胞を慣用的方法で用いて、昆虫耐性
である形質転換植物を作る。これに関しては、Agrobact
erium tumefaciens中の、殺虫剤的に有効なbt I 109P
又はbt I 260遺伝子部分を含有する無力化Ti−プラスミ
ドを用いて植物細胞を形質転換し、その後、例えば欧州
特許出願公開第116,718号、及び欧州特許出願公開第27
0,822号、PCT出願公開WO84/02,913、欧州特許出願第874
00544.0号、並びにGouldら（1990）（これらの記載内容
は、参考として本明細書中に含めるものとする）に記載
された上記の手法を用いて形質転換植物を形質転換植物
細胞から再生し得る。好ましいTi−プラスミドベクター
は、各々、Ti−プラスミドのＴ−DNAの末端配列（borde
r sequences）間に、あるいは少なくとも右端配列の左
に位置する殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺
伝子部分を含有する。もちろん、直接的遺伝子移動（例
えば欧州特許出願公開第233,247号に記載されているよ
うな）、花粉媒介形質転換（例えば、欧州特許出願公開
第270,356号、PCT出願公開WO85/01856、及び米国特許第
4,684,611号に記載されているような）、植物RNAウイル
ス媒介形質転換（例えば欧州特許出願公開第67,553号及
び米国特許第4,407,956号に記載されているような）、
リポソーム媒介形質転換（例えば米国特許第4,536,475
号に記載されているような）、並びにその他の方法、例
えばトウモロコシのある系統を形質転換するための最近
記載された方法（Fromm et al.,1990;Gordon−Kamm
et al.,1990）を用いて、他の種類のベクターを用いて
植物細胞を形質転換し得る。
の殺虫剤的有効部分をコードする殺虫剤的に有効なbt I
109P又はbt I 260遺伝子部分は、慣用的方法で、単一
植物細胞の核ゲノム中に安定に挿入され、そのようにし
て形質転換された細胞を慣用的方法で用いて、昆虫耐性
である形質転換植物を作る。これに関しては、Agrobact
erium tumefaciens中の、殺虫剤的に有効なbt I 109P
又はbt I 260遺伝子部分を含有する無力化Ti−プラスミ
ドを用いて植物細胞を形質転換し、その後、例えば欧州
特許出願公開第116,718号、及び欧州特許出願公開第27
0,822号、PCT出願公開WO84/02,913、欧州特許出願第874
00544.0号、並びにGouldら（1990）（これらの記載内容
は、参考として本明細書中に含めるものとする）に記載
された上記の手法を用いて形質転換植物を形質転換植物
細胞から再生し得る。好ましいTi−プラスミドベクター
は、各々、Ti−プラスミドのＴ−DNAの末端配列（borde
r sequences）間に、あるいは少なくとも右端配列の左
に位置する殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺
伝子部分を含有する。もちろん、直接的遺伝子移動（例
えば欧州特許出願公開第233,247号に記載されているよ
うな）、花粉媒介形質転換（例えば、欧州特許出願公開
第270,356号、PCT出願公開WO85/01856、及び米国特許第
4,684,611号に記載されているような）、植物RNAウイル
ス媒介形質転換（例えば欧州特許出願公開第67,553号及
び米国特許第4,407,956号に記載されているような）、
リポソーム媒介形質転換（例えば米国特許第4,536,475
号に記載されているような）、並びにその他の方法、例
えばトウモロコシのある系統を形質転換するための最近
記載された方法（Fromm et al.,1990;Gordon−Kamm
et al.,1990）を用いて、他の種類のベクターを用いて
植物細胞を形質転換し得る。
その結果生じた形質転換植物の慣用的植物品種改良計
画に用いて、同一の特徴を有するさらに形質転換された
植物を生産し得るし、あるいは同一又は関連の植物種の
他の変種に殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺
伝子部分を導入し得る。形質転換植物から得られる種子
は、安定したゲノム挿入物として殺虫剤的に有効なbt I
109P又はbt I 260遺伝子部分を含有する。形質転換植
物の細胞を慣用的方法で培養して、鞘翅類に対する慣用
的殺虫剤組成物中に用いるために回収し得る、それぞれ
のBt I 109P又はBt I 260プロトキシンの、好ましくは
それぞれのBt I 109P又はBt I 260毒素の殺虫剤的有効
部分を生成し得る（米国特許出願第821,582号；欧州特
許出願第86300291.1号）。
画に用いて、同一の特徴を有するさらに形質転換された
植物を生産し得るし、あるいは同一又は関連の植物種の
他の変種に殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺
伝子部分を導入し得る。形質転換植物から得られる種子
は、安定したゲノム挿入物として殺虫剤的に有効なbt I
109P又はbt I 260遺伝子部分を含有する。形質転換植
物の細胞を慣用的方法で培養して、鞘翅類に対する慣用
的殺虫剤組成物中に用いるために回収し得る、それぞれ
のBt I 109P又はBt I 260プロトキシンの、好ましくは
それぞれのBt I 109P又はBt I 260毒素の殺虫剤的有効
部分を生成し得る（米国特許出願第821,582号；欧州特
許出願第86300291.1号）。
殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部
分、好ましくは切頭bt I 109P又はbt I 260遺伝子は、
遺伝子の挿入部分が、植物細胞における遺伝子部分の発
現を指示し得るプロモーターの下流（即ち、３′）に、
そしてその制御下にあるように植物細胞ゲノムに挿入す
る。これは、植物細胞ゲノムにbt I 109P又はbt I 260
キメラ遺伝子を挿入することにより達成するのが好まし
い。好ましいプロモーターとしては：単離物CM 1841
（Gardner et al.,1981）、CabbB−Ｓ（Franck et
al.,1980）、及びCabbB−JI（HullとHowell,1987）のカ
リフラワーモザイクウイルスの強構成性（Strong cons
titutive）35Sプロモーター（“35Sプロモーター”）；
並びにＴ−DNAのそれぞれ１′及び２′遺伝子の発現を
駆動するTR1′プロモーター及びTR2′プロモーター（そ
れぞれ“TR1′プロモーター”及び“TR2′プロモータ
ー”）（Velten et al.,1984）が挙げられる。あるい
は、構成性でなく、むしろ植物の１つ又はそれ以上の組
織又は器官（例えば、葉及び／又は根）に特異的であっ
て、それにより挿入bt I 109P又はbt I 260遺伝子部分
が特定の組織又は器官の細胞中でのみ発現されるプロモ
ーターを用い得る。例えば、bt I 109P又はbt I 260遺
伝子部分は、植物（例えばジャガイモ、トウモロコシ、
アブラナ、及びイネ）それ自体の、あるいは米国特許出
願第821,582号及び欧州特許出願第86300291.1号に開示
されているようなマメのような別の植物のリブロース−
1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニッ
ト遺伝子のプロモーターのような光誘導性プロモーター
の制御下に遺伝子部分を置くことにより、上記の植物の
葉において選択的に発現される。あるいは、発現が誘導
される（例えば温度又は化学的因子により）プロモータ
ーを用いる。
分、好ましくは切頭bt I 109P又はbt I 260遺伝子は、
遺伝子の挿入部分が、植物細胞における遺伝子部分の発
現を指示し得るプロモーターの下流（即ち、３′）に、
そしてその制御下にあるように植物細胞ゲノムに挿入す
る。これは、植物細胞ゲノムにbt I 109P又はbt I 260
キメラ遺伝子を挿入することにより達成するのが好まし
い。好ましいプロモーターとしては：単離物CM 1841
（Gardner et al.,1981）、CabbB−Ｓ（Franck et
al.,1980）、及びCabbB−JI（HullとHowell,1987）のカ
リフラワーモザイクウイルスの強構成性（Strong cons
titutive）35Sプロモーター（“35Sプロモーター”）；
並びにＴ−DNAのそれぞれ１′及び２′遺伝子の発現を
駆動するTR1′プロモーター及びTR2′プロモーター（そ
れぞれ“TR1′プロモーター”及び“TR2′プロモータ
ー”）（Velten et al.,1984）が挙げられる。あるい
は、構成性でなく、むしろ植物の１つ又はそれ以上の組
織又は器官（例えば、葉及び／又は根）に特異的であっ
て、それにより挿入bt I 109P又はbt I 260遺伝子部分
が特定の組織又は器官の細胞中でのみ発現されるプロモ
ーターを用い得る。例えば、bt I 109P又はbt I 260遺
伝子部分は、植物（例えばジャガイモ、トウモロコシ、
アブラナ、及びイネ）それ自体の、あるいは米国特許出
願第821,582号及び欧州特許出願第86300291.1号に開示
されているようなマメのような別の植物のリブロース−
1,5−ビスホスフェートカルボキシラーゼ小サブユニッ
ト遺伝子のプロモーターのような光誘導性プロモーター
の制御下に遺伝子部分を置くことにより、上記の植物の
葉において選択的に発現される。あるいは、発現が誘導
される（例えば温度又は化学的因子により）プロモータ
ーを用いる。
殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分
は、遺伝子の挿入部分が好適な３′末端転写調節シグナ
ル（即ち、転写物形成及びポリアデニル化シグナル）の
上流にあるように、植物ゲノム中に挿入する。これは、
好ましくは、植物ゲノムにbt I 109P又はbt I 260キメ
ラ遺伝子を挿入することにより達成する。好ましいポリ
アデニル化及び転写物形成シグナルは、形質転換植物細
胞中で３′−未翻訳DNA配列として作用するオクトピン
シンターゼ遺伝子（Gielen et al.,1984）、及びＴ−
DNA遺伝子７（VeltenとSchell,1985）のシグナルを包含
する。
は、遺伝子の挿入部分が好適な３′末端転写調節シグナ
ル（即ち、転写物形成及びポリアデニル化シグナル）の
上流にあるように、植物ゲノム中に挿入する。これは、
好ましくは、植物ゲノムにbt I 109P又はbt I 260キメ
ラ遺伝子を挿入することにより達成する。好ましいポリ
アデニル化及び転写物形成シグナルは、形質転換植物細
胞中で３′−未翻訳DNA配列として作用するオクトピン
シンターゼ遺伝子（Gielen et al.,1984）、及びＴ−
DNA遺伝子７（VeltenとSchell,1985）のシグナルを包含
する。
選択可能なマーカー遺伝子として、同一プロモーター
と同じ転写単位で、及びその制御下で、殺虫剤的に有効
なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分を植物ゲノムに挿
入するのが好ましい。それにより、その結果生じるハイ
ブリッドbt I 109P又はbt I 260マーカー遺伝子は、融
合タンパク質として形質転換植物中で発現される（米国
特許出願第821,582号；欧州特許出願第86300291.1号;Va
eck et al.,1987）。この結果は、好ましくは、植物
細胞ゲノムにマーカー遺伝子を含有するbt I 109P又はb
t I 260キメラ遺伝子を挿入することにより達成し得
る。その発現が形質転換植物細胞を選択するために用い
られる任意の慣用的マーカー遺伝子を用い得る。好適な
選択可能なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性
遺伝子、例えばカナマイシン耐性をコードするneo遺伝
子が挙げられる（Reiss et al.,1984:欧州特許出願第
87400544.0号；米国特許出願第821,582号；欧州特許出
願第86300291.1号）。それにより、殺虫剤的に有効なbt
I 109P又はbt I 260遺伝子部分及びマーカー遺伝子
（例えば、bt I 109P−neo又はbt I 260−neoハイブリ
ッド遺伝子）は、融合タンパク質として形質転換植物中
で発現される（米国特許出願第821,582号；欧州特許出
願第86300291.1号;Vaeck et al.,1987）。
と同じ転写単位で、及びその制御下で、殺虫剤的に有効
なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部分を植物ゲノムに挿
入するのが好ましい。それにより、その結果生じるハイ
