JPH08224085A - 植物細胞の選択方法およびそれを利用した植物の再生方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 植物細胞の選択方法およびそれを利用した成
熟植物の再生方法を提供する。 【解決手段】 ５'側にある植物発現プロモーター配
列、３'側にあるターミネータ信号配列、およびその間
に位置しているハイグロマイシン・ホスホトランスフェ
ラーゼをコードする遺伝子の暗号領域からなり、植物細
胞内での該暗号領域の発現により該植物にハイグロマイ
シン耐性を与え、その耐性により該植物細胞の選択を可
能にする植物細胞において機能的なキメラ遺伝子をハイ
グロマイシン−感受性の植物細胞中に挿入し、該植物細
胞をハイグロマイシンに曝してハイグロマイシン耐性細
胞を増殖させることによって、ハイグロマイシン耐性を
発現している細胞を選択することからなる、ハイグロマ
イシン耐性の組み換えＤＮＡを含有している植物細胞を
選択する方法、ならびに該選択した細胞を培養すること
からなる成熟植物の再生方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は植物細胞の選択方法
およびそれを利用した植物の再生方法、さらに詳しく
は、植物中で機能的であり、かつ形質転換した植物の選
別が可能な組み換えＤＮＡ発現ベクターを用いて植物細
胞を選択する方法、およびその選択された細胞を培養し
て植物を再生する方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】アグ
ロバクテリウム・チュメファシエンス(Ａgrobacterium
tumefaciens)による双子葉植物のクラウンゴールの形
成は、植物細胞の染色体ＤＮＡ中に、腫瘍誘発性プラス
ミド(Ｔiプラスミド)のトランスファーＤＮＡ(Ｔ−ＤＮ
Ａ)と呼ばれる小さいセグメントが、転移し、共有結合
的に組み込まれることに起因する。転移したＴ−ＤＮＡ
は植物細胞中で発現することができ、これは、いくつか
のポリアデニル化された転写体(転写物)をコードしてい
る。転写体のあるものは、オパイン合成、および腫瘍増
殖に関与していることが知られている。この後者の転写
体は腫瘍遺伝子によってコードされているものである。
これらの転写体のどれも、Ｔ−ＤＮＡの転移にとって必
須ではないことがわかっている。転移機構は、Ｔ−ＤＮ
Ａの境界近くに存在する、繰り返しのヌクレオチド配列
に関係していると考えられている。このような境界が存
在する限り、外来性遺伝子をＴiプラスミドのＴ−ＤＮ
Ａに挿入し、そのことによって、該遺伝子を腫瘍細胞ま
たは再生された植物のゲノムに導入することができる。

【０００３】Ｔ−ＤＮＡ配列に加えて、ＶＩＲビルレン
ス領域と呼ばれ、Ｔ−ＤＮＡの外側に位置する、別のＴ
iプラスミド遺伝子群が、Ｔ−ＤＮＡの細菌から植物細
胞への移動において、ある役割を果たしていると一般に
考えられている。これまでは、Ｔ−ＤＮＡとＶＩＲ領域
の両方を有するアグロバクテリウムに感染した植物上に
クラウンゴールが存在することが、形質転換した植物細
胞を同定するための基本的手段であった。しかし、機能
的な腫瘍遺伝子を含有するクラウンゴールからは植物全
体を再生することができないため、この同定方法は商業
的利用価値を制限するものであった。従って、形質転換
した植物細胞を選択し、同定するのに腫瘍遺伝子にたよ
ることなく、植物細胞中に外来性遺伝子を導入し、これ
を発現させる方法を開発することは有用なことである。

【０００４】現在、成功率は異なるが、植物細胞にＤＮ
Ａを導入するために種々の方法を利用することができ
る。このような方法には、１またはそれ以上のＤＮＡ分
子をカプセル化するためにリポソームを使用する方法、
植物細胞とＤＮＡ(多価陽イオン性物質またはリン酸カ
ルシウムのいずれかとコンプレックスを形成しているＤ
ＮＡ)とを接触させる方法、およびプロトプラスト融合
法が含まれる。現在、目的の遺伝子を植物細胞へ転移さ
せるための好ましい方法は、アグロバクテリウム細胞の
Ｔiプラスミドを利用する技術である。最近では、モン
サント社(Ｍonsanto Ｃompany)の研究者により、植物
細胞を形質転換するのに共(同時)−組み込みＴiプラス
ミドの利用が可能であることが証明された[フレーリー
およびロジャース(Ｆraley and Ｒogers),ＰＣＴ出願
ＷＯ ８４／０２１９を参照]。さらに、ホエケマ等[Ｈo
ekema ら、ネイチャー(Ｎature),３０３,１７９頁,１
９８３]が開発した、Ｔiバイナリー(２成分)ベクター系
が当分野で知られている。

【０００５】前記Ｔiプラスミド由来のＴ−ＤＮＡ領域
を、機能的な植物の発現機構の制御下にある目的の遺伝
子を挿入するのに利用できる。そのようなキメラ遺伝子
は、植物および細菌の両方に由来するポリペプタイドを
発現することが、当分野で知られている。本発明以前に
は、植物の構造遺伝子の一部または全体と融合させた異
種の遺伝子により、キメラタンパクが、植物細胞の中で
発現されたことはなかった。本発明のベクター構築物
は、そのようなキメラタンパクの生成を提供するもので
あり、従って、植物における形質転換系の継続的な開発
に寄与するものである。

【０００６】

【発明を解決するための手段】細菌および哺乳動物の細
胞において明らかにされたように、効果的な形質転換系
の開発における基本段階の１つは、有力な選択可能なマ
ーカーを組み立てることである。この様なマーカーは、
形質転換により新しい遺伝子を獲得した細胞の、選択お
よび同定を可能にするものである。本発明によれば、ア
ミノサイクリトール抗生物質であるハイグロマイシンＢ
が、形質転換した植物細胞の選択物質となり得る新規な
発現ベクターが提供され、それを用いることにより植物
細胞を選択することができる。

【０００７】すなわち、本発明は、非形質転換細胞を含
有する系から形質転換した植物細胞を選択する方法を提
供するものである。この方法によれば、本発明のベクタ
ーに非選択性のＤＮＡを付加し、この修飾されたベクタ
ーで植物細胞を形質転換し、そして、その様にしなけれ
ば選択不能であるＤＮＡを含有しているハイグロマイシ
ン耐性の形質転換体を選択することができる。形質転換
は非常に低い確率で起こる現象であるため、数百万の細
胞の中でどの細胞が形質転換を行なうＤＮＡを獲得した
かを特定するために、このような機能試験が実際上必要
となる。

【０００８】本明細書で使用する用語について、以下に
説明する。組み換えＤＮＡクローニングベクター １またはそれ以上の余分のＤＮＡセグメントを付加する
ことができる、あるいは既に付加されているＤＮＡ分子
からなる、自律的に複製可能なあらゆる物質を指し、プ
ラスミドを含むが、それに限定されない。組み換えＤＮＡ発現ベクター １またはそれ以上の転写および翻訳活性化配列が挿入さ
れている組み換えＤＮＡクローニングベクター。アミノ末端領域−暗号配列 その部分でポリペプタイドへの翻訳が開始され、かつ、
その部分からポリペプタイドのアミノ末端部分が翻訳さ
れる様なmＲＮＡの部分をコードしているＤＮＡ領域。キメラタンパク プロモーターおよびホモローガスな(同種の)暗号領域の
一部を含有する遺伝子によってコードされているＲＮＡ
から翻訳された、回収可能な、ヘテロローガス(異種の)
ポリペプタイド。境界配列 Ｔ−ＤＮＡの末端を含有するＤＮＡ配列。広範囲宿主(広宿主域)レプリコン 多種多様の細菌細胞に転移され、保持され得るＤＮＡ分
子。接合(コンジュゲーション) 細胞同士を接触させ、ある種の細菌から他種の細菌へ、
ＤＮＡを転移させる操作。クラウンゴール アグロバクテリウム・チュメファシエンスによって誘発
される植物腫瘍。Ｔiプラスミド アグロバクテリウムが有する大きいプラスミドであっ
て、細菌との接合を促し、腫瘍誘発能を付与するプラス
ミド。マイクロ−Ｔiプラスミド アグロバクテリウム中で複製可能で、Ｔ−ＤＮＡ境界で
側面を接しているＤＮＡを含有するプラスミド。非腫瘍性遺伝子株 ＶＩＲ機能は保持しているが、クラウンゴールを誘発す
ることができないアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株。形質転換 受容宿主細胞にＤＮＡを導入して受容細胞の遺伝型を変
化させ、その結果表現型を変化させること。

