JP3260139B2 - バチルスチュリンギエンシスの殺虫毒素を産生するように形質転換した植物 - Google Patents
バチルスチュリンギエンシスの殺虫毒素を産生するように形質転換した植物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、２つ新規のバチルスチュリンギエンシス
（B.thuringiensis）株（「BtPGSI208株」及び「BtPGSI
245株」）に係わる。これらの株はいずれも、胞子形成
中に結晶（それぞれ「BtPGSI208結晶」及び「BtPGSI−2
45結晶」）にパッケージされる結晶化タンパク質（それ
ぞれ「BtPGSI208結晶タンパク質」及び「BtPGSI245結晶
タンパク質」）を産生する。これらのBtPGSI208株及びB
tPGSI245株はブダペスト条約の条項に従い、1989年１月
19日にそれぞれ受託番号5131及び5132でドイツ連邦共和
国Mascheroder Weg 1B,d−3300 Braunschweig,Deutsche
Sammlung Fr Mikroorganismen and Zellkulturen
（“DSM"）に寄託した。
（B.thuringiensis）株（「BtPGSI208株」及び「BtPGSI
245株」）に係わる。これらの株はいずれも、胞子形成
中に結晶（それぞれ「BtPGSI208結晶」及び「BtPGSI−2
45結晶」）にパッケージされる結晶化タンパク質（それ
ぞれ「BtPGSI208結晶タンパク質」及び「BtPGSI245結晶
タンパク質」）を産生する。これらのBtPGSI208株及びB
tPGSI245株はブダペスト条約の条項に従い、1989年１月
19日にそれぞれ受託番号5131及び5132でドイツ連邦共和
国Mascheroder Weg 1B,d−3300 Braunschweig,Deutsche
Sammlung Fr Mikroorganismen and Zellkulturen
（“DSM"）に寄託した。
本発明は、甲虫類に対して活性を示す殺虫組成物であ
って、そのままの形態のBtPGSI208もしくはBtPGSI245株
か、又は好ましくはBtPGSI208もしくはBtPGSI245結晶、
結晶タンパク質もしくはその活性成分を活性材料として
含む殺虫剤組成物にも係わる。
って、そのままの形態のBtPGSI208もしくはBtPGSI245株
か、又は好ましくはBtPGSI208もしくはBtPGSI245結晶、
結晶タンパク質もしくはその活性成分を活性材料として
含む殺虫剤組成物にも係わる。
本発明は更に、 １）BtPGSI208株のゲノムに由来するDNA配列（「btPGSI
208遺伝子」）であって、BtPGSI208結晶中に存在する74
kDaタンパク質（「BtPGSI208プロトキシン」）をコード
するDNA配列と、 ２）BtPGSI245株のゲノムに由来するDNA配列（「btPGSI
245遺伝子」）であって、BtPGSI245結晶中に存在する12
9kDaタンパク質（「BtPGSI245プロトキシン」）をコー
ドするDNA配列とにも係わる。
208遺伝子」）であって、BtPGSI208結晶中に存在する74
kDaタンパク質（「BtPGSI208プロトキシン」）をコード
するDNA配列と、 ２）BtPGSI245株のゲノムに由来するDNA配列（「btPGSI
245遺伝子」）であって、BtPGSI245結晶中に存在する12
9kDaタンパク質（「BtPGSI245プロトキシン」）をコー
ドするDNA配列とにも係わる。
BtPGSI208プロトキシン及びBtPGSI245プロトキシン
は、対応するBtPGSI208株及びBtPGSI245株によって産生
され、その後対応するBtPGSI208結晶及びBtPGSI245結晶
にパッケージされるタンパク質である。
は、対応するBtPGSI208株及びBtPGSI245株によって産生
され、その後対応するBtPGSI208結晶及びBtPGSI245結晶
にパッケージされるタンパク質である。
本発明は更に、それぞれBtPGSI208プロトキシン及びB
tPGSI245プロトキシンから（例えばトリプシン消化によ
って）得ることができる68kDaタンパク質（「BtPGSI208
毒素」）及び66kDaタンパク質（「BtPGSI245毒素」）に
も係わる。BtPGSI208毒素及びBtPGSI245毒素はそれぞれ
BtPGSI208株及びBtPGSI245株によって産生されたBtPGSI
208結晶及びBtPGSI245結晶から遊離し得る殺虫活性タン
パク質であり、いずれも甲虫類に対して大きな活性を示
す。BtPGSI208毒素及びBtPGSI245毒素は、甲虫類に対し
て殺虫効果のある対応するBtPGSI208プロトキシン及びB
tPGSI245プロトキシンの最小部分を示すものと考えられ
る。
tPGSI245プロトキシンから（例えばトリプシン消化によ
って）得ることができる68kDaタンパク質（「BtPGSI208
毒素」）及び66kDaタンパク質（「BtPGSI245毒素」）に
も係わる。BtPGSI208毒素及びBtPGSI245毒素はそれぞれ
BtPGSI208株及びBtPGSI245株によって産生されたBtPGSI
208結晶及びBtPGSI245結晶から遊離し得る殺虫活性タン
パク質であり、いずれも甲虫類に対して大きな活性を示
す。BtPGSI208毒素及びBtPGSI245毒素は、甲虫類に対し
て殺虫効果のある対応するBtPGSI208プロトキシン及びB
tPGSI245プロトキシンの最小部分を示すものと考えられ
る。
本発明は更に、植物細胞の形質転換に使用でき、 １）対応するBtPGSI208プロトキシン又はBtPGSI245プロ
トキシンの殺虫効果のある部分をコードするbtPGSI208
又はbtPGSI245遺伝子の一部分（「殺虫効果のあるbtPGS
I208又はbtPGSI245遺伝子部分）、好ましくはそれぞれB
tPGSI208毒素又はBtPGSI245毒素だけをコードするbtPGS
I208遺伝子又はbtPGSI245遺伝子の切断（truncated）
（即ち、端を切り取った）部分（「切断btPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子」）と、 ２）植物細胞中で殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI2
45遺伝子部分を転写するのに適したプロモーターと、 ３）植物細胞中で殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI2
45遺伝子部分を発現するのに適した転写終結及びポリア
デニル化シグナル とを含むキメラ遺伝子にも係わる。このキメラ遺伝子は
以後「btPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子」と称す
る。殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
は、BtPGSI208−NTP II又はBtPGSI245−NPT II融合タン
パク質をコードするハイブリッド遺伝子であって、切断
btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子と選択可能なマーカー遺
伝子例えばneo遺伝子との融合体を含むハイブリッド遺
伝子（「btPGSI208−neo又はbtPGSI245−neoハイブリッ
ド遺伝子」）としてbtPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝
子中に存在するのが好ましい。
トキシンの殺虫効果のある部分をコードするbtPGSI208
又はbtPGSI245遺伝子の一部分（「殺虫効果のあるbtPGS
I208又はbtPGSI245遺伝子部分）、好ましくはそれぞれB
tPGSI208毒素又はBtPGSI245毒素だけをコードするbtPGS
I208遺伝子又はbtPGSI245遺伝子の切断（truncated）
（即ち、端を切り取った）部分（「切断btPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子」）と、 ２）植物細胞中で殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI2
45遺伝子部分を転写するのに適したプロモーターと、 ３）植物細胞中で殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI2
45遺伝子部分を発現するのに適した転写終結及びポリア
デニル化シグナル とを含むキメラ遺伝子にも係わる。このキメラ遺伝子は
以後「btPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子」と称す
る。殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
は、BtPGSI208−NTP II又はBtPGSI245−NPT II融合タン
パク質をコードするハイブリッド遺伝子であって、切断
btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子と選択可能なマーカー遺
伝子例えばneo遺伝子との融合体を含むハイブリッド遺
伝子（「btPGSI208−neo又はbtPGSI245−neoハイブリッ
ド遺伝子」）としてbtPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝
子中に存在するのが好ましい。
本発明は更に、 １）殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
でゲノムが形質転換された例えばジャガイモのような植
物の細胞（「形質転換植物細胞」）、並びに ２）殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
を含むゲノムを有し且つ甲虫類に対して耐性のある形質
転換植物細胞から再生された植物又はこのようにして再
生された植物から製造された植物（「形質転換植物」） にも係わる。
でゲノムが形質転換された例えばジャガイモのような植
物の細胞（「形質転換植物細胞」）、並びに ２）殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
を含むゲノムを有し且つ甲虫類に対して耐性のある形質
転換植物細胞から再生された植物又はこのようにして再
生された植物から製造された植物（「形質転換植物」） にも係わる。
本発明は更に、好ましくはエレクトロポレーション
（electroporation）によって、btPGSI208又はbtPGSI24
5遺伝子の全体又は一部分を運ぶベクターで形質転換し
たB.thuringiensis（「Bt」）株にも係わる。
（electroporation）によって、btPGSI208又はbtPGSI24
5遺伝子の全体又は一部分を運ぶベクターで形質転換し
たB.thuringiensis（「Bt」）株にも係わる。
発明の背景 B.thuringiensisは胞子形成時に内生結晶を産生する
グラム陽性菌である。前記結晶は昆虫の幼虫に対して特
異的な毒性を示すタンパク質からなる。これまでに開示
されたBtパソタイプ（pathotype）には次の３種類があ
る：毛虫等の鱗翅類に対して活性を示すパソタイプＡ、
蚊及びブユのような特定の双翅類に対して活性を示すパ
ソタイプＢ、並びにカブトムシ等の甲虫類に対して活性
を示すパソタイプＣ（Ellerら、1986）。
グラム陽性菌である。前記結晶は昆虫の幼虫に対して特
異的な毒性を示すタンパク質からなる。これまでに開示
されたBtパソタイプ（pathotype）には次の３種類があ
る：毛虫等の鱗翅類に対して活性を示すパソタイプＡ、
蚊及びブユのような特定の双翅類に対して活性を示すパ
ソタイプＢ、並びにカブトムシ等の甲虫類に対して活性
を示すパソタイプＣ（Ellerら、1986）。
甲虫類に対して毒性の結晶を産生するBt株は、Bt ten
ebrionis（米国特許第4,766,203号、欧州特許公告第0,1
49,162号）、Bt M−７もしくはBt San Diego（欧州特許
公告第0,213,818号、米国特許第4,771,131号）及びBtS1
（欧州特許出願第88/402,115.5号）として開示されてい
る。
ebrionis（米国特許第4,766,203号、欧州特許公告第0,1
49,162号）、Bt M−７もしくはBt San Diego（欧州特許
公告第0,213,818号、米国特許第4,771,131号）及びBtS1
（欧州特許出願第88/402,115.5号）として開示されてい
る。
Bt胞子は一般的な水中発酵技術によって大量生産でき
るため、Bt菌は殺虫剤組成物源として産業的に有用な菌
である。
るため、Bt菌は殺虫剤組成物源として産業的に有用な菌
である。
殺虫タンパク質をコードする或る種のBt株に由来する
遺伝子フラグメントはこれまでにも同定されており、植
物に耐昆虫性を与えるべく植物ゲノム中に組込まれてき
た。しかしながら、このようなBt遺伝子フラグメントを
植物中で発現させるプロセスは簡単なものではない。植
物細胞中での殺虫タンパク質の発現を最適に生起させる
ためには、各Bt遺伝子フラグメントが目的昆虫に対する
実質的な毒性を保持するBtプロトキシンの水溶性部分を
コードするように、各Bt遺伝子フラグメントを特異的な
方法で操作しなければならないことが判明した（欧州特
許出願第86/300,291.1号及び第88/402,115.5号、1986年
１月22日に出願された米国特許出願第821,582号）。
遺伝子フラグメントはこれまでにも同定されており、植
物に耐昆虫性を与えるべく植物ゲノム中に組込まれてき
た。しかしながら、このようなBt遺伝子フラグメントを
植物中で発現させるプロセスは簡単なものではない。植
物細胞中での殺虫タンパク質の発現を最適に生起させる
ためには、各Bt遺伝子フラグメントが目的昆虫に対する
実質的な毒性を保持するBtプロトキシンの水溶性部分を
コードするように、各Bt遺伝子フラグメントを特異的な
方法で操作しなければならないことが判明した（欧州特
許出願第86/300,291.1号及び第88/402,115.5号、1986年
１月22日に出願された米国特許出願第821,582号）。
発明の概要 本発明ではパソタイプＣの２つの新規Bt株、即ちBtPG
SI208株及びBtPGSI245株を提供する。胞子形成時にそれ
ぞれの株によって産生されるBtPGSI208及びBtPGSI245結
晶、結晶タンパク質、プロトキシン及び毒素、並びにBt
PGSI208及びBtPGSI245プロトキシンの殺虫効果部分はい
ずれも殺虫活性を有し、従って一般的には甲虫類、特定
的にはAgelastica alni、Diabrotica luteola、Haltica
tombacina、Anthonomus grandis、ちゃいろこめのごみ
むしだましTenebrio molitor、Diabrotica undecimpunc
tata及びTriboluem castaneum、特に経済的に重要な作
物の主な害虫であるコロラドハムシLeptinotarsa decem
lineataに対する殺虫剤組成物に配合することができ
る。
SI208株及びBtPGSI245株を提供する。胞子形成時にそれ
ぞれの株によって産生されるBtPGSI208及びBtPGSI245結
晶、結晶タンパク質、プロトキシン及び毒素、並びにBt
PGSI208及びBtPGSI245プロトキシンの殺虫効果部分はい
ずれも殺虫活性を有し、従って一般的には甲虫類、特定
的にはAgelastica alni、Diabrotica luteola、Haltica
tombacina、Anthonomus grandis、ちゃいろこめのごみ
むしだましTenebrio molitor、Diabrotica undecimpunc
tata及びTriboluem castaneum、特に経済的に重要な作
物の主な害虫であるコロラドハムシLeptinotarsa decem
lineataに対する殺虫剤組成物に配合することができ
る。
本発明では更に、植物細胞ゲノムを殺虫効果のあるbt
PGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分、好ましくは切断btPG