ブリッドbt I 109P又はbt I 260マーカー遺伝子は、融
合タンパク質として形質転換植物中で発現される（米国
特許出願第821,582号；欧州特許出願第86300291.1号;Va
eck et al.,1987）。この結果は、好ましくは、植物
細胞ゲノムにマーカー遺伝子を含有するbt I 109P又はb
t I 260キメラ遺伝子を挿入することにより達成し得
る。その発現が形質転換植物細胞を選択するために用い
られる任意の慣用的マーカー遺伝子を用い得る。好適な
選択可能なマーカー遺伝子の例としては、抗生物質耐性
遺伝子、例えばカナマイシン耐性をコードするneo遺伝
子が挙げられる（Reiss et al.,1984:欧州特許出願第
87400544.0号；米国特許出願第821,582号；欧州特許出
願第86300291.1号）。それにより、殺虫剤的に有効なbt
I 109P又はbt I 260遺伝子部分及びマーカー遺伝子
（例えば、bt I 109P−neo又はbt I 260−neoハイブリ
ッド遺伝子）は、融合タンパク質として形質転換植物中
で発現される（米国特許出願第821,582号；欧州特許出
願第86300291.1号;Vaeck et al.,1987）。
鞘翅類毒素をコードするbt I 109P又はbt I 260遺伝
子の全部又は殺虫剤的有効部分を用いて、鱗翅類又は鞘
翅類に対する殺虫活性を有するグラム陽性細菌、例えば
B.thuringiensisを形質転換することもできる。それに
より、鱗翅類及び鞘翅類害虫をともに駆除する又は別の
鞘翅類害虫を駆除するのに有効な形質転換Bt株を産生し
得る。好適なクローニングビヒクルに組み込まれたbt I
109P又はbt I 260遺伝子の全部又は一部による細菌の
形質転換は、慣用的方法で、好ましくは1989年12月に出
願されたPCT特許出願 PCT/EP89/01539に記載されてい
るようなエレクトロポレーション法を用いて、実施し得
る。
子の全部又は殺虫剤的有効部分を用いて、鱗翅類又は鞘
翅類に対する殺虫活性を有するグラム陽性細菌、例えば
B.thuringiensisを形質転換することもできる。それに
より、鱗翅類及び鞘翅類害虫をともに駆除する又は別の
鞘翅類害虫を駆除するのに有効な形質転換Bt株を産生し
得る。好適なクローニングビヒクルに組み込まれたbt I
109P又はbt I 260遺伝子の全部又は一部による細菌の
形質転換は、慣用的方法で、好ましくは1989年12月に出
願されたPCT特許出願 PCT/EP89/01539に記載されてい
るようなエレクトロポレーション法を用いて、実施し得
る。
Bt I 109P又はBt I 260株はさらに、１つ又はそれ以
上の外来Bt遺伝子、例えば:bt2遺伝子（米国特許出願第
821,582号；欧州特許出願第86300291.1号、）、又は鱗
翅類に対して活性なBtプロトキシンの全部又は殺虫剤的
有効部分をコードする別のBt遺伝子；及び／又はbt13遺
伝子（欧州特許出願第88402115.5号）、あるいは鞘翅類
に対して活性なBtプロトキシンの全部又は殺虫剤的有効
部分をコードする別のBt遺伝子、例えばbtPGS I 208遺
伝子又はbtPGS I 245遺伝子（欧州特許出願第89400428.
2号;PCT出願公開WO90/09445）の全部又は殺虫剤的有効
部分で形質転換される。それにより、より広範囲の害
虫、例えば鱗翅類（Lepidoptera）及び／又は別の鞘翅
類（Coleoptera）をも駆除するのに有用な形質転換Bt株
が産生される。慣用的クローニングベクター中に組み込
まれた外来Bt遺伝子の全部又は一部によるBt I 109P又
はBt I 260株の形質転換は、十分公知の方法で、好まし
くは慣用的エレクトロポレーションを用いて実施し得る
（Chassy et al.,1988）。
上の外来Bt遺伝子、例えば:bt2遺伝子（米国特許出願第
821,582号；欧州特許出願第86300291.1号、）、又は鱗
翅類に対して活性なBtプロトキシンの全部又は殺虫剤的
有効部分をコードする別のBt遺伝子；及び／又はbt13遺
伝子（欧州特許出願第88402115.5号）、あるいは鞘翅類
に対して活性なBtプロトキシンの全部又は殺虫剤的有効
部分をコードする別のBt遺伝子、例えばbtPGS I 208遺
伝子又はbtPGS I 245遺伝子（欧州特許出願第89400428.
2号;PCT出願公開WO90/09445）の全部又は殺虫剤的有効
部分で形質転換される。それにより、より広範囲の害
虫、例えば鱗翅類（Lepidoptera）及び／又は別の鞘翅
類（Coleoptera）をも駆除するのに有用な形質転換Bt株
が産生される。慣用的クローニングベクター中に組み込
まれた外来Bt遺伝子の全部又は一部によるBt I 109P又
はBt I 260株の形質転換は、十分公知の方法で、好まし
くは慣用的エレクトロポレーションを用いて実施し得る
（Chassy et al.,1988）。
Bt I 109P及びBt I 260株の各々を慣用的方法（Dulma
ge,1981）により発酵させて、高収率の細胞を提供し得
る。十分理解される適切な条件下（Dulmage,1981）で、
Bt I 109P及びBt I 260株は各々胞子形成して、それら
のそれぞれのBt I 109P及びBt I 260結晶タンパク質を
高収率で提供する。
ge,1981）により発酵させて、高収率の細胞を提供し得
る。十分理解される適切な条件下（Dulmage,1981）で、
Bt I 109P及びBt I 260株は各々胞子形成して、それら
のそれぞれのBt I 109P及びBt I 260結晶タンパク質を
高収率で提供する。
Bt I 109P及びBt I 260株、結晶プロトキシン、毒
素、及び／又は殺虫剤有効部分、好ましくはそれらのプ
ロトキシンは、各々、鞘翅類に属する害虫を制御するた
めに用いられる殺虫剤組成物中の活性成分として用い得
る。例えば、Bt I 109P及びBt I 260結晶をBt I 109P及
びBt I 260株の胞子形成済培養から単離し（Mahillonと
Delcour,1984）、次にそれぞれのプロトキシンを、Ｈ
fteら（1986）の方法に従ってこれらの結晶から単離し
得る。
素、及び／又は殺虫剤有効部分、好ましくはそれらのプ
ロトキシンは、各々、鞘翅類に属する害虫を制御するた
めに用いられる殺虫剤組成物中の活性成分として用い得
る。例えば、Bt I 109P及びBt I 260結晶をBt I 109P及
びBt I 260株の胞子形成済培養から単離し（Mahillonと
Delcour,1984）、次にそれぞれのプロトキシンを、Ｈ
fteら（1986）の方法に従ってこれらの結晶から単離し
得る。
本発明の殺虫剤、特に抗鞘翅類組成物は、活性成分と
してBt I 109P及びBt I 260株、又は好ましくはそのそ
れぞれの結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、
及び／又はそのプロトキシンの殺虫剤的有効部分を、好
適な担体、希釈剤、乳化剤、及び／又は分散剤とともに
用いて、慣用的方法で処方し得る。この殺虫剤組成物
は、水和剤、ペレット、顆粒、又はダストとして、ある
いは発泡体、ゲル、懸濁液、濃縮物等として水性又は非
水性溶媒を伴う液体処方物として処方し得る。このよう
な組成物中のBt I 109P及びBt I 260株、結晶、結晶タ
ンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有
効プロトキシン部分の濃度は、処方物の性質及びその意
図される使用方法に依る。一般に、本発明の殺虫剤組成
物は、本組成物の使用により鞘翅類に対して２〜４週間
ジャガイモ畑を防御するために用い得る。さらに長期間
（例えば全成育時季中）防御するためには、さらに組成
物を定期的に適用する必要がある。
してBt I 109P及びBt I 260株、又は好ましくはそのそ
れぞれの結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、
及び／又はそのプロトキシンの殺虫剤的有効部分を、好
適な担体、希釈剤、乳化剤、及び／又は分散剤とともに
用いて、慣用的方法で処方し得る。この殺虫剤組成物
は、水和剤、ペレット、顆粒、又はダストとして、ある
いは発泡体、ゲル、懸濁液、濃縮物等として水性又は非
水性溶媒を伴う液体処方物として処方し得る。このよう
な組成物中のBt I 109P及びBt I 260株、結晶、結晶タ
ンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有
効プロトキシン部分の濃度は、処方物の性質及びその意
図される使用方法に依る。一般に、本発明の殺虫剤組成
物は、本組成物の使用により鞘翅類に対して２〜４週間
ジャガイモ畑を防御するために用い得る。さらに長期間
（例えば全成育時季中）防御するためには、さらに組成
物を定期的に適用する必要がある。
本発明に従って昆虫、特に鞘翅類を防除する方法は、
好ましくは、保護すべき場所（領域）に殺虫可能量のBt
I 109P又はBt I 260結晶、結晶タンパク質、プロトキ
シン、毒素、又は殺虫剤的有効プロトキシン部分、好ま
しくはプロトキシンを適用することを包含する。保護す
べき場所は、例えば害虫又は成育に適した野菜の生息
地、あるいは野菜を栽培する領域を含む。
好ましくは、保護すべき場所（領域）に殺虫可能量のBt
I 109P又はBt I 260結晶、結晶タンパク質、プロトキ
シン、毒素、又は殺虫剤的有効プロトキシン部分、好ま
しくはプロトキシンを適用することを包含する。保護す
べき場所は、例えば害虫又は成育に適した野菜の生息
地、あるいは野菜を栽培する領域を含む。
Bt I 109P及びBt I 260プロトキシン又は毒素を生成
するために、Bt I 109P及びBt I 260株の細胞を、好適
な培地上で慣用的方法で増殖させ、次いで、慣用的方
法、例えば酸素分解又は洗剤等を用いて溶解する。次
に、クロマトグラフィー、抽出、電気泳動等のような標
準技法によりプロトキシンを分離し、精製する。次に、
プロトキシンのトリプシン消化により毒素を生成するこ
とができる。
するために、Bt I 109P及びBt I 260株の細胞を、好適
な培地上で慣用的方法で増殖させ、次いで、慣用的方
法、例えば酸素分解又は洗剤等を用いて溶解する。次
に、クロマトグラフィー、抽出、電気泳動等のような標
準技法によりプロトキシンを分離し、精製する。次に、
プロトキシンのトリプシン消化により毒素を生成するこ
とができる。
Bt I 109P又はBt I 260細胞を収穫し、次に保護すべ
き場所に無傷で、生きたもの又は死んだもの、好ましく
は死んだものを使用する。これに関しては、精製Bt I 1
09P又はBt I 260株（生きたもの又は死んだもの）、特
に90.0〜99.9％Bt I 109P又はBt I 260株である細胞塊
（cell mass）を用いるのが好ましい。
き場所に無傷で、生きたもの又は死んだもの、好ましく
は死んだものを使用する。これに関しては、精製Bt I 1
09P又はBt I 260株（生きたもの又は死んだもの）、特
に90.0〜99.9％Bt I 109P又はBt I 260株である細胞塊
（cell mass）を用いるのが好ましい。
Bt I 109P又はBt I 260細胞、結晶、結晶タンパク
質、プロトキシン、毒素、又は殺虫剤的有効プロトキシ
ン部分を、特定の使用に依って、任意の数の慣用的添加
剤（湿潤又は乾燥）を用いて、種々の方法で、殺虫剤組
成物中に処方し得る。添加剤としては、湿潤剤、洗剤、
安定剤、付着剤、散布剤、増量剤が挙げられる。このよ
うな組成物の例としては、ペースト、散粉用粉剤、水和
剤、顆粒、毒餌、及びエアゾール組成物が挙げられる。
他のBt細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒
素、及び殺虫剤的有効プロトキシン部分、並びにその他
の殺虫剤、並びに殺真菌剤、殺生物剤、除草剤、及び肥
料を、Bt I 109P又はBt I 260細胞、結晶、結晶タンパ
ク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プ
ロトキシン部分とともに用いて、別の利点又は利益を提
供する。このような殺虫剤組成物は慣用的方法で調製し
得るし、使用するBt I 109P又はBt I 260細胞、結晶、
結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫
剤的有効プロトキシン部分の量は、種々の因子、例えば
標的にする害虫、使用する組成物、組成物を適用する領
域の種類、及び主な気象条件に依る。一般に、Bt I 109
P又はBt I 260プロトキシン、殺虫剤的有効プロトキシ
ン部分及び／又は毒素の濃度は、処方物の少なくとも約
0.1重量％〜約100重量％、しばしば約0.15重量％〜約0.