【０００９】本発明は、機能的、かつ選択可能なマイク
ロＴiプラスミドを開示するものである。すなわち、５'
側のオクトピン・シンセターゼ(ＯＣＳ)のプロモーター
およびこれに結合するアミノ末端領域−暗号化配列遺伝
子と、３'側のノパリン・シンセターゼ遺伝子のターミ
ネータ配列との間に、大腸菌のハイグロマイシン・ホス
ホトランスフェラーゼ(aphＩＶ)遺伝子を挿入した。本
発明のマイクロ−Ｔiプラスミドを組み立てるために、
広範囲宿主ベクター中のＴ−ＤＮＡ境界フラグメント
(複数)の間に、この様な構造を組み立てた。

【００１０】本発明は、ハイグロマイシン耐性の植物細
胞を作成し、得られた細胞を選択するための方法であっ
て、 a)ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコー
ドしている遺伝子を含有している本発明の組み換えＤＮ
Ａ発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス株を、植物または植物挿木(切り枝)に接種
し、 b)ハイグロマイシン耐性の選択条件下で、該ベクターに
よって形質転換された植物細胞を選択することからなる
方法を提供するものである。

【００１１】図１はプラスミドpＣＥＬ３０の制限部位
および機能地図を示す。図２はプラスミドpＣＥＬ４０
の制限部位および機能地図を示す。図３はプラスミドp
ＣＥＬ４４の制限部位および機能地図を示す。

【００１２】

【発明の実施の形態】本発明は、植物中で機能的であ
り、かつ選択可能な組み換えＤＮＡ発現ベクターであっ
て: １)転移−ＤＮＡの境界配列で側面を限られている、プ
ロモーターおよびこれに結合したアミノ末端領域−暗号
化配列、およびターミネータ信号配列を含んでいる転写
単位(ここに、これらの配列は、植物細胞中で天然に発
現される１またはそれ以上の遺伝子から導かれたもので
ある); ２)前記プロモーターおよびこれに結合するアミノ末端
領域−暗号化配列と、前記ターミネータ配列の間に位置
する抗生物質耐性遺伝子−暗号化配列；および、 ３)アグロバクテリウム中で機能的なレプリコンを含有
するＤＮＡフラグメント、からなる組み換えＤＮＡ発現
ベクターを開示するものである。

【００１３】本発明においては、中間体クローニングベ
クターであるプラスミドpＣＥＬ３０の特異な(単一の)
Ｂgl ＩＩ制限部位に、ハイグロマイシン・ホスホトラ
ンスフェラーゼをコードしている〜１.３kb ＢamＨ Ｉ
−Ｂgl ＩＩフラグメントを、２つの方向性で導入し
た。プラスミドpＣＥＬ３０は、プロモーター転写信号
(シグナル)およびocs遺伝子の最初の１１アミノ酸の暗
号配列を持っている。ハイグロマイシン・ホスホトラン
スフェラーゼ(aph ＩＶ)をコードしている遺伝子の導入
は、(ocs)暗号領域の読み枠を保持するようにして行な
う。このようにして、pＣＥＬ３０のＢgl ＩＩ部位にap
h ＩＶ遺伝子をサブクローンすると、この特定の配列の
ためにocsの開始コドン付近にＢgl ＩＩ−ＢamＨ Ｉ融
合体が生じる。得られたベクター、プラスミドpＣＥＬ
４０はocs−aph ＩＶ融合タンパクをコードしている。a
ph ＩＶ遺伝子を反対の方向で挿入した時には、ハイグ
ロマイシン・ホスホトランスフェラーゼは生成しなかっ
た。pＣＥＬ３０およびpＣＥＬ４０それぞれの制限部位
および機能地図を、添付の図１および図２に示す。

【００１４】プラスミドpＣＥＬ３０は、Ｅ. coli Ｋ
１２ ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ３０から常法通り単離
できる[この菌株はノーザン・リージョナル・リサーチ
・ラボラトリー,ペオリア,イリノイス(Ｎorthern Ｒeg
ional Ｒesearch Ｌaboratory,Ｐeoria,Ｉllinois)６
１６０４に寄託され、その一部を構成している]。ハイ
グロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子の原料
であるプラスミドpＯＷ２０もまたＮＲＲＬに寄託され
ているＥ． coli ＪＡ２２１／pＯＷ２０から容易に単
離できる。両株はそれぞれ寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５
９１５およびＮＲＲＬ Ｂ−１５８３８の下、プラスミ
ドの好ましい供給源および貯蔵体として、誰でも利用で
きる。

【００１５】プラスミドpＣＥＬ４０はアグロバクテリ
ウム中で複製することができないので、まず、プラスミ
ドpＣＥＬ４０のマイクロＴ−ＤＮＡを、〜１１.８kb
ＥcoＲＩフラグメントとして、広範囲宿主ベクターpＫ
Ｔ２１０に転移させた。この宿主ベクターは、ザ・プラ
スミド・リファレンス・センター，スタンフォード・ユ
ニバーシティ，パロ・アルト,カリフォルニア９４３０
５(the Ｐlasmids Ｒeference Ｃenter,Ｓtanford
Ｕniversity,Ｐalo Ａlto,Ｃalifornia)から入手し得
る。本発明のプラスミドを組み立てる上で、この特定の
宿主域ベクターを使用することは臨界的なことではな
い。例えば、このような目的に有用な他のベクターに
は、pＲＫ２９０[ディッタ他,１９８０,プロク・ナトル
・アカド・サイ(Ｄitta et al．,Ｐroc．Ｎatl．Ａca
d．Ｓci．),７７,７３４７−７３５１頁]およびＲ７７
２[オエケマ他,１９８３,ネイチャー(Ｈoekema et a
l．,Ｎature),３０３,１７９−１８０頁]が含まれる。
もし、適正に組み立て、植物ゲノムに挿入されたなら、
植物細胞中で融合タンパクが発現され、植物に抗生物質
耐性を与える細菌性酵素のような、所望のポリペプタイ
ドが作られるであろう。

【００１６】従って、得られたマイクロ−Ｔiプラスミ
ドpＣＥＬ４４は、ハイグロマイシン耐性に関して選択
が可能であり、かつ機能的な植物遺伝子を含有するが故
に、極めて有用である。選択可能かつ機能的な植物遺伝
子の存在に関連して、プラスミドpＣＥＬ４４の特異的
な構成は、植物形質転換系に使用する上でさらに有益な
貢献をする。例えば、Ｔ−ＤＮＡ境界配列は、本発明の
マイクロ−Ｔiプラスミドの転写単位が、植物細胞の染
色体ＤＮＡに移送され、共有結合的に組み込まれるのを
助け;アグロバクテリウム機能性レプリコンは、効率的
なプラスミド複製手段となり、他の当業者が行なってい
る同時(共)組み込み工程を不要なものとし;そして唯一
のＳal Ｉクローニング部位は、所望の遺伝子挿入のた
めの便利な開裂部位となる。

【００１７】上に説明したベクターは、機能的なホスホ
トランスフェラーゼaph ＩＶ遺伝子が存在するため、植
物細胞にハイグロマイシン耐性を与える。前記ベクター
に挿入された特定のホスホトランスフェラーゼ遺伝子
は、〜１.３kb ＢamＨ Ｉ−Ｂgl ＩＩ制限フラグメン
トであるが、他の既知のホスホトランスフェラーゼaph
ＩＶ遺伝子で置換することもできる。このような遺伝子
には、ラオ等[アンチマイクロビアル・エージェンツ・
アンド・ケモセラピー(Ｒao et al．,Ａntimicrobial
Ａgents and Ｃhemotherapy)、２４、６８９〜６９
５頁、１９８３]によって開示されたものがあるが、こ
れらに限定されない。また、ハイグロマイシン耐性を与
える遺伝子を含有している、多種多様な、プラスミドp
ＯＷ２０の制限フラグメントで置き換えることもでき
る。ただしこのような制限フラグメントは、プロモータ
ー領域がその構造遺伝子の転写を行なう様に位置せしめ
る必要がある。ホスホトランスフェラーゼaph ＩＶ遺伝
子は、プラスミドpＯＷ２０の〜１.３kb ＢamＨ Ｉ−
Ｂgl ＩＩフラグメント上にコードされているので、こ
の〜１.３kb ＢamＨ Ｉ−Ｂgl ＩＩフラグメントを含有
するどの制限フラグメントでも、感受性のある植物宿主
細胞に対して、目的の耐性を与える。前記のすべての遺
伝子およびフラグメントは機能的に等価であり、従って
本発明の目的を達成するために使用し、変換し得るとい
うことは、当業者の認める所であろう。