SI208又はbtPGSI245遺伝子で形質転換する。この形質転
換はbtPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子を用いて実施
するのが好ましい。得られた形質転換植物細胞は、植物
に耐甲虫類性を付与すべく、植物組織の一部分又は全体
における植物細胞が、１）殺虫効果のあるbtPGSI208又
はbtPGSI245遺伝子部分を安定挿入体としてゲノム中に
含み、且つ２）対応するBtPGSI208又はBtPGSI245プロト
キシンの殺虫効果部分、好ましくは対応するBtPGSI208
又はBtPGSI245毒素を産生することにより殺虫効果のあ
るbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分を発現するような
形質転換植物を製造するのに使用できる。本発明の形質
転換植物細胞は、このような殺虫Btタンパク質を回収す
るために産生する場合にも使用できる。
PGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分、好ましくは切断btPG
SI208又はbtPGSI245遺伝子で形質転換する。この形質転
換はbtPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子を用いて実施
するのが好ましい。得られた形質転換植物細胞は、植物
に耐甲虫類性を付与すべく、植物組織の一部分又は全体
における植物細胞が、１）殺虫効果のあるbtPGSI208又
はbtPGSI245遺伝子部分を安定挿入体としてゲノム中に
含み、且つ２）対応するBtPGSI208又はBtPGSI245プロト
キシンの殺虫効果部分、好ましくは対応するBtPGSI208
又はBtPGSI245毒素を産生することにより殺虫効果のあ
るbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分を発現するような
形質転換植物を製造するのに使用できる。本発明の形質
転換植物細胞は、このような殺虫Btタンパク質を回収す
るために産生する場合にも使用できる。
本発明では更に、植物細胞ゲノムを殺虫効果のあるbt
PGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分、好ましくは切断btPG
SI208又はbtPGSI245遺伝子で形質転換することにより、
植物に耐甲虫類性を与える方法も提供する。この場合、
植物細胞はbtPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子で形質
転換するのが好ましい。
PGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分、好ましくは切断btPG
SI208又はbtPGSI245遺伝子で形質転換することにより、
植物に耐甲虫類性を与える方法も提供する。この場合、
植物細胞はbtPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子で形質
転換するのが好ましい。
本発明では更に、BtPGSI208及びBtPGSI245プロトキシ
ン、これらプロトキシンの殺虫効果部分、BtPGSI208及
びBtPGSI245毒素、btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、殺
虫効果のあるbtPGSI208及びbtPGSI245遺伝子部分、切断
btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、並びにキメラbtPGSI20
8及びbtPGSI245遺伝子も提供する。
ン、これらプロトキシンの殺虫効果部分、BtPGSI208及
びBtPGSI245毒素、btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、殺
虫効果のあるbtPGSI208及びbtPGSI245遺伝子部分、切断
btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、並びにキメラbtPGSI20
8及びbtPGSI245遺伝子も提供する。
本発明では更に、BtPGSI208又はBtPGSI245プロトキシ
ンの全体又は殺虫効果部分をコードするbtPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子の全体又は一部分を運ぶベクターで、好
ましくはエレクトロポレーションにより、Bt株を形質転
換する。
ンの全体又は殺虫効果部分をコードするbtPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子の全体又は一部分を運ぶベクターで、好
ましくはエレクトロポレーションにより、Bt株を形質転
換する。
発明の詳細 本発明では、BtPGSI208及びBtPGSI245プロトキシンを
一般的な方法でそれぞれBtPGSI208株（受託番号5131でD
SMに寄託）及びBtPGSI245株（受託番号5132でDSMに寄
託）から単離することができる。例えば、BtPGSI208及
びBtPGSI245結晶を対応する株の胞子形成した培養物か
ら単離し（Mahillon及びDelcour,1984）、次いでＨft
eら（1986）の方法によりこれらの結晶から対応するプ
ロトキシンを単離し得る。このプロトキシンは、これら
のプロトキシンに特異的なモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体を通常の方法で製造するのに使用できる（Ｈ
fteら、1988）。次いで、BtPGSI208プロトキシンから
約57個のＮ末端アミノ酸を（例えばトリプシン消化によ
って）除去すれば、BtPGSI208毒素を得ることができ
る。BtPGSI245毒素は、（例えばトリプシン消化によ
り）約52個のＮ末端アミノ酸と約501個のＣ末端アミノ
酸とをBtPGSI245プロトキシンから除去することによっ
て得られる。
一般的な方法でそれぞれBtPGSI208株（受託番号5131でD
SMに寄託）及びBtPGSI245株（受託番号5132でDSMに寄
託）から単離することができる。例えば、BtPGSI208及
びBtPGSI245結晶を対応する株の胞子形成した培養物か
ら単離し（Mahillon及びDelcour,1984）、次いでＨft
eら（1986）の方法によりこれらの結晶から対応するプ
ロトキシンを単離し得る。このプロトキシンは、これら
のプロトキシンに特異的なモノクローナル又はポリクロ
ーナル抗体を通常の方法で製造するのに使用できる（Ｈ
fteら、1988）。次いで、BtPGSI208プロトキシンから
約57個のＮ末端アミノ酸を（例えばトリプシン消化によ
って）除去すれば、BtPGSI208毒素を得ることができ
る。BtPGSI245毒素は、（例えばトリプシン消化によ
り）約52個のＮ末端アミノ酸と約501個のＣ末端アミノ
酸とをBtPGSI245プロトキシンから除去することによっ
て得られる。
btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子も通常の方法でそれぞ
れの株から単離することができる。例えば、btPGSI208
又はbtPGSI245遺伝子は、1986年１月22日に出願された
米国特許出願第821,582号並びに欧州特許出願第86/300,
291.1号及び第88/402,115.5号（これらは本明細書に参
考として包含される）に記載の方法を用いて、対応する
BtPGSI208又はBtPGSI245株中で同定することができる。
btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子の各々は、１種類以上の
制限酵素により対応するBtPGSI208及びBtPGSI245株から
完全DNAを消化し、得られたDNAフラグメントを５〜10Kb
のDNAフラクションにサイズ分別し、これらのフラクシ
ョンをクローニングベクターに連結し、このベクターで
大腸菌（E.coli）を形質転換し、クローンを適当なDNA
プローブでスクリーニングすることによって同定するの
が好ましい。DNAプローブは、１）甲虫類に対する別の
結晶プロトキシンをコードするBt遺伝子、例えば欧州特
許出願第88/402,115.5号及びＨfteら（1987）によっ
て記述されているbt13遺伝子が高度に保存された領域で
構成し得、又は２）対応するbtPGSI208又はbtPGSI−245
遺伝子によってコードされるプロトキシンのＮ末端アミ
ノ酸配列をベースとして構成し得る。前記アミノ酸配列
は固定プロトキシンの気相配列決定によって決定し得る
（欧州特許出願第88/402,115.5号）。
れの株から単離することができる。例えば、btPGSI208
又はbtPGSI245遺伝子は、1986年１月22日に出願された
米国特許出願第821,582号並びに欧州特許出願第86/300,
291.1号及び第88/402,115.5号（これらは本明細書に参
考として包含される）に記載の方法を用いて、対応する
BtPGSI208又はBtPGSI245株中で同定することができる。
btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子の各々は、１種類以上の
制限酵素により対応するBtPGSI208及びBtPGSI245株から
完全DNAを消化し、得られたDNAフラグメントを５〜10Kb
のDNAフラクションにサイズ分別し、これらのフラクシ
ョンをクローニングベクターに連結し、このベクターで
大腸菌（E.coli）を形質転換し、クローンを適当なDNA
プローブでスクリーニングすることによって同定するの
が好ましい。DNAプローブは、１）甲虫類に対する別の
結晶プロトキシンをコードするBt遺伝子、例えば欧州特
許出願第88/402,115.5号及びＨfteら（1987）によっ
て記述されているbt13遺伝子が高度に保存された領域で
構成し得、又は２）対応するbtPGSI208又はbtPGSI−245
遺伝子によってコードされるプロトキシンのＮ末端アミ
ノ酸配列をベースとして構成し得る。前記アミノ酸配列
は固定プロトキシンの気相配列決定によって決定し得る
（欧州特許出願第88/402,115.5号）。
あるいは、BtPGSI208株又はBtPGSI245株の完全DNAか
ら調製した５〜10kBフラグメントを適当な発現ベクター
中に連結し、大腸菌中で形質転換し、次いでクローンを
通常のコロニーイムノプロービング法（Frenchら、198
6）によりスクリーニングにかけて、BtPGSI208又はBtPG
SI245毒素をその毒素に対するモノクローナル又はポリ
クローナル抗体により発現を検出してもよい。
ら調製した５〜10kBフラグメントを適当な発現ベクター
中に連結し、大腸菌中で形質転換し、次いでクローンを
通常のコロニーイムノプロービング法（Frenchら、198
6）によりスクリーニングにかけて、BtPGSI208又はBtPG
SI245毒素をその毒素に対するモノクローナル又はポリ
クローナル抗体により発現を検出してもよい。
このようにして同定したbtPGSI208及びbtPGSI245遺伝
子は次いで通常の方法（Maxam及びGilbert、1980）で配
列決定すると、第１図及び第２図にそれぞれ示すDNA配
列が得られる。第１図及び第２図に示すbtPGSI208遺伝
子及びbtPGSI245遺伝子のヌクレオチド配列は、BtPGSI2
08及びBtPGSI245プロトキシン及び毒素が、甲虫類に対
する活性をもつ先行技術のプロトキシン及び毒素（Ｈ
fte及びWhiteley、1989）とは異なるものであることを
証明している。
子は次いで通常の方法（Maxam及びGilbert、1980）で配
列決定すると、第１図及び第２図にそれぞれ示すDNA配
列が得られる。第１図及び第２図に示すbtPGSI208遺伝
子及びbtPGSI245遺伝子のヌクレオチド配列は、BtPGSI2
08及びBtPGSI245プロトキシン及び毒素が、甲虫類に対
する活性をもつ先行技術のプロトキシン及び毒素（Ｈ
fte及びWhiteley、1989）とは異なるものであることを
証明している。
対応するプロトキシンの殺虫効果部分をコードする配
列決定した各遺伝子の殺虫効果部分と、対応する毒素だ
けをコードする配列決定した各遺伝子の切断部分は、遺
伝子の配列決定後に各遺伝子から通常の方法で形成でき
る。BtPGSI208及びBtPGSI245プロトキシン及び毒素のア
ミノ酸配列は、対応するbtPGSI208及びbtPGSI245遺伝子
並びに切断btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子のDNA配列か
ら決定し得る。btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子の「殺虫
効果部分」又は「一部分」とは、アミノ酸数が対応する
BtPGSI208又はBtPGSI245プロトキシンより少ないがそれ
でも甲虫類に対して毒性を示すポリペプチドをコードす
るDNA配列を意味する。btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子
のこのような部分はプロトキシンの少なくとも１つのト
リプシン開裂部位で切断されたBtPGSI208又はBtPGSI245
プロトキシンをコードし得る（米国特許出願第821,582
号、欧州特許出願第86/300291.1号）。
列決定した各遺伝子の殺虫効果部分と、対応する毒素だ
けをコードする配列決定した各遺伝子の切断部分は、遺
伝子の配列決定後に各遺伝子から通常の方法で形成でき
る。BtPGSI208及びBtPGSI245プロトキシン及び毒素のア
ミノ酸配列は、対応するbtPGSI208及びbtPGSI245遺伝子
並びに切断btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子のDNA配列か
ら決定し得る。btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子の「殺虫
効果部分」又は「一部分」とは、アミノ酸数が対応する
BtPGSI208又はBtPGSI245プロトキシンより少ないがそれ
でも甲虫類に対して毒性を示すポリペプチドをコードす
るDNA配列を意味する。btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子
のこのような部分はプロトキシンの少なくとも１つのト
リプシン開裂部位で切断されたBtPGSI208又はBtPGSI245
プロトキシンをコードし得る（米国特許出願第821,582
号、欧州特許出願第86/300291.1号）。
btPGSI208遺伝子又はbtPGSI245遺伝子の全体又は殺虫
効果部分を大腸菌及び植物中で発現するためには、適当
な制限部位を各遺伝子又は遺伝子部分の側に導入する。
この操作は、良く知られた手順で、特定部位の突然変異
誘発により実施し得る（Stanssensら、1987;Stanssens
ら、1989）。
効果部分を大腸菌及び植物中で発現するためには、適当
な制限部位を各遺伝子又は遺伝子部分の側に導入する。
この操作は、良く知られた手順で、特定部位の突然変異
誘発により実施し得る（Stanssensら、1987;Stanssens
ら、1989）。
対応するBtPGSI208又はBtPGSI245プロトキシンの殺虫
効果部分をコードする殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtP
GSI245遺伝子部分は通常の方法で単一植物細胞の該ゲノ
ム中に安定的に挿入し得、このようにして形質転換され
た植物細胞は耐昆虫性をもつ形質転換植物を製造すべく
通常の方法で使用できる。例えば、Agrobcterium tumef
aciensの攻撃性のない（disarmed）Tiプラスミド、即ち
殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分を含
んだTiプラスミドを用いて植物細胞を形質転換し、その
後、欧州特許公告第0,116,718号及び第0,270,822号、PC
T公告WO 84/02,913号並びに欧州特許出願第87/400,544.