8重量％である。
質、プロトキシン、毒素、又は殺虫剤的有効プロトキシ
ン部分を、特定の使用に依って、任意の数の慣用的添加
剤（湿潤又は乾燥）を用いて、種々の方法で、殺虫剤組
成物中に処方し得る。添加剤としては、湿潤剤、洗剤、
安定剤、付着剤、散布剤、増量剤が挙げられる。このよ
うな組成物の例としては、ペースト、散粉用粉剤、水和
剤、顆粒、毒餌、及びエアゾール組成物が挙げられる。
他のBt細胞、結晶、結晶タンパク質、プロトキシン、毒
素、及び殺虫剤的有効プロトキシン部分、並びにその他
の殺虫剤、並びに殺真菌剤、殺生物剤、除草剤、及び肥
料を、Bt I 109P又はBt I 260細胞、結晶、結晶タンパ
ク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫剤的有効プ
ロトキシン部分とともに用いて、別の利点又は利益を提
供する。このような殺虫剤組成物は慣用的方法で調製し
得るし、使用するBt I 109P又はBt I 260細胞、結晶、
結晶タンパク質、プロトキシン、毒素、及び／又は殺虫
剤的有効プロトキシン部分の量は、種々の因子、例えば
標的にする害虫、使用する組成物、組成物を適用する領
域の種類、及び主な気象条件に依る。一般に、Bt I 109
P又はBt I 260プロトキシン、殺虫剤的有効プロトキシ
ン部分及び／又は毒素の濃度は、処方物の少なくとも約
0.1重量％〜約100重量％、しばしば約0.15重量％〜約0.
8重量％である。
実際には、保護領域、即ちこのようなプロトキシン、
毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分を適用
した領域で、数種類の昆虫がBt I 109P又はBt I 260プ
ロトキシン、毒素、殺虫剤的有効プロトキシン部分、又
はその混合物を食する。あるいは、数種類の昆虫がBt I
109P又はBt I 260株、あるいはその形質転換体の無傷
の生細胞を食し、したがって、昆虫はいくつかの株のプ
ロトキシンを摂取して、死亡するか損傷を受ける。
毒素、及び／又は殺虫剤的有効プロトキシン部分を適用
した領域で、数種類の昆虫がBt I 109P又はBt I 260プ
ロトキシン、毒素、殺虫剤的有効プロトキシン部分、又
はその混合物を食する。あるいは、数種類の昆虫がBt I
109P又はBt I 260株、あるいはその形質転換体の無傷
の生細胞を食し、したがって、昆虫はいくつかの株のプ
ロトキシンを摂取して、死亡するか損傷を受ける。
以下の実施例で本発明をさらに説明する。実施例で言
及される図面及び配列表を以下に示す。
及される図面及び配列表を以下に示す。
図面
図１− 胞子形成Bt I 109P、Bt I 260、BtS1、及びBtP
GS I 208 Bacillus培養物のSDS−PAGEによる全タンパ
ク質パターン。“MW"は、分子量マーカーを示す。
GS I 208 Bacillus培養物のSDS−PAGEによる全タンパ
ク質パターン。“MW"は、分子量マーカーを示す。
図２− プローブとしてbt13遺伝子（“cry III A"遺伝
子）の内部断片を含有するBtS1株のゲノムの1.46KbPst
I−EcoR V断片と、BtS1、BtPGS I 208、Bt I 109P、及
びBt I 260株から調製されたEcoR I消化全DNAとの低厳
格条件下でのハイブリダイゼーションパターン。
子）の内部断片を含有するBtS1株のゲノムの1.46KbPst
I−EcoR V断片と、BtS1、BtPGS I 208、Bt I 109P、及
びBt I 260株から調製されたEcoR I消化全DNAとの低厳
格条件下でのハイブリダイゼーションパターン。
図３− プローブとしてbtPGS I 208遺伝子（“cry III
B"遺伝子）の内部断片を含有するBtPGS I 208株のゲノ
ムの1.38KbEcoR V−Nco I断片と、BtS1、BtPGS I 208、
Bt I 109P、及びBt I 260株から調製されたNla IV消化
全DNAとの低厳格条件下でのハイブリダイゼーションパ
ターン。プローブ断片を32P（Ａ）で、又はジオキシゲ
ニン（Ｂ）で標識した（Boehringer Non−Radioactive
Labeling Kit）。
B"遺伝子）の内部断片を含有するBtPGS I 208株のゲノ
ムの1.38KbEcoR V−Nco I断片と、BtS1、BtPGS I 208、
Bt I 109P、及びBt I 260株から調製されたNla IV消化
全DNAとの低厳格条件下でのハイブリダイゼーションパ
ターン。プローブ断片を32P（Ａ）で、又はジオキシゲ
ニン（Ｂ）で標識した（Boehringer Non−Radioactive
Labeling Kit）。
配列表
配列番号 １− bt I 109P遺伝子のDNA配列。コードさ
れたBt I 109Pプロトキシンの誘導アミノ酸配列は、本D
NA配列の下に存在する。Bt I 109P毒素をまさにコード
する切頭bt I 109P遺伝子は、ヌクレオチド位置397から
ヌクレオチド位置2179のTAA終止コドンまで伸びると思
われる。
れたBt I 109Pプロトキシンの誘導アミノ酸配列は、本D
NA配列の下に存在する。Bt I 109P毒素をまさにコード
する切頭bt I 109P遺伝子は、ヌクレオチド位置397から
ヌクレオチド位置2179のTAA終止コドンまで伸びると思
われる。
配列番号 ２− bt I 260遺伝子の部分DNA配列。コー
ドされたBt I 260プロトキシンの誘導部分アミノ酸配列
は、本DNA配列の下に存在する。
ドされたBt I 260プロトキシンの誘導部分アミノ酸配列
は、本DNA配列の下に存在する。
実施例中で別記しないかぎり、組換えDNAの製造及び
操作法はすべて、ManiatisらMolecular Cloning−Ａ
laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y（1982）に記載されている標準手法により実施する。
操作法はすべて、ManiatisらMolecular Cloning−Ａ
laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laborator
y（1982）に記載されている標準手法により実施する。
実施例1:Bt I 109P及びBt I 260株の特性
Bt I 109P株を、フィリピンで採取した穀物ダストか
ら単離し、寄託番号5870として、1990年４月４日にDSM
に寄託した。
ら単離し、寄託番号5870として、1990年４月４日にDSM
に寄託した。
Bt I 260株、フィリピンで採取したコウモリの糞から
単離し、寄託番号5871として、1990年４月４日にDSMに
寄託した。
単離し、寄託番号5871として、1990年４月４日にDSMに
寄託した。
各株を、慣用的標準培地、好ましくはLB培地（Bacto
−トリプトン 10g/、酵母菌抽出物 5g/、NaCl 1
0g/、及び寒天 15g/）上で、好ましくは28℃で培
養し得る。長期間保存するためには、等量の胞子−結晶
懸濁液と等量の50％グリセロールを混合し、これを−70
℃で保存するか、又は胞子懸濁液を凍結乾燥する。胞子
形成のためには、T3培地（トリプトン 3g/、トリプ
トース 2g/、酵母菌抽出物 1.5g/、5mgMnCl2、0.
05M Na2PO4,pH6.8、及び1.5％ 寒天）を用いて28℃で
24時間おき、その後４℃で保存するのが好ましい。その
増殖期中、Bt I 109P及びBt I 260株の各々は、任意の
嫌気条件下でも増殖するが、しかし胞子形成は好気条件
下でしか起きない。
−トリプトン 10g/、酵母菌抽出物 5g/、NaCl 1
0g/、及び寒天 15g/）上で、好ましくは28℃で培
養し得る。長期間保存するためには、等量の胞子−結晶
懸濁液と等量の50％グリセロールを混合し、これを−70
℃で保存するか、又は胞子懸濁液を凍結乾燥する。胞子
形成のためには、T3培地（トリプトン 3g/、トリプ
トース 2g/、酵母菌抽出物 1.5g/、5mgMnCl2、0.
