JP3090926B2 - 植物におけるベクターおよび形質転換系の開発のための選択可能なマーカー - Google Patents
植物におけるベクターおよび形質転換系の開発のための選択可能なマーカーInfo
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Description
【発明の詳細な説明】
［産業上の利用分野］
本発明は組み換えDNA発現ベクターに関する。さらに
詳しくは、植物中で機能的であり、かつ形質転換した植
物の選別が可能な組み換えDNA発現ベクターに関する。 ［従来技術］ アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobact
erium tumefaciens）による双子葉植物のクラウンゴー
ルの形成は、植物細胞の染色体DNA中に、腫瘍誘発性プ
ラスミド（Tiプラスミド）のトランスファーDNA（Ｔ−D
NA）と呼ばれる小さいセグメントが、転移し、共有結合
的に組み込まれることに起因する。転移したＴ−DNAは
植物細胞中で発現することができ、これは、いくつかの
ポリアデニル化された転写体（転写物）をコードしてい
る。転写体のあるものは、オパイン合成、および腫瘍増
殖に関与していることが知られている。この後者の転写
体は腫瘍遺伝子によってコードされているものである。
これらの転写体のどれも、Ｔ−DNAの転移にとって必須
ではないことがわかっている。転移機構は、Ｔ−DNAの
境界近くに存在する、繰り返しのヌクレオチド配列に関
係していると考えられている。このような境界が存在す
る限り、外来性遺伝子をTiプラスミドのＴ−DNAに挿入
し、そのことによって、該遺伝子を腫瘍細胞または再生
された植物のゲノムに導入することができる。 Ｔ−DNA配列に加えて、VIRビルレンス領域と呼ばれ、
Ｔ−DNAの外側に位置する、別のTiプラスミド遺伝子群
が、Ｔ−DNAの細菌から植物細胞への移動において、あ
る役割を果たしていると一般に考えられている。これま
では、Ｔ−DNAとVIR領域の両方を有するアグロバクテリ
ウムに感染した植物上にクラウンゴールが存在すること
が、形質転換した植物細胞を同定するための基本的手段
であった。しかし、機能的な腫瘍遺伝子を含有するクラ
ウンゴールからは植物全体を再生することができないた
め、この同定方法は商業的利用価値を制限するものであ
った。従って、形質転換した植物細胞を選択し、同定す
るのに腫瘍遺伝子にたよることなく、植物細胞中に外来
性遺伝子を導入し、これを発現させる方法を開発するこ
とは有用なことである。 現在、成功率は異なるが、植物細胞にDNAを導入する
ために種々の方法を利用することができる。このような
方法には、１またはそれ以上のDNA分子をカプセル化す
るためにリポソームを使用する方法、植物細胞とDNA
（多価陽イオン性物質またはリン酸カルシウムのいずれ
かとコンプレックスを形成しているDNA）とを接触させ
る方法、およびプロトプラスト融合法が含まれる。現
在、目的の遺伝子を植物細胞へ転移させるための好まし
い方法は、アグロバクテリウム細胞のTiプラスミドを利
用する技術である。最近では、モンサント社（Monsanto
Company）の研究者により、植物細胞を形質転換する
のに共（同時）−組み込みTiプラスミドの利用が可能で
あることが証明された［フレーリーおよびロジャース
（Fraley and Rogers）,PCT出願WO84/0219を参照］。さ
らに、ホエケマ等［Hoekemaら、ネイチャー（Natur
e），303,179頁,1983］が開発した、Tiバイナリー（２
成分）ベクター系が当分野で知られている。 前記Tiプラスミド由来のＴ−DNA領域を、機能的な植
物の発現機構の制御下にある目的の遺伝子を挿入するの
に利用できる。そのようなキメラ遺伝子は、植物および
細菌の両方に由来するポリペプタイドを発現すること
が、当分野で知られている。本発明以前に、植物の構造
遺伝子の一部または全体と融合させた異種の遺伝子によ
り、キメラタンパクが、植物細胞の中で発現されたこと
はなかった。本発明のベクター構築物は、そのようなキ
メラタンパクの生成を提供するものであり、従って、植
物における形質転換系の継続的な開発に寄与するもので
ある。 ［発明の目的および構成］ 細菌および哺乳動物の細胞において明らかにされたよ
うに、効果的な形質転換系の開発における基本段階の１
つは、有力な選択可能なマーカーを組み立てることであ
る。この様なマーカーは、形質転換により新しい遺伝子
を獲得した細胞の、選択および同定を可能にするもので
ある。本発明は、アミノサイクリトール抗生物質である
ハイグロマイシンＢが、形質転換した植物細胞の選択物
質となり得る新規な発現ベクターを提供するものであ
る。 さらに本発明は、非形質転換細胞を含有する系から形
質転換した植物細胞を選択する方法をも提供するもので
ある。この方法によれば、本発明のベクターに非選択性
のDNAを付加し、この修飾されたベクターで植物細胞を
形質転換し、そして、その様にしなければ選択不能であ
るDNAを含有しているハイグロマイシン耐性の形質転換
体を選択することができる。形質転換は非常に低い確率
で起こる現象であるため、数百万の細胞の中でどの細胞
が形質転換を行なうDNAを獲得したかを特定するため
に、このような機能試験が実際上必要となる。 本明細書で使用する用語について、以下に説明する。 組み換えDNAクローニングベクター １またはそれ以上の余分のDNAセグメントを付加する
ことができる、あるいは既に付加されているDNA分子か
らなる、自律的に複製可能なあらゆる物質を指し、プラ
スミドを含むが、それに限定されない。 組み換えDNA発現ベクター １またはそれ以上の転写および翻訳活性化配列が挿入
されている組み換えDNAクローニングベクター。 アミノ末端領域−暗号配列 その部分でポリペプタイドへの翻訳が開始され、か
つ、その部分からポリペプタイドのアミノ末端部分が翻
訳される様なmRNAの部分をコードしているDNA領域。 キメラタンパク プロモータおよびホモローガスな（同種の）暗号領域
の一部を含有する遺伝子によってコードされているRNA
から翻訳された、回収可能な、ヘテロローガス（異種
の）ポリペプタイド。 境界配列 Ｔ−DNAの末端を含有するDNA配列。 広範囲宿主（広宿主域）レプリコン 多種多様の細菌細胞に転移され、保持され得るDNA分
子。 接合（コンシュゲーション） 細胞同志を接触させ、ある種の細菌から他種の細菌
へ、DNAを転移させる操作。 クラウンゴール アグロバクテリウム・チュメファシエンスによって誘
発される植物腫瘍。 Tiプラスミド アグロバクテリウムが有する大きいプラスミドであっ
て、細菌との接合を促し、腫瘍誘発能を付与するプラス
ミド。 マイクロ−Tiプラスミド アグロバクテリウム中で複製可能で、Ｔ−DNA境界で
側面を接しているDNAを含有するプラスミド。 非腫瘍性遺伝子株 VIR機能は保持しているが、クラウンゴールを誘発す
ることができないアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株。 形質転換 受容宿主細胞にDNAを導入して受容細胞の遺伝型を変
化させ、その結果表現型を変化させること。 本発明は、機能的、かつ選択可能なマイクロTiプラス
ミドを開示するものである。すなわち、５側のオクトピ
ン・シンセターゼ（OCS）のプロモーターおよびこれに
結合するアミノ末端領域−暗号化配列遺伝子と、３′側
のノパリン・シンセターゼ遺伝子のターミネータ配列と
の間に、大腸菌のハイグロマイシン・ホスホトランスフ
エラーゼ（aph IV）遺伝子を挿入した。本発明のマイク
ロ−Tiプラスミドを組み立てるために、広範囲宿主ベク
ター中のＴ−DNA境界フラグメント（複数）の間に、こ
の様な構造を組み立てた。 本発明はまた、ハイグロマイシン耐性の植物細胞を作
成し、得られた細胞を選択するための方法であって、 ａ）ハイグロマイシン・ホスホトランスフエラーゼをコ
ードしている遺伝子を含有している本発明の組み換えDN