0号（これらも本明細書に参考として包含される）に記
載のような方法を用いて形質転換植物細胞から形質転換
植物を再生することができる。
効果部分をコードする殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtP
GSI245遺伝子部分は通常の方法で単一植物細胞の該ゲノ
ム中に安定的に挿入し得、このようにして形質転換され
た植物細胞は耐昆虫性をもつ形質転換植物を製造すべく
通常の方法で使用できる。例えば、Agrobcterium tumef
aciensの攻撃性のない（disarmed）Tiプラスミド、即ち
殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分を含
んだTiプラスミドを用いて植物細胞を形質転換し、その
後、欧州特許公告第0,116,718号及び第0,270,822号、PC
T公告WO 84/02,913号並びに欧州特許出願第87/400,544.
0号（これらも本明細書に参考として包含される）に記
載のような方法を用いて形質転換植物細胞から形質転換
植物を再生することができる。
得られた形質転換植物は、一般的な植物栽培（繁殖）
方法で、同じ特性を有する形質転換植物を更に製造する
ために、又は殺虫効果のあるbtPGSI208もしくはbtPGSI2
45遺伝子部分を同じもしくは関連した植物種の他の変種
に導入するために使用できる。形質転換植物から得られ
る種子は、殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝
子部分を安定なゲノム挿入体として含む。形質転換植物
の細胞は、甲虫類に対する一般的な殺虫剤組成物に使用
するために回収することができるBtPGSI208又はBtPGSI2
45プロトキシン、好ましくはそれぞれの毒素を製造すべ
く、通常の方法で培養することができる（米国特許出願
第821,582号、欧州特許出願第86/300291.1号）。
方法で、同じ特性を有する形質転換植物を更に製造する
ために、又は殺虫効果のあるbtPGSI208もしくはbtPGSI2
45遺伝子部分を同じもしくは関連した植物種の他の変種
に導入するために使用できる。形質転換植物から得られ
る種子は、殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝
子部分を安定なゲノム挿入体として含む。形質転換植物
の細胞は、甲虫類に対する一般的な殺虫剤組成物に使用
するために回収することができるBtPGSI208又はBtPGSI2
45プロトキシン、好ましくはそれぞれの毒素を製造すべ
く、通常の方法で培養することができる（米国特許出願
第821,582号、欧州特許出願第86/300291.1号）。
殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分、
好ましくは切断btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分は、
遺伝子の挿入部分が、植物細胞中での遺伝子部分の発現
を制御し得るプロモーターの下流（即ち3'）に位置し且
つその制御下におかれるように、植物細胞ゲノム中に挿
入する。この操作は、btPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺
伝子を植物細胞ゲノム中に挿入することによって実施す
るのが好ましい。好ましいプロモーターとしては、単離
体CM1841（Gardnerら、1981）、CabbB−Ｓ（Franckら、
1980）及びCabbB−JI（Hull及びHowell、1987）のカリ
フラワーモザイクウイルスの強力な構成性35Sプロモー
ター（「35Sプロモーター」）、並びにTDNAの1'遺伝子
及び2'遺伝子をそれぞれ発現させるTR1'プロモーター及
びTR2'プロモーター（「TR1'プロモーター」及び「TR2'
プロモーター」）（Veltenら、1984）が挙げられる。あ
るいは、構成性ではなく植物の組織又は器官の１つ以上
（例えば葉及び／又は根）に対して特異的であり、挿入
されたbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分を１つ以上の
特定の組織又は器官の細胞中でのみ発現させるプロモー
ターを使用することもできる。例えば、btPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子部分は植物（例えばジャガイモ）の葉の
中で、その遺伝子部分をその植物又は別の植物、例えば
米国特許出願第821,582号及び欧州特許出願第86/300,29
1.1号に記載のようなエンドウのリブロース−1,5−ビホ
スフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプ
ロモーターのような光誘導プロモーターの制御下におく
ことによって、選択的に発現させ得る。あるいは、発現
が（例えば温度又は化学的要因によって）誘発されるプ
ロモーターを使用してもよい。
好ましくは切断btPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分は、
遺伝子の挿入部分が、植物細胞中での遺伝子部分の発現
を制御し得るプロモーターの下流（即ち3'）に位置し且
つその制御下におかれるように、植物細胞ゲノム中に挿
入する。この操作は、btPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺
伝子を植物細胞ゲノム中に挿入することによって実施す
るのが好ましい。好ましいプロモーターとしては、単離
体CM1841（Gardnerら、1981）、CabbB−Ｓ（Franckら、
1980）及びCabbB−JI（Hull及びHowell、1987）のカリ
フラワーモザイクウイルスの強力な構成性35Sプロモー
ター（「35Sプロモーター」）、並びにTDNAの1'遺伝子
及び2'遺伝子をそれぞれ発現させるTR1'プロモーター及
びTR2'プロモーター（「TR1'プロモーター」及び「TR2'
プロモーター」）（Veltenら、1984）が挙げられる。あ
るいは、構成性ではなく植物の組織又は器官の１つ以上
（例えば葉及び／又は根）に対して特異的であり、挿入
されたbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分を１つ以上の
特定の組織又は器官の細胞中でのみ発現させるプロモー
ターを使用することもできる。例えば、btPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子部分は植物（例えばジャガイモ）の葉の
中で、その遺伝子部分をその植物又は別の植物、例えば
米国特許出願第821,582号及び欧州特許出願第86/300,29
1.1号に記載のようなエンドウのリブロース−1,5−ビホ
スフェートカルボキシラーゼ小サブユニット遺伝子のプ
ロモーターのような光誘導プロモーターの制御下におく
ことによって、選択的に発現させ得る。あるいは、発現
が（例えば温度又は化学的要因によって）誘発されるプ
ロモーターを使用してもよい。
殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
は、遺伝子の挿入部分が適当な3'転写調節シグナル（即
ち転写終結及びポリアデニル化シグナル）の上流（即ち
5'）に位置するように、植物ゲノム中に挿入する。この
操作は、btPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子を植物細
胞ゲノム中に挿入することによって実施するのが好まし
い。好ましいポリアデニル化及び転写終結シグナルとし
ては、オクトピン合成遺伝子（Gielenら、1984）及びＴ
−DNA遺伝子７（Velten及びSchell、1985）のシグナル
が挙げられる。これらのシグナルは、形質転換植物細胞
中で3'−非翻訳DNA配列として機能する。
は、遺伝子の挿入部分が適当な3'転写調節シグナル（即
ち転写終結及びポリアデニル化シグナル）の上流（即ち
5'）に位置するように、植物ゲノム中に挿入する。この
操作は、btPGSI208又はbtPGSI245キメラ遺伝子を植物細
胞ゲノム中に挿入することによって実施するのが好まし
い。好ましいポリアデニル化及び転写終結シグナルとし
ては、オクトピン合成遺伝子（Gielenら、1984）及びＴ
−DNA遺伝子７（Velten及びSchell、1985）のシグナル
が挙げられる。これらのシグナルは、形質転換植物細胞
中で3'−非翻訳DNA配列として機能する。
殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI245遺伝子部分
は、選択可能なマーカー遺伝子と同じ転写単位で且つ同
じプロモーターの制御下で植物ゲノム中に挿入するのが
好ましい。得られたハイブリッドbtPGSI208又はbtPGSI2
45マーカー遺伝子は、これにより、融合タンパク質とし
て形質転換植物中に発現される（米国特許出願第821,58
2号；欧州特許出願第86/300291.1号;Vaeckら、1987）。
この結果は、マーカー遺伝子を含んだbtPGSI208又はbtP
GSI245キメラ遺伝子を植物細胞ゲノム中に挿入すること
によって得るのが好ましい。マーカー遺伝子としては、
その発現を形質転換植物細胞の選択に使用できる任意の
一般的遺伝子を使用し得る。適当な選択可能マーカー遺
伝子の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えばカ
ナマイシン耐性をコードするneo遺伝子が挙げられる（R
eissら、1984;欧州特許出願第87/400,544.0号；米国特
許出願第821,582号；欧州特許出願第86/300,291.1
号）。このようにして、殺虫効果のあるbtPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子部分及びマーカー遺伝子（例えばbtPGSI
208−neo又はbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子）が形
質転換植物中に融合タンパク質として発現される（米国
特許出願第821,582号；欧州特許出願第86/300,291.1号;
Vaeckら、1987）。
は、選択可能なマーカー遺伝子と同じ転写単位で且つ同
じプロモーターの制御下で植物ゲノム中に挿入するのが
好ましい。得られたハイブリッドbtPGSI208又はbtPGSI2
45マーカー遺伝子は、これにより、融合タンパク質とし
て形質転換植物中に発現される（米国特許出願第821,58
2号；欧州特許出願第86/300291.1号;Vaeckら、1987）。
この結果は、マーカー遺伝子を含んだbtPGSI208又はbtP
GSI245キメラ遺伝子を植物細胞ゲノム中に挿入すること
によって得るのが好ましい。マーカー遺伝子としては、
その発現を形質転換植物細胞の選択に使用できる任意の
一般的遺伝子を使用し得る。適当な選択可能マーカー遺
伝子の具体例としては、抗生物質耐性遺伝子、例えばカ
ナマイシン耐性をコードするneo遺伝子が挙げられる（R
eissら、1984;欧州特許出願第87/400,544.0号；米国特
許出願第821,582号；欧州特許出願第86/300,291.1
号）。このようにして、殺虫効果のあるbtPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子部分及びマーカー遺伝子（例えばbtPGSI
208−neo又はbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子）が形
質転換植物中に融合タンパク質として発現される（米国
特許出願第821,582号；欧州特許出願第86/300,291.1号;
Vaeckら、1987）。
甲虫類毒素をコードするbtPGSI208及びbtPGSI245遺伝
子の全体又は一部分は、鱗翅類又は甲虫類に対して殺虫
活性を示すB.thuringiensisのようなグラム陽性菌の形
質転換にも使用できる。このようにすれば、鱗翅類及び
甲虫類双方の昆虫の害又は別の甲虫類昆虫の害に対処す
る上で有用な形質転換Bt株を製造することができる。適
当なクローニングベヒクル中に組込んだbtPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子の全体又は一部分による細菌の形質転換
は、好ましくは1989年12月11日出願のPCT特許出願PCT/E
P89/01539号に記載のような一般的エレクトロポレーシ
ョン技術を用いて、通常の方法で実施し得る。
子の全体又は一部分は、鱗翅類又は甲虫類に対して殺虫
活性を示すB.thuringiensisのようなグラム陽性菌の形
質転換にも使用できる。このようにすれば、鱗翅類及び
甲虫類双方の昆虫の害又は別の甲虫類昆虫の害に対処す
る上で有用な形質転換Bt株を製造することができる。適
当なクローニングベヒクル中に組込んだbtPGSI208又はb
tPGSI245遺伝子の全体又は一部分による細菌の形質転換
は、好ましくは1989年12月11日出願のPCT特許出願PCT/E
P89/01539号に記載のような一般的エレクトロポレーシ
ョン技術を用いて、通常の方法で実施し得る。
BtPGSI208株及びBtPGSI245株はいずれも、通常の方法
で発酵させて高収率で細胞が得られる（Dulmage、198
1）。十分に解明されている適当な条件（Dulmage、198
1）の下ではBtPGSI208株もBtPGSI245株も胞子を形成し
て、それぞれBtPGSI208結晶タンパク質及びBtPGSI245結
晶タンパク質を高収率で産生する。
で発酵させて高収率で細胞が得られる（Dulmage、198
1）。十分に解明されている適当な条件（Dulmage、198
1）の下ではBtPGSI208株もBtPGSI245株も胞子を形成し
て、それぞれBtPGSI208結晶タンパク質及びBtPGSI245結
晶タンパク質を高収率で産生する。
本発明の殺虫剤組成物は、BtPGSI208株もしくはBtPGS
I245株、又は好ましくは対応する結晶、結晶タンパク
質、プロトキシン、毒素及び／又は対応するプロトキシ
ンの殺虫効果部分を活性成分として、適当なキャリヤ
ー、希釈剤、乳化剤及び／又は分散剤と一緒に用いて、
通常の方法で調製し得る。本発明の殺虫剤組成物は、水
和剤、ペレット、顆粒もしくは粉末の形態、又は水性も
しくは非水性溶媒を用いた液体配合物、ムース、ゲル、
懸濁液、濃縮液等の形態に調製できる。BtPGSI208もし
くはBtPGSI245株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシ
ン、毒素及び／又はプロトキシン部分の前記組成物中の
濃度は、組成物の種類と用途とに依存する。本発明の殺
虫剤組成物は一般的には、該組成物の適用毎にジャガイ
モ畑が２〜４週間にわたって甲虫類から防護されるよう
に使用できる。より長期の（例えば成長期全体にわた
る）防護では、さらに組成物を定期的に適用しなければ