【００１８】本発明の例示的ベクターを組み立てるため
に使用する制限フラグメントは、ライゲーションを容易
にする様、常法通り修飾することができる。例えば、特
定のホスホトランスフェラーゼaph ＩＶを含有している
制限フラグメント、ベクターの複製機能を含有している
ＤＮＡ、あるいはプロモーターまたはターミネータ配列
を含有しているＤＮＡに、分子リンカーを供給すること
ができる。このようにして後のライゲーションのための
特異的な部位を簡便に構成することができる。

【００１９】さらに、その性質を変えるため、およびＤ
ＮＡのライゲーションのための種々の制限部位を提供
し、または削除するために、あるヌクレオチドを付加、
脱離または置換することにより、このようなＤＮＡフラ
グメントの任意のものを修飾することができる。当業者
は、ヌクレオチドの化学および遺伝子暗号を理解してい
るので、特定の目的にとって、どのヌクレオチドが交換
可能か、また、どの様なＤＮＡの修飾が望ましいかを知
っている。

【００２０】本発明は、また、ハイグロマイシン耐性の
植物細胞を作成し、得られたそのような細胞を選択する
方法であって、 a)ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコー
ドしている遺伝子を含む本発明の組み換えＤＮＡ発現ベ
クターを含有するアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株を植物または植物挿木に接種し;そして、 b)ハイグロマイシン耐性の選択条件下で、該ベクターに
よって形質転換された植物細胞を選択することからなる
方法を開示するものである。

【００２１】本発明の方法により、pＣＥＬ４４のよう
なマイクロ−Ｔiプラスミドを、アグロバクテリウム・
チュメファシエンスの種々の菌株にコンジュゲートす
る。Ｅ． Ｃoli Ｋ１２ ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ４
４、ヘルパープラスミドpＲＫ２０１３を含有する大腸
菌(デッタ他、上記)、および野生型ＴiプラスミドpＴi
Ａｃｈ５を含有しているアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスＬＢＡ４０１３株を用いて３母株間（トリパ
レンタル)交配を行なう。本発明の目的からして、特定
のヘルパープラスミド、または特定のＡ．チュメファシ
エンス株の使用に限定するものではない。この点に関し
て、バグダサリアン等[Ｂagdasarian et al．,１９８
１,ジーン(Ｇene),１６,２３７〜２４７頁]が記載して
いるヘルパープラスミドのいずれかを、プラスミドpＲ
Ｋ２０１３の代りに使用してもよい。何故なら、このカ
ナマイシン耐性のヘルパープラスミドpＲＫ２０１３の
唯一の機能は、マイクロ−Ｔiプラスミドの移動に関す
るトランス−コンプリメント(輸送補助)作用であるから
である。同様に、機能性Ｖir領域を有する野生型Ｔiプ
ラスミドを含有している腫瘍遺伝子性アグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス株であって、自身のＴiプラス
ミドを植物細胞へ転移させ、植物細胞を形質転換するこ
とが可能な菌株を本発明に使用することができる。本発
明において使用するのに適当な種々のアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス株は、一般に入手可能なもので
ある。たとえば、ＡＴＣＣカタログ・オブ・ストレイン
Ｉ(ＡＴＣＣ Ｃatalogue of ＳtrainＩ)、６６頁、
１５版、１９８２を参照。

【００２２】本発明の好ましい実施態様では、非腫瘍遺
伝子性、即ち非病原性(avirulent)のアグロバクテリウ
ム・チュメファシエンス株を使用する。Ｔ−ＤＮＡ領域
を削除したＴiプラスミドを入れることにより、そのよ
うな株を組み立てることができる。本発明において使用
するために入手し得る特定のアグロバクテリウム・チュ
メファシエンス株は、アグロバクテリウム・チュメファ
シエンスＬＢＡ４４０４である。この株は、ホーイカー
ズ(Ｄr．Ｐ．Ｊ．Ｊ．Ｈooykaas)によって開発され、Ｃ
ＢＳ１９１.８３の番号でバーン(Ｂaarn)のセントラル
・コレクティー・バン・シンメルカルチュアース(Ｃent
rale Ｃollectie van Ｓchimmelcultures、ＣＢＳ)
に寄託されている。また、この株は、ノーザン・リージ
ョナル・リサーチ・ラボラトリー(Ｎorthern Ｒegiona
l Ｒesearch Ｌaboratory)にも寄託されてその一部を
構成しており、寄託番号ＮＲＲＬ Ｂ−１５９２０のも
とで、一般的に利用できる。この細菌株にさらされた植
物細胞はクラウンゴールを形成しない。逆に、容易に成
熟植物まで再生されるハイグロマイシン耐性のカルスを
生成する。

【００２３】アグロバクテリウムで植物組織を感染させ
ることは、当業界で周知の簡単な技術である。通常、カ
ミソリで切る、針で穴を開ける、研摩剤でこする等多数
の方法のどれかで、植物に傷をつける。次いで、腫瘍誘
発性細菌を含有する溶液を、この傷に接種する。本発明
では、ニコチアナ・タバクム(Ｎicotiana tabacumcv
Ｗisconsin ３８)の無菌的に先端を切った苗木上にゴ
ールを惹起させるために、野生型Ｔiプラスミドおよび
マイクロ−ＴiプラスミドpＣＥＬ４４で構成されるバイ
ナリー(二成分系)ベクターを含有しているアグロバクテ
リウムを使用した。さらに、ニコチアナ・プラムバージ
ニフォリア(Ｎicotiana plumbaginifolia)およびニコ
チアナ・タバクム cv ウィスコンシン３８の葉切片か
らカルス生成を誘導するために、マイクロ−Ｔiプラス
ミドpＣＥＬ４４を含有する、非腫瘍遺伝子性のアグロ
バクテリウム・チュメファシエンス株を使用した。上記
の両変種は、ユナイテッド・ステイツ・デパートメント
・オブ・アグリカルチャーズ・タバコ・リサーチ・ラボ
ラトリー(Ｕnited Ｓtates Ｄepertment of Ａgric
ulture's Ｔobacco Ｒesearch Ｌaboratory)、私書
箱１６Ｇ、オックスフォード(Ｏxford)、ノース・カロ
ライナ(Ｎorth Ｃarolina)２７５６５から容易に入手
できる。アグロバクテリウムを介してＴiプラスミドを
導入(トランスフォーム)することができるならば、いず
れの植物からの細胞でも利用できるので、特定の植物種
の細胞を使用することに限定されるものではない。たと
えば、トマト、ジャガイモ、タバコ、ヒマワリおよびダ
イズ等の双子葉植物、あるいはユリ科およびアマリリス
科に属するような単子葉植物から、細胞を得ることがで
きる。

【００２４】生じた増殖腫瘍を切り取り、代表的なタバ
コクローンからＤＮＡを単離し、ＢamＨ Ｉ、およびＢa
mＨ ＩとＨind ＩＩＩからなる制限酵素で消化し、サザ
ーンブロッティングにかけた。Ｔ−ＤＮＡの構造を分析
するためのハイブリダイゼーションプローブとして使用
するため、〜１.３kbのＢamＨ Ｉ−Ｂgl ＩＩハイグロ
マイシン耐性付与フラグメントを、ニックトランスレー
ションにかけた。

【００２５】ハイグロマイシン耐性と同様に、Ｔiプラ
スミドがコードしている他の機能をも発現する植物を再
生するために、本発明のＴiプラスミドで形質転換した
植物細胞を使用する。本発明は、他の植物種または株に
由来する有用な植物遺伝子を導入することにより、植物
組織および植物全体を、遺伝学的に修飾するのに有用で
あり、このような植物遺伝子には、貯蔵タンパク、レク
チン、並びに、病気、昆虫および除草剤に対する抵抗性
因子、および環境ストレスに対する耐性因子等をコード
する遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものでは
ない。本発明の、方法、プラスミドおよび形質転換体
は、植物中に目的の遺伝子を導入する新規方法を、植物
の品種改良家に提供し、また植物の発生を研究するため
の分子プローブを、植物の分子生物学者に提供するもの
である。次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明
する。

【００２６】

【実施例】実施例１ Ｅ．coli ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ３０の培養および
プラスミドpＣＥＬ３０の単離 Ａ．Ｅ．coli ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ３０の培養 通常の微生物学的操作に従い、アンピシリン５０μg／m
lを含むＬ培地(１０g／lカゼイン加水分解物、５g／l酵
母エキス、５g／l ＮaＣl、１g／lグルコース、pＨ７.
４)７５０ml中で、Ｅ．coli ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ
３０を増殖させる。３７℃で激しく振盪しながら２４時
間インキュベートした後、培養物を集める。