05M Na2PO4,pH6.8、及び1.5％ 寒天）を用いて28℃で
24時間おき、その後４℃で保存するのが好ましい。その
増殖期中、Bt I 109P及びBt I 260株の各々は、任意の
嫌気条件下でも増殖するが、しかし胞子形成は好気条件
下でしか起きない。
各株の滅菌は、120℃（１気圧）で20分間、オートク
レーブ処理して実施する。このような処理は、全体的に
胞子、並びに結晶Bt I 109P及びBt I 260プロトキシン
を不活性化する。UV照射（254nm）は、胞子を不活性化
するが、プロトキシンは不活性化しない。
レーブ処理して実施する。このような処理は、全体的に
胞子、並びに結晶Bt I 109P及びBt I 260プロトキシン
を不活性化する。UV照射（254nm）は、胞子を不活性化
するが、プロトキシンは不活性化しない。
栄養物含有寒天（“NA",Difco Laboratories,Detroi
t,MI,USA）上で１日培養後、各々のBt I 109P及びBt I
260株のコロニーは、不規則縁（irregular edges）を
有する不透明白色コロニーを形成する。各株の細胞（1.
7〜2.4x5.6〜7.7,230mのグラム陽性ロッド）は、NA上で
28℃で３日間の培養後に胞子形成する。胞子形成中に生
成された結晶タンパク質は、Bt I 109P株中の扁平四辺
形結晶中に、Bt I 260株においては小菱形結晶中に封入
される。さらに、B.thuringiensis Ｈ 抗血清（Insti
tut Pasteur,FranceのH.de Barjacによる）を用いた
血清型分け（serotyping）により、両株を特性付ける。
Bt I 109Pは血清型 Ｈ 303bに属し、Bt kurstakiを
用いて25,000の凝集力価を示す。Bt I 260は、血清型H1
8に属し、Bt kumamotoensisを用いて凝集力価3,200で
ある。
t,MI,USA）上で１日培養後、各々のBt I 109P及びBt I
260株のコロニーは、不規則縁（irregular edges）を
有する不透明白色コロニーを形成する。各株の細胞（1.
7〜2.4x5.6〜7.7,230mのグラム陽性ロッド）は、NA上で
28℃で３日間の培養後に胞子形成する。胞子形成中に生
成された結晶タンパク質は、Bt I 109P株中の扁平四辺
形結晶中に、Bt I 260株においては小菱形結晶中に封入
される。さらに、B.thuringiensis Ｈ 抗血清（Insti
tut Pasteur,FranceのH.de Barjacによる）を用いた
血清型分け（serotyping）により、両株を特性付ける。
Bt I 109Pは血清型 Ｈ 303bに属し、Bt kurstakiを
用いて25,000の凝集力価を示す。Bt I 260は、血清型H1
8に属し、Bt kumamotoensisを用いて凝集力価3,200で
ある。
実施例2:Bt I 109P及びBt I 260結晶の特性
Bt I 109P及びBt I 260株を、T3培地上で28℃で48〜7
2時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をリン酸
塩緩衝塩水（Oxoid Ltd.,Basingstroke,Hampshire,U.
K.から入手した“PBS"）中に集めた。その結果生じた水
性胞子−結晶懸濁液を遠心分離し、ペレットをPBS中に
再懸濁して、再遠心分離し、ペレットをさらに再懸濁し
た。
2時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をリン酸
塩緩衝塩水（Oxoid Ltd.,Basingstroke,Hampshire,U.
K.から入手した“PBS"）中に集めた。その結果生じた水
性胞子−結晶懸濁液を遠心分離し、ペレットをPBS中に
再懸濁して、再遠心分離し、ペレットをさらに再懸濁し
た。
Bt I 109P及びBt I 260株の胞子形成培養の全タンパ
ク質パターンを、Lambertら（1987）により、Cry III A
又はCry III B結晶タンパク質を産生する他のBaillus株
と比較した。この比較のために、各株の洗浄済胞子−結
晶混合液のアリコートを遠心分離し、上清を捨てて、ペ
レットを試料緩衝混合液中に溶解させた。結晶タンパク
質を含有する抽出物を12.5％SDS−PAGEゲル（Laemmli,1
970）上で分析し、Coomassieブリリアントブルー Ｒ−
250で染色した。この分析結果から、Bt I 109P株の胞子
−結晶中においては、１つの主バンド（分子両65.5kD
a）と２つの小バンド（分子量72.4kDa及び49.1kDa）
が、また、Bt I 260株の胞子−結晶中においては、分子
量約65kDa及び約30kDaの２つの主バンドの存在が明らか
にされた。さらに、Bt I 109P及びBt I 260の全体的タ
ンパク質パターンは、BtS1の全体的タンパク質パターン
とは明らかに異なる。
ク質パターンを、Lambertら（1987）により、Cry III A
又はCry III B結晶タンパク質を産生する他のBaillus株
と比較した。この比較のために、各株の洗浄済胞子−結
晶混合液のアリコートを遠心分離し、上清を捨てて、ペ
レットを試料緩衝混合液中に溶解させた。結晶タンパク
質を含有する抽出物を12.5％SDS−PAGEゲル（Laemmli,1
970）上で分析し、Coomassieブリリアントブルー Ｒ−
250で染色した。この分析結果から、Bt I 109P株の胞子
−結晶中においては、１つの主バンド（分子両65.5kD
a）と２つの小バンド（分子量72.4kDa及び49.1kDa）
が、また、Bt I 260株の胞子−結晶中においては、分子
量約65kDa及び約30kDaの２つの主バンドの存在が明らか
にされた。さらに、Bt I 109P及びBt I 260の全体的タ
ンパク質パターンは、BtS1の全体的タンパク質パターン
とは明らかに異なる。
実施例3:Bt I 109P及びBt I 260結晶タンパク質の殺虫
活性 実施例２の場合と同様に、両株を、T3培地上で28℃で
48〜72時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をPB
S（リン酸塩緩衝塩水）中に集めた。その結果生じた胞
子−結晶懸濁液を遠心分離し、ペレットを再懸濁して、
再遠心分離し、上清除去後、ペレットをさらに再懸濁し
た。ペレットを50mM Na2CO3及び5mMジチオトレイトー
ルを含有する水性溶液中で一夜インキュベートした。遠
心分離後、上清を回収し、２株のそれぞれの結晶タンパ
ク質の抽出物のタンパク質含量を測定した。
活性 実施例２の場合と同様に、両株を、T3培地上で28℃で
48〜72時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をPB
S（リン酸塩緩衝塩水）中に集めた。その結果生じた胞
子−結晶懸濁液を遠心分離し、ペレットを再懸濁して、
再遠心分離し、上清除去後、ペレットをさらに再懸濁し
た。ペレットを50mM Na2CO3及び5mMジチオトレイトー
ルを含有する水性溶液中で一夜インキュベートした。遠
心分離後、上清を回収し、２株のそれぞれの結晶タンパ
ク質の抽出物のタンパク質含量を測定した。
ジャガイモの葉を標準胞子−結晶混合液か又は結晶タ
ンパク質溶液の水性希釈液中に浸し、次に２時間風乾し
た。初齢のコロラドジャガイモカブトムシ幼虫を処理葉
上に置き、３日後に幼虫の死亡率を測定した。これらの
結果を、BtS1（DSMから入手。寄託番号4288）の胞子−
結晶混合液か又は可溶化結晶タンパク質で処理した葉を
摂食した幼虫の死亡率と比較して、これを参照株として
用いた可溶化結晶タンパク質（μｇ）／溶液（ｍ）と
して、又は浸漬−懸濁液中の胞子−結晶数として表わさ
れるLC50（50％致死濃度）を、プロビット分析（Finne
y,1971）により算出した。95％信頼区間及びプロビット
ラインを含めた結果を、以下の表１及び２に要約する。
ンパク質溶液の水性希釈液中に浸し、次に２時間風乾し
た。初齢のコロラドジャガイモカブトムシ幼虫を処理葉
上に置き、３日後に幼虫の死亡率を測定した。これらの
結果を、BtS1（DSMから入手。寄託番号4288）の胞子−
結晶混合液か又は可溶化結晶タンパク質で処理した葉を
摂食した幼虫の死亡率と比較して、これを参照株として
用いた可溶化結晶タンパク質（μｇ）／溶液（ｍ）と
して、又は浸漬−懸濁液中の胞子−結晶数として表わさ
れるLC50（50％致死濃度）を、プロビット分析（Finne
y,1971）により算出した。95％信頼区間及びプロビット
ラインを含めた結果を、以下の表１及び２に要約する。
表1:Leptinotarsa decemlineataの幼虫に対する、Bt I
109P株、Bt I 260株、Bt San Diego株（NRRL寄託番
号Ｂ−15939）、及びBtS1株（参照株）から得た可溶化
結晶タンパク質の毒性の比較。
109P株、Bt I 260株、Bt San Diego株（NRRL寄託番
号Ｂ−15939）、及びBtS1株（参照株）から得た可溶化
結晶タンパク質の毒性の比較。
表2:Leptinotarsa decemlimeataの幼虫に対する、Bt I
109P株、Bt I 260株、及びBtS1株（参照株）から得た
胞子−結晶混合液の毒性の比較。
109P株、Bt I 260株、及びBtS1株（参照株）から得た
胞子−結晶混合液の毒性の比較。
実施例4:bt I 109P又はbt I 260遺伝子の同定
それぞれBt I 109P及びBt I 260株から得られたBt I
109P及びBt I 260プロトキシンを、Bt13鞘翅類毒素に対
するポリクローナル抗血清（Ｈfte et al.,1987）
を用いてELISA（EngvallとPesce,1978）により検出し
た。これらの株の全DNAを調製し、次いで制限酵素Nla I
V及びEcoR IでDNAを消化することにより、それらのそれ
ぞれの株におけるbt I 109P及びbt I 260遺伝子を同定
した。
109P及びBt I 260プロトキシンを、Bt13鞘翅類毒素に対
するポリクローナル抗血清（Ｈfte et al.,1987）
を用いてELISA（EngvallとPesce,1978）により検出し
た。これらの株の全DNAを調製し、次いで制限酵素Nla I
V及びEcoR IでDNAを消化することにより、それらのそれ
ぞれの株におけるbt I 109P及びbt I 260遺伝子を同定
した。
EcoR I消化DNAは、bt13遺伝子を含有するBtS1株（欧
州特許出願第88402115.5号）のゲノムから得られる32P
標識1.46KbPst I−EcoR V断片でプローブするサザーン
ブロッティングにより分析した。プローブとのハイブリ
ダイゼーション後、低厳格条件（２×SSC,0.1％SDS,68
℃で2x15分）下でブロットを洗浄し、現像した。オート
ラジオグラム（図２）は、bt I 109P遺伝子のみがbt13
遺伝子に関連することを示す。プローブとのハイブリダ
イゼーションパターンはさらに、bt I 109P遺伝子がbt1
3遺伝子とは明らかに異なることを、そしてBt I 260株
のゲノムが、用いた実験条件下でbt13（cry III A）のP
st I−EcoR Vプローブ断片に関連するDNA配列を含有し
ないことを示した（図２）。
州特許出願第88402115.5号）のゲノムから得られる32P
標識1.46KbPst I−EcoR V断片でプローブするサザーン
ブロッティングにより分析した。プローブとのハイブリ
ダイゼーション後、低厳格条件（２×SSC,0.1％SDS,68
℃で2x15分）下でブロットを洗浄し、現像した。オート
ラジオグラム（図２）は、bt I 109P遺伝子のみがbt13
遺伝子に関連することを示す。プローブとのハイブリダ
イゼーションパターンはさらに、bt I 109P遺伝子がbt1
3遺伝子とは明らかに異なることを、そしてBt I 260株
のゲノムが、用いた実験条件下でbt13（cry III A）のP
st I−EcoR Vプローブ断片に関連するDNA配列を含有し