A発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス株を、植物または植物挿木（切り枝）に接
種し、 ｂ）ハイグロマイシン耐性の選択条件下で、該ベクター
によって形質転換された植物細胞を選択することからな
る方法を提供するものである。 第１図はプラスミドpCEL30の制限部位および機能地図
を示す。 第２図はプラスミドpCEL40の制限部位および機能地図
を示す。 第３図はプラスミドpCEL44の制限部位および機能地図
を示す。 発明についての詳しい記述 本発明は、植物中で機能的であり、かつ選択可能な組
み換えDNA発現ベクターであって： １）転移−DNAの境界配列で側面を限られている、プロ
モーターおよびこれに結合したアミノ末端領域−暗号化
配列、およびターミネータ信号配列を含んでいる転写単
位（ここに、これらの配列は、植物細胞中で天然に発現
される１またはそれ以上の遺伝子から導かれたものであ
る）； ２）前記プロモーターおよびこれに結合するアミノ末端
領域−暗号化配列と、前記ターミネータ配列の間に位置
する抗生物質耐性遺伝子−暗号化配列；および ３）アグロバクテリウム中で機能的なレプリコンを含有
するDNAフラグメント、からなる組み換えDNA発現ベクタ
ーを開示するものである。 本発明においては、中間体クローニングベクターであ
るプラスミドpCEL30の特異な（単一の）Bal II制限部位
に、ハイグロマイシン・ホスホトランスフエラーゼをコ
ードしている〜1.3kb BamH I−Bal IIフラグメントを、
２つの方向性で導入した。プラスミドpCEL30は、プロモ
ーター転写信号（シグナル）およびcos遺伝子の最初の1
1アミノ酸の暗号配列を持っている。ハイグロマイシン
・ホスホトランスフエラーゼ（aph IV）をコードしてい
る遺伝子の導入は、（ocs）暗号領域の読み枠を保持す
るようにして行なう。このようにして、pCEL30のBgl II
部位にaph IV遺伝子をサブクローンすると、この特定の
配列のためにocsの開始コドン付近にBal II−BamH I融
合体が生じる。得られたベクター、プラスミドpCEL40は
ocs−aph IV融合タンパクをコードしている。aph IV遺
伝子を反対の方向で挿入した時には、ハイグロマイシン
・ホスホトランスフエラーゼは生成しなかった。pCEL30
およびpCEL40それぞれの制限部位および機能地図を、添
付の第１図および第２図に示す。 プラスミドpCEL30はE.coli K12 RR1△M15/pCEL30か
ら常法通り単離できる［この菌株はノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリー，ペオリア，イリノイス
（Northern Regional Research Laboratory,Peoria,
Illinois）61604に寄託され、その一部を構成してい
る］。ハイグロマイシン・ホスホトランスフエラーゼ遺
伝子の原料であるプラスミドpOW20もまたNRRLに寄託さ
れているE.coli JA221/pOW20から容易に単離できる。
両株はそれぞれ寄託番号NRRL Ｂ−15915およびNRRL
Ｂ−15838の下、プラスミドの好ましい供給源および貯
蔵体として、誰でも利用できる。 プラスミドpCEL40はアグロバクテリウム中で複製する
ことができないので、まず、プラスミドpCEL40のマイク
ロＴ−DNAを、〜11.8kb EcoR Iフラグメントとして、広
範囲宿主ベクターpKT210に転移させた。この宿主ベクタ
ーは、ザ・プラスミド・リファレンス・センター，スタ
ンフォード・ユニバーシティ，パロ・アルト，カリフォ
ルニア94305（the Plasmids Reference Center,Stan
ford University,Palo Alto,California）から入手し
得る。本発明のプラスミドを組み立てる上で、この特定
の宿主域ベクターを使用することは臨界的なことではな
い。例えば、このような目的に有用な他のベクターに
は、pRK290［ディッタ他,1980,プロク・ナトル・アガド
・サイ（Ditta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci），77,734
7−7351頁］およびＲ 772［オエケマ他,1983,ネイチャ
ー（Hoekema et al.,Nature），303,179−180頁］が含
まれる。もし、適正に組み立て、植物ゲノムに挿入され
たなら、植物細胞中で融合タンパクが発現され、植物に
抗生物質耐性を与える細菌性酵素のような、所望のポリ
ペプタイドが作られるであろう。 従って、得られたマイクロ−TiプラスミドpCEL44は、
ハイグロマイシン耐性に関して選択が可能であり、かつ
機能的な植物遺伝子を含有するが故に、極めて有用であ
る。選択可能かつ機能的な植物遺伝子の存在に関連し
て、プラスミドpCEL44の特異的な構成は、植物形質転換
系に使用する上でさらに有益な貢献をする。例えば、Ｔ
−DNA境界配列は、本発明のマイクロ−Tiプラスミドの
転写単位が、植物細胞の染色体DNAに移送され、共有結
合的に組み込まれるのを助け；アグロバクテリウム機能
性レプリコンは、効率的なプラスミド複製手段となり、
他の当業者が行なっている同時（共）組み込み工程を不
要なものとし；そして唯一のSal Iクローニング部位
は、所望の遺伝子挿入のための便利な開裂部位となる。 上に説明したベクターは、機能的なホスホトランスフ
エラーゼaph IV遺伝子が存在するため、植物細胞にハイ
グロマイシン耐性を与える。前記ベクターに挿入された
特定のホスホトランスフエラーゼ遺伝子は、〜1.3kb Ba
mH I−Bgl II制限フラグメントであるが、他の既知のホ
スホトランスフエラーゼaph IV遺伝子で置換することも
できる。このような遺伝子には、ラオ等［アンチマイク
ロビアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Reoe
t al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、2
4、689〜695頁、1983］によって開示されたものがある
が、これらに限定されない。また、ハイグロマイシン耐
性を与える遺伝子を含有している、多種多様な、プラス
ミドpOW20の制限フラグメントで置き換えることもでき
る。ただしこのような制限フラグメントは、プロモータ
ー領域がその構造遺伝子の転写を行なう様に位置せしめ
る必要がある。ホスホトランスフェラーゼaph IV遺伝子
は、プラスミドpOW20の〜1.3kb BamH I−Bgl IIフラグ
メント上にコードされているので、この〜1.3kb BamH I
−Bgl IIフラグメントを含有するどの制限フラグメント
でも、感受性のある植物宿主細胞に対して、目的の耐性
を与える。前記のすべての遺伝子およびフラグメントは
機能的に等価であり、従って本発明の目的を達成するた
めに使用し、変換し得るということは、当業者の認める
所であろう。 本発明の例示的ベクターを組み立てるために使用する
制限フラグメントは、ライゲーションを容易にする様、
常法通り修飾することができる。例えば、特定のホスホ
トランスフェラーゼaph IVを含有している制限フラグメ
ント、ベクターの複製機能を含有しているDNA、あるい
はプロモーターまたはターミネータ配列を含有している
DNAに、分子リンカーを供給することができる。このよ
うにして後のライゲーションのための特異的な部位を簡
便に構成することができる。 さらに、その性質を変えるため、およびDNAのライゲ
ーションのための種々の制限部位を提供し、または削除
するために、あるヌクレオチドを付加、脱離または置換
することにより、このようなDNAフラグメントの任意の
ものを修飾することができる。当業者は、ヌクレオチド
の化学および遺伝子暗号を理解しているので、特定の目
的にとって、どのヌクレオチドが交換可能か、また、ど