ならない。
I245株、又は好ましくは対応する結晶、結晶タンパク
質、プロトキシン、毒素及び／又は対応するプロトキシ
ンの殺虫効果部分を活性成分として、適当なキャリヤ
ー、希釈剤、乳化剤及び／又は分散剤と一緒に用いて、
通常の方法で調製し得る。本発明の殺虫剤組成物は、水
和剤、ペレット、顆粒もしくは粉末の形態、又は水性も
しくは非水性溶媒を用いた液体配合物、ムース、ゲル、
懸濁液、濃縮液等の形態に調製できる。BtPGSI208もし
くはBtPGSI245株、結晶、結晶タンパク質、プロトキシ
ン、毒素及び／又はプロトキシン部分の前記組成物中の
濃度は、組成物の種類と用途とに依存する。本発明の殺
虫剤組成物は一般的には、該組成物の適用毎にジャガイ
モ畑が２〜４週間にわたって甲虫類から防護されるよう
に使用できる。より長期の（例えば成長期全体にわた
る）防護では、さらに組成物を定期的に適用しなければ
ならない。
以下、添付図面を参照し、実施例を挙げて本発明をよ
り詳細に説明する。
り詳細に説明する。
第１図はbtPGSI208遺伝子のDNA配列を示している。コ
ードされたBtPGSI208プロトキシンの誘導アミノ酸配列
はこの配列の下に示されている。矢印はＮ末端の57個の
アミノ酸を、BtPGSI208毒素をコードするＣ末端部分か
ら分離している。BtPGSI208毒素のみをコードする切断b
tPGSI2遺伝子はヌクレオチド位置513（矢印参照）から
ヌクレオチド位置2295のTAG終結コドンまで延びてい
る。
ードされたBtPGSI208プロトキシンの誘導アミノ酸配列
はこの配列の下に示されている。矢印はＮ末端の57個の
アミノ酸を、BtPGSI208毒素をコードするＣ末端部分か
ら分離している。BtPGSI208毒素のみをコードする切断b
tPGSI2遺伝子はヌクレオチド位置513（矢印参照）から
ヌクレオチド位置2295のTAG終結コドンまで延びてい
る。
第２図はbtPGSI245遺伝子のDNA配列を示している。コ
ードされたBtPGSI245プロトキシンの誘導アミノ酸配列
はこの配列の下に示されている。矢印はBtPGSI245プロ
トキシンのアミノ酸52とアミノ酸638との間のBtPGSI245
毒素の範囲を示している。BtPGSI245遺伝子のみをコー
ドする切断btPGSI245遺伝子はヌクレオチド位置399（矢
印参照）からヌクレオチド位置2094（矢印参照）まで延
びている。
ードされたBtPGSI245プロトキシンの誘導アミノ酸配列
はこの配列の下に示されている。矢印はBtPGSI245プロ
トキシンのアミノ酸52とアミノ酸638との間のBtPGSI245
毒素の範囲を示している。BtPGSI245遺伝子のみをコー
ドする切断btPGSI245遺伝子はヌクレオチド位置399（矢
印参照）からヌクレオチド位置2094（矢印参照）まで延
びている。
第３図は胞子を形成したBtPGSI208、BtPGSI245及び他
のBacillus培養物のSDS−PAGEによる総タンパク質パタ
ーンを示している。比較用の株のうち、B.subt.はBacil
lus subtilis、B.cer.はBacillus cereus、Bt DarmはBa
cillus thuringiensis亜種darmstadiensisである。これ
ら比較用の株は後出の表１に示す源から得たものであ
る。「MW」は分子量マーカーを意味する。
のBacillus培養物のSDS−PAGEによる総タンパク質パタ
ーンを示している。比較用の株のうち、B.subt.はBacil
lus subtilis、B.cer.はBacillus cereus、Bt DarmはBa
cillus thuringiensis亜種darmstadiensisである。これ
ら比較用の株は後出の表１に示す源から得たものであ
る。「MW」は分子量マーカーを意味する。
第4A図はBtS1株及びBtPGSI208株に由来する総タンパ
ク質及びトリプシン処理結晶タンパク質のタンパク質ブ
ロッティングを示している。総タンパク質パターンはイ
ンディアンインキで染色し、結晶タンパク質はBt13毒素
に対する抗血清（「抗Cry IIIA」」）で可視化した。
「HMW」は分子量マーカーを意味する。
ク質及びトリプシン処理結晶タンパク質のタンパク質ブ
ロッティングを示している。総タンパク質パターンはイ
ンディアンインキで染色し、結晶タンパク質はBt13毒素
に対する抗血清（「抗Cry IIIA」」）で可視化した。
「HMW」は分子量マーカーを意味する。
第4B図はBtS1株、BtPGSI245株及びBt HD−110株に由
来する総タンパク質及びトリプシン処理結晶タンパク質
のタンパク質ブロッティングを示している。総タンパク
質パターンについてはその免疫反応性を、Bt13毒素に対
する抗血清（「抗Cry−IIIA」）及びBt2プロトキシンに
対する抗血清（「抗Cry IA（ｂ）」）で調べた。「LM
W」は分子量マーカーを意味する。比較用の株HD−110
は、Cotton Insect Laboratories,U.S.D.A.,Brownsvill
e,Texas,U.S.A.のDr.H.Dulmageから入手したBt HD−110
である。
来する総タンパク質及びトリプシン処理結晶タンパク質
のタンパク質ブロッティングを示している。総タンパク
質パターンについてはその免疫反応性を、Bt13毒素に対
する抗血清（「抗Cry−IIIA」）及びBt2プロトキシンに
対する抗血清（「抗Cry IA（ｂ）」）で調べた。「LM
W」は分子量マーカーを意味する。比較用の株HD−110
は、Cotton Insect Laboratories,U.S.D.A.,Brownsvill
e,Texas,U.S.A.のDr.H.Dulmageから入手したBt HD−110
である。
以下の実施例では特に指示のない限り、組換え体DNA
の形成及び操作はManiatisらのMolecular Cloning−A l
aboratorty Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1
982）に記載の標準化された手順に従って行なわれたと
理解されたい。
の形成及び操作はManiatisらのMolecular Cloning−A l
aboratorty Manual,Cold Spring Harbor Laboratory（1
982）に記載の標準化された手順に従って行なわれたと
理解されたい。
実施例1:BtPGSI208株及びBtPGSI245株の特徴分析 BtPGSI208株はベルギーで試料採取された穀物粉末か
ら単離し、1989年１月19日に受託番号5131でDSMに寄託
した。
ら単離し、1989年１月19日に受託番号5131でDSMに寄託
した。
BtPGSI245株は米国で試料採取された牛糞から単離
し、1989年１月19日に受託番号5132でDSMに寄託した。
し、1989年１月19日に受託番号5132でDSMに寄託した。
各株は通常の標準的培地、好ましくはLB培地（バクト
トリプトン10g/、酵母抽出物5g/、NaCl10g/、寒
天15g/）を用いて好ましくは28℃で培養し得る。長期
間貯蔵する場合は、グリセロールを50％含むLB液体培地
を−70℃で又は凍結乾燥状態で使用する。胞子形成の場
合は、T3培地（トリプトン3g/、トリプトース2g/、
酵母抽出物1.5g/、MnCl25mg、0.05M Na2PO4（pH6.
8）、寒天1.5％）を28℃で24時間使用し、次いで４℃で
貯蔵するのが好ましい。BtPGSI208株及びBtPGSI245株は
いずれも生長段階は通性の嫌気性条件でも増殖し得る
が、胞子形成は好気性条件でしか生起しない。
トリプトン10g/、酵母抽出物5g/、NaCl10g/、寒
天15g/）を用いて好ましくは28℃で培養し得る。長期
間貯蔵する場合は、グリセロールを50％含むLB液体培地
を−70℃で又は凍結乾燥状態で使用する。胞子形成の場
合は、T3培地（トリプトン3g/、トリプトース2g/、
酵母抽出物1.5g/、MnCl25mg、0.05M Na2PO4（pH6.
8）、寒天1.5％）を28℃で24時間使用し、次いで４℃で
貯蔵するのが好ましい。BtPGSI208株及びBtPGSI245株は
いずれも生長段階は通性の嫌気性条件でも増殖し得る
が、胞子形成は好気性条件でしか生起しない。
各株の殺菌は120℃（圧力１バール）で20分間オート
クレーブ処理することによって行う。この処理は胞子と
結晶BtPGSI208プロトキシン及びBtPGSI245プロトキシン
とを完全に失活させる。UV照射（254nm）は胞子を失活
させるがプロトキシンは失活させない。
クレーブ処理することによって行う。この処理は胞子と
結晶BtPGSI208プロトキシン及びBtPGSI245プロトキシン
とを完全に失活させる。UV照射（254nm）は胞子を失活
させるがプロトキシンは失活させない。
普通寒天（「NA」、Difco Laboratories,Detroit,MI,
USA）で一日培養すると、BtPGSI208株及びBtPGSI245株
各々のコロニーが不規則なエッジを有する不透明な白色
コロニーを形成する。NAで28℃で３日間培養すると、各
株の細胞（1.7〜2.4x5.6〜7.7μｍのグラム陽性ロッ
ド）が胞子を形成する。胞子形成中に産生された結晶タ
ンパク質は、BtPGSI208株の場合には偏平な菱形結晶に
パッケージされ、BtPGSI245株の場合には二重錐形結晶
にパッケージされる。
USA）で一日培養すると、BtPGSI208株及びBtPGSI245株
各々のコロニーが不規則なエッジを有する不透明な白色
コロニーを形成する。NAで28℃で３日間培養すると、各
株の細胞（1.7〜2.4x5.6〜7.7μｍのグラム陽性ロッ
ド）が胞子を形成する。胞子形成中に産生された結晶タ
ンパク質は、BtPGSI208株の場合には偏平な菱形結晶に
パッケージされ、BtPGSI245株の場合には二重錐形結晶
にパッケージされる。
これら２つの株の生化学的特徴を調べるために、例え
ばSneathら（1986）によって記述されているような良く
知られた方法を用いて下記の検査を行った。NaClを２％
及び５％加えた普通ブイヨン（「NB」、Difco）では増
殖が観察された。７％のNaClの存在下ではBtPGSI208株
の増殖は全く見られず、BtPGSI245株の増殖はほんの僅
かであった。10％のNaClを加えた培地ではどちらの株も
増殖しなかった。BtPGSI208株及びBtPGSI245株は、NAで
20℃、28℃及び37℃で培養すると良く増殖したが、４
℃、10℃（但しBtPGSI245株はこの温度でゆっくり増殖
した）、50℃及び60℃では増殖しなかった。どちらの株
もpH＝５、pH＝６及びpH＝７のNB並びにNB1ml当たり100
単位のリゾチーム（Sigma Chemical Company,St.Louis,
MO,USA）を含んだNBでは増殖した。嫌気生活ではNAでの
増殖は極めて低かった。
ばSneathら（1986）によって記述されているような良く
知られた方法を用いて下記の検査を行った。NaClを２％
及び５％加えた普通ブイヨン（「NB」、Difco）では増
殖が観察された。７％のNaClの存在下ではBtPGSI208株
の増殖は全く見られず、BtPGSI245株の増殖はほんの僅
かであった。10％のNaClを加えた培地ではどちらの株も
増殖しなかった。BtPGSI208株及びBtPGSI245株は、NAで
20℃、28℃及び37℃で培養すると良く増殖したが、４
℃、10℃（但しBtPGSI245株はこの温度でゆっくり増殖
した）、50℃及び60℃では増殖しなかった。どちらの株
もpH＝５、pH＝６及びpH＝７のNB並びにNB1ml当たり100
単位のリゾチーム（Sigma Chemical Company,St.Louis,
MO,USA）を含んだNBでは増殖した。嫌気生活ではNAでの
増殖は極めて低かった。
これら２種類の株の代謝特性を、API−20Eテストスト
リップ（API Systems S.A.,Montalieu−Vercieu,Franc
e）を用いて調べた。これらのアッセイの結果を次表１
に示す。
リップ（API Systems S.A.,Montalieu−Vercieu,Franc
e）を用いて調べた。これらのアッセイの結果を次表１
に示す。
ONPG＝β−ガラクトシダーゼ活性 ADH＝アルギニンジヒドロラーゼ活性 LDC＝リシンデカルボキシラーゼ活性 ODC＝オルニチンデカルボキシラーゼ活性 CIT＝唯一の炭素源としてのクエン酸塩の使用 H2S＝チオスルフェートからのH2Sの形成 URE＝ウレアーゼ活性 TDA＝トリプトファンデアミナーゼ活性 IND＝トリプトファンからのインドールの形成 VP＝ピルビン酸ナトリウムからのアセトインの形成 GEL＝ゼラチンの液化 OX＝オキシダーゼ活性 NO2＝硝酸塩の亜硝酸塩への還元 N2＝硝酸塩からのN2ガスの生成 BTS1＝DSMから入手した受託番号4288のBacillus thurin
giensis BtS1。
giensis BtS1。
BTEN＝DSMから入手した受託番号2803のBacillus thurin
giensis亜種tenebrionis。
giensis亜種tenebrionis。
BDAR＝Institut fr Landwirschaftliche Bacteriolog
ie und Grungsbiologie der Eidgenssiche Technis
che Hochshle,Zrich,Switzerland（“LBG"）から入
手した受託番号4447のBacillus thuringiensis亜種darm
stadiensis。
ie und Grungsbiologie der Eidgenssiche Technis
che Hochshle,Zrich,Switzerland（“LBG"）から入
手した受託番号4447のBacillus thuringiensis亜種darm
stadiensis。
BCER＝Laboratorium voor Microbiologie,Gent,Belgium
（“LMG"）から入手した受託番号2098のBacillus cereu
s。
（“LMG"）から入手した受託番号2098のBacillus cereu
s。
BSUB＝Agricultural Research Culture Collection,Peo
ria,Illinois,USAから入手した受託番号NRRL B−237のB
acillus subtilis。
ria,Illinois,USAから入手した受託番号NRRL B−237のB
acillus subtilis。
前記２種類の株は、Sneathらのテスト（1986）におい
て、脱脂乳寒天でカゼインを急速に分解し且つフェニル
アラニンを脱アミノ化することが判明した。
て、脱脂乳寒天でカゼインを急速に分解し且つフェニル
アラニンを脱アミノ化することが判明した。
これら２種類の株による種々の糖からの酸の生成を、
API−50CHBテストストリップ（API Systmes SA）を用い
て調べた。結果を次表２に示す。
API−50CHBテストストリップ（API Systmes SA）を用い