【００２７】Ｂ．プラスミドpＣＥＬ３０の単離 培養物を遠心し、細胞のペレットを、新調した溶菌緩衝
液(５０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８)、１０mＭ ＥＤＴ
Ａ、９mg／mlグルコース、２mg／mlリゾチーム)５０ml
中に再懸濁させる。氷冷下、４５分間インキュベートし
た後、この懸濁液を０.２Ｎ ＮaＯＨおよび１％ＳＤＳ
の溶液１００mlに混合し、次いでさらに５分間氷冷す
る。３Ｍ酢酸ナトリウムをさらに９０ml加え、混合物を
６０分間氷冷する。

【００２８】遠心により細胞残渣を除き、上澄液をエタ
ノール５００mlと混合する。−２０℃で２時間放置した
後、遠心により核酸をペレット化し、１０mＭトリス−
ＨＣl(pＨ８)−１０mＭ ＥＤＴＡ９０mlに再懸濁す
る。

【００２９】核酸溶液に、塩化セシウム９０gおよび１
０mg／mlエチジウムブロマイド溶液０.９mlを混合し、
次いで４０,０００rpmで２４時間遠心し、プラスミドＤ
ＮＡを精製する。プラスミドＤＮＡバンドを回収し、さ
らに４０,０００rpmで１６時間遠心する。プラスミドＤ
ＮＡバンドを再び回収し、塩化セシウムおよびエチジウ
ムブロマイドを通常の方法で除き、次いで９０g／l酢酸
アンモニウムを含有する２倍量のエタノールを加えて沈
澱させる。ペレット化したＤＮＡを０.２mg／mlの濃度
でＴＥ緩衝液(１０mＭトリス−ＨＣl(pＨ８),１mＭ Ｅ
ＤＴＡ)に溶解させる。

【００３０】実施例２ Ｅ．coli ＪＡ２２１／pＯＷ２０の培養およびプラス
ミドpＯＷ２０の単離 Ａ．Ｅ．coli ＪＡ２２１／pＯＷ２０の培養 Ｅ． coli ＲＲ１△Ｍ１５について記載した前記実施
例１と同様にして、本細菌を増殖させる。 Ｂ．プラスミドpＯＷ２０の単離 プラスミドpＣＥＬ３０について記載した前記実施例１
と同様にして、本プラスミドを調製する。

【００３１】実施例３ Ｅ．coli ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ４０の構築 Ａ．プラスミドpＣＥＬ３０のＢgl ＩＩ消化およびウシ
腸ホスファターゼによる処理 酵素製造元(＊)推奨の組成を有する反応液１５０μl中
で、プラスミドpＣＥＬ３０ＤＮＡ５μgをＢgl ＩＩ制
限酵素５０単位で消化する。消化は３７℃で９０分間行
なう。始めに０.５Ｍトリス−ＨＣl(pＨ８)−１mＭ Ｅ
ＤＴＡ８.７５μlを反応物に混合し、次いでウシ腸ホス
ファターゼ(ベーリンガー・マンハイム(ＢoehrigerＭan
nheim))１.２５単位を混合し、３７℃で１５分間インキ
ュベートする。混合物を緩衝フェノール、次いでエーテ
ルで抽出し、酢酸アンモニウムを含有する２倍量のエタ
ノールを加え沈澱させる。−７０℃で３０分間放置した
後、ＤＮＡをペレット化し、１０μg／mlの濃度でＴＥ
緩衝液に再溶解させる。

【００３２】＊制限酵素およびその他の酵素は次の供給
者から容易に入手できる。ベセスダ・リサーチ・ラボラ
トリーズ,インコーポレィテッド(Ｂethesda Ｒesearch
Ｌaboratories,Ｉnc．)私書箱６０１０,ロックビル,
メリーランド(Ｂox６０１０,Ｒockville,Ｍaryland)２
０８５０。ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカル
ズ(Ｂoehringer Ｍannheim Ｂiochemicals)、７９４
１キャッスルウェイ・トライブ,ピー・オー・私書箱５
０８１６,インデアナポリス,インデアナ(Ｃastleway
Ｄrive Ｐ．Ｏ．Ｂox ５０８１６,Ｉndianapolis,Ｉn
diana)４６２５０。ニュー・イングランド・バイオ・ラ
ブズ．,インコーポレィテッド(Ｎew Ｅngland Ｂio
Ｌabs．,Ｉnc．)、３２トザー・ロード,ベバリー,マサ
チューセッツ(Ｔozer Ｒoad,Ｂeverly,Ｍassachusett
s)０１９１５。

【００３３】Ｂ．プラスミドpＯＷ２０のＢamＨ Ｉ−Ｂ
gl ＩＩ消化および〜１.３kbフラグメントの単離 酵素製造元推奨の方法に従い、プラスミドＤＮＡ約２０
μgを制限酵素ＢamＨＩおよびＢgl ＩＩで消化する。消
化により得られたＤＮＡフラグメントを、通常のアガロ
ースゲル電気泳動法により分画し、電気泳動中にゲルに
挿入したＮＡ−４５ＤＥＡＥ紙(シュライハー・アンド
・シュエル・インク．,キーン,ニュー・ハンプシャー
(Ｓchleicher＆ Ｓchuell Ｉnc．,Ｋeene,Ｎew Ｈam
pshire)０３４３１)に捕獲して単離する。マイクロ遠心
管を用い、紙をおおうに十分な量の高塩緩衝液(１.０Ｍ
ＮaＣl;０.１mＭ ＥＤＴＡ;および２０mＭトリス,p
Ｈ８.０)中で紙を５秒間振り回すことにより、紙からＤ
ＮＡを溶出させる。時々旋回させつつ、紙を５５〜６０
℃で１０〜４５分間インキュベートする。緩衝液を除
き、紙をさらに緩衝液約５０μlで洗浄する。このＤＮ
Ａを始めにフェノールで、次いでエーテルで抽出し、約
２５μg／mlの濃度でＴＥ緩衝液に再懸濁させる。

【００３４】Ｃ．ライゲーション ０.８単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ(ＢＲＬ)を含有するリ
ガーゼ緩衝液(５０mＭトリス−ＨＣl,pＨ７.６;１０mＭ
ＭgＣl₂;１０mＭ ＤＴＴ;および１mＭ ＡＴＰ)１５
μl中で、ホスファターゼ処理をした１０ngのＢgl ＩＩ
−切断プラスミドpＣＥＬ３０と、精製した〜１.３kb
ＢamＨ Ｉ−Ｂgl ＩＩフラグメント５０ngを混合する。
この混合液を１５℃で一晩インキュベートする。

【００３５】Ｄ．Ｅ．coli ＲＲ１△Ｍ１５の形質転換
および選別 滅菌した６０mＭの塩化カルシウム溶液１５μlにライゲ
ーション混合物を混合する。次いで、３０mＭ塩化カル
シウム,１５％グリセリン中で２０倍に濃縮して−７０
℃で保存しておいた、コンピテントＥ． coli ＲＲ１
△Ｍ１５細胞の懸濁液７０μlを加える。６０分間氷冷
した後、形質転換混合物を４２℃で２分間熱処理し、次
いでＬ培地０.５mlと共に３７℃で９０分間インキュベ
ートする。混合物のサンプルを、５０mg／lのアンピシ
リンを含有するＬ培地に広げ、１５g／lの寒天で固型化
する。次いで、形質転換した細胞のコロニーが生育する
ように、このサンプルを３７℃で一晩インキュベートす
る。

【００３６】Ｅ．プラスミドpＣＥＬ４０を含有する
Ｅ．coli ＲＲ１△Ｍ１５のクローンの同定 形質転換により生じたコロニーを、５０mg／mlのアンピ
シリンを含有するＬ培地５mlに接種し、３７℃で一晩増
殖させる。ホルムズ(Ｈolmes)およびキグレー(Quigley)
の方法[アナリィティカル・バイオケミストリー(Ａnaly
tical Ｂiochemistry)、１１４:１９３頁;１９８１]に
従い、この培養サンプル１mlよりプラスミドＤＮＡを調
製し、ＴＥ緩衝液５０μlに再溶解する。ＤＮＡ溶液７.
５μlと、制限酵素Ｈind ＩＩＩ,Ｐst Ｉ,Ｂgl ＩＩお
よびＢgl ＩＩ−Ｈind ＩＩＩ混合品のそれぞれを約５
単位および酵素製造元の指示による他の試薬を含んでい
る反応液１０μl中でプラスミドを消化する。適温で６
０分間放置の後、消化物を通常の方法によるアガロース
ゲル電気泳動によって分析する。制限酵素によりpＣＥ
Ｌ４０から生じたフラグメントの大きさは図２に示した
プラスミドの構造と一致する。