の様なDNAの修飾が望ましいかを知っている。 本発明は、また、ハイグロマイシン耐性の植物細胞を
作成し、得られたそのような細胞を選択する方法であっ
て、 ａ）ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコ
ードしている遺伝子を含む本発明の組み換えDNA発現ベ
クターを含有するアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株を植物または植物挿木に接種し；そして、 ｂ）ハイグロマイシン耐性の選択条件下で、該ベクター
によって形質転換された植物細胞を選択することからな
る方法を開示するものである。 本発明の方法により、pCEL44のようなマイクロ−Tiプ
ラスミドを、アグロバクテリウム・チュメファシエンス
の種々の菌株にコンジュゲートする。E.coli K12 RR1
△M15/pCEL44、ヘルパープラスミドpRK2013を含有する
大腸菌（デッタ他、上記）、および野生型Tiプラスミド
pTiAch5を含有しているアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスLBA4013株を用いて３母株間（トリパレンタ
ル）交配を行なう。本発明の目的からして、特定のヘル
パープラスミド、または特定のA.チュメファシエンス株
の使用に限定するものではない。この点に関して、バグ
ダサリアン等［Bagdasarian et al.,1981.ジーン（Ge
ne），16,237〜247頁］が記載しているヘルパープラス
ミドのいずれかを、プラスミドpRK2013の代りに使用し
てもよい。何故なら、このカナマイシン耐性のヘルパー
プラスミドpRK2013の唯一の機能は、マイクロ−Tiプラ
スミドの移動に関するトランス−コンプリメント（輸送
補助）作用であるからである。同様に、機能性Vir領域
を有する野生型Tiプラスミドを含有している腫瘍遺伝子
性アグロバクテリウム・チュメファシエンス株であっ
て、自身のTiプラスミドを植物細胞へ転移させ、植物細
胞を形質転換することが可能な菌株を本発明に使用する
ことができる。本発明において使用するのに適当な種々
のアグロバクテリウム・チュメファシエンス株は、一般
に入手可能なものである。たとえば、ATCCカタログ・オ
ブ・ストレインＩ（ATCC Catalogue of Strain
I）、66頁、15版、1982を参照。 本発明の好ましい実施態様では、非腫瘍遺伝子性、即
ち非病原性（avirulent）のアグロバクテリウム・チュ
メファシエンス株を使用する。Ｔ−DNA領域を削除したT
iプラスミドを入れることにより、そのような株を組み
立てることができる。本発明において使用するために入
手し得る特定のアグロバクテリウム・チュメファシエン
ス株は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4
404である。この株は、ホーイカーズ（Dr.P.J.J.Hooyka
as）によって開発され、CBS191.83の番号でバーン（Baa
rn）のセントラル・コレクティー・バン・シンメルカル
チュアース（Centrale Collectie van Schimmelcultur
es、CBS）に寄託されている。また、この株は、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー（Northern
Regional Research Laboratory）にも寄託されてそ
の一部を構成しており、寄託番号NRRL Ｂ−15920のも
とで、一般的に利用できる。この細菌株にさらされた植
物細胞はクラウンゴールを形成しない。逆に、容易に成
熟植物まで再生されるハイグロマイシン耐性のカルスを
生成する。 アグロバクテリウムで植物組織を感染させることは、
当業界で周知の簡単な技術である。通常、カミソリで切
る、針で穴を開ける、研摩剤でこする等多数の方法のど
れかで、植物に傷をつける。次いで、腫瘍誘発性細菌を
含有する溶液を、この傷に接種する。本発明では、ニコ
チアナ・タバクム（Nicotiana tabacum cv Wisconsi
n 38）の無菌的に先端を切った苗木上にゴールを惹起
させるために、野生型Tiプラスミドおよびマイクロ−Ti
プラスミドpCEL44で構成されるバイナリー（二成分系）
ベクターを含有しているアグロバクテリウムを使用し
た。さらに、ニコチアナ・プラムバージニフォリア（Ni
cotiana plumbaginifolia）およびニコチアナ・タバク
ムcvウィスコンシン38の葉切片からカルス生成を誘導す
るために、マイクロ−TiプラスミドpCEL44を含有する、
非腫瘍遺伝子性のアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株を使用した。上記の両変種は、ユナイテッド・ス
テイツ・デパートメント・オブ・アグリカルチャーズ・
タバコ・リサーチ・ラボラトリー（United States De
pertment of Agriculture's Tobacco Research La
boratory）、私書箱16G、オックスフォード（Oxfor
d）、ノース・カロライナ（North Carolina）27565か
ら容易に入手できる。アグロバクテリウムを介してTiプ
ラスミドを導入（トランスフォーム）することができる
ならば、いずれの植物からの細胞でも利用できるので、
特定の植物種の細胞を使用することに限定されるもので
はない。たとえば、トマト、ジャガイモ、タバコ、ヒマ
ワリおよびダイズ等の双子葉植物、あるいはユリ科およ
びアマリリス科に属するような単子葉植物から、細胞を
得ることができる。 生じた増殖腫瘍を切り取り、代表的なタバコクローン
からDNAを単離し、BamH I、およびBamH IとHind IIIか
らなる制限酵素で消化し、サザーンブロッティングにか
けた。Ｔ−DNAの構造を分析するためのハイブリダイゼ
ーションプローブとして使用するため、〜1.3kbのBamH
I−Bgl IIハイグロマイシン耐性付与フラグメントを、
ニックトランスレーションにかけた。 ハイグロマイシン耐性と同様に、Tiプラスミドがコー
ドしている他の機能をも発現する植物を再生するため
に、本発明のTiプラスミドで形質転換した植物細胞を使
用する。本発明は、他の植物種または株に由来する有用
な植物遺伝子を導入することにより、植物組織および植
物全体を、遺伝学的に修飾するのに有用であり、このよ
うな植物遺伝子には、貯蔵タンパク、レクチン、並び
に、病気、昆虫および除草剤に対する抵抗性因子、およ
び環境ストレスに対する耐性因子等をコードする遺伝子
が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発
明の、方法、プラスミドおよび形質転換体は、植物中の
遺伝子を導入する新規方法を、植物の品質改良家に提供
し、また植物の発生を研究するための分子プローブを、
植物の分子生物学者に提供するものである。 次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。 実施例１ E.coli RR1△M15/pCEL30の培養およびプラスミドpCEL3
0の単離 A.E.Coli RR1△M15/pCEL30の培養 通常の微生物学的操作に従い、アンピシリン50μg/ml
を含むＬ培地（10g/カゼイン加水分解物、5g/酵母
エキス、5g/ NaCl、1g/グルコース、pH7.4）750ml
中で、E.Coli RR1△M15/pCEL30を増殖させる。37℃で
激しく振盪しながら24時間インキュベートした後、培養
物を集める。 B.プラスミドpCEL30の単離 培養物を遠心し、細胞のペレットを、新調した溶菌緩
衝液（50mMトリス−HCl（pH8）、10mM EDTA、9mg/mlグ
ルコース、2mg/mlリゾチーム）50ml中に再懸濁させる。
氷冷下、45分間インキュベートした後、この懸濁液を0.