て調べた。結果を次表２に示す。
種々の抗生物質に対する前記２種類の株の感度をOxoi
d susceptibility Test Discsを用いてOxoid Isosensit
est寒天（「CM471」、Oxoid Ltd.,Basingstoke,Hampshi
re,England）で調べた。結果を次表３に示す。
d susceptibility Test Discsを用いてOxoid Isosensit
est寒天（「CM471」、Oxoid Ltd.,Basingstoke,Hampshi
re,England）で調べた。結果を次表３に示す。
拡張API−ZYMストリップ（API System S.A.）を用い
てBtPGSI208株及びBtPGSI245株の酵素スペクトルを調べ
た。
てBtPGSI208株及びBtPGSI245株の酵素スペクトルを調べ
た。
結果を次表４に示す。エステラーゼテストストリッ
プ、ペプチダーゼテストストリップ（AP1、AP2、AP3、A
P4、AP5及びAP6テストストリップ）及びオシダーゼテス
トストリップには50μｌ細胞懸濁液（107cfu/ml）を植
え付けた。オシダーゼ反応は25μｌの0.1N NaOHと一緒
に４時間（28℃）インキュベートした後で現れた。他の
総ての反応は25μｌのZYM A及びZYM B試薬（API no.704
8）で現れた。
プ、ペプチダーゼテストストリップ（AP1、AP2、AP3、A
P4、AP5及びAP6テストストリップ）及びオシダーゼテス
トストリップには50μｌ細胞懸濁液（107cfu/ml）を植
え付けた。オシダーゼ反応は25μｌの0.1N NaOHと一緒
に４時間（28℃）インキュベートした後で現れた。他の
総ての反応は25μｌのZYM A及びZYM B試薬（API no.704
8）で現れた。
実施例2:BtPGSI208結晶及びBtPGSI245結晶の特徴 BtPGSI208株及びBtPGSI245株をT3培地で28℃で48〜72
時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をTrihalsk
iスパチュラでの掻取りによりリン酸塩緩衝生理食塩水
（「PBS」、Oxoid Ltd.製）中に回収した。得られた胞
子−結晶懸濁水を遠心分離にかけ、ペレットを50mMのNa
2CO3と5mMのジチオトレイトール（「DTT」）とを含むpH
10の水溶液中に再懸濁させて一晩インキュベートした。
遠心分離後、それぞれの結晶タンパク質を含む上清を回
収した。
時間増殖させた。胞子形成後、胞子及び結晶をTrihalsk
iスパチュラでの掻取りによりリン酸塩緩衝生理食塩水
（「PBS」、Oxoid Ltd.製）中に回収した。得られた胞
子−結晶懸濁水を遠心分離にかけ、ペレットを50mMのNa
2CO3と5mMのジチオトレイトール（「DTT」）とを含むpH
10の水溶液中に再懸濁させて一晩インキュベートした。
遠心分離後、それぞれの結晶タンパク質を含む上清を回
収した。
BtPGSI208プロトキシン及び毒素並びにBtPGSI245毒素
は第４図に示すようにBt13毒素に対するポリクローナル
抗血清とだけ反応する。これに対し、BtPGSI245プロト
キシンは第４図に示すようにBtS1又はBt13毒素（欧州特
許出願第88/402115.5号）及びBt2プロトキシン（米国特
許出願第821,582号、欧州特許出願第86/300,291.1号）
に対するポリクローナル抗血清と反応する。
は第４図に示すようにBt13毒素に対するポリクローナル
抗血清とだけ反応する。これに対し、BtPGSI245プロト
キシンは第４図に示すようにBtS1又はBt13毒素（欧州特
許出願第88/402115.5号）及びBt2プロトキシン（米国特
許出願第821,582号、欧州特許出願第86/300,291.1号）
に対するポリクローナル抗血清と反応する。
BtPGSI208株及びBtPGSI245株の総タンパク質パターン
を他のBacillus株と比較して第３図に示した。この比較
のために、各株の結晶タンパク質を12.5％SDS−PAGEゲ
ル上で分析し（Laemmli,1970）、且つLambertら（198
7）に従ってクーマシーブリリアントブルーＲ−250で染
色した。前記胞子−結晶混合物を一晩37℃で50mM Na2CO
3（pH10）、5mM DTTに暴露することにより結晶タンパク
質を溶解させた。pHを0.5M HClで9.0に調整し且つトリ
プシン化（１μｇウシトリプシン/25μｇタンパク質）
を行って、溶解した結晶タンパク質を消化した。BtPGSI
208結晶タンパク質及びBtPGSI245結晶タンパク質のトリ
プシン消化を37℃で一晩行うと、それぞれ68kDa及び66k
Daのトリプシンフラグメントの存在が明らかになった
（第４図）。Peferoen（1988）の方法に従い、Bt13毒素
及びBt2プロトキシンに対するポリクローナル抗血清を
用いてイムノブロッティング実験を行ったところ、第4A
図及び第4B図に示すように、BtPGSI208及びBtPGSI245プ
ロトキシン及び毒素はBt13毒素と免疫学的に関係がある
ことが判明した。また、第4B図に示すように、BtPGSI24
5毒素は免疫学的にBt2プロトキシンとも関係があること
が判明した。ブロッティング後、これらのタンパク質を
インディアンインキで染色して（Sutherland及びSkerri
tt、1986）免疫反応性タンパク質及び非免疫反応性タン
パク質の両方を明らかにした（第４図）。
を他のBacillus株と比較して第３図に示した。この比較
のために、各株の結晶タンパク質を12.5％SDS−PAGEゲ
ル上で分析し（Laemmli,1970）、且つLambertら（198
7）に従ってクーマシーブリリアントブルーＲ−250で染
色した。前記胞子−結晶混合物を一晩37℃で50mM Na2CO
3（pH10）、5mM DTTに暴露することにより結晶タンパク
質を溶解させた。pHを0.5M HClで9.0に調整し且つトリ
プシン化（１μｇウシトリプシン/25μｇタンパク質）
を行って、溶解した結晶タンパク質を消化した。BtPGSI
208結晶タンパク質及びBtPGSI245結晶タンパク質のトリ
プシン消化を37℃で一晩行うと、それぞれ68kDa及び66k
Daのトリプシンフラグメントの存在が明らかになった
（第４図）。Peferoen（1988）の方法に従い、Bt13毒素
及びBt2プロトキシンに対するポリクローナル抗血清を
用いてイムノブロッティング実験を行ったところ、第4A
図及び第4B図に示すように、BtPGSI208及びBtPGSI245プ
ロトキシン及び毒素はBt13毒素と免疫学的に関係がある
ことが判明した。また、第4B図に示すように、BtPGSI24
5毒素は免疫学的にBt2プロトキシンとも関係があること
が判明した。ブロッティング後、これらのタンパク質を
インディアンインキで染色して（Sutherland及びSkerri
tt、1986）免疫反応性タンパク質及び非免疫反応性タン
パク質の両方を明らかにした（第４図）。
実施例3:BtPGSI208結晶タンパク質及びBtPGSI245結晶タ
ンパク質の殺虫活性 実施例２と同様に、前記２種類の株をT3培地で28℃で
48〜72時間増殖させた。胞子形成後、Trihalskiスパチ
ュラで胞子及び結晶をPBS（phosphate buffered salin
e）中に回収した。得られた胞子−結晶懸濁液を遠心分
離にかけ、ペレットを実施例２と同様のNa2CO3及びDTT
水溶液中に再懸濁させて一晩インキュベートした。遠心
分離後、上清を回収し、前記２種類の株のそれぞれの結
晶タンパク質の含量を測定した。
ンパク質の殺虫活性 実施例２と同様に、前記２種類の株をT3培地で28℃で
48〜72時間増殖させた。胞子形成後、Trihalskiスパチ
ュラで胞子及び結晶をPBS（phosphate buffered salin
e）中に回収した。得られた胞子−結晶懸濁液を遠心分
離にかけ、ペレットを実施例２と同様のNa2CO3及びDTT
水溶液中に再懸濁させて一晩インキュベートした。遠心
分離後、上清を回収し、前記２種類の株のそれぞれの結
晶タンパク質の含量を測定した。
ジャガイモの葉を前記上清溶液の水性希釈物に浸し、
次いで２時間風乾した。このようにして処理した葉の上
に第二齢のコロラドハムシ幼虫を配置し、３日後の幼虫
の死亡率を測定した。その結果を、対照としてBt HD−
１の可溶化結晶タンパク質（「Bt Kurstaki Dipel」、A
bbott Laboratoires,Abbott Park,North Chicago,Ill.,
USA）で処理した葉を与えた幼虫の死亡率と比較した。1
ml当たりの可溶化結晶タンパク質量μｇで表されるLC50
をProbit分析（Finney,1971）によって計算した。結果
を次表５にまとめた。
次いで２時間風乾した。このようにして処理した葉の上
に第二齢のコロラドハムシ幼虫を配置し、３日後の幼虫
の死亡率を測定した。その結果を、対照としてBt HD−
１の可溶化結晶タンパク質（「Bt Kurstaki Dipel」、A
bbott Laboratoires,Abbott Park,North Chicago,Ill.,
USA）で処理した葉を与えた幼虫の死亡率と比較した。1
ml当たりの可溶化結晶タンパク質量μｇで表されるLC50
をProbit分析（Finney,1971）によって計算した。結果
を次表５にまとめた。
実施例4:btPGSI208遺伝子の同定及びクローニング BtPGSI208株に由来するBtPGSI208プロトキシンを、Bt
13甲虫類毒素に対するポリクローナル抗血清を用いて
（Ｈfteら、1987）、ELISAにより検出した（Engvall
及びPesce、1978）。BtPGSI208株の完全DNAを調製し、
このDNAを制限酵素Hind III,EcoR I及びCla Iで消化す
ることによって、btPGSI208遺伝子をBtPGSI208株内で同
定した。このように消化したDNAは、bt13遺伝子を含むB
tS1株（欧州特許出願第88/402,115.5号）のゲノムに由
来するニックトランスレーションした2.9kbHind IIIフ
ラグメントをプローブとして用いて、サザンブロッティ
ングで分析した。プローブとのハイブリダイゼーション
後、ブロットを低ストリンジェンシー条件下で洗浄（2X
SSC、0.1％SDS、68℃、2x15分間）すると、bt13遺伝子
に関連したbtPGSI208遺伝子の存在が判明した。プロー
ブとのハイブリダイゼーションパターンは更に、btPGSI
208遺伝子がbt13遺伝子とは明らかに異なるものである
ことも明示した。
13甲虫類毒素に対するポリクローナル抗血清を用いて
（Ｈfteら、1987）、ELISAにより検出した（Engvall
及びPesce、1978）。BtPGSI208株の完全DNAを調製し、
このDNAを制限酵素Hind III,EcoR I及びCla Iで消化す
ることによって、btPGSI208遺伝子をBtPGSI208株内で同
定した。このように消化したDNAは、bt13遺伝子を含むB
tS1株（欧州特許出願第88/402,115.5号）のゲノムに由
来するニックトランスレーションした2.9kbHind IIIフ
ラグメントをプローブとして用いて、サザンブロッティ
ングで分析した。プローブとのハイブリダイゼーション
後、ブロットを低ストリンジェンシー条件下で洗浄（2X
SSC、0.1％SDS、68℃、2x15分間）すると、bt13遺伝子
に関連したbtPGSI208遺伝子の存在が判明した。プロー
ブとのハイブリダイゼーションパターンは更に、btPGSI
208遺伝子がbt13遺伝子とは明らかに異なるものである
ことも明示した。
btPGSI208遺伝子を単離すべく、BtPGSI208株から完全
DNAを調製した。この完全DNA調製物をSau3Aで部分的に
消化し、ショ糖勾配でサイズ分画した。5kb〜10kbのDNA
を含むフラクションを、Bgl IIIで消化し且つウシアル
カリホスファターゼ（「BAP」）で処理したクローニン
グベクターpEcoR251（1988年７月13日に受託番号DSM471
1でDSMに寄託）に連結した。このベクターを含む組換え
体大腸菌クローンを、プローブとしてbt13遺伝子を含む
2.9kbのHind III DNAフラグメントを用いてスクリーニ
ングにかけ、btPGSI208遺伝子を含むクローンのDNAフラ
グメントを同定した。このようにして同定したDNAフラ
グメントをMaxam及びGilbert（1980）の方法で配列決定
した（第１図）。
DNAを調製した。この完全DNA調製物をSau3Aで部分的に
消化し、ショ糖勾配でサイズ分画した。5kb〜10kbのDNA
を含むフラクションを、Bgl IIIで消化し且つウシアル
カリホスファターゼ（「BAP」）で処理したクローニン
グベクターpEcoR251（1988年７月13日に受託番号DSM471
1でDSMに寄託）に連結した。このベクターを含む組換え
体大腸菌クローンを、プローブとしてbt13遺伝子を含む
2.9kbのHind III DNAフラグメントを用いてスクリーニ
ングにかけ、btPGSI208遺伝子を含むクローンのDNAフラ
グメントを同定した。このようにして同定したDNAフラ
グメントをMaxam及びGilbert（1980）の方法で配列決定
した（第１図）。
btPGSI208遺伝子のDNA配列の分析に基づいてこの遺伝
子を適当な制限酵素で切断し、約68kDaのBtPGSI208毒素
をコードする切断btPGSI208遺伝子を得た。
子を適当な制限酵素で切断し、約68kDaのBtPGSI208毒素
をコードする切断btPGSI208遺伝子を得た。
実施例5:btPGSI245遺伝子の同定及びクローニング BtPGSI245株に由来するBtPGSI245プロトキシンを、Bt
13甲虫類毒素に対するポリクローナル抗血清を用いてEL
ISAにより検出した（Engvall及びPesce、1978）。BtPGS
I245株のコロニーハイブリダイゼーションと、bt13遺伝
子を含む2.9kbHind III DNAフラグメントでプローブし
且つ前述の低ストリンジェンシー条件下で洗浄したBtPG
SI245完全DNAのサザンブロッティングとの結果、ハイブ
リダイジングDNAは観察されなかった。
13甲虫類毒素に対するポリクローナル抗血清を用いてEL
ISAにより検出した（Engvall及びPesce、1978）。BtPGS
I245株のコロニーハイブリダイゼーションと、bt13遺伝
子を含む2.9kbHind III DNAフラグメントでプローブし
且つ前述の低ストリンジェンシー条件下で洗浄したBtPG
SI245完全DNAのサザンブロッティングとの結果、ハイブ
リダイジングDNAは観察されなかった。
btPGSI245遺伝子を単離すべく、BtPGSI245株から完全
DNAを調製し、Sau3Aで部分的に消化した。消化したDNA
をショ糖勾配でサイズ分画し、5kb〜10kbのフラグメン
トを、BamH Iで消化し且つBAPで処理したクローニング
ベクターpUC18に連結した（Yannisch−Perronら、198