【００３７】実施例４ マイクロ−ＴiプラスミドpＣＥＬ４４の構築 Ａ．プラスミドpＫＴ２１０のＥcoＲＩ消化およびホス
ファターゼ処理 酵素製造元推奨の組成を有する反応液１５０μl中で、
プラスミドpＫＴ２１０(５μg)をＥcoＲＩ制限酵素５０
単位で消化する。３７℃で９０分間放置した後、反応物
を実施例３と同様にして、ウシ腸ホスファターゼで処理
し、１０μg／mlの濃度になる様、ＴＥ緩衝液に再溶解
する。

【００３８】Ｂ．プラスミドpＣＥＬ４０のＥcoＲＩ消
化 実施例３ＥプラスミドpＣＥＬ４０ＤＮＡ調製品１５μl
を、３７℃で９０分間、反応液２０μl中のＥcoＲＩ制
限酵素１０単位で消化する。次いでフェノールで抽出
し、次いでエーテルで抽出する。−２０℃で酢酸アンモ
ニウムを含有する２倍量のエタノールを加え、消化され
たＤＮＡを沈澱させ、ＴＥ緩衝液２０μlに再溶解す
る。

【００３９】Ｃ．ライゲーション、形質転換およびＥ．
coli ＲＲ１△Ｍ１５／pＣＥＬ４４の選別 実施例３Ｃと同様にして、ホスファターゼ処理したＥco
ＲＩ−切断pＫＴ２１０(１０ng)とＥcoＲＩ−切断pＣＥ
Ｌ４０(５μl)をライゲーションし、実施例３Ｄと同様
にして、Ｅ． coli ＲＲ１△Ｍ１５に導入して形質転
換する。１０mg／lのクロラムフェニコールを含有する
固形Ｌ培地上での増殖能によって形質転換した細胞を選
別する。実施例３Ｅと同様にして、Ｐst Ｉ、Ｈind Ｉ
ＩＩおよびＢamＨ Ｉによる、細胞の構成成分であるプ
ラスミドの制限酵素分析により、pＣＥＬ４４を含有す
るコロニーを同定する。制限部位および機能地図を添付
の図３に示す。

【００４０】実施例５ pＣＥＬ４４のアグロバクテリウム・チュメファシエン
スＬＢＡ４０１３への接合 Ａ．親株の増殖 固形Ｌ培地上、３７℃で一晩Ｅ． coli Ｋ１２ ＲＲ
１△Ｍ１５／pＣＥＬ４４およびＥ． coli pＲＫ２０
１３を増殖させる。固形Ｌ培地上、２８℃で２日間、ア
グロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４０１３
を増殖させる。

【００４１】Ｂ．３親株間接合および選別 上記３種の株、１ループづつを３０mＭ硫酸マグネシウ
ム１ml中で混合する。次いで、固形ＴＹ培地(５g／lカ
ゼイン加水分解物、５g／l酵母エキス、１５g／l寒天)
上に、この混合物１滴を落とし、２８℃で一晩インキュ
ベートする。増殖細菌を１０mＭ硫酸マグネシウム溶液
３mlに再懸濁させ、この系列希釈試料０.１mlを、１０
０mg／lナリディキシ酸および２mg／lクロラムフェニコ
ールを含有する固形ＴＹ培地上に広げ、２８℃でインキ
ュベートする。２〜４日の増殖後、トランス接合体が個
々のコロニーを生じる。これらを、１００mg／lのナリ
ディキシ酸および２mg／lのクロラムフェニコールを含
有する液体ＴＹ培地２５mlに、各個に接種し、２８℃で
振盪しながら、さらに２日間インキュベートする。次い
でカッセらの方法(ジャーナル・オブ・ゼネラル・マイ
クロバイオロジー・１１３(Ｃasse et al,Ｊournal
of Ｇeneral Ｍicrobiology):２２９−２４２頁；１
９７９)により、トランス接合体のプラスミド内容を調
べる。

【００４２】実施例６ タバコクラウンゴール細胞に於けるハイグロマイシン耐
性の導入および発現 栽培品種Ｗisconsin３８の無菌タバコ植物を次のように
生育させる。種子を１０％Ｃlorox漂白剤で１０分間処
理して滅菌し、９５％エタノールですすぎ、次いで多量
の滅菌水ですすぐ。ＭＳ主要塩類および副塩類[フィジ
オル・プラント(Ｐhysiol．Ｐlant．),１５:４７３〜４
９７頁,１９６２]、３０g／lのショ糖、１００mg／lの
ミオイノシトール(シグマ(Ｓigma)),２.５mg／lのチア
ミンＨＣl(イーライ・リリー(Ｅli Ｌilly)),１.２５m
g／lのピリドキシンＨＣl(リリー(Ｌilly))および１.２
５mg／lのパントテン酸カルシウム(シグマ(Ｓigma))で
構成され(pＨ６)、９g／lのＤifco Ｂacto 寒天で固
型化したＲ５培地の表面に種をまく。発芽した種は同じ
Ｒ５培地上に摘み取り、約２ケ月毎に、マゼンタ(Ｍage
nta)ＧＡ７箱中に挿木(ベジタティブ・カッティング)を
行なって植物を維持する。日照１６時間、照度１５０ル
ックスおよび温度２６℃の光照射培養器で、この挿木を
生育させる。アグロバクテリウムを接種をするため、滅
菌した外科用メスを用いて、頭部および葉を切り落と
し、頂上および広がった葉柄に切り口を残す。数分以内
に、目で見て切り口面に淡黄色−褐色の堆積物が観察さ
れるまで、切り口面にアグロバクテリウム・チュメファ
シエンスＬＢＡ４０１３／pＣＥＬ４４の培養物を塗布
する。切り口をつけ、菌を接種した植物にラベルを付
け、箱に密閉し、光照射培養器に戻す。ゴールが誘発さ
れる間、周囲温度が決して３０℃を超えないよう注意す
る。

【００４３】接種後１５日で、Ｗisconsin３８の滅菌植
物のほとんどの接種切り口に、ゴールの生成が認められ
る。このゴールを個々に切り取り、番号を付け、カルベ
ニシリン(シグマ(Ｓigma))およびバンコマイシン(バン
コシンＨＣl、リリー(Ｌilly))をそれぞれ２００μg／m
l添加したＲ５培地に植える。腫瘍誘起細菌を殺し、無
菌培養物を得るためのこの処理には、上記抗生物質を含
有する培地上で３週間、同培地に移植してさらに３週
間、２５〜２７℃の暗所でクラウンゴールを培養して行
なう。これらクラウンゴールのカルス組織培養物のハイ
グロマイシンに対する感応性を試験するため、ＭＳ塩、
３０g／l ショ糖、１mg／l チアミンＨＣl、１００mg／
l ミオイノシトール、９g／l Ｄifco Ｂacto寒天、１m
g／lのＩＡＡ(インドール−３−酢酸;シグマ)および０.
１mg／lのキネチン(６−フルフリルアミノプリン;シグ
マ)(pＨ６)を含有するカルス増殖培地約１５mlを満たし
たＦalcon１００７ペトリ皿に、１００mgのカルスサン
プルを植える。このサンプルを滅菌した後、前記濃度の
バンコマイシンおよびカルベニシリン、および５０μg
／mlのハイグロマイシンＢ(リリー)を加える。２７℃の
暗所で３週間インキュベートした後この試験の結果を調
べ、正の増殖表現型を回収した。