ないことを示した（図２）。
Nla IV−消化DNAは、btPGS I 208又はcry III B遺伝
子を含有するBtPGS I 208株（PCT特許出願PCT/EP90/002
44号）のゲノムから得られる32P標識化又はジゴキシゲ
ニン（非放射性標識キット,Boehringer Mannheim,Mann
heim,Germany）1.38Kb EcoR V−Nco I断片でプローブ
するサザーンブロッティングにより分析した。プローブ
とのハイブリダイゼーション後、低厳格条件（２×SSC,
0.1％SDS,68℃で２×15分）下でブロットを洗浄し、現
像した。結果（図３）は、bt I 260遺伝子のみがbtPGS
I 208遺伝子に関連することを示す。プローブとのハイ
ブリダイゼーションパターンはさらに、bt I 260遺伝子
がbtPGS I 208遺伝子とは明らかに異なることを、そし
てbt I 109P遺伝子株が、用いた実験条件下でbtPGS I 2
08遺伝子にかすかに関連するのみであるDNA配列を含有
することを示した（図３）。
子を含有するBtPGS I 208株（PCT特許出願PCT/EP90/002
44号）のゲノムから得られる32P標識化又はジゴキシゲ
ニン（非放射性標識キット,Boehringer Mannheim,Mann
heim,Germany）1.38Kb EcoR V−Nco I断片でプローブ
するサザーンブロッティングにより分析した。プローブ
とのハイブリダイゼーション後、低厳格条件（２×SSC,
0.1％SDS,68℃で２×15分）下でブロットを洗浄し、現
像した。結果（図３）は、bt I 260遺伝子のみがbtPGS
I 208遺伝子に関連することを示す。プローブとのハイ
ブリダイゼーションパターンはさらに、bt I 260遺伝子
がbtPGS I 208遺伝子とは明らかに異なることを、そし
てbt I 109P遺伝子株が、用いた実験条件下でbtPGS I 2
08遺伝子にかすかに関連するのみであるDNA配列を含有
することを示した（図３）。
実施例5:bt I 109P遺伝子のクローニング及び発現
bt I 109P遺伝子を単離するために、Bt I 109P株から
得られる全DNAを調製した。次いで、全DNAをHind IIIで
消化した。消化DNAをショ糖勾配上でサイズ分画し、5kb
〜7kbの範囲の断片をHind III−消化及びBAP−処理クロ
ーニングベクターpUC19（Yanisch−Perron et al.,19
85）に連結した。次に、ベクターを含有する組換え大腸
菌クローン“pUC.cry III DHd1"を、プローブとしてbt1
3遺伝子の内部1.4kb EcoR V−Pst I DNA断片（欧州特
許出願公開第305,275号）を用いてスクリーニングし
て、bt I 109P遺伝子を含有するクローンを確認した。
得られる全DNAを調製した。次いで、全DNAをHind IIIで
消化した。消化DNAをショ糖勾配上でサイズ分画し、5kb
〜7kbの範囲の断片をHind III−消化及びBAP−処理クロ
ーニングベクターpUC19（Yanisch−Perron et al.,19
85）に連結した。次に、ベクターを含有する組換え大腸
菌クローン“pUC.cry III DHd1"を、プローブとしてbt1
3遺伝子の内部1.4kb EcoR V−Pst I DNA断片（欧州特
許出願公開第305,275号）を用いてスクリーニングし
て、bt I 109P遺伝子を含有するクローンを確認した。
そのようにして確認したDNA断片を、次に、MaxamとGi
lbert（1980）に従ってシーケンシングした（配列番号
１）。
lbert（1980）に従ってシーケンシングした（配列番号
１）。
そのDNA配列の分析に基づいて、適切な制限酵素で遺
伝子を切断して、Bt I 109P毒素をコードする切頭bt I
109P遺伝子を生成する。
伝子を切断して、Bt I 109P毒素をコードする切頭bt I
109P遺伝子を生成する。
実施例6:bt I 260遺伝子のクローニング及び発現
bt I 260遺伝子を単離するために、Bt I 260株から得
られる全DNAを調製し、Sau 3Aで部分的に消化した。消
化DNAをショ糖勾配上でサイズ分画し、5kb〜10kbの範囲
の断片をBgl II−消化及びBAP−処理クローニングベク
ターpECOR251（寄託番号4711でDSMに寄託）に連結す
る。次に、組換え大腸菌クローンを、プローブとしてbt
PGS I 208遺伝子の内部Nco I−EcoR V DNA断片（欧州特
許出願公開第382,990号）を用いてスクリーニングし
て、bt I 260遺伝子を含有するクローンを確認した。
られる全DNAを調製し、Sau 3Aで部分的に消化した。消
化DNAをショ糖勾配上でサイズ分画し、5kb〜10kbの範囲
の断片をBgl II−消化及びBAP−処理クローニングベク
ターpECOR251（寄託番号4711でDSMに寄託）に連結す
る。次に、組換え大腸菌クローンを、プローブとしてbt
PGS I 208遺伝子の内部Nco I−EcoR V DNA断片（欧州特
許出願公開第382,990号）を用いてスクリーニングし
て、bt I 260遺伝子を含有するクローンを確認した。
bt I 260遺伝子を含有するDNA断片を、次に、Maxamと
Gilbert（1980）に従ってシーケンシングした（配列番
号２）。
Gilbert（1980）に従ってシーケンシングした（配列番
号２）。
そのDNA配列の分析に基づいて、適切な制限酵素で遺
伝子を切断して、Bt I 260毒素をコードする切頭bt I 2
60遺伝子を生成する。
伝子を切断して、Bt I 260毒素をコードする切頭bt I 2
60遺伝子を生成する。
実施例7:bt I 109P−neoハイブリッド遺伝子及びbt I 2
60−neoハイブリッド遺伝子の構築 米国特許出願第821,582号、並びに欧州特許出願第884
02115.5号及び欧州特許出願第86300291.1号の手法に従
って、実施例５及び６から得られる切頭bt I 109P及びb
t I 260遺伝子を各々neo遺伝子に融合させて、対応する
ハイブリッド遺伝子を生成する。
60−neoハイブリッド遺伝子の構築 米国特許出願第821,582号、並びに欧州特許出願第884
02115.5号及び欧州特許出願第86300291.1号の手法に従
って、実施例５及び６から得られる切頭bt I 109P及びb
t I 260遺伝子を各々neo遺伝子に融合させて、対応する
ハイブリッド遺伝子を生成する。
実施例8:大腸菌（E.coli）へのbt I 109P及びbt I 260
遺伝子、切頭bt I 109P及びbt I 260遺伝子、並びにbt
I 109P−neo及びbt I 260−neoハイブリッド遺伝子の挿
入、並びにジャガイモ植物への切頭bt I 109P及びbt I
260遺伝子、並びにbt I 109P−neo及びbt I 260−neoハ
イブリッド遺伝子の挿入 大腸菌及び植物中で、実施例５、６、及び７から得ら
れたbt I 109P遺伝子及びbt I 260遺伝子、切頭bt I 10
9P遺伝子及び切頭bt I 260遺伝子、並びにbt I 109P−n
eoハイブリッド遺伝子及びbt I 260−neoハイブリッド
遺伝子を発現させるために、欧州特許出願第86300291.1
号及び欧州特許出願第88402115.5号に記載の手法によ
り、大腸菌中に異なる遺伝子カセットを作製する。
遺伝子、切頭bt I 109P及びbt I 260遺伝子、並びにbt
I 109P−neo及びbt I 260−neoハイブリッド遺伝子の挿
入、並びにジャガイモ植物への切頭bt I 109P及びbt I
260遺伝子、並びにbt I 109P−neo及びbt I 260−neoハ
イブリッド遺伝子の挿入 大腸菌及び植物中で、実施例５、６、及び７から得ら
れたbt I 109P遺伝子及びbt I 260遺伝子、切頭bt I 10
9P遺伝子及び切頭bt I 260遺伝子、並びにbt I 109P−n
eoハイブリッド遺伝子及びbt I 260−neoハイブリッド
遺伝子を発現させるために、欧州特許出願第86300291.1
号及び欧州特許出願第88402115.5号に記載の手法によ
り、大腸菌中に異なる遺伝子カセットを作製する。
植物中での主要発現を可能にするために、各々切頭
（truncated）及び／又はハイブリッド遺伝子の１つを
含有するカセットを、各々、中間植物発現ベクター（本
ベクターのＴ−DNA末端配列間）に挿入し、各々、植物
発現ベクター中の転写体形成及びポリアデニル化シグナ
ルに融合し、各々、35S3転写体（HullとHowell,1987）
を駆動するカリフラワーモザイクウイルス由来プロモー
ター、又はオクトピンTi−プラスミド（Velten et a
l.,1984）のTR−DNAから得られる2'プロモーターのよう
な構成プロモーターの制御化に置き、各々、オクトピン
シンターゼ遺伝子（Gielen et al.,1984）の3'末端の
ような、植物中で作用し得る3'末端転写体形成及びポリ
アデニル化シグナルに融合させる。
（truncated）及び／又はハイブリッド遺伝子の１つを
含有するカセットを、各々、中間植物発現ベクター（本
ベクターのＴ−DNA末端配列間）に挿入し、各々、植物
発現ベクター中の転写体形成及びポリアデニル化シグナ
ルに融合し、各々、35S3転写体（HullとHowell,1987）
を駆動するカリフラワーモザイクウイルス由来プロモー
ター、又はオクトピンTi−プラスミド（Velten et a
l.,1984）のTR−DNAから得られる2'プロモーターのよう
な構成プロモーターの制御化に置き、各々、オクトピン
シンターゼ遺伝子（Gielen et al.,1984）の3'末端の
ような、植物中で作用し得る3'末端転写体形成及びポリ
アデニル化シグナルに融合させる。
標準手法（Deblaere et al.,1985）を用いて、切頭
bt I 109P及びbt I 260遺伝子並びにbt I 109P−neo及
びbt I 260−neoハイブリッド遺伝子を含有する中間植
物発現ベクターを、無力化Ti−プラスミドpG V 2260（V
aeck et al.,1987）を保有するAgrobacterium株Ｃ 5
8C1 RifR（米国特許出願第821,582号；欧州特許出願第
86300291.1号）中にトランスファーさせる。スペクチノ
マイシン耐性に関する選択により、pG V 2260及びそれ
ぞれの中間植物発現ベクターから成る同時組み込みプラ
スミドを得る。次に、これらの組換えAgrobacterium株
の各々を用いて、切頭bt I 109P遺伝子、切頭bt I 260
遺伝子、bt I 109P−neoハイブリッド遺伝子、及びbt I
260−neoハイブリッド遺伝子が異なるジャガイモ植物
体細胞中に含有され、発現されるように、異なるジャガ
イモ植物体（Solanum tuberosum）を形質転換する。
bt I 109P及びbt I 260遺伝子並びにbt I 109P−neo及
びbt I 260−neoハイブリッド遺伝子を含有する中間植
物発現ベクターを、無力化Ti−プラスミドpG V 2260（V
aeck et al.,1987）を保有するAgrobacterium株Ｃ 5
8C1 RifR（米国特許出願第821,582号；欧州特許出願第
86300291.1号）中にトランスファーさせる。スペクチノ
マイシン耐性に関する選択により、pG V 2260及びそれ
ぞれの中間植物発現ベクターから成る同時組み込みプラ
スミドを得る。次に、これらの組換えAgrobacterium株
の各々を用いて、切頭bt I 109P遺伝子、切頭bt I 260
遺伝子、bt I 109P−neoハイブリッド遺伝子、及びbt I
260−neoハイブリッド遺伝子が異なるジャガイモ植物
体細胞中に含有され、発現されるように、異なるジャガ
イモ植物体（Solanum tuberosum）を形質転換する。
実施例9:ジャガイモ植物体における切頭bt I 109P及びb
t I 260遺伝子並びにbt I 109P−neo及びbt I 260−neo