2N NaOHおよび１％SDSの溶液100mlに混合し、次いでさ
らに５分間氷冷した。3M酢酸ナトリウムをさらに90ml加
え、混合物を60分間氷冷する。 遠心により細胞残渣を除き、上澄液をエタノール500m
lと混合する。−20℃で２時間放置した後、遠心により
核酸をペレット化し、10mMトリス−HCl（pH8）−10mM
EDTA90mlに再懸濁する。 核酸溶液に、塩化セシウム90gおよび10mg/mlエチジウ
ムブロマイド溶液0.9mlを混合し、次いで40,000rpmで24
時間遠心し、プラスミドDNAを精製する。プラスミドDNA
バンドを回収し、さらに40,000rpmで16時間遠心する。
プラスミドDNAバンドを再び回収し、塩化セシウムおよ
びエチジウムブロマイドを通常の方法で除き、次いで90
g/酢酸アンモニウムを含有する２倍量のエタノールを
加えて沈澱させる。ペレット化したDNAを0.2mg/mlの濃
度でTE緩衝液（10mMトリス−HCl（pH8）,1mM EDTA）に
溶解させる。 実施例２ E.coli JA221/pOW20の培養およびプラスミドpOW20の単
離 A.E.coli JA221/pOW20の培養 E.coli RR1△M15について記載した前記実施例１と同
様にして、本細菌を増殖させる。 B.プラスミドpOW20の単離 プラスミドpCEL30について記載した前記実施例１と同
様にして、本プラスミドを調製する。 実施例３ E.coli RR1△M15/pCEL40の構築 A.プラスミドpCEL30のBgl II消化およびウシ腸ホスファ
ターゼによる処理 酵素製造元＊推奨の組成を有する反応液150μ中
で、プラスミドpCEL30DNA5μｇをBgl II制限酵素50単位
で消化する。消化は37℃で90分間行なう。 始めに0.5Mトリス−HCl（pH8）−1mM EDTA8.75μ
を反応物に混合し、次いでウシ腸ホスファターゼ（ベー
リンガー・マンハイム（Boehriger Mannheim））1.25
単位を混合し、37℃で15分間インキュベートする。混合
物を緩衝フェノール、次いでエーテルで抽出し、酢酸ア
ンモニウムを含有する２倍量のエタノールを加え沈澱さ
せる。−70℃で30分間放置した後、DNAをペレット化
し、10μg/mlの濃度でTE緩衝液に再溶解させる。 ＊制限酵素およびその他の酵素は次の供給者から容易
に入手できる。 ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ，インコーポレ
ィテッド（Bethesda Research Laboratories,Inc.）、
私書箱6010,ロックビル，メリーランド（Box 6010,Roc
kville,Maryland）20850。 ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boeh
ringer Mannheim Biochemicals）、7941キャッスルウ
ェイ・ドライブ，ピー・オー・私書箱50816,インデアナ
ポリス，インデアナ（Castleway Drive P.O.Box 508
16,Indianapolis,Indiana）46250。 ニュー・イングランド・バイオ・ラブズ.,インコーポ
レィテッド（New England Bio Labs.,Inc.）、32ト
ザー・ロード，ベバリー，マサチューセッツ（Tozer R
oad,Beverly,Massachusetts）01915 B.プラスミドpOW20のBamH I−Bgl II消化および〜1.3kb
フラグメントの単離 酵素製造元推奨の方法に従い、プラスミドDNA約20μ
ｇを制限酵素BamH IおよびBgl IIで消化する。 消化により得られたDNAフラグメントを、通常のアガ
ロースゲル電気泳動法により分画し、電気泳動中にゲル
に挿入したNA−45DEAE紙（シュライハー・アンド・シュ
エル，インク.,キーン，ニュー・ハンプシャー（Schlei
cher ＆ Schuell Inc.,Keene,New Hampshire）0343
1）に捕獲して単離する。マイクロ遠心管を用い、紙を
おおうに十分な量の高塩緩衝液（1.0M NaCl;0.1mM ED
TA;および20mMトリス,pH8.0）中で紙を５秒間振り回す
ことにより、紙からDNAを溶出させる。時々旋回させつ
つ、紙を55〜60℃で10〜45分間インキュベートする。緩
衝液を除き、紙をさらに緩衝液約50μで洗浄する。こ
のDNAを始めにフェノールで、次いでエーテルで抽出
し、約20μg/mlの濃度でTE緩衝液に再懸濁させる。 C.ライゲーション 0.8単位のT4DNAリガーゼ（BRL）を含有するリガーゼ
緩衝液（50mMトリス−HCl,pH7.6;10mM MgCl2:10mM DTT;
および1mM ATP）15μ中で、ホスファターゼ処理をし
た10ngのBgl II−切断プラスミドpCEL30と、精製した〜
1.3kb BamH I−Bgl IIフラグメント50ngを混合する。こ
の混合液を15℃で一晩インキュベートする。 D.E.coli RR1△M15の形質転換および選別 滅菌した60mMの塩化カルシウム溶液15μにライゲー
ション混合物を混合する。次いで、30mM塩化カルシウ
ム,15％グリセリン中で20倍に濃縮して−70℃で保存し
ておいた、コンピテントE.coli RR1△M15細胞の懸濁液7
0μを加える。60分間氷冷した後、形質転換混合物を4
2℃で２分間熱処理し、次いでＬ培地0.5mlと共に37℃で
90分間インキュベートする。 混合物のサンプルを、50mg/のアンピシリンを含有
するＬ培地に広げ、15g/の寒天で固型化する。次い
で、形質転換した細胞のコロニーが生育するように、こ
のサンプルを37℃で一晩インキュベートする。 E.プラスミドpCEL40を含有するE.coli RR1△M15のクロ
ーンの同定 形質転換により生じたコロニーを、50mg/mlのアンピ
シリンを含有するＬ培地5mlに接種し、37℃で一晩増殖
させる。ホルムズ（Holmes）およびキグレー（Quigle
y）の方法［アナリィティカル・バイオケミストリー（A
nalytical Biochemistry）、114:193頁;1981］に従
い、この培養サンプル1mlよりプラスミドDNAを調製し、
TE緩衝液50μに再溶解する。DNA溶解7.5μと、制限
酵素Hind III,Pst I,Bgl IIおよびBgl II−Hind II混合
品のそれぞれを約５単位および酵素製造元の指示による
他の試薬を含んでいる反応液10μ中でプラスミドを消
化する。適温で60分間放置の後、消化物を通常の方法に
よるアガロースゲル電気泳動によって分析する。制限酵
素によりpCEL40から生じたフラグメントの大きさは第２
図に示したプラスミドの構造と一致する。 実施例４ マイクロ−TiプラスミドpCEL44の構築 A.プラスミドpKT210のEcoR I消化およびホスファターゼ
処理 酵素製造元推奨の組成を有する反応液150μ中で、
プラスミドpKT210（５μｇ）をEcoR I制限酵素50単位で
消化する。37℃で90分間放置した後、反応物を実施例３
と同様にして、ウシ腸ホスファターゼで処理し、10μg/
mlの濃度になる様、TE緩衝液に再溶解する。 B.プラスミドpCEL40のEcoR I消化 実施例3EプラスミドpCEL40DNA調製品15μを、37℃
で90分間、反応液２μ中のEcoR I制限酵素10単位で消
化する。次いでフェノールで抽出し、次いでエーテルで
抽出する。−20℃で酢酸アンモニウムを含有する２倍量
のエタノールを加え、消化されたDNAを沈澱させ、TE緩
衝液20μに再溶解する。 C.ライゲーション、形質転換およびE.coli RR1△M15/p
CEL44の選別 実施例3Cと同様にして、ホスファターゼ処理したEcoR
I−切断pKT210（10ng）とEcoR I−切断pCEL40（５μ
）をライゲーションし、実施例3Dと同様にして、E.co
li RR1△M15に導入しぃて形質転換する。 10mg/のクロラムフェニコールを含有する固形Ｌ培
地上での増殖能によって形質転換した細胞を選別する。
実施例3Eと同様にして、Pst I、Hind IIIおよびBamH I
による、細胞の構成成分であるプラスミドの制限酵素分
析により、pCEL44を含有するコロニーを同定する。制限