【００４４】実施例７ ハイグロマイシン耐性ゴール組織中のaphＩＶ配列の存
在 Ａ．植物ＤＮＡのサザーンブロット “マイズ・フォー・バイオロジカル・リサーチ(Ｍaize
for ＢiologicalＲesearch)"[ダブリュー・エフ・シ
ェリンダ編,パブル・プラント・モレキュラー・バイオ
ロジー・アスン;チャーロッテスビレ,バージニア(ed
Ｗ．Ｆ．Ｓheridan,publ．Ｐlant Ｍolecular Ｂiolo
gy Ａssn;Ｃharlottesville,Ｖirginia),１９８２]の
１６１〜１６４頁に記載されたリビン(Ｒivin)らの方法
により、約１０gmのゴール組織から核ＤＮＡを調製す
る。酵素製造元推奨組成の反応液２００ml中で、ＢamＨ
ＩおよびＢamＨ Ｉ−Ｈind ＩＩＩ混合の制限酵素それ
ぞれ１００単位で、各ＤＮＡ１０μgを消化する。３７
℃で４時間インキュベートした後、酢酸アンモニウムを
含有する４００μlのエタノールを加え、−７０℃で３
０分間、消化したＤＮＡを沈澱させる。このＤＮＡを、
ＴＥ緩衝液２５μl中に、４℃で一晩溶解させる。消化
したＤＮＡフラグメントを通常のアガロースゲル電気泳
動で分画し、製造元のプロトコールに従い、ジーンスク
リーン(Ｇene Ｓcreen)、即ちハイブリダイゼーション
移行メンブラン(ニュー・イングランド・ニュークレア
ー,ボストン,マサチューセッツ(Ｎew Ｅngland Ｎucl
ear,Ｂoston,Ｍassachusetts)に移し換える。

【００４５】Ｂ．プラスミドpＯＷ２０の１.３kbフラグ
メントからのプローブ 実施例３Ｂ記載の方法により精製した、プラスミドpＯ
Ｗ２０のフラグメントから、ハイブリダイゼーションプ
ローブを作る。通常の方法(マニアティス他,１９８２・
モレキュラー・クローニング,コールド・スプリング・
ハーバー・ラボラトリー,コールド・スプリング・ハー
バー,ニューヨーク(Ｍaniatis et al．,１９８２Ｍol
ecular Ｃloning,Ｃold Ｓpring Ｈarbor Ｌaborat
ory,ＣoidＳpring Ｈarbor,Ｎew Ｙork)を参照)によ
り、ＤＮaseＩおよびＤＮＡポリメラーゼを使用し、プ
ローブがＤＮＡ０.２μgあたり２０μＣiの[３２−Ｐ]d
ＣＴＰを持つように、フラグメントをニックトランスレ
ーションする。

【００４６】Ｃ．aphＩＶ配列相同体(ホモロギー)検出
のためのハイブリダイゼーション ０.７５Ｍ ＮaＣl、７５mＭクエン酸ナトリウム、２５m
Ｍリン酸ナトリウム(pＨ６.７)、２g／l フィコール(Ｆ
icoll)４００、２g／lポリビニルピロリドン３６０、２
g／l ウシ血清アルブミン、１％ドデシル硫酸ナトリウ
ム、１０％硫酸デキストラン、５０％ホルムアミドおよ
び２５０mg／lの変性した、超音波処理ウシ胸腺ＤＮＡ
を含有する溶液中で、４２℃で一晩、前記植物ＤＮＡフ
ラグメントを含有しているジーンスクリーンをプレハイ
ブリダイズする。ハイブリダイゼーションは、同一組成
の新鮮な溶液中で、熱変性した前記プローブＤＮＡ(溶
液２５mlあたり０.２μg)を追加して行なう。４２℃で
一晩インキュベートした後、このジーンスクリーンメン
ブランをＧＳ緩衝液(０.３Ｍ ＮaＣl、６０mＭトリス
−ＨＣl、２mＭ ＥＤＴＡ、pＨ８)で２回洗浄する。各
洗浄は室温で１時間行なう。次いでメンブランを、１％
ＳＤＳを添加した０.１×ＧＳ緩衝液で、７０℃、１時
間、厳密に洗浄する。この操作を繰り返し、次いで室温
下、０.１×ＧＳ緩衝液でさらに２回ジーンスクリーン
を洗浄する。メンブランを吸収乾燥し、−７０℃で強化
したスクリーンを用いて一晩Ｘ線フィルムに露出する。

【００４７】実施例８ 植物の再生 Ａ．非クローン化ゴール組織からの再生 制限レベルのハイグロマイシンＢの存在下で、強い増殖
を示す非クローン化ゴール組織について、選択圧下で植
物再生を誘起する処理を行なう。この処理は、０.３mg
／l ＩＡＡ、１０mg／l ２−ip(６−γ,γ−ジメチル
アリルアミノプリン,ギブコ(＊)(Ｇibco))、１００mg／
l ミオイノシトール、１mg／l チアミンＨＣl(pＨ６)お
よび３０g／l ショ糖を含有し、０.９％Ｄifco Ｂacto
寒天に５０μg／mlのハイグロマイシンを加えて固形化
したＭＳ培地上に、カルス組織のかけらを置いて行な
う。この処理物を１ケ月間光照射インキュベーター中に
置き、次いで組織中の暗緑色の発芽領域を選別し、同一
の高濃度のサイトキニン、ハイグロマイシンを添加した
培地に移し換え、さらに１ケ月光照射下でインキュベー
トする。抗生物質を加えた再生培地上で、上記の２期間
が経過した後、単一の植物体を切り取るために苗木の緑
がかった発芽部分を切り取り、滅菌植物を生育させるた
め、固形培地上、光照射下でさらに培養する。３種の異
なる組織系統から十分に生育した植物が得られたら、こ
の植物中のハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を、次の
様にして試験する。約１cm平方の葉片を切り出し、ハイ
グロマイシン含有あるいは非含有のカルス増殖培地上に
置く。対照組織は、ここでのクラウンゴールを誘導する
実験の出発材料である、無菌Ｗisconsin３８の植物の葉
片である。これらの標品を２７℃の暗所でインキュベー
トする。３週間後、抗生物質を含有しない培地では、Ｗ
isconsin３８およびゴール組織から再生した植物は両方
共、葉細胞の拡大および葉片移植体の端部でのカルス増
殖を示す。しかし、抗生物質を含有する培地では、対照
のＷisconsin３８の葉は細胞分裂を開始することができ
ず、褐色となり、枯れかかっていた。一方、ハイグロマ
イシン耐性のゴール培養物から選択圧下で再生した植物
の葉は、ハイグロマイシンを含有しない皿での結果に匹
敵する。細胞の拡大、増殖およびカルス生成を示した。
これらの結果は、再生植物がpＣＥＬ４４起因のハイグ
ロマイシン耐性遺伝子を含有し、かつ発現可能であると
いうことを示している。＊植物の培地および補助剤はギ
ブコ、グランドアイランド、ニューヨーク(Ｇibco,Ｇra
nd Ｉsland,Ｎew Ｙork)より容易に入手できる。

【００４８】Ｂ．ハイグロマイシン耐性ゴールの単細胞
から誘導されたクローン 抗生物質を含有しない１／.１培地(ＭＳ塩、１mg／l
ＩＡＡ、０.１mg／l カイネチン、０.９g／l Ｄifco
Ｂacto寒天、１００ml／l ミオイノシトール、１mg／l
チアミンＨＣl、３０g／l ショ糖、pＨ６をオートクレ
ーブで滅菌し、Ｆalcon １００５ペトリ皿に５０ml／皿
で配分する)上で、１ケ月毎に継代培養しながら、２７
℃の暗所でハイグロマイシン耐性のクラウンゴール系統
を維持する。寒天なしで調製し、１２５mlの三角フラス
コに５０ml／フラスコの割合で配分し、泡止めの栓をし
た、上記と同一の培地に、上記培養系統のサンプルを分
散させる。この様にして開始した懸濁培養を、２７℃の
暗所、１３５rpmの旋回振盪器中で振盪する。１週間
後、カルスの固い塊を除き、クラウンゴール細胞の懸濁
培養物を１週間単位で、新しい液体培地に１:１で分配
して継代培養する。これらの短期間懸濁物は、それがカ
ルスの塊にもどるまで、１ケ月間振盪培養してもよい。
単細胞誘導クローンを生成させるために、以下のように
して、これらの培養物からプロトプラストを調製し、次
いで極端に低密度で培養する。細胞を濃縮するために、
短期間懸濁培養物を軽く遠心し、上澄液の増殖培地を除
き、５mlの濃縮した細胞に、６％w／vセルリジン(オノ
ヅカＲ１０、キンキヤクルト(ＯnozukaＫinki Ｙakult
Ｍfg．)、日本)、１％w／vマセラーゼ[マセロザイム
Ｒ１０、キンキヤクルト(Ｍacerozyme、Ｋinki Ｙakul
t)提供]、９％w／vマンニトール(シグマ)、３mＭ ＭＥ
Ｓ(２−(Ｎ−モルホリノ)−エタンスルホン酸、シグマ)
(pＨ５.８)を含有する濾過滅菌した酵素混合物２５mlを
混合する。細胞と酵素の混合物をＦalcon １００５ペト
リ皿に入れ、５０rpmの低回転振盪をしながら、室温で
４.５時間インキュベートする。顕微鏡でプロトプラス
トの放出を確認した後、すきまサイズ２５９および２３
１ミクロンの金網ふるい(ダブリューエス・タイラー、
インク・オブ・メンター、オハイオ(Ｗ．Ｓ．Ｔyler,Ｉ
nc．of Ｍentor,Ｏhio))でこの標品を濾過し、２５％w
／v Ｆicoll ＤＬ(シグマ)(重量平均分子量が約４０
０,０００となるように合成した水溶性のショ糖とエピ
クロルヒドリンの共重合体)となるように作ったプロト
プラスト培養用培地と１:１で混合する。この混合物を
丸底ガラス製の遠心管の底に入れ、８％w／v Ｆicoll
となるように作った同一のプロトプラスト培養用培地数
mlを上層に浮かべ、最後に２％w／v Ｆicollとなるよう
に作ったプロトプラスト培養培地１〜２mlの薄い層を浮
かべる。Ｆicollを含有する溶液はすべてフィルター滅
菌しておく。この非連続的密度勾配の調製物を、回転バ
ケット中、周囲温度、５０ＸＧで３０分間遠心する。プ
ロトプラストが最上層となり、本実験では、１mlあたり
２×１０⁵個という高濃度の生存細胞を、大口径のパス
ツールピペットを使って集めた。使用するプロトプラス
ト培養の培地はＫＰ[カオおよびミカイルークのＫ３培
地,プランタ(Ｋao ＆ Ｍichayluk．Ｐlanta),１２０:
２１５−２２７頁,１９７４]であって、ミュラー(Ｍull
er)らの文献[フィジオロジー・オブ・プラント(physiol
・Ｐlant)、５７:３５−４１頁、１９８３]に記載され
ているカボッチェ(Ｃaboche)の方法により、マンニトー
ルで浸透圧を.５Ｍに改良したものである。