ハイブリッド遺伝子の発現 実施例８の形質転換ジャガイモ植物体細胞から生じる
形質転換ジャガイモ植物体の葉における切頭bt I 109P
及びbt I 260遺伝子並びにbt I 109P−neo及びbt I 260
−neoハイブリッド遺伝子の発現生成物質の鞘翅類に対
する殺虫活性を、これらの葉の上で摂食したLeptinotar
sa decemlineata幼虫の成長率及び死亡率を記録して評
価する。これらの結果を、非形質転換ジャガイモ植物体
から得られる葉を摂食した幼虫の成長率と比較する。欧
州特許出願第88402115.5号、米国特許出願第821,582
号、及び欧州特許出願第86300291.1号に記載されている
のと同様にして、毒性検定を実施する。有意に高い死亡
率は、非形質転換植物の葉を摂食した幼虫よりも切頭bt
I 109P遺伝子、切頭bt I 260遺伝子、bt I 109P−neo
ハイブリッド遺伝子、又はbt I 260−neoハイブリッド
遺伝子を含有する形質転換ジャガイモ植物体の葉上で摂
食した幼虫の間で得られた。
t I 260遺伝子並びにbt I 109P−neo及びbt I 260−neo
ハイブリッド遺伝子の発現 実施例８の形質転換ジャガイモ植物体細胞から生じる
形質転換ジャガイモ植物体の葉における切頭bt I 109P
及びbt I 260遺伝子並びにbt I 109P−neo及びbt I 260
−neoハイブリッド遺伝子の発現生成物質の鞘翅類に対
する殺虫活性を、これらの葉の上で摂食したLeptinotar
sa decemlineata幼虫の成長率及び死亡率を記録して評
価する。これらの結果を、非形質転換ジャガイモ植物体
から得られる葉を摂食した幼虫の成長率と比較する。欧
州特許出願第88402115.5号、米国特許出願第821,582
号、及び欧州特許出願第86300291.1号に記載されている
のと同様にして、毒性検定を実施する。有意に高い死亡
率は、非形質転換植物の葉を摂食した幼虫よりも切頭bt
I 109P遺伝子、切頭bt I 260遺伝子、bt I 109P−neo
ハイブリッド遺伝子、又はbt I 260−neoハイブリッド
遺伝子を含有する形質転換ジャガイモ植物体の葉上で摂
食した幼虫の間で得られた。
言うまでもなく、本発明はBt I 109P（DSM 5870）株
及びBt I 260（DSM 5871）株に限定されない。むし
ろ、本発明はさらに、Bt I 109P又はBt I 260結晶、結
晶タンパク質、プロトキシン又は毒素と実質的に同一の
特性、特に殺虫特性を有する結晶、結晶タンパク質、プ
ロトキシン又は毒素を産生するBt I 109P又はBt I 260
株の任意の突然変異体又は変種を包含する。これに関し
ては、Bt I 109P及びBt I 260株の変種は、全タンパク
質パターンが図１に示すBt I 109P株又はBt I 260株の
タンパク質パターンと実質的に同一である変種を包含す
る。
及びBt I 260（DSM 5871）株に限定されない。むし
ろ、本発明はさらに、Bt I 109P又はBt I 260結晶、結
晶タンパク質、プロトキシン又は毒素と実質的に同一の
特性、特に殺虫特性を有する結晶、結晶タンパク質、プ
ロトキシン又は毒素を産生するBt I 109P又はBt I 260
株の任意の突然変異体又は変種を包含する。これに関し
ては、Bt I 109P及びBt I 260株の変種は、全タンパク
質パターンが図１に示すBt I 109P株又はBt I 260株の
タンパク質パターンと実質的に同一である変種を包含す
る。
本発明は、切頭bt I 109P又はbt I 260遺伝子で形質
転換されるジャガイモ植物体にも限定されない。本発明
は、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部
分で形質転換される任意の単子葉植物又は双子葉植物、
例えばトマト、タバコ、ナタネ、アルファルファ、ヒマ
ワリ、ワタ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ属、テン
サイ、及びその他の植物を包含する。
転換されるジャガイモ植物体にも限定されない。本発明
は、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部
分で形質転換される任意の単子葉植物又は双子葉植物、
例えばトマト、タバコ、ナタネ、アルファルファ、ヒマ
ワリ、ワタ、トウモロコシ、ダイズ、アブラナ属、テン
サイ、及びその他の植物を包含する。
本発明は、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260
遺伝子部分で植物細胞を形質転換するためのAgrobacter
ium tumefaciens Ti−プラスミドの使用に限定されな
い。植物細胞形質転換のためのその他の公知の技法、例
えばリポソームによる、エレクトロポレーションによ
る、あるいは植物ウイルス又は花粉を基礎にしたベクタ
ー系による方法が、このような遺伝子部分で単子葉植物
及び双子葉植物を形質転換するために用い得る。例え
ば、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部
分を用いて、Frommら（1990）、Gordon−Kammら（199
0）、Shimamotoら（1989）、及びDattaら（1990）が記
載しているような方法により選択されたある系統のトウ
モロコシ及びコメ植物を形質転換し得る。
遺伝子部分で植物細胞を形質転換するためのAgrobacter
ium tumefaciens Ti−プラスミドの使用に限定されな
い。植物細胞形質転換のためのその他の公知の技法、例
えばリポソームによる、エレクトロポレーションによ
る、あるいは植物ウイルス又は花粉を基礎にしたベクタ
ー系による方法が、このような遺伝子部分で単子葉植物
及び双子葉植物を形質転換するために用い得る。例え
ば、殺虫剤的に有効なbt I 109P又はbt I 260遺伝子部
分を用いて、Frommら（1990）、Gordon−Kammら（199
0）、Shimamotoら（1989）、及びDattaら（1990）が記
載しているような方法により選択されたある系統のトウ
モロコシ及びコメ植物を形質転換し得る。
さらに、Bt I 109P及びBt I 260株中に天然に存在
し、それぞれ天然Bt I 109P及びBt I 260プロトキシ
ン、毒素、及び殺虫剤的有効プロトキシン部分、をコー
ドするもの以外のDNA配列を、植物及び細菌を形質転換
するために用い得る。これに関しては、これらの遺伝子
の天然DNA配列を:1）いくつかのコドンを同一アミノ酸
又は他の、好ましくは等価のアミノ酸をコードする別の
コドンと置換し；及び／又は２）いくつかのコドンを欠
失又は付加することにより修飾し得るが、但し、このよ
うな修飾は、特に、コードされたBt I 109P又はBt I 26
0プロトキシン、Bt I 109P又はBt I 260プロトキシンの
殺虫剤的有効部分、あるいはBt I 109P又はBt I 260毒
素の特性、特に殺虫特性を実質的には変えない。
し、それぞれ天然Bt I 109P及びBt I 260プロトキシ
ン、毒素、及び殺虫剤的有効プロトキシン部分、をコー
ドするもの以外のDNA配列を、植物及び細菌を形質転換
するために用い得る。これに関しては、これらの遺伝子
の天然DNA配列を:1）いくつかのコドンを同一アミノ酸
又は他の、好ましくは等価のアミノ酸をコードする別の
コドンと置換し；及び／又は２）いくつかのコドンを欠
失又は付加することにより修飾し得るが、但し、このよ
うな修飾は、特に、コードされたBt I 109P又はBt I 26
0プロトキシン、Bt I 109P又はBt I 260プロトキシンの
殺虫剤的有効部分、あるいはBt I 109P又はBt I 260毒
素の特性、特に殺虫特性を実質的には変えない。
さらに、本発明は、他の外来DNA、特に大腸菌以外の
植物及び微生物を形質転換するのに適したベクターのDN
Aに関連して前記のDNA配列を含有するその他のDNA組換
え体を包含する。これに関しては、本発明は、前記のbt
I 109P及びbt I 260遺伝子又はその部分を含有する特
異的プラスミドに限定されず、むしろ本発明は、それら
の等価物であるDNA配列を含有する任意のDNA組換え体を
包含する。さらに、本発明は、bt I 109P遺伝子又はbt
I 260遺伝子の全部又は一部を含有し、その遺伝子の全
部又は一部が発現され、上記の微生物から回収され、あ
るいは植物細胞にトランスファーされ得る条件下で微生
物（例えば、Bacillus subtilis、Pseudomonas及びXan
thomonasのような植物関連細菌、又はStreptomyces ce
revisiaeのような酵母菌）を形質転換するのに適した全
DNA組換え体に関する。
植物及び微生物を形質転換するのに適したベクターのDN
Aに関連して前記のDNA配列を含有するその他のDNA組換
え体を包含する。これに関しては、本発明は、前記のbt
I 109P及びbt I 260遺伝子又はその部分を含有する特
異的プラスミドに限定されず、むしろ本発明は、それら
の等価物であるDNA配列を含有する任意のDNA組換え体を
包含する。さらに、本発明は、bt I 109P遺伝子又はbt
I 260遺伝子の全部又は一部を含有し、その遺伝子の全
部又は一部が発現され、上記の微生物から回収され、あ
るいは植物細胞にトランスファーされ得る条件下で微生
物（例えば、Bacillus subtilis、Pseudomonas及びXan
thomonasのような植物関連細菌、又はStreptomyces ce
revisiaeのような酵母菌）を形質転換するのに適した全
DNA組換え体に関する。
以下に、本明細書中で引用した参考文献を列挙する：
− Chassy et al.,Trends in Biotechnology ６,303−
309（1988） − Datta S.,Peterhans A.,Datta K.and Potrykus I.,
Bio/Technology ８,736−740（1990）． − Deblaere,R.,Bijtebier,B.De Greve,H.,Debock,F.,
Schell,J.,Van Montagu,M.and Leemans,J.,Nucleic Aci
ds Research 13,4777−4788（1985）． − Deblaere,R.,Reynaerts A.,Hfte H.,Hernalsteen
s J.−P.,Leemans J.and Van Montagu M.,Methods in E
nzymology 153,277−292（1988）． − Dulmage,H.T.,“Production of Bacteria for Biol
ogical Control of Insects"in Biological Control in
Crop Production,Ed.Paparizas,D.C.,Osmun Publisher
s,Totowa,N.J.,USA,pp.129−141（1981）． − Ellar,D.J.,Knowles,B.H.,Drobniewski,S.A.and Ha
ider,M.Z.,in“Fundamental and Applied aspects of I
nvertebrate Pathology".Ed.Samson,R.A.,Vlak,J.M.and
Peters,D.（1986）pp.7−10.Wageningen,Foundation o
f the fourth International Colloqium of Invertebra
te Pathology. − Engvall and Pesce,Scand.Immunol.Suppl.7（197
8） − Finney,Probit Analysis,3rd Edition,Cambridge U
niversity Press（1971） − Franck,Guilley,Jonard,Richards and Hirth,Cell