部位および機能地図を添付の第３図に示す。 実施例５ pCEL44のアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4
013への接合 A.親株の増殖 固形Ｌ培地上、37℃で一晩E.coli K12 RR1△M15/pCE
L44およびE.coli pRK2013を増殖させる。固形Ｌ培地
上、28℃で２日間、アグロバクテリウム・チュメファシ
エンスLBA4013を増殖させる。 B.3親株間接合および選別 上記３種の株、１ループづつを30mM硫酸マグネシウム
1ml中で混合する。次いで、固形TY培地（5g/カゼイン
加水分解物、5g/酵母エキス、15g/寒天）上に、こ
の混合物１滴を落とし、28℃で一晩インキュベートす
る。 増殖細菌を10mM硫酸マグネシウム溶液30mlに再懸濁さ
せ、この系列希釈試料0.1mlを、100mg/ナリディキシ
酸および2mg/クロラムフェニコールを含有する固形TY
培地上に広げ、28℃でインキュベートする。 ２〜４日の増殖後、トランス接合体が個々のコロニー
を生じる。これらを、100mg/のナリディキシ酸および
2mg/のクロラムフェニコールを含有する液体TY培地25
mlに、各個に接種し、28℃で振盪しながら、さらに２日
間インキュベートする。次いでカッセらの方法（ジャー
ナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー・113（C
asse et al.,Journal of General Microbi−ology）:22
9−242頁;1979）により、トランス接合体のプラスミド
内容を調べる。 実施例６ タバコクラウンゴール細胞に於けるハイグロマイシン耐
性の導入および発現 栽培品種Wisconsin38の無菌タバコ植物を次のように
生育させる。種子を10％Clorox漂白剤で10分間処理して
滅菌し、95％エタノールですすぎ、次いで多量の滅菌水
ですすぐ。MS主要塩類および副塩類［フィジオル・プラ
ント（Physiol.Plant.），15:473〜497頁,1962］、30g/
のショ糖、100mg/のミオイノシトール（シグマ（Si
gma））,2.5mg/のチアミンHCl（イーライ・リリー（E
li Lilly））,1.25mg/のピリドキシンHCl（リリー
（Lilly））および1.25mg/のパントテン酸カルシウム
（シグマ（Sigma））で構成され（pH6）、9g/のDifco
Bacto寒天で固型化したR5培地の表面に種をまく。発
芽した種は同じR5培地上に摘み取り、約２ケ月毎に、マ
ゼンタ（Magenta）GA7箱中に挿木（ベジタティブ・カッ
ティング）を行なって植物を維持する。日照16時間、照
度150ルックスおよび温度26℃の光照射培養器で、その
挿木を生育させる。 アグロバクテリウムを接種するため、滅菌した外科用
メスを用いて、頭部および葉を切り落とし、頂上および
広がった葉柄に切り口を残す。数分以内に、目で見て切
り口面に淡黄色−褐色の堆積物が観察されるまで、切り
口面にアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA401
3/pCEL44の培養物を塗布する。切り口をつけ、菌を接種
した植物にラベルを付け、箱に密閉し、光照射培養器に
戻す。コールが誘発される間、周囲温度が決して30℃を
超えないよう注意する。 接種後15日で、Wisconsin38の滅菌植物のほとんどの
接種切り口に、ゴールの生成が認められる。このゴール
を個々に切り取り、番号を付け、カルベニシリン（シグ
マ（Sigma））およびバンコマイシン（バンコシンHCl,
リリー（Lilly））をそれぞれ200μg/ml添加したR5培地
に植える。腫瘍誘起細菌を殺し、無菌培養物を得るため
のこの処理には、上記抗生物質を含有する培地上で３週
間、同培地に移植してさらに３週間、25〜27℃の暗所で
クラウンゴールを培養して行なう。 これらのクラウンゴールのカルス組織培養物のハイグ
ロマイシンに対する感応性を試験するため、MS塩、30g/
ショ糖、1mg/チアミンHCl、100mg/ミオイノシト
ール、9g/ Difco Bacto寒天、1mg/のIAA（インド
ール−３−酢酸；シグマ）および0.1mg/のキネチン
（６−フルフリルアミノブリン；シグマ）（pH6）を含
有するカルス増殖培地約15mlを満たしたFalcon1007ペト
リ皿に、100mgのカルスサンプルを植える。このサンプ
ルを滅菌した後、前記濃度のバンコマイシンおよびカル
ベニシリン、および50μg/mlのハイグロマイシンＢ（リ
リー）を加える。27℃の暗所で３週間インキュベートし
た後この試験の結果を調べ、正の増殖表現型を回収し
た。 実施例７ ハイグロマイシン耐性ゴール組織中のaph IV配列の存在 A.植物DNAのサザーンブロット “マイズ・フォー・バイオロジカル・リサーチ（Maiz
e for Biological Research）”［ダブリュー・エフ
・シェリダン編，パブル・プラント・モレギュラー・バ
イオロジー・アスン；チャーロッテスビレ，バージニア
（ed W.F.Sheridan,publ.Plant Molecular Biology
Assn;Charlottesville,Virginia）,1982］の161〜164頁
に記載されたリビン（Rivin）らの方法により、約10gm
のゴール組織から核DNAを調製する。 酵素製造元推奨組成の反応液200ml中で、BamH Iおよ
びBamH I−Hind III混合の制限酵素それぞれ100単位
で、各DNA10μｇを消化する。37℃で４時間インキュベ
ートした後、酢酸アンモニウムを含有する400μのエ
タノールを加え、−70℃で30分間、消化したDNAを沈澱
させる。このDNAを、TE緩衝液25μ中に、４℃で一晩
溶解させる。 消化したDNAフラグメントを通常のアガロースゲル電
気泳動で分画し、製造元のプロトコールに従い、ジーン
スクリーン（Gene Screen）、即ちハイブリゼーション
移行メンブラン（ニュー・イングランド・ニュークレア
ー，ボストン，マサチューセッツ（New England Nucle
ar,Boston,Massachusetts））に移し換える。 B.プラスミドpOW20の1.3kbフラグメントからのプローブ 実施例3B記載の方法により精製した、プラスミドpOW2
0のフラグメントから、ハイブリダイゼーションプロー
ブを作る。通常の方法（マニアティス他,1982・モレキ
ュラー・クローニング，コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，
ニューヨーク（Maniatis et al.,1982Molecular Cloni
ng,Cold Spring Harbor Laboratory,Coid Spring Ha
rbor,New York）を参照）により、DNase IおよびDNAポ
リメラーゼを使用し、プローブがDNA0.2μｇあたり20μ
Ciの［32−Ｐ］dCTPを持つように、フラグメントをニッ
クトランスフレーションする。 C.aph IV配列相同体（ホモロギー）検出のためのハイブ
リダイゼーション 0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、25mMリン酸ナ
トリウム（pH6.7）、2g/フィコール（Ficoll）400、2
g/ポリビニルピロリドン360、2g/ウシ血清アルブミ
ン、１％ジデシル硫酸ナトリウム、10％硫酸デキストラ
ン、50％ホルムアルデヒドおよび250mg/の変性した、
超音波処理ウシ胸腺DNAを含有する溶液中で、42℃で一
晩、前記植物DNAフラグメントを含有しているジーンス
クリーンをプレハイブリダイズする。 ハイブリダイゼーションは、同一組成の新鮮な溶液中
で、熱変性した前記プローブDNA（溶液25mlあたり0.2μ
ｇ）を追加して行なう。42℃で一晩インキュベートした
後、このジーンスクリーンメンブランをGS緩衝液（0.3M
NaCl、60mMトリス−HCl、2mM EDTA、pH8）で２回洗浄
する。各洗浄は室温で１時間行なう。次いでメンブラン
を、１％SDSを添加した0.1×GS緩衝液で、70℃、１時
間、厳密に洗浄する。この操作を繰り返し、次いで室温
下、0.1×GS緩衝液でさらに２回ジーンスクリーンを洗
浄する。メンブランを吸収乾燥し、−70℃で強化したス