【００４９】このようにして集めたプロトプラストを、
高濃度(集めた時のままの)で、Ｆalcon ３００１皿に１
mlづつ入れ、２６℃の暗所で培養する。６日後、増殖
性、致死的染料エバンス青(シグマ)を排除するか否かに
より決定される細胞生存能力、および細胞壁の形成およ
び分裂について調べる。細胞の直径は顕微鏡で測定す
る。標品を、１０７ミクロン直径の金網製フィルターで
濾過する。標品に細胞集合体が存在しないことを確認す
る。マンニトールを使用して、培養培地と同一の浸透力
に調整したカボッチェ(前記)のＣ培地１mlあたり、最終
的に約１００の生存細胞密度となるように、細胞数を数
えながら、細胞を順次希釈する。この希釈物をペトリ皿
に一皿あたり約１５ml入れ、光照射下でインキュベート
する。単細胞誘導コロニーは、ある培養物からは１ケ月
以内に、他の培養物からは２ケ月後に得られた。このコ
ロニーを大口径パスツールピペットを使って液体培地か
ら取り出し、液体培地１／．１に浸したＷhatman＃３濾
紙上に置く。この濾紙上の培養物を、必要なら液体培地
を添加しながら、さらに１ケ月光照射下でインキュベー
トし、次いで固形培地１／．１上に取り出し、２７℃の
暗所で培養する。単細胞から誘導したカルス培養物のハ
イグロマイシン耐性の発現を試験するため、一対のクロ
ーン化カルス組織系統サンプルを、５０μg／mlのハイ
グロマイシンＢを含有する１／．１固形培地および抗生
物質を含有しない同一培地に置く。２７℃の暗所で３週
間培養した後、対の培養物を比較する。５６例の内５２
例で、５０μg／mlのハイグロマイシンＢの存在下で
も、非存在下と同様に生育し、ハイグロマイシン耐性を
示した。

【００５０】Ｃ．クローン化した組織からの再生 実施例８Ｂの、単細胞をクローニングするプロトプラス
ト法により誘導した、ハイグロマイシン耐性のカルス組
織培養物を、再生プロトコールにかけることができる。
ＭＳ塩、１００mg／l ミオイノシトール、１mg／l チア
ミン−ＨＣl、０.３mg／l ＩＡＡ、１０mg／l ２−ip、
０.９g／l Ｄifco Ｂacto寒天および３０g／l ショ糖
(pＨ６)を含有する固形培地上にカルス片を置き、光照
射下で１ケ月間培養する。緑の発芽組織片を再度同一の
培地で継代培養する。このようにして生育させた苗木
を、光照射下で十分に生育した植物まで育てるため、実
施例６に記載したＲ５培地で培養する。得られた植物に
対して、実施例８Ａと同様に、ハイグロマイシンを含有
するカルス増殖培地の上に葉片移植体を置き、暗所でイ
ンキュベートすることにより、プラスミドpＣＥＬ４４
より導入したハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を試験
する。この植物は実施例８と同様、葉片移植体の切り口
上に葉細胞の拡大およびカルスの生成を見せ、ハイグロ
マイシン耐性遺伝子の発現を示した。この植物を土に移
植し、この植物が、ハイグロマイシン耐性遺伝子のメン
デル性遺伝子をすることを証明するため、温室で、生殖
能を有する成熟体まで生育させる。この操作により、p
ＣＥＬ４４を含有する二重(バイナリー)ベクターが、腫
瘍を誘起する発ガン遺伝子を伴うことなく、ハイグロマ
イシン耐性遺伝子だけを転移させることができることが
証明され、かくして性的能力のある植物に再生すること
が可能な植物細胞中に、希望する特性を導入する新規か
つ有用な方法が提供されたのである。

【００５１】実施例９ アグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４０
５へのpＣＥＬ４４の接合 実施例５と同様にして、Ｅ. coli Ｋ１２ ＲＲ１△
Ｍ１５／pＣＥＬ４４、Ｅ. coli pＲＫ２０１３およ
びアグロバクテリウム・チュメファシエンスＬＢＡ４４
０５の３親株間接合を行なう。２０mg／l リファンピシ
ンおよび２mg／lクロラムフェニコールを含有するＴＹ
固形培地上でトランス接合体を選別する。

【００５２】実施例１０ カルス中へのハイグロマイシン耐性の導入および発現 Ａ．ニコチアナ・プラムバギニフォリア(Ｎicotiana p
lumbaginifolia) ニコチアナ・プラムバギニフォリアの種子をエタノール
に短時間さらして滅菌し、０.５％Ｃhlorox漂白剤で３
分間処理する。滅菌水ですすいだ後、０.５mg／l のギ
ベレリン酸を含有する溶液中で、１時間種子をインキュ
ベートする。次いで、０.６％フィトアガー(phytagar)
で固形化したＭＳ培地に種を蒔く。２７℃、日照時間１
６時間、照射強度約７００ルックスの条件で生育させ
る。３ケ月経過した植物から約１cm平方の葉部を切り取
り、切り口にアグロバクテリウム・チュメファシエンス
ＬＢＡ４４０４／pＣＥＬ４４の培養物を塗布する。１m
g／l ナフタレン酢酸(ＮＡＡ)および０.１mg／l ベンジ
ルアデニン(ＢＡ)を含有する固形ＭＳ培地上、２７℃の
暗所で３日間、感染部分をインキュベートする。次い
で、２００mg／l バンコマイシンおよび２００mg／l カ
ルベニシリンを添加した同一培地に感染部分を移植す
る。１ケ月間増殖させた後、１mg／mlＮＡＡ、０.１mg
／ml ＢＡおよび５０mg／l ハイグロマイシンＢを含有
するＭＳ培地に、カルス片を移植し、インキュベートを
続ける。３週間後、０.１mg／l ＮＡＡおよび１mg／l
ＢＡを添加した固形ＭＳ培地に、カルスの小片を移植し
２７℃、日照時間１６時間でインキュベートし、苗条を
再生させる。この苗条を、根の生育促進剤を含有しない
固形ＭＳ培地に移植する。