21,285−294（1980） − French,B.T.,Maul,HN.and Maul,G.G.,Anal.Bioche
m.156,417423（1986） − Fromm M.,Morrish F.,Armstrong C.,Williams R.,T
homas J.and Klein T.,Bio/Technology ８,833−839（1
990）． − Gardner,Howarth,Hahn,Brown−Luedi,Shepard and
Messing,Nucleic Acids Research ９,2871−2887（198
1） − Gielen,J.,De Beukeleer,M.,Seurinck,J.,Deboeck,
F.,De Greve,H.,Lemmers,M.,Van Montagu,M.and Schel
l,J.,EMBO J ３,835−845（1984）． − Gordon−Kamm W.,Spencer M.,Mangano M.,Adams
T.,Daines R.,Start W.,O'Brien J.,Chambers S.,Adams
W.,Willets N.,Rice T.,Mackey C.,Krueger R.,Kausch
A.and Lemaux P.,The Plant Cell ２,603−618（199
0）． − Gould et al.,Plant Physiology 95,426−434（199
1）． − Ｈfte,H.,De Greve,H.,Seurinck,J.,Jansens,S.,
Mahillon,J.,Ampe,Vandekerckhove,J,Vanderbruggen,
H.,Van Montagu,M.,Zabeau,M.and Vaeck,M.,Eur.J.Bioc
hem.161,273−280（1986） − Ｈfte,H.,Seurinck,J.,Van Houtven A.and Vaec
k,M.,Nucleic Acids Research 15,7183（1987） − Ｈfte,H.,Dissertation thesis at the State Un
iversity of Ghent,Belgium（1988）． − Ｈfte,H.,Van Rie,J.,Jansens,S.,Van Houtven,
A.,Verbruggen,H.and Vaeck,M.,Applied and Environme
ntal Microbiology 54,2010−2017（1988） − Ｈfte H.and Whiteley H.R.,Microbiological Re
view 53,_242−255（1989）． − Hull and Howell,Virology 86,482−493（1987） − Laemmli V.,Nature 227,680−685（1970） − Lambert,B.,Leyns,F.,Van Rooyen,L.,Gossel,F.,
Papon,Y.and Swings,J.Applied and Environmental Mic
robiology 53,1866−1871（1987） − Mahillon,J.and Delcour,J.,J.Microbiol.Methods
３,69−73（1984） − Maxam,A.M.and Gilbert,W.,Methods in Enzymol.6
5,499−560（1980）． − Odell,J.T.,Nagy,J.,and Chua,N.,Nature 313,810
−812（1985）． − Reiss,B.,Sprengel,R.,Will,H.and Schaller,H.,Ge
ne 30,217−223（1984）． − Shimamoto K.,Terada R.,Izawa T.and Fujimoto
H.,Nature 338,274−276（1989）． − Stanssens P.,McKeown Y.,Friedrich K.and Fritz
H.J.（1988），“Oligonucleotide−directed construc
tion of mutations by the gapped duplex DNA method
using the pMA/c plasmid vectors",published in the
collection of additional experimental procedures d
istributed at the EMBO laboratory course on“Direc
ted mutagenesis and protein engineering"in July 19
87 at the Max Planck Institute fr Biochemi,Marti
nsried,Federal Republic of Germany. − Stanssens P.,Opsomer C.,McKeown Y.,Kramer W.,Z
abeau M.and Fritz H.J.,Nucleic Acids Research 12,4
441−4454（1989）． − Vaeck,M.,Reynaerts,A.,Hfte,H.,Jansens,S.,De
Beuckeleer,M.,Dean,C.,Zabeau,M.,Van Montagu,M.and
Leemans,J.,Nature 327,33−37（1987）． − Velten,J.,Velten,L.,Hain,R.and Schell,J.,EMBO
J ３,2723−2730（1984）． − Velten,J.and Schell,J.Nucleic Acids Research 1
3,6981−6998（1985） − Yanisch−Perron,C.,Vierra,J.and Messing,J.,Gen
e 33,103−119（1985）． 配列表 1.一般的情報 ｉ）出願人:Plant Genetic System N.V. ii）発明の名称：新規のBacillus thuringiensis株
及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子 iii）配列の数:2 iv）住所： A.宛名:Plant Genetic System N.V. B.番地:Plateaustraat 22 C.郵便番号及び市名:9000 Ghent D.国名：ベルギー国 ｖ）コンピューター読み取り可能な方式： A.媒体型式:5.25インチ両面高密度1.2Mbフロッピー
ディスク B.コンピューター:IBM PC/AT C.操作系:DOS バージョン3.3 D.ソフトウェア:WordPerfect vi）現出願データ：入手不可能 vii）先願データ：欧州特許出願第90403724.9号，欧
州特許出願第90401144.2号 配列番号:1 配列の型：核酸及び対応するタンパク質 配列の長さ:2411塩基対 鎖の数:2本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の種類:Bacillus thuringiensis由来DNA 仮想的配列：いいえ アンチセンス：いいえ 起源： A.生物名:Bacillus thuringiensis var.kurstaki B.株名:Bt I 109P（DSM寄託番号5870） 国際供給源:pUC.cry III DHd I 配列の特徴：ヌクレオチド１〜232:bt I 109P遺伝子
（Ｓ）の5'（上流）配列；ヌクレオチド231〜2179:bt I
109P遺伝子（Ｓ）のコード配列；ヌクレオチド2180〜
末端:bt I 109P遺伝子（Ｓ）の3'（下流）配列 配列の性質:bt I 109P遺伝子は鞘翅類に対する72kD殺虫
性結晶タンパク質毒素をコードする。
309（1988） − Datta S.,Peterhans A.,Datta K.and Potrykus I.,
Bio/Technology ８,736−740（1990）． − Deblaere,R.,Bijtebier,B.De Greve,H.,Debock,F.,
Schell,J.,Van Montagu,M.and Leemans,J.,Nucleic Aci
ds Research 13,4777−4788（1985）． − Deblaere,R.,Reynaerts A.,Hfte H.,Hernalsteen
s J.−P.,Leemans J.and Van Montagu M.,Methods in E
nzymology 153,277−292（1988）． − Dulmage,H.T.,“Production of Bacteria for Biol
ogical Control of Insects"in Biological Control in
Crop Production,Ed.Paparizas,D.C.,Osmun Publisher
s,Totowa,N.J.,USA,pp.129−141（1981）． − Ellar,D.J.,Knowles,B.H.,Drobniewski,S.A.and Ha
ider,M.Z.,in“Fundamental and Applied aspects of I
nvertebrate Pathology".Ed.Samson,R.A.,Vlak,J.M.and
Peters,D.（1986）pp.7−10.Wageningen,Foundation o
f the fourth International Colloqium of Invertebra
te Pathology. − Engvall and Pesce,Scand.Immunol.Suppl.7（197
8） − Finney,Probit Analysis,3rd Edition,Cambridge U
niversity Press（1971） − Franck,Guilley,Jonard,Richards and Hirth,Cell
21,285−294（1980） − French,B.T.,Maul,HN.and Maul,G.G.,Anal.Bioche
m.156,417423（1986） − Fromm M.,Morrish F.,Armstrong C.,Williams R.,T
homas J.and Klein T.,Bio/Technology ８,833−839（1
990）． − Gardner,Howarth,Hahn,Brown−Luedi,Shepard and
Messing,Nucleic Acids Research ９,2871−2887（198
1） − Gielen,J.,De Beukeleer,M.,Seurinck,J.,Deboeck,
F.,De Greve,H.,Lemmers,M.,Van Montagu,M.and Schel
l,J.,EMBO J ３,835−845（1984）． − Gordon−Kamm W.,Spencer M.,Mangano M.,Adams
T.,Daines R.,Start W.,O'Brien J.,Chambers S.,Adams
W.,Willets N.,Rice T.,Mackey C.,Krueger R.,Kausch
A.and Lemaux P.,The Plant Cell ２,603−618（199
0）． − Gould et al.,Plant Physiology 95,426−434（199
1）． − Ｈfte,H.,De Greve,H.,Seurinck,J.,Jansens,S.,
Mahillon,J.,Ampe,Vandekerckhove,J,Vanderbruggen,
H.,Van Montagu,M.,Zabeau,M.and Vaeck,M.,Eur.J.Bioc
hem.161,273−280（1986） − Ｈfte,H.,Seurinck,J.,Van Houtven A.and Vaec
k,M.,Nucleic Acids Research 15,7183（1987） − Ｈfte,H.,Dissertation thesis at the State Un