クリーンを用いて一晩Ｘ線フィルムに露出する。 実施例８ 植物の再生 A.非クローン化ゴール組織からの再生 制限レベルのハイグロマイシンＢの存在下で、強い増
殖を示す非クローン化ゴール組織について、選択圧下で
植物再生を誘起する処理を行なう。この処理は、0.3mg/
IAA、10mg/ 2−ip（６−γ，γ−ジメチルアリル
アミノプリン，ギブコ＊（Gibco））、100mg/ミオイ
ノシトール、1mg/チアミンHCl（pH6）および30g/シ
ョ糖を含有し、0.9％Difco Bacto寒天に50μg/mlのハイ
グロマイシンを加えて固形化したMS培地上に、カルス組
織のかけらを置いて行なう。この処理物を１ケ月間光照
射インキュベーター中に置き、次いで組織中の暗緑色の
発芽領域を選別し、同一の高濃度のサイトキニン、ハイ
グロマイシンを添加した培地に移し換え、さらに１ケ月
光照射下でインキュベートする。抗生物質を加えた再生
培地上で、上記の２期間が経過した後、単一の植物体を
切り取るために苗木の緑がかった発芽部分を切り取り、
滅菌触媒を生育させるため、固形培地上、光照射下でさ
らに培養する。３種の異なる組織系統から十分に生育し
た植物が得られたら、この植物中のハイグロマイシン耐
性遺伝子の発現を、次の様にして試験する。約1cm平法
の葉片を切り出し、ハイグロマイシン含有あるいは非含
有のカルス増殖培地上に置く。 対照組織は、ここでのクラウンゴールを誘導する実現
の出発材料である、無菌Wisconsin38の植物の葉片であ
る。これらの標品を27℃の暗所でインキュベートする。
３週間後、抗生物質を含有しない培地では、Wisconsin3
8およびゴール組織から再生した植物は両方共、葉細胞
の拡大および葉片移植体の端部でのカルス増殖を示す。
しかし、抗生物質を含有する培地では、対照のWisconsi
n38の葉は細胞分裂を開始することができず、褐色とな
り、枯れかかっていた。一方、ハイグロマイシン耐性の
ゴール培養物から選択圧下で再生した植物の葉は、ハイ
グロマイシンを含有しない皿での結果に匹敵する、細胞
の拡大、増殖およびカルス生成を示した。これらの結果
は、再生植物がpCEL44起因のハイグロマイシン耐性遺伝
子を含有し、かつ発現可能であるということを示してい
る。 ＊植物の培地および補助剤はギブコ、グランドアイラ
ンド、ニューヨーク（Gibco,Grand Island,Now York）
より容易に入手できる。 B.ハイグロマイシンタ耐性ゴールの単細胞から誘導され
たクローン 抗生物質を含有しない1/.1培地（MS塩、1mg/ IAA、
0.1mg/カイネチン、0.9g/ Difco Bacto寒天、100ml
/ミオイノシトール、1mg/チアミンHCl、30g/ショ
糖、pH6をオートグレーブで滅菌し、Falcon1005ペトリ
皿に50ml/皿で配分する）上で、１ケ月毎に継代培養し
ながら、27℃の暗所でハイグロマイシン耐性のクラウン
ゴール系統を維持する。寒天なしで調製し、125mlの三
角フラスコに50ml/フラスコの割合で配分し、泡止めの
栓をした、上記と同一の培地に、上記培養系統のサンプ
ルを分散させる。この様にして開始した懸濁培養を、27
℃の暗所、135rpmの旋回振盪器中で振盪する。１週間
後、カルスの固い塊を除き、クラウンゴール細胞の懸濁
培養物を１週間単位で、新しい液体培地に1:1で分配し
て継代培養する。これらの短期間懸濁物は、それがカル
スの塊にもどるまで、１ケ月間振盪培養してもよい。 単細胞誘導クローンを生成させるために、以下のよう
にして、これらの培養物からプロトプラストを調製し、
次いで極端に低密度で培養する。細胞を濃縮するため
に、短期間懸濁培養物を軽く遠心し、上澄液の増殖培地
を除き、5mlの濃縮した細胞に、６％w/vセルリジン（オ
ノヅカR10、キンキヤクルト（Onozuka、Kinki Yakult M
fg.）、日本）、１％w/vマセラーゼ［マセロザイムR1
0、キンキヤクルト（Macerozyme、Kinki Yakult）提
供］、９％w/vマンニトール（シグマ）、3mM MES（２−
（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸、シグマ）（pH
5.8）を含有する濾過滅菌した酵素混合物25mlを混合す
る。細胞と酵素の混合物をFalcon1005ペトリ皿に入れ、
50rpmの低回転振盪をしながら、室温で4.5時間インキュ
ベートする。顕微鏡でプロトプラストの放出を確認した
後、すきまサイズ259および231ミクロンの金網ふるい
（ダブリューエス・タイラー、インク・オブ・メンタ
ー、オハイオ（W.S.Tyler,Inc.of Mentor,Ohio））で
この標品を濾過し、25％w/v Ficoll DL（シグマ）（重
量平均分子量が約400,000となるように合成した水溶性
のショ糖とエピクロルヒドリンの共重合体）となるよう
に作ったプロトプラスト培養用培地と1:1で混合する。
この混合物を丸底ガラス製の遠心管の底に入れ、８％w/
v Ficollとなるように作った同一のプロトプラスト培養
用培地数mlを上層に浮かべ、最後に２％w/v Ficollとな
るように作ったプロトプラスト培養用培地１〜2mlの薄
い層を浮かべる。Ficollを含有する溶液はすべてフィル
ター滅菌しておく。この非連続的密度勾配の調製物を、
回転バケット中、周囲温度、50XGで30分間遠心する。プ
ロトプラストが最上層となり、本実験では、1mlあたり
２×105個という高濃度の生存細胞を、大口径のパスツ
ールピペットを使って集めた。使用するプロトプラスト
培養の培地はKP［カオおよびミカイルークのK3培地，プ
ランタ（Kao ＆ Michayluk,planta），120:250−227頁,
1974］であって、ミュラー（Muller）らの文献［フィジ
オロジー・オブ・プラント（physiol・Plant）、57:35
−41頁、1983］に記載されているカボッチェ（Caboch
e）の方法により、マンニトールで浸透圧を、5Mに改良
したものである。 このようにして集めたプロトプラストを、高濃度（集
めた時のままの）で、Falcon3001皿に1mlづつ入れ、26
℃の暗所で培養する。６日後、増殖性、致死的染料エバ
ンス青（シグマ）を排除するか否かにより決定される細
胞生存能力、および細胞壁の形成および分裂について調
べる。細胞の直径は顕微鏡で測定する。標品を、107ミ
クロン直径の金網製フィルターで濾過する。標品に細胞
集合体が存在しないことを確認する。マンニトールを使
用して、培養培地と同一の浸透力に調整したカボッチェ
（前記）のＣ培地1mlあたり、最終的に約100の生存細胞
密度となるように、細胞数を数えながら、細胞を順次希
釈する。この希釈物をペトリ皿に一皿あたり約15ml入
れ、光照射下でインキュベートする。単細胞誘導コロニ
ーは、ある培養物からは１ケ月以内に、他の培養物から
は２ケ月後に得られた。このコロニーを大口径パスツー
ルビペットを使って液体培地から取り出し、液体培地1
/.1に浸したWhatman＃３濾紙上に置く。この濾紙上の培
養物を、必要なら液体培地を添加しながら、さらに１ケ
月光照射下でインキュベートし、次いで固形培地1/.1上
に取り出し、27℃の暗所で培養する。 単細胞から誘導したカルス培養物のハイグロマイシン
耐性の発現を試験するため、一対のクローン化カルス組
織系統サンプルを、50μg/mlのハイグロマイシンＢを含
有する1/.1固形培地および抗生物質を含有しない同一培
地に置く。27℃の暗所で３週間培養した後、対の培養物
を比較する。56例の内52例で、50μg/mlのハイグロマイ
シンＢの存在下でも、非存在下と同様に生育し、ハイグ
ロマイシン耐性を示した。 C.クローン化した組織からの再生 実施例8Bの、単細胞をクローニングするプロトプラス
ト法により誘導した、ハイグロマイシン耐性のカルス組
織培養物を、再生プロトコールにかけることができる。
MS塩、100mg/ミオイノシトール、1mg/チアミン−HC
l、0.3mg/ IAA、10mg/ 2−ip、0.9g/ Difco Bact
o寒天および30g/ショ糖（pH6）を含有する固形培地上
にカルス片を置き、光照射下で１ケ月間培養する。緑の
発芽組織片を再度同一の培地で継代培養する。このよう
にして生育させた苗木を、光照射下で十分に生育した植
物まで育てるため、実施例６に記載したR5培地で培養す