5）。このベクターを含む組換え体クローンを、bt13毒
素に対する抗血清でのコロニーイムノプロービングによ
りスクリーニングした（Frenchら、1986）。陽性コロニ
ーを精製し、総タンパク質調製物をBt13毒素に対する抗
血清でのイムノブロッティングによって再分析した。Bt
PGSI245プロトキシンを発現するクローンに由来するBtP
GSI245遺伝子を含むDNAフラグメントをMaxam及びGilber
t（1980）の方法で配列決定した（第２図）。
DNAを調製し、Sau3Aで部分的に消化した。消化したDNA
をショ糖勾配でサイズ分画し、5kb〜10kbのフラグメン
トを、BamH Iで消化し且つBAPで処理したクローニング
ベクターpUC18に連結した（Yannisch−Perronら、198
5）。このベクターを含む組換え体クローンを、bt13毒
素に対する抗血清でのコロニーイムノプロービングによ
りスクリーニングした（Frenchら、1986）。陽性コロニ
ーを精製し、総タンパク質調製物をBt13毒素に対する抗
血清でのイムノブロッティングによって再分析した。Bt
PGSI245プロトキシンを発現するクローンに由来するBtP
GSI245遺伝子を含むDNAフラグメントをMaxam及びGilber
t（1980）の方法で配列決定した（第２図）。
btPGSI245遺伝子のDNA配列の分析に基づいてこの遺伝
子を適当な制限酵素で切断し、約66kDaのBtPGSI245毒素
をコードする切断btPGSI245遺伝子を得た。
子を適当な制限酵素で切断し、約66kDaのBtPGSI245毒素
をコードする切断btPGSI245遺伝子を得た。
実施例6:btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子及びbtPGSI
245−neoハイブリッド遺伝子の構築 米国特許出願第821,582号並びに欧州特許出願第88/40
2,115.5号及び第86/300291.1号に記載の方法に従い、そ
れぞれ実施例４及び５で得た切断btPGSI208遺伝子及び
切断btPGSI245遺伝子をneo遺伝子と融合して、対応する
ハイブリッド遺伝子を構築する。
245−neoハイブリッド遺伝子の構築 米国特許出願第821,582号並びに欧州特許出願第88/40
2,115.5号及び第86/300291.1号に記載の方法に従い、そ
れぞれ実施例４及び５で得た切断btPGSI208遺伝子及び
切断btPGSI245遺伝子をneo遺伝子と融合して、対応する
ハイブリッド遺伝子を構築する。
実施例7:btPGSI208遺伝子、btPGSI245遺伝子、切断btPG
SI208遺伝子、切断btPGSI245遺伝子、btPGSI208−neoハ
イブリッド遺伝子及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝
子の大腸菌への挿入、並びに切断btPGSI208遺伝子、切
断btPGSI245遺伝子、btPGSI208−neoハイブリッド遺伝
子及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子のジャガイモ
植物への挿入 btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、実施例４及び５の切
断btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、並びに実施例６のbt
PGSI208−neo及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子の
各々を、Botterman及びZabeau（1987）によって記述さ
れている大腸菌発現ベクターを用いて、通常の方法で、
種々の大腸菌に挿入し発現させる。これらの遺伝子を大
腸菌内及び植物中で発現させるために、種々の遺伝子カ
セットを形成する。BamH I制限部位を特定部位の突然変
異誘発によりbtPGSI208遺伝子のATG開始コドンに導入す
る（Stanssensら、1988;Stanssensら、1989）。btPGSI2
08遺伝子の４番目のヌクレオチドがＡからＧに変化して
唯一のBamH I部位が得られる。「Kozakの法則」（Koza
k,1986）によれば、この突然変異は植物細胞における翻
訳開始も最適化する筈である。このようにして、Asnを
コードするAATコドン（第２コドン）がAspをコードする
GATコドンに変わる。同様にして、Nco IをbtPGSI245遺
伝子のATG翻訳開始コドンに挿入する。
SI208遺伝子、切断btPGSI245遺伝子、btPGSI208−neoハ
イブリッド遺伝子及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝
子の大腸菌への挿入、並びに切断btPGSI208遺伝子、切
断btPGSI245遺伝子、btPGSI208−neoハイブリッド遺伝
子及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子のジャガイモ
植物への挿入 btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、実施例４及び５の切
断btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子、並びに実施例６のbt
PGSI208−neo及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子の
各々を、Botterman及びZabeau（1987）によって記述さ
れている大腸菌発現ベクターを用いて、通常の方法で、
種々の大腸菌に挿入し発現させる。これらの遺伝子を大
腸菌内及び植物中で発現させるために、種々の遺伝子カ
セットを形成する。BamH I制限部位を特定部位の突然変
異誘発によりbtPGSI208遺伝子のATG開始コドンに導入す
る（Stanssensら、1988;Stanssensら、1989）。btPGSI2
08遺伝子の４番目のヌクレオチドがＡからＧに変化して
唯一のBamH I部位が得られる。「Kozakの法則」（Koza
k,1986）によれば、この突然変異は植物細胞における翻
訳開始も最適化する筈である。このようにして、Asnを
コードするAATコドン（第２コドン）がAspをコードする
GATコドンに変わる。同様にして、Nco IをbtPGSI245遺
伝子のATG翻訳開始コドンに挿入する。
大腸菌（btPGSI208遺伝子で形質転換）中で産生され
たBtPGSI208プロトキシンのコロラドハムシ第二齢幼虫
に対する殺虫活性を表６に示す。毒性は50％致死濃度
（μg/ml）で表し、95％信頼範囲及びプロビットライン
のスロープも示した。
たBtPGSI208プロトキシンのコロラドハムシ第二齢幼虫
に対する殺虫活性を表６に示す。毒性は50％致死濃度
（μg/ml）で表し、95％信頼範囲及びプロビットライン
のスロープも示した。
表６ LC50（μg/ml） スロープ 1.0（0.6〜1.8） 2.3 大腸菌中で産生したBtPGSI208プロトキシンの毒性
は、BtPGSI208株によって産生したBtPGSI208プロトキシ
ンの毒性の約５倍以上であった。大腸菌中で産生したBt
PGSI208プロトキシンをトリプシンで消化すると、やは
りコロラドハムシに対して活性のBtPGSI208毒素が得ら
れた。
は、BtPGSI208株によって産生したBtPGSI208プロトキシ
ンの毒性の約５倍以上であった。大腸菌中で産生したBt
PGSI208プロトキシンをトリプシンで消化すると、やは
りコロラドハムシに対して活性のBtPGSI208毒素が得ら
れた。
米国特許出願第821,582号並びに欧州特許出願第86/30
0,291.1号及び第88/402,115.5号に記載の方法を用い
て、切断btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子並びにbtPGSI20
8−neo及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子を単離
し、中間Ｔ−DNAベクターであるpGSH160（Deblaereら、
1988）のＴ−DNA末端ボーダー反復配列の間に挿入す
る。植物中で主要発現が得られるように、前記ハイブリ
ッド遺伝子及び切断遺伝子を強力な構成性プロモーター
であるCabb−JI 35Sプロモーター（Hull及びHowell、19
87）又はTR2'プロモーター（Veltenら、1984）の制御下
におき、オクトピン合成遺伝子（Gielenら、1984）の転
写終結及びポリアデニル化シグナルと融合する。
0,291.1号及び第88/402,115.5号に記載の方法を用い
て、切断btPGSI208及びbtPGSI245遺伝子並びにbtPGSI20
8−neo及びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子を単離
し、中間Ｔ−DNAベクターであるpGSH160（Deblaereら、
1988）のＴ−DNA末端ボーダー反復配列の間に挿入す
る。植物中で主要発現が得られるように、前記ハイブリ
ッド遺伝子及び切断遺伝子を強力な構成性プロモーター
であるCabb−JI 35Sプロモーター（Hull及びHowell、19
87）又はTR2'プロモーター（Veltenら、1984）の制御下
におき、オクトピン合成遺伝子（Gielenら、1984）の転
写終結及びポリアデニル化シグナルと融合する。
標準的な方法（Deblaereら、1985）により、切断btPG
SI208及びbtPGSI245遺伝子並びにbtPGSI208−neo及びbt
PGSI245−neoハイブリッド遺伝子を含む中間植物発現ベ
クターを、攻撃性のないTi−プラスミドpGV2260を担持
するAgrobacterium株C 58 Cl RifR（米国特許出願第82
1,582号、欧州特許出願第86/300,291.1号）に移す。ス
ペクチノマイシン耐性を選択すると、pGV2260とそれぞ
れの中間植物発現ベクターとからなる同時組込み（coin
tegrated）プラスミドが得られる。これらの各組換えAg
robacterium株を用いて、切断btPGSI208遺伝子、切断bt
PGSI245遺伝子、btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子及
びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子が種々のジャガイ
モ植物細胞中に含まれ且つ発現されるように種々のジャ
ガイモ植物（Solanum tuberosum）を形質転換する。
SI208及びbtPGSI245遺伝子並びにbtPGSI208−neo及びbt
PGSI245−neoハイブリッド遺伝子を含む中間植物発現ベ
クターを、攻撃性のないTi−プラスミドpGV2260を担持
するAgrobacterium株C 58 Cl RifR（米国特許出願第82
1,582号、欧州特許出願第86/300,291.1号）に移す。ス
ペクチノマイシン耐性を選択すると、pGV2260とそれぞ
れの中間植物発現ベクターとからなる同時組込み（coin
tegrated）プラスミドが得られる。これらの各組換えAg
robacterium株を用いて、切断btPGSI208遺伝子、切断bt
PGSI245遺伝子、btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子及
びbtPGSI245−neoハイブリッド遺伝子が種々のジャガイ
モ植物細胞中に含まれ且つ発現されるように種々のジャ
ガイモ植物（Solanum tuberosum）を形質転換する。
実施例8:切断btPGSI208遺伝子、切断btPGSI245遺伝子、
btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子及びbtPGSI245−neo
ハイブリッド遺伝子のジャガイモ植物中での発現 実施例７の形質転換ジャガイモ植物細胞から発生した
形質転換ジャガイモ植物の葉における切断btPGSI208及
びbtPGSI245遺伝子並びにbtPGSI208−neo及びbtPGSI245
−neoハイブリッド遺伝子の発現産生物が甲虫類に対し
て示す殺虫活性を、これらの葉で飼育したLeptinotarsa
decemlineata幼虫の成長率及び死亡率を記録すること
によって調べる。その結果を、非形質転換ジャガイモ植
物の葉で飼育した幼虫の成長率と比較する。毒性アッセ
イは欧州特許出願第88/402,115.5号、米国特許出願第82
1,582号及び欧州特許出願第86/300,291.1号に記載のよ
うに実施する。切断btPGSI208遺伝子、切断btPGSI245遺
伝子、btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子又はbtPGSI24
5−neoハイブリッド遺伝子を含む形質転換ジャガイモ植
物の葉で飼育した幼虫の死亡率は、非形質転換植物の葉
で飼育した幼虫の死亡率よりかなり高い。
btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子及びbtPGSI245−neo
ハイブリッド遺伝子のジャガイモ植物中での発現 実施例７の形質転換ジャガイモ植物細胞から発生した
形質転換ジャガイモ植物の葉における切断btPGSI208及
びbtPGSI245遺伝子並びにbtPGSI208−neo及びbtPGSI245
−neoハイブリッド遺伝子の発現産生物が甲虫類に対し
て示す殺虫活性を、これらの葉で飼育したLeptinotarsa
decemlineata幼虫の成長率及び死亡率を記録すること
によって調べる。その結果を、非形質転換ジャガイモ植
物の葉で飼育した幼虫の成長率と比較する。毒性アッセ
イは欧州特許出願第88/402,115.5号、米国特許出願第82
1,582号及び欧州特許出願第86/300,291.1号に記載のよ
うに実施する。切断btPGSI208遺伝子、切断btPGSI245遺
伝子、btPGSI208−neoハイブリッド遺伝子又はbtPGSI24
5−neoハイブリッド遺伝子を含む形質転換ジャガイモ植
物の葉で飼育した幼虫の死亡率は、非形質転換植物の葉
で飼育した幼虫の死亡率よりかなり高い。
実施例9:内因性btPGSI208遺伝子によるBt株の形質転換 殺虫スペクトルを向上させるべく、BtS174A株（Mahil
lonら、1989）をプラスミドpAMbt21R1を用いてエレクト
ロポレーションにかける。pAMbt21R1は、プラスミドpJL
21の5.4kbのHpa IフラグメントをシャトルベクターpAM4
01（Wirthら、1987）のテトラサイクリン耐性遺伝子のE
coR V部位にクローニングすることによって得られる。
プラスミドpJL21は、BtPGSI208株に由来するbtPGSI208
遺伝子を含む6kbフラグメントをプラスミドpEcoR251（D
SM受託番号4711）のBgl II部位にクローニングすること
によって得られる。