iversity of Ghent,Belgium（1988）． − Ｈfte,H.,Van Rie,J.,Jansens,S.,Van Houtven,
A.,Verbruggen,H.and Vaeck,M.,Applied and Environme
ntal Microbiology 54,2010−2017（1988） − Ｈfte H.and Whiteley H.R.,Microbiological Re
view 53,_242−255（1989）． − Hull and Howell,Virology 86,482−493（1987） − Laemmli V.,Nature 227,680−685（1970） − Lambert,B.,Leyns,F.,Van Rooyen,L.,Gossel,F.,
Papon,Y.and Swings,J.Applied and Environmental Mic
robiology 53,1866−1871（1987） − Mahillon,J.and Delcour,J.,J.Microbiol.Methods
３,69−73（1984） − Maxam,A.M.and Gilbert,W.,Methods in Enzymol.6
5,499−560（1980）． − Odell,J.T.,Nagy,J.,and Chua,N.,Nature 313,810
−812（1985）． − Reiss,B.,Sprengel,R.,Will,H.and Schaller,H.,Ge
ne 30,217−223（1984）． − Shimamoto K.,Terada R.,Izawa T.and Fujimoto
H.,Nature 338,274−276（1989）． − Stanssens P.,McKeown Y.,Friedrich K.and Fritz
H.J.（1988），“Oligonucleotide−directed construc
tion of mutations by the gapped duplex DNA method
using the pMA/c plasmid vectors",published in the
collection of additional experimental procedures d
istributed at the EMBO laboratory course on“Direc
ted mutagenesis and protein engineering"in July 19
87 at the Max Planck Institute fr Biochemi,Marti
nsried,Federal Republic of Germany. − Stanssens P.,Opsomer C.,McKeown Y.,Kramer W.,Z
abeau M.and Fritz H.J.,Nucleic Acids Research 12,4
441−4454（1989）． − Vaeck,M.,Reynaerts,A.,Hfte,H.,Jansens,S.,De
Beuckeleer,M.,Dean,C.,Zabeau,M.,Van Montagu,M.and
Leemans,J.,Nature 327,33−37（1987）． − Velten,J.,Velten,L.,Hain,R.and Schell,J.,EMBO
J ３,2723−2730（1984）． − Velten,J.and Schell,J.Nucleic Acids Research 1
3,6981−6998（1985） − Yanisch−Perron,C.,Vierra,J.and Messing,J.,Gen
e 33,103−119（1985）． 配列表 1.一般的情報 ｉ）出願人:Plant Genetic System N.V. ii）発明の名称：新規のBacillus thuringiensis株
及び殺虫毒素をコードするそれらの遺伝子 iii）配列の数:2 iv）住所： A.宛名:Plant Genetic System N.V. B.番地:Plateaustraat 22 C.郵便番号及び市名:9000 Ghent D.国名：ベルギー国 ｖ）コンピューター読み取り可能な方式： A.媒体型式:5.25インチ両面高密度1.2Mbフロッピー
ディスク B.コンピューター:IBM PC/AT C.操作系:DOS バージョン3.3 D.ソフトウェア:WordPerfect vi）現出願データ：入手不可能 vii）先願データ：欧州特許出願第90403724.9号，欧
州特許出願第90401144.2号 配列番号:1 配列の型：核酸及び対応するタンパク質 配列の長さ:2411塩基対 鎖の数:2本鎖 トポロジー：直鎖状 分子の種類:Bacillus thuringiensis由来DNA 仮想的配列：いいえ アンチセンス：いいえ 起源： A.生物名:Bacillus thuringiensis var.kurstaki B.株名:Bt I 109P（DSM寄託番号5870） 国際供給源:pUC.cry III DHd I 配列の特徴：ヌクレオチド１〜232:bt I 109P遺伝子
（Ｓ）の5'（上流）配列；ヌクレオチド231〜2179:bt I
109P遺伝子（Ｓ）のコード配列；ヌクレオチド2180〜
末端:bt I 109P遺伝子（Ｓ）の3'（下流）配列 配列の性質:bt I 109P遺伝子は鞘翅類に対する72kD殺虫
性結晶タンパク質毒素をコードする。
配列番号:2
配列の型：核酸及び対応するタンパク質
配列の長さ:1291塩基対
鎖の数:2本鎖
トポロジー：直鎖状
分子の種類:Bacillus thuringiensis由来DNA
仮想的配列：いいえ
アンチセンス：いいえ
起源：
A.生物名:Bacillus thuringiensis var.kumamotoen
sis B.株名:Bt I 260（DSM寄託番号5871） 配列の特徴：ヌクレオチド２〜1045:Bt I 260殺虫性タ
ンパク質のＣ末端をコードするbt I 260遺伝子の5'末端
配列（アミノ酸の番号付けは不完全である） 配列の性質:bt I 260遺伝子は鞘翅類に対する66kD殺虫
性タンパク質毒素をコードする。
sis B.株名:Bt I 260（DSM寄託番号5871） 配列の特徴：ヌクレオチド２〜1045:Bt I 260殺虫性タ
ンパク質のＣ末端をコードするbt I 260遺伝子の5'末端
配列（アミノ酸の番号付けは不完全である） 配列の性質:bt I 260遺伝子は鞘翅類に対する66kD殺虫
性タンパク質毒素をコードする。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
5/10 21/06
Ｃ１２Ｐ 21/02 21/02
21/06 Ｃ１２Ｒ 1:07
//(Ｃ１２Ｐ 21/02 1:19
Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(Ｃ１２Ｐ 21/02 5/00 Ｃ
Ｃ１２Ｒ 1:19）
(72)発明者 フアン・オーデンホーベ，カトリエン
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ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．84（1987）ｐｐ.
7036−7040
Claims (25)
- 【請求項１】配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む殺
虫性結晶タンパク質を産生する寄託番号DSM5870のバチ
ルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）Bt
I 109P株。 - 【請求項２】請求項１に記載の株の胞子−結晶混合物。
- 【請求項３】配列番号１のアミノ酸配列を含むことを特
徴とする殺虫性タンパク質。 - 【請求項４】殺虫活性を有する請求項３に記載のタンパ
ク質からのフラグメントであって、そのフラグメントが
配列番号１のアミノ酸位置56〜649のアミノ酸配列を含
むことを特徴とするフラグメント。 - 【請求項５】トリプシン消化によって得られ、殺虫活性
を有する請求項３に記載のタンパク質からのフラグメン
ト。 - 【請求項６】請求項３に記載のタンパク質をコードする
DNA。 - 【請求項７】請求項４又は５に記載のタンパク質フラグ
メントをコードするDNA。 - 【請求項８】配列番号１のアミノ酸位置56〜649のアミ
ノ酸配列を含むことを特徴とする殺虫性タンパク質をコ
ードするDNA。 - 【請求項９】１）請求項７または８に記載のDNAである
コーディング領域と、２）植物細胞中での前記DNAの転
写に適したプロモーターと、３）植物細胞中で前記DNA
を発現させる適切な3'末端転写体形成及びポリアデニル
化シグナルとを含むキメラ遺伝子。 - 【請求項１０】前記コーディング領域が配列番号１のDN
Aと比べて変化したコドン使用を有する請求項９に記載
のキメラ遺伝子。 - 【請求項１１】前記コーディング領域がアミノ酸コドン
の置換、欠失又は付加によって改変されているが、但
し、キメラ遺伝子によりコードされるタンパク質の殺虫
活性は請求項３に記載のタンパク質または請求項４に記
載のタンパク質フラグメントと比べて変わらないことを
特徴とする、請求項９に記載のキメラ遺伝子。 - 【請求項１２】前記コーディング領域が、発現時に融合
タンパク質が産生されるように、請求項７又は８に記載
のDNAと、選択マーカーをコードするDNAとのハイブリッ
ドであることを特徴とする、請求項11に記載のキメラ遺
伝子。 - 【請求項１３】植物細胞のゲノム中に安定に組込まれる
ことを特徴とする請求項９〜12のいずれか１項に記載の
キメラ遺伝子。 - 【請求項１４】請求項９〜12のいずれか１項のキメラ遺
伝子を含むように形質転換された植物細胞。 - 【請求項１５】アグロバクテリウムで形質転換され得る
請求項９〜12のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を細
胞中に含む植物。 - 【請求項１６】請求項９〜12のいずれか１項に記載のキ
メラ遺伝子を組織の一部または全部に含む形質転換双子
葉植物。 - 【請求項１７】細胞のゲノム中に安定に組込まれた請求
項９〜12のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を含む、
形質転換されたトウモロコシ又はイネ植物体。 - 【請求項１８】細胞のゲノム中に安定に組込まれた請求
項９〜12のいずれか１項に記載のキメラ遺伝子を含む、
請求項15〜17のいずれか１項に記載の植物の種子。 - 【請求項１９】請求項６〜８のいずれか１項に記載のDN
Aで形質転換された細菌。 - 【請求項２０】バチルス・スリンジエンシス（Bacillus
thuringiensis）である請求項19に記載の細菌。 - 【請求項２１】請求項３〜５のいずれか１項に記載のタ
ンパク質又はタンパク質フラグメント、請求項１に記載
の株、又は請求項２に記載の胞子−結晶混合物、を含む
殺虫剤組成物。 - 【請求項２２】請求項９〜12のいずれか１項に記載のキ
メラ遺伝子で植物細胞を形質転換し、前記細胞から形質
転換植物を再生することを含む、鞘翅類昆虫から植物を
保護する方法であって、前記植物がアグロバクテリウム
で形質転換され得る植物である方法。 - 【請求項２３】請求項９〜12のいずれか１項に記載のキ
メラ遺伝子で植物細胞を形質転換し、前記細胞から形質
転換植物を再生することを含む、鞘翅類昆虫から植物を
保護する方法であって、前記植物が双子葉植物、イネ又
はトウモロコシである方法。 - 【請求項２４】請求項２に記載の胞子−結晶混合物又は
請求項３〜５のいずれか１項に記載のタンパク質又はタ
ンパク質フラグメントを鞘翅類昆虫から保護されるべき
場所に散布又は噴霧することを含む、鞘翅類昆虫を防除
する方法。 - 【請求項２５】請求項３〜５のいずれか１項に記載のタ
ンパク質又はタンパク質フラグメントが発現され微生物
から回収され得る条件下で形質転換された微生物。
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