る。得られた植物に対して、実施例8Aと同様に、ハイグ
ロマイシンを含有するカルス増殖培地の上に葉片移植体
を置き、暗所でインキュベートすることにより、プラス
ミドpCEL44より導入したハイグロマイシン耐性遺伝子の
発現を試験する。この植物は実施例８と同様、葉片移植
体の切り口上に葉細胞の拡大およびカルスの生成を見
せ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を示した。 この植物を土に移植し、この植物が、ハイグロマイシ
ン耐性遺伝子のメンデル性遺伝子をすることを証明する
ため、温室で、生殖能を有する成熟体まで生育させる。
この操作により、pCEL44を含有する二重（バイナリー）
ベクターが、腫瘍を誘起する発ガン遺伝子を伴うことな
く、ハイグロマイシン耐性遺伝子だけを転移させるここ
ができることが証明され、かくして性的能力のある植物
に再生することが可能な植物細胞中に、希望する特性を
導入する新規かつ有用な方法が提供されたのである。 実施例９ アグロバクテリウム・チュメファシエンスLB4405へのpC
EL44の接合 実施例５と同様にして、E.coli K12 RR1△M15/pCEL
44、E.coli pRK2013およびアグロバクテリウム・チュ
メファシエンスLBA4405の３親株間接合を行なう。20mg/
リファンピシンおよび2mg/クロラムフェニコールを
含有するTY固形培地上でトランス接合体を選別する。 実施例10 カルス中へのハイグロマイシン耐性の導入および発現 A.ニコチアナ・プラムバギニフオリア（Nicotiana plu
mbaginifolia） ニコチア・プラムバギニフオリアの種子をエタノール
に短期間さらして滅菌し、0.5％Chlorox漂白剤で３分間
処理する。滅菌水ですすいだ後、0.5mg/のギベレリン
酸を含有する溶液中で、１時間種子をインキュベートす
る。次いで、0.6％フィトアガー（phytagar）で固形化
したMS培地に種を蒔く。27℃、日照時間16時間、照射強
度約700ルックスの条件で生育させる。 ３ケ月経過した植物から約1cm平方の葉部を切り取
り、切り口にアグロバクテリウム・チュメファシエンス
LB440/pCEL44の培養物を塗布する。1mg/ナフタレン酢
酸（NAA）および0.1mg/ベンジルアデニン（BA）を含
有する固形MS培地上、27℃の暗所で３日間、感染部分を
インキュベートする。次いで、200mg/バンコマイシン
および200mg/カルベニシリンを添加した同一培地に感
染部分を移植する。１ケ月間増殖させた後、1mg/mlNA
A、0.1mg/ml BAおよび50mg/ハイグロマイシンＢを含
有するMS培地に、カルス片を移植し、インキュベートを
続ける。 ３週間後、0.1mg/ NAAおよび1mg/ BAを添加した
固形MS培地に、カルスの小片を移植し27℃、日照時間16
時間でインキュベートし、苗条を再生させる。この苗条
を、根の生育促進剤を含有しない固形MS培地に移植す
る。 B.ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum） タバコカルスの懸濁培養液（NT575）の一部を、固形
培地（実施例8Cの記載の）に流し込む。過剰の水を除去
した後、２層の滅菌Whatman＃１濾紙を細胞上に置く供
給細胞層系を組み立てる。細胞を26℃の暗所で一晩イン
キュベートする。 アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404/pC
EL44培養物を、2mg/のクロラムフエニコールを含有す
るTY培地上で増殖させる。5g/カゼイン加水分解物お
よび3g/酵母エキスを含有する液体培地に、単離した
細胞を移し、旋回振盪器中、26℃で一晩振盪する。３ケ
月経過した植物から約1cm平方の葉部を切り取り、この
細菌の液体培養物に６〜８分間浸し、吸収乾燥し、次い
で上で調製した供給細胞層系をおおう濾紙の上に置く。 光照射下、26℃で２日間、この葉片をインキュベート
した後、取り上げ、カルベニシリンおよびバンコマイシ
ンを各200μg/ml含有する再生培地に移植する。この培
地上、光照射下でさらに12日間経過させた後、50μg/ml
のハイグロマイシンを含有する同一培地に、葉片を移植
する。この移植体を、光照射下、26℃で更に３ケ月間培
養する。 ハイグロマイシン含有培地上で、このように処理した
葉片から、苗が再生し、生育する。前記と同様に、ただ
し逆の方向にハイグロマイシン耐性遺伝子を含有してい
るアグロバクテリアで処理した葉片からは苗は生育しな
い。 このような葉の部分から植物体を摘み取り、ホルモン
を含有しないR5培地で生育させ、実質的に実施例8Aと同
様にして、50μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するカ
ルス増殖培地に葉片を移植して、ハイグロマイシン耐性
を試験する。再生培地の代わりにカルス増殖培地（実施
例10A）を使用する以外は、上記と同様にして葉部を処
理する。バンコマイシンおよびカルベニシリンを各200
μg/ml添加したカルス増殖培地でこの葉部を増殖させ
る。このようにして調製したものを26℃の暗所で２週間
インキュベートし、次いで50μg/mlのハイグロマイシン
Ｂを添加した培地に移植する。ハイグロマイシン耐性
は、抗生物質を含有する培地でカルスが増殖すること、
および実施例７で示したように、aph IV配列で植物DNA
のサザーンブロットをプローブすることによって証明さ
れる。
詳しくは、植物中で機能的であり、かつ形質転換した植
物の選別が可能な組み換えDNA発現ベクターに関する。 ［従来技術］ アグロバクテリウム・チュメファシエンス（Agrobact
erium tumefaciens）による双子葉植物のクラウンゴー
ルの形成は、植物細胞の染色体DNA中に、腫瘍誘発性プ
ラスミド（Tiプラスミド）のトランスファーDNA（Ｔ−D
NA）と呼ばれる小さいセグメントが、転移し、共有結合
的に組み込まれることに起因する。転移したＴ−DNAは
植物細胞中で発現することができ、これは、いくつかの
ポリアデニル化された転写体（転写物）をコードしてい
る。転写体のあるものは、オパイン合成、および腫瘍増
殖に関与していることが知られている。この後者の転写
体は腫瘍遺伝子によってコードされているものである。
これらの転写体のどれも、Ｔ−DNAの転移にとって必須
ではないことがわかっている。転移機構は、Ｔ−DNAの
境界近くに存在する、繰り返しのヌクレオチド配列に関
係していると考えられている。このような境界が存在す
る限り、外来性遺伝子をTiプラスミドのＴ−DNAに挿入
し、そのことによって、該遺伝子を腫瘍細胞または再生
された植物のゲノムに導入することができる。 Ｔ−DNA配列に加えて、VIRビルレンス領域と呼ばれ、
Ｔ−DNAの外側に位置する、別のTiプラスミド遺伝子群
が、Ｔ−DNAの細菌から植物細胞への移動において、あ
る役割を果たしていると一般に考えられている。これま
では、Ｔ−DNAとVIR領域の両方を有するアグロバクテリ
ウムに感染した植物上にクラウンゴールが存在すること
が、形質転換した植物細胞を同定するための基本的手段
であった。しかし、機能的な腫瘍遺伝子を含有するクラ
ウンゴールからは植物全体を再生することができないた
め、この同定方法は商業的利用価値を制限するものであ
った。従って、形質転換した植物細胞を選択し、同定す
るのに腫瘍遺伝子にたよることなく、植物細胞中に外来
性遺伝子を導入し、これを発現させる方法を開発するこ
とは有用なことである。 現在、成功率は異なるが、植物細胞にDNAを導入する
ために種々の方法を利用することができる。このような
方法には、１またはそれ以上のDNA分子をカプセル化す
るためにリポソームを使用する方法、植物細胞とDNA
（多価陽イオン性物質またはリン酸カルシウムのいずれ
かとコンプレックスを形成しているDNA）とを接触させ
る方法、およびプロトプラスト融合法が含まれる。現
在、目的の遺伝子を植物細胞へ転移させるための好まし
い方法は、アグロバクテリウム細胞のTiプラスミドを利
用する技術である。最近では、モンサント社（Monsanto
Company）の研究者により、植物細胞を形質転換する
のに共（同時）−組み込みTiプラスミドの利用が可能で
あることが証明された［フレーリーおよびロジャース