lonら、1989）をプラスミドpAMbt21R1を用いてエレクト
ロポレーションにかける。pAMbt21R1は、プラスミドpJL
21の5.4kbのHpa IフラグメントをシャトルベクターpAM4
01（Wirthら、1987）のテトラサイクリン耐性遺伝子のE
coR V部位にクローニングすることによって得られる。
プラスミドpJL21は、BtPGSI208株に由来するbtPGSI208
遺伝子を含む6kbフラグメントをプラスミドpEcoR251（D
SM受託番号4711）のBgl II部位にクローニングすること
によって得られる。
エレクトロポレーションはPCT特許出願PCT/EP89/0153
9号に記載の方法で行う。pAMbt21R1で形質転換したBtS1
74A株は鱗翅類に対する殺虫活性を保持し、株内でのbtP
GSI208遺伝子の発現に起因して新たに獲得した対甲虫類
殺虫活性を示す。
9号に記載の方法で行う。pAMbt21R1で形質転換したBtS1
74A株は鱗翅類に対する殺虫活性を保持し、株内でのbtP
GSI208遺伝子の発現に起因して新たに獲得した対甲虫類
殺虫活性を示す。
言うまでもなく、本発明はBtPGSI208（DSM5131）株及
びBtPGSI245（DSM5132）株には限定されない。本発明の
範囲には、BtPGSI208又はBtPGSI245結晶、結晶タンパク
質、プロトキシン又は毒素と実質的に同じ性質を有する
結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又は毒素を産生す
る任意のBtPGSI208又はBtPGSI245株突然変異体又は変株
が含まれる。ちなみに、BtPGSI208株及びBtPGSI245株の
変株は、総タンパク質パターンが第３図に示すBtPGSI20
8株又はBtPGSI245株のタンパク質パターンと実質的に同
じである変株を含む。
びBtPGSI245（DSM5132）株には限定されない。本発明の
範囲には、BtPGSI208又はBtPGSI245結晶、結晶タンパク
質、プロトキシン又は毒素と実質的に同じ性質を有する
結晶、結晶タンパク質、プロトキシン又は毒素を産生す
る任意のBtPGSI208又はBtPGSI245株突然変異体又は変株
が含まれる。ちなみに、BtPGSI208株及びBtPGSI245株の
変株は、総タンパク質パターンが第３図に示すBtPGSI20
8株又はBtPGSI245株のタンパク質パターンと実質的に同
じである変株を含む。
本発明は切断btPGSI208遺伝子又は切断btPGSI245遺伝
子で形質転換したジャガイモ植物には限定されない。本
発明の範囲には、トマト、タバコ、菜種、アルファルフ
ァ、ヒマワリ、木綿、コーン、大豆、アブラナ、テンサ
イその他の野菜のような任意の植物をbtPGSI208遺伝子
又はbtPGSI245遺伝子の殺虫効果部分で形質転換したも
のが含まれる。
子で形質転換したジャガイモ植物には限定されない。本
発明の範囲には、トマト、タバコ、菜種、アルファルフ
ァ、ヒマワリ、木綿、コーン、大豆、アブラナ、テンサ
イその他の野菜のような任意の植物をbtPGSI208遺伝子
又はbtPGSI245遺伝子の殺虫効果部分で形質転換したも
のが含まれる。
本発明はまた、殺虫効果のあるbtPGSI208又はbtPGSI2
45遺伝子部分での植物細胞の形質転換におけるAgrobact
erium tumefaciens Ti−プラミドの使用にも限定されな
い。他の公知の植物細胞形質転換方法、例えばリポソー
ムを用いる方法、エレクトロポレーションによる方法又
は植物ウイルスもしくは花粉をベースとするベクターシ
ステムを用いる方法も、このような遺伝子部分での単子
葉植物及び双子葉植物の形質転換に使用できる。
45遺伝子部分での植物細胞の形質転換におけるAgrobact
erium tumefaciens Ti−プラミドの使用にも限定されな
い。他の公知の植物細胞形質転換方法、例えばリポソー
ムを用いる方法、エレクトロポレーションによる方法又
は植物ウイルスもしくは花粉をベースとするベクターシ
ステムを用いる方法も、このような遺伝子部分での単子
葉植物及び双子葉植物の形質転換に使用できる。
また、btPGSI208遺伝子及び切断btPGSI208遺伝子につ
いて第１図に示し且つbtPGSI245遺伝子及び切断btPGSI2
45遺伝子について第２図に示したようなDNA配列以外のD
NA配列も植物及び細菌の形質転換に使用できる。ちなみ
に、第１図又は第２図のDNA配列は、１）或るコドンを
同じアミノ酸又は別のアミノ酸をコードする別のコドン
で置換し、及び／又は２）幾つかのコドンを除去もしく
は添加することによって修飾できる。但し、この種の修
飾はBtPGSI208もしくはBtPGSI245プロトキシン又は毒素
のコードされた殺虫効果を有する部分の性質を変化させ
るようなものであってはならない。
いて第１図に示し且つbtPGSI245遺伝子及び切断btPGSI2
45遺伝子について第２図に示したようなDNA配列以外のD
NA配列も植物及び細菌の形質転換に使用できる。ちなみ
に、第１図又は第２図のDNA配列は、１）或るコドンを
同じアミノ酸又は別のアミノ酸をコードする別のコドン
で置換し、及び／又は２）幾つかのコドンを除去もしく
は添加することによって修飾できる。但し、この種の修
飾はBtPGSI208もしくはBtPGSI245プロトキシン又は毒素
のコードされた殺虫効果を有する部分の性質を変化させ
るようなものであってはならない。
前述のDNA配列を他の外来DNA、特に植物及び大腸菌以
外の微生物の形質転換に適したベクターのDNAと組合わ
せて含む他のDNA組換え体も本発明の範囲内に含まれ
る。ちなみに、本発明は前述したbtPGSI208及びbtPGSI2
45遺伝子又はその一部分を含む特定のプラスミドには限
定されず、これらと等価のDNA配列を含む任意のDNA組換
え体を包含する。本発明はまた、btPGSI208遺伝子又はb
tPGSI245遺伝子の全体又は一部分を含むDNA組換え体で
あって、微生物（例えば植物に関係のあるBacillus sub
tilis、Pseudomonas及びXanthomonasのような細菌又はS
treptomyces cerevisiaeのような酵母）を、遺伝子の
全体もしくは一部分を発現させ得ると共に前記微生物か
ら回収するかあるいは植物細胞に移すことができる条件
下で、形質転換するのに適している総てのDNA組換え体
に係わる。
外の微生物の形質転換に適したベクターのDNAと組合わ
せて含む他のDNA組換え体も本発明の範囲内に含まれ
る。ちなみに、本発明は前述したbtPGSI208及びbtPGSI2
45遺伝子又はその一部分を含む特定のプラスミドには限
定されず、これらと等価のDNA配列を含む任意のDNA組換
え体を包含する。本発明はまた、btPGSI208遺伝子又はb
tPGSI245遺伝子の全体又は一部分を含むDNA組換え体で
あって、微生物（例えば植物に関係のあるBacillus sub
tilis、Pseudomonas及びXanthomonasのような細菌又はS
treptomyces cerevisiaeのような酵母）を、遺伝子の
全体もしくは一部分を発現させ得ると共に前記微生物か
ら回収するかあるいは植物細胞に移すことができる条件
下で、形質転換するのに適している総てのDNA組換え体
に係わる。
下記の文献は明細書に引用されたものである： − Botterman and Zabeau,DNA ６,583−591（1987） − Deblaere,R.,Bijtebier,B.De Greve,H.,Debock,F.,
Schell,J.,Van Montagu,M.and Leemans,J.,Nucleic Aci
ds Research 13,4777−4788（1985）． − Deblaere,R.,Reynaerts A.,Hfte H.,Hernalsteen
s J.−P.,Leemans J.and Van Montagu M.,Methods in E
nzymology 153,277−292（1988）． − Dulmage,H.T.,“Production of Bacteria for Biol
ogical Control of Incects"in Biological Control in
Crop Production,Ed.Paparizas,D.C.,Osmun Publisher
s,Totowa,N.J.,USA,pp.129−141（1981）． − Ellar,D.J.,Knowles,B.H.,Drobniewski,S.A.and Ha
ider,M.Z.,in “Fundamental and Applied aspects of
Invertebrate Pathology".Ed.Samson,R.A.,Vlak,J.M.an
d Peters,D.（1986）pp.7−10.Wageningen,Foundation
of the fourth International Colloqium of Invertebr
ate Pathology. − Engvall and Pesce,Scand.Immunol.Suppl.7（197
8） − Finney,Probit Analysis,3rd Edition,Cambridge
University Press（1971） − Franck,Guilley,Jonard,Richards and Hirth,Cell
21,285−294（1980） − French,B.T.,Maul,H.N.and Maul,G.G.,Anal.Bioche
m.156,417423（1986） − Gardner,Howarth,Hahn,Brown−Luedi,Shepard and
Messing,Nucleic Acids Research ９,2871−2887（198
1） − Gielen,J.,De Beukeleer,M.,Seurinck,J.,Deboeck,
F.,De Greve,H.,Lemmers,M.,Van Montagu,M.and Schel
l,J.,EMBO J ３,835−845（1984）． − Goldberg,R.B.,Science 240,1460−1467（1988） − Ｈfte H.,De Greve,H.,Seurinch,J.,Jansens,S.,
Mahillon,J.,Ampe,Vandekerckhove,J,Vanderbruggen,
H.,Van Montagu,M.,Zabeau,M.and Vaeck,M.,Eur.J.Bioc
hem.161,273−280（1986） − Ｈfte H.,Seurinck,J.,Van Houtven A.and Vaec
k,M.,Nucleic Acids Research 15,7183（1987） − Ｈfte H.,Dissertation thesis at the State Un
iversity of Ghent,Belgium（1988）． − Ｈfte H.,Van Rie,J.,Jansens,S.,Van Houtven,
A.,Verbruggen,H.and Vaeck,M.,Applied and Environme
ntal Microbiology 54,2010−2017（1988） − Ｈfte H.and Whiteley H.R.,Microbiological Re
view 53,242−255（1989）． − Hull and Howell,Virology 86,482−493（1987） − Kozak M.,Cell 44,283−292（1986）． − Kuhlemeier,Green and Chua,Ann.Rev.Plant Physio
l.38,221−257（1987） − Laemmli V.,Nature 227,680−685（1970） − Lambert,B.,Leyns,F.,Van Rooyen,L.,Gossel,F.,
Papon,Y.and Swings,J.Applied and Environmental Mic
robiology 53,1866−1871（1987） − Mahillon,J.and Delcour,J.,J.Microbiol.Methods
３,69−73（1984） − Mahillon et al.FEMS Microbiology Letters 60,20
5−210（1989） − Maxam,A.M.and Gilbert,W.,Methods in Enzymol.6
5,499−560（1980）． − Odell,J.T.,Nagy,J.,and Chua,N.,Nature 313,810
−812（1985）． − Peferoen,M.in Methods in Molecular Biology,vo
l.3:New Protein Techniques,p.395−402,Ed.John M.Wa
lker,Humana Press（1988）． − Reiss,B.,Sprengel,R.,Will,H.and Schaller,H.,Ge
ne 30,217−223（1984） − Sneath,P.,Mair,N.,Sharpe,M.and Holt,J.,（198
6）in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,V
ol.2,pp.1104−1139.Eds.Williams and Wilkins,Baltim
ore,London. − Stanssens P.,McKeown Y.,Friedrich K.and Fritz
H.J.（1988），“Oligonucleotide−directed constru
ction of mutations by the gapped duplex DNA metho
d using the pMA/c plasmid vectors",published in th
e collection of additional experimental procedures
distributed at the EMBO laboratory course on “Di
rected mutagenesis and protein engineering"in July
1987 at the Max Planck Institute fr Biochemie,M
artinsried,Federal Republic of Germany. − Stanssens P.,Opsomer C.,McKeown Y.,Kramer W.,Z
abeau M.and Fritz H.J.,Nucleic Acids Research 12,4
441−4454（1989）． − Sutherland,M.W.and Skerritt,J.M.,Electrophores
is,７,401−406（1986） − Vaeck,M.,Reynaerts,A.,Hfte H.,Jansens,S.,De
Beuckeleer,M.,Dean,C.,Zabeau,M.,Van Montagu,M.and