【００５３】Ｂ．ニコチアナ・タバクム(Ｎicotiana t
abacum) タバコカルスの懸濁培養物(ＮＴ５７５)の一部を、固形
培地(実施例８Ｃ記載の)に流し込む。過剰の水を除去し
た後、２層の滅菌Ｗhatman＃１濾紙を細胞上に置く供給
細胞層系を組み立てる。細胞を２６℃の暗所で一晩イン
キュベートする。アグロバクテリウム・チュメファシエ
ンスＬＢＡ４４０４／pＣＥＬ４４培養物を、２mg／l
のクロラムフェニコールを含有するＴＹ培地上で増殖さ
せる。５g／l カゼイン加水分解物および３g／l 酵母エ
キスを含有する液体培地に、単離した細胞を移し、旋回
振盪器中、２６℃で一晩振盪する。３ケ月経過した植物
から約１cm平方の葉部を切り取り、この細菌の液体培養
物に６〜８分間浸し、吸収乾燥し、次いで上で調製した
供給細胞層系をおおう濾紙の上に置く。光照射下、２６
℃で２日間、この葉片をインキュベートした後、取り上
げ、カルベニシリンおよびバンコマイシンを各２００μ
g／ml を含有する再生培地に移植する。この培地上、光
照射下でさらに１２日間経過させた後、５０μg／ml の
ハイグロマイシンを含有する同一培地に、葉片を移植す
る。この移植体を、光照射下、２６℃で更に３ケ月間培
養する。ハイグロマイシン含有培地上で、このように処
理した葉片から、苗が再生し、生育する。前記と同様
に、ただし逆の方向にハイグロマイシン耐性遺伝子を含
有しているアグロバクテリアで処理した葉片からは苗は
生育しない。このような葉の部分から植物体を摘み取
り、ホルモンを含有しないＲ５培地で生育させ、実質的
に実施例８Ａと同様にして、５０μg／ml のハイグロマ
イシンＢを含有するカルス増殖培地に葉片を移植して、
ハイグロマイシン耐性を試験する。再生培地の代わりに
カルス増殖培地(実施例１０Ａ)を使用する以外は、上記
と同様にして葉部を処理する。バンコマイシンおよびカ
ルベニシリンを各２００μg／ml 添加したカルス増殖培
地でこの葉部を増殖させる。このようにして調製したも
のを２６℃の暗所で２週間インキュベートし、次いで５
０μg／ml のハイグロマイシンＢを添加した培地に移植
する。ハイグロマイシン耐性は、抗生物質を含有する培
地でカルスが増殖すること、および実施例７で示したよ
うに、ａｐｈＩＶ配列で植物ＤＮＡのサザーンブロット
をプローブすることによって証明される。

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドｐＣＥＬ３０(７.１５kb)の制限
サイトおよび機能地図を示す図である。

【図２】 プラスミドpＣＥＬ４０(８.４５kb)の制限サ
イトおよび機能地図を示す図である。

【図３】 プラスミドpＣＥＬ４４(１７.５kb)の制限サ
イトおよび機能地図を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91）

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （Ａ）（a）暗号領域(c)の５'側にある
   植物発現プロモーター配列、（b）暗号領域(c)の３'側
   にあるターミネータ信号配列、（c）該植物発現プロモ
   ーター配列(a)と該ターミネータ信号配列(b)の間に位置
   しているハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ
   をコードする遺伝子の暗号領域からなり、植物細胞内で
   の該暗号領域の発現により該植物にハイグロマイシン耐
   性を与え、該ハイグロマイシン耐性により該植物細胞の
   選択を可能にする植物細胞において機能的なキメラ遺伝
   子をハイグロマイシン−感受性の植物細胞中に挿入し；
   そして （Ｂ）該植物細胞がハイグロマイシン耐性でない場合に
   は、その増殖が妨げられるような十分な量のハイグロマ
   イシンに該植物細胞を曝してハイグロマイシン耐性細胞
   を増殖させることによって、ハイグロマイシン耐性を発
   現している細胞を選択する；ことからなる、ハイグロマ
   イシン耐性の組み換えＤＮＡを含有している植物細胞を
   選択する方法。
2. 【請求項２】 該植物発現プロモーター配列が天然のプ
   ロモーター配列であり、該プロモーター配列に天然に結
   合した遺伝子のアミノ末端領域−暗号化領域まで延びか
   つそれを含むプロモーター領域の３'側の天然の配列を
   さらに含み、該ハイグロマイシン・ホスホトランスフェ
   ラーゼ遺伝子のコード領域が正しい読み枠内でアミノ末
   端領域−暗号化配列に融合している請求項１に記載の方
   法。
3. 【請求項３】 該プロモーター配列がオクトピン・シン
   セターゼ遺伝子からのものである請求項１または２に記
   載の方法。
4. 【請求項４】 該天然のプロモーター配列および天然の
   プロモーター配列に天然に結合した３'側の天然配列が
   オクトピン・シンセターゼ遺伝子からのものである請求
   項２に記載の方法。
5. 【請求項５】 該ターミネータ信号配列がノパリン・シ
   ンセターゼ・ターミネータ信号配列である請求項１〜４
   のいずれかに記載の方法。
6. 【請求項６】 該アミノ末端領域−暗号化配列が、開始
   コドンを含むメッセンジャーＲＮＡをコードしている請
   求項２または４に記載の方法。
7. 【請求項７】 該アミノ末端領域−暗号化配列が、オク
   トピン・シンセターゼ遺伝子の最初の１１アミノ酸をコ
   ードしている請求項６に記載の方法。
8. 【請求項８】 ハイグロマイシン耐性を付与する暗号領
   域が、プラスミドpＯＷ２０の〜１.３kb ＢamＨI−Ｂgl
   II制限フラグメントから誘導される請求項１〜７のいず
   れかに記載の方法。
9. 【請求項９】 該キメラ遺伝子の挿入を、そのようなキ
   メラ遺伝子を含むベクターで形質転換されたアグロバク
   テリウム・チュメファシエンス株を介して行なう請求項
   １〜８のいずれかに記載の方法。
10. 【請求項１０】 （Ａ）（a）暗号領域(c)の５'側にあ
    る植物発現プロモーター配列、（b）暗号領域(c)の３'
    側にあるターミネータ信号配列、（c）該植物発現プロ
    モーター配列(a)と該ターミネータ信号配列(b)の間に位
    置しているハイグロマイシン・ホスホトランスフェラー
    ゼをコードする遺伝子の暗号領域からなり、植物細胞内
    での該暗号領域の発現により該植物にハイグロマイシン
    耐性を与え、該ハイグロマイシン耐性により該植物細胞
    の選択を可能にする植物細胞において機能的なキメラ遺
    伝子をハイグロマイシン−感受性の植物細胞中に挿入
    し；そして （Ｂ）該植物細胞がハイグロマイシン耐性でない場合に
    は、その増殖が妨げられるような十分な量のハイグロマ
    イシンに該植物細胞を曝してハイグロマイシン耐性細胞
    を増殖させることによって、ハイグロマイシン耐性の植
    物細胞を選択し、選択した細胞を成熟植物の再生に適し
    た条件下で培養し、そして成熟植物を再生することから
    なる、選択したハイグロマイシン耐性植物細胞から成熟
    植物を再生する方法。
11. 【請求項１１】 該植物発現プロモーター配列が天然の
    プロモーター配列であり、該プロモーター配列に天然に
    結合した遺伝子のアミノ末端領域−暗号化領域まで延び
    かつそれを含むプロモーター領域の３'側の天然の配列
    をさらに含み、該ハイグロマイシン・ホスホトランスフ
    ェラーゼ遺伝子のコード領域が正しい読み枠内でアミノ
    末端領域−暗号化配列に融合している請求項１０に記載
    の方法。
12. 【請求項１２】 該プロモーター配列がオクトピン・シ
    ンセターゼ遺伝子からのものである請求項１０または１
    １に記載の方法。
13. 【請求項１３】 該天然のプロモーター配列および天然
    のプロモーター配列に天然に結合した３'側の天然配列
    がオクトピン・シンセターゼ遺伝子からのものである請
    求項１１に記載の方法。
14. 【請求項１４】 該ターミネータ信号配列がノパリン・
    シンセターゼ・ターミネータ信号配列である請求項１０
    〜１３のいずれかに記載の方法。
15. 【請求項１５】 該アミノ末端領域−暗号化配列が、開
    始コドンを含むメッセンジャーＲＮＡをコードしている
    請求項１１または１３に記載の方法。
16. 【請求項１６】 該アミノ末端領域−暗号化配列が、オ
    クトピン・シンセターゼ遺伝子の最初の１１アミノ酸を
    コードしている請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 ハイグロマイシン耐性を付与する暗号
    領域が、プラスミドpＯＷ２０の〜１.３kb ＢamＨI−Ｂ
    glII制限フラグメントから誘導される請求項１０〜１６
    のいずれかに記載の方法。
18. 【請求項１８】 該キメラ遺伝子の挿入を、そのような
    キメラ遺伝子を含むベクターで形質転換されたアグロバ
    クテリウム・チュメファシエンス株を介して行なう請求
    項１０〜１７のいずれかに記載の方法。