Leemans,J.,Nature 327,33−37（1987）． − Velten,J.,Velten,L.,Hain,R.and Schell,J.,EMBO
J ３,2723−2730（1984）． − Velten,J.and Schell,J.Nucleic Acids Research 1
3,6981−6998（1985） − Wirth,R.,An,F.and Clewell,D.B.in“Streptococcu
s Genetics"（Ferreti J.J.and Curtiss III,R.,ed
s.）,pp.25−27,American Society for Microbiology,W
ashington D.C.（1987）． − Yannisch−Perron,C.,Vierra,J.and Messing,J.,Ge
ne 33,103−119（1985）．
Schell,J.,Van Montagu,M.and Leemans,J.,Nucleic Aci
ds Research 13,4777−4788（1985）． − Deblaere,R.,Reynaerts A.,Hfte H.,Hernalsteen
s J.−P.,Leemans J.and Van Montagu M.,Methods in E
nzymology 153,277−292（1988）． − Dulmage,H.T.,“Production of Bacteria for Biol
ogical Control of Incects"in Biological Control in
Crop Production,Ed.Paparizas,D.C.,Osmun Publisher
s,Totowa,N.J.,USA,pp.129−141（1981）． − Ellar,D.J.,Knowles,B.H.,Drobniewski,S.A.and Ha
ider,M.Z.,in “Fundamental and Applied aspects of
Invertebrate Pathology".Ed.Samson,R.A.,Vlak,J.M.an
d Peters,D.（1986）pp.7−10.Wageningen,Foundation
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8） − Finney,Probit Analysis,3rd Edition,Cambridge
University Press（1971） − Franck,Guilley,Jonard,Richards and Hirth,Cell
21,285−294（1980） − French,B.T.,Maul,H.N.and Maul,G.G.,Anal.Bioche
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Messing,Nucleic Acids Research ９,2871−2887（198
1） − Gielen,J.,De Beukeleer,M.,Seurinck,J.,Deboeck,
F.,De Greve,H.,Lemmers,M.,Van Montagu,M.and Schel
l,J.,EMBO J ３,835−845（1984）． − Goldberg,R.B.,Science 240,1460−1467（1988） − Ｈfte H.,De Greve,H.,Seurinch,J.,Jansens,S.,
Mahillon,J.,Ampe,Vandekerckhove,J,Vanderbruggen,
H.,Van Montagu,M.,Zabeau,M.and Vaeck,M.,Eur.J.Bioc
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k,M.,Nucleic Acids Research 15,7183（1987） − Ｈfte H.,Dissertation thesis at the State Un
iversity of Ghent,Belgium（1988）． − Ｈfte H.,Van Rie,J.,Jansens,S.,Van Houtven,
A.,Verbruggen,H.and Vaeck,M.,Applied and Environme
ntal Microbiology 54,2010−2017（1988） − Ｈfte H.and Whiteley H.R.,Microbiological Re
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l.38,221−257（1987） − Laemmli V.,Nature 227,680−685（1970） − Lambert,B.,Leyns,F.,Van Rooyen,L.,Gossel,F.,
Papon,Y.and Swings,J.Applied and Environmental Mic
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３,69−73（1984） − Mahillon et al.FEMS Microbiology Letters 60,20
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5,499−560（1980）． − Odell,J.T.,Nagy,J.,and Chua,N.,Nature 313,810
−812（1985）． − Peferoen,M.in Methods in Molecular Biology,vo
l.3:New Protein Techniques,p.395−402,Ed.John M.Wa
lker,Humana Press（1988）． − Reiss,B.,Sprengel,R.,Will,H.and Schaller,H.,Ge
ne 30,217−223（1984） − Sneath,P.,Mair,N.,Sharpe,M.and Holt,J.,（198
6）in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology,V
ol.2,pp.1104−1139.Eds.Williams and Wilkins,Baltim
ore,London. − Stanssens P.,McKeown Y.,Friedrich K.and Fritz
H.J.（1988），“Oligonucleotide−directed constru
ction of mutations by the gapped duplex DNA metho
d using the pMA/c plasmid vectors",published in th
e collection of additional experimental procedures
distributed at the EMBO laboratory course on “Di
rected mutagenesis and protein engineering"in July
1987 at the Max Planck Institute fr Biochemie,M
artinsried,Federal Republic of Germany. − Stanssens P.,Opsomer C.,McKeown Y.,Kramer W.,Z
abeau M.and Fritz H.J.,Nucleic Acids Research 12,4
441−4454（1989）． − Sutherland,M.W.and Skerritt,J.M.,Electrophores
is,７,401−406（1986） − Vaeck,M.,Reynaerts,A.,Hfte H.,Jansens,S.,De
Beuckeleer,M.,Dean,C.,Zabeau,M.,Van Montagu,M.and
Leemans,J.,Nature 327,33−37（1987）． − Velten,J.,Velten,L.,Hain,R.and Schell,J.,EMBO
J ３,2723−2730（1984）． − Velten,J.and Schell,J.Nucleic Acids Research 1
3,6981−6998（1985） − Wirth,R.,An,F.and Clewell,D.B.in“Streptococcu
s Genetics"（Ferreti J.J.and Curtiss III,R.,ed
s.）,pp.25−27,American Society for Microbiology,W
ashington D.C.（1987）． − Yannisch−Perron,C.,Vierra,J.and Messing,J.,Ge
ne 33,103−119（1985）．
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 15/09 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ヨース，ヘンク ベルギー国、9880・アールテル、オース トモレン・ズイト・５ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/325 A01H 5/00 A01N 63/00 A01N 63/02 C12N 1/21 C12N 5/10 C12N 15/09 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (23)
- 【請求項１】下記のアミノ酸配列を含む、殺虫活性を有
するタンパク質又はその殺虫効果部分 【化１】 - 【請求項２】下記のアミノ酸位置１〜637のアミノ酸配
列を含む、殺虫活性を有するタンパク質。 【化２】 - 【請求項３】下記のアミノ酸位置53〜637のアミノ酸配
列を含む、殺虫活性を有するタンパク質。 【化３】 - 【請求項４】請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク
質をコードするDNA。 - 【請求項５】下記のヌクレオチド位置184〜2094、又は1
84〜3597のDNAを含むDNA。 【化４】 - 【請求項６】植物細胞での転写に適当なプロモーターの
制御下に、請求項４又は５に記載のDNAを含むキメラ遺
伝子。 - 【請求項７】請求項６に記載のキメラ遺伝子を含む形質
転換植物細胞。 - 【請求項８】請求項６に記載のキメラ遺伝子を含む形質
転換双子葉植物。 - 【請求項９】請求項６に記載のキメラ遺伝子を含む双子
葉植物種子。 - 【請求項１０】請求項６に記載のキメラ遺伝子を植物に
付与することを含む、双子葉植物を甲虫類耐性にする方
法。 - 【請求項１１】請求項６に記載のキメラ遺伝子で植物細
胞を安定に形質転換し、該植物細胞から植物を再生し、
該植物を生物的に複製することを含む、甲虫類に耐性な
双子葉植物の産生方法。 - 【請求項１２】請求項４又は５に記載のDNAを含む、形
質転換微生物。 - 【請求項１３】バチルス・チュリンギエンシスである、
請求項12に記載の形質転換微生物。 - 【請求項１４】選択可能マーカーとの融合タンパク質の
一部である、請求項１〜３のいずれかに記載のタンパク
質。 - 【請求項１５】殺虫活性タンパク質BtPGSI245を産生す
る、DSM寄託番号5132の単離バチルス・チュリンギエン
シス株。 - 【請求項１６】請求項15に記載の細菌株の結晶−胞子混
合物。 - 【請求項１７】請求項15に記載の細菌株又は請求項16に
記載の結晶−胞子混合物を含む、甲虫類に活性を有する
殺虫剤組成物。 - 【請求項１８】請求項17に記載の殺虫剤組成物を、甲虫
類害虫と接触させることを含む、該害虫を防除する方
法。 - 【請求項１９】甲虫類害虫が、Leptinotarsa decemline
ataであることを特徴とする請求項18に記載の方法。 - 【請求項２０】請求項１〜３のいずれかに記載のタンパ
ク質を含む、甲虫類に活性を有する殺虫剤組成物。 - 【請求項２１】請求項６に記載のキメラ遺伝子を含む植
物であり、ジャガイモ、トマト、タバコ、菜種、アルフ
ァルファ、ヒマワリ、コーン、綿、大豆、アブラナおよ
びテンサイから成る群より選択されることを特徴とする
植物。 - 【請求項２２】請求項６に記載のキメラ遺伝子を含む請
求項21に記載の植物の種子。 - 【請求項２３】請求項６に記載のキメラ遺伝子を植物に
付与することを含む、植物を甲虫類耐性にする方法であ
って、植物がジャガイモ、トマト、タバコ、菜種、アル
ファルファ、ヒマワリ、コーン、綿、大豆、アブラナお
よびテンサイから成る群より選択される方法。
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|---|---|---|---|
| EP89400428A EP0382990A1 (en) | 1989-02-15 | 1989-02-15 | Strains of bacillus thuringiensis |
| EP89400428.2 | 1989-02-15 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP50296590A Expired - Fee Related JP3260139B2 (ja) | 1989-02-15 | 1990-02-14 | バチルスチュリンギエンシスの殺虫毒素を産生するように形質転換した植物 |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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| US5187091A (en) * | 1990-03-20 | 1993-02-16 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryiiic gene encoding toxic to coleopteran insects |
| DK73890D0 (da) * | 1990-03-22 | 1990-03-22 | Novo Nordisk As | Pesticid |
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| US5264364A (en) * | 1991-01-31 | 1993-11-23 | Ecogen Inc. | Bacillus thuringiensis cryIIIc(B) toxin gene and protein toxic to coleopteran insects |
| US5204100A (en) * | 1991-02-01 | 1993-04-20 | Ciba-Geigy Corporation | Baciullus thuringiensis strains active against coleopteran insects |
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