（Fraley and Rogers）,PCT出願WO84/0219を参照］。さ
らに、ホエケマ等［Hoekemaら、ネイチャー（Natur
e），303,179頁,1983］が開発した、Tiバイナリー（２
成分）ベクター系が当分野で知られている。 前記Tiプラスミド由来のＴ−DNA領域を、機能的な植
物の発現機構の制御下にある目的の遺伝子を挿入するの
に利用できる。そのようなキメラ遺伝子は、植物および
細菌の両方に由来するポリペプタイドを発現すること
が、当分野で知られている。本発明以前に、植物の構造
遺伝子の一部または全体と融合させた異種の遺伝子によ
り、キメラタンパクが、植物細胞の中で発現されたこと
はなかった。本発明のベクター構築物は、そのようなキ
メラタンパクの生成を提供するものであり、従って、植
物における形質転換系の継続的な開発に寄与するもので
ある。 ［発明の目的および構成］ 細菌および哺乳動物の細胞において明らかにされたよ
うに、効果的な形質転換系の開発における基本段階の１
つは、有力な選択可能なマーカーを組み立てることであ
る。この様なマーカーは、形質転換により新しい遺伝子
を獲得した細胞の、選択および同定を可能にするもので
ある。本発明は、アミノサイクリトール抗生物質である
ハイグロマイシンＢが、形質転換した植物細胞の選択物
質となり得る新規な発現ベクターを提供するものであ
る。 さらに本発明は、非形質転換細胞を含有する系から形
質転換した植物細胞を選択する方法をも提供するもので
ある。この方法によれば、本発明のベクターに非選択性
のDNAを付加し、この修飾されたベクターで植物細胞を
形質転換し、そして、その様にしなければ選択不能であ
るDNAを含有しているハイグロマイシン耐性の形質転換
体を選択することができる。形質転換は非常に低い確率
で起こる現象であるため、数百万の細胞の中でどの細胞
が形質転換を行なうDNAを獲得したかを特定するため
に、このような機能試験が実際上必要となる。 本明細書で使用する用語について、以下に説明する。 組み換えDNAクローニングベクター １またはそれ以上の余分のDNAセグメントを付加する
ことができる、あるいは既に付加されているDNA分子か
らなる、自律的に複製可能なあらゆる物質を指し、プラ
スミドを含むが、それに限定されない。 組み換えDNA発現ベクター １またはそれ以上の転写および翻訳活性化配列が挿入
されている組み換えDNAクローニングベクター。 アミノ末端領域−暗号配列 その部分でポリペプタイドへの翻訳が開始され、か
つ、その部分からポリペプタイドのアミノ末端部分が翻
訳される様なmRNAの部分をコードしているDNA領域。 キメラタンパク プロモータおよびホモローガスな（同種の）暗号領域
の一部を含有する遺伝子によってコードされているRNA
から翻訳された、回収可能な、ヘテロローガス（異種
の）ポリペプタイド。 境界配列 Ｔ−DNAの末端を含有するDNA配列。 広範囲宿主（広宿主域）レプリコン 多種多様の細菌細胞に転移され、保持され得るDNA分
子。 接合（コンシュゲーション） 細胞同志を接触させ、ある種の細菌から他種の細菌
へ、DNAを転移させる操作。 クラウンゴール アグロバクテリウム・チュメファシエンスによって誘
発される植物腫瘍。 Tiプラスミド アグロバクテリウムが有する大きいプラスミドであっ
て、細菌との接合を促し、腫瘍誘発能を付与するプラス
ミド。 マイクロ−Tiプラスミド アグロバクテリウム中で複製可能で、Ｔ−DNA境界で
側面を接しているDNAを含有するプラスミド。 非腫瘍性遺伝子株 VIR機能は保持しているが、クラウンゴールを誘発す
ることができないアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株。 形質転換 受容宿主細胞にDNAを導入して受容細胞の遺伝型を変
化させ、その結果表現型を変化させること。 本発明は、機能的、かつ選択可能なマイクロTiプラス
ミドを開示するものである。すなわち、５側のオクトピ
ン・シンセターゼ（OCS）のプロモーターおよびこれに
結合するアミノ末端領域−暗号化配列遺伝子と、３′側
のノパリン・シンセターゼ遺伝子のターミネータ配列と
の間に、大腸菌のハイグロマイシン・ホスホトランスフ
エラーゼ（aph IV）遺伝子を挿入した。本発明のマイク
ロ−Tiプラスミドを組み立てるために、広範囲宿主ベク
ター中のＴ−DNA境界フラグメント（複数）の間に、こ
の様な構造を組み立てた。 本発明はまた、ハイグロマイシン耐性の植物細胞を作
成し、得られた細胞を選択するための方法であって、 ａ）ハイグロマイシン・ホスホトランスフエラーゼをコ
ードしている遺伝子を含有している本発明の組み換えDN
A発現ベクターを含有するアグロバクテリウム・チュメ
ファシエンス株を、植物または植物挿木（切り枝）に接
種し、 ｂ）ハイグロマイシン耐性の選択条件下で、該ベクター
によって形質転換された植物細胞を選択することからな
る方法を提供するものである。 第１図はプラスミドpCEL30の制限部位および機能地図
を示す。 第２図はプラスミドpCEL40の制限部位および機能地図
を示す。 第３図はプラスミドpCEL44の制限部位および機能地図
を示す。 発明についての詳しい記述 本発明は、植物中で機能的であり、かつ選択可能な組
み換えDNA発現ベクターであって： １）転移−DNAの境界配列で側面を限られている、プロ
モーターおよびこれに結合したアミノ末端領域−暗号化
配列、およびターミネータ信号配列を含んでいる転写単
位（ここに、これらの配列は、植物細胞中で天然に発現
される１またはそれ以上の遺伝子から導かれたものであ
る）； ２）前記プロモーターおよびこれに結合するアミノ末端
領域−暗号化配列と、前記ターミネータ配列の間に位置
する抗生物質耐性遺伝子−暗号化配列；および ３）アグロバクテリウム中で機能的なレプリコンを含有
するDNAフラグメント、からなる組み換えDNA発現ベクタ
ーを開示するものである。 本発明においては、中間体クローニングベクターであ
るプラスミドpCEL30の特異な（単一の）Bal II制限部位
に、ハイグロマイシン・ホスホトランスフエラーゼをコ
ードしている〜1.3kb BamH I−Bal IIフラグメントを、
２つの方向性で導入した。プラスミドpCEL30は、プロモ
ーター転写信号（シグナル）およびcos遺伝子の最初の1
1アミノ酸の暗号配列を持っている。ハイグロマイシン
・ホスホトランスフエラーゼ（aph IV）をコードしてい
る遺伝子の導入は、（ocs）暗号領域の読み枠を保持す
るようにして行なう。このようにして、pCEL30のBgl II
部位にaph IV遺伝子をサブクローンすると、この特定の
配列のためにocsの開始コドン付近にBal II−BamH I融
合体が生じる。得られたベクター、プラスミドpCEL40は
ocs−aph IV融合タンパクをコードしている。aph IV遺
伝子を反対の方向で挿入した時には、ハイグロマイシン
・ホスホトランスフエラーゼは生成しなかった。pCEL30
およびpCEL40それぞれの制限部位および機能地図を、添
付の第１図および第２図に示す。 プラスミドpCEL30はE.coli K12 RR1△M15/pCEL30か
ら常法通り単離できる［この菌株はノーザン・リージョ
ナル・リサーチ・ラボラトリー，ペオリア，イリノイス
（Northern Regional Research Laboratory,Peoria,
Illinois）61604に寄託され、その一部を構成してい
る］。ハイグロマイシン・ホスホトランスフエラーゼ遺
伝子の原料であるプラスミドpOW20もまたNRRLに寄託さ
れているE.coli JA221/pOW20から容易に単離できる。
両株はそれぞれ寄託番号NRRL Ｂ−15915およびNRRL
Ｂ−15838の下、プラスミドの好ましい供給源および貯
蔵体として、誰でも利用できる。 プラスミドpCEL40はアグロバクテリウム中で複製する
ことができないので、まず、プラスミドpCEL40のマイク
ロＴ−DNAを、〜11.8kb EcoR Iフラグメントとして、広
範囲宿主ベクターpKT210に転移させた。この宿主ベクタ
ーは、ザ・プラスミド・リファレンス・センター，スタ
ンフォード・ユニバーシティ，パロ・アルト，カリフォ
ルニア94305（the Plasmids Reference Center,Stan
ford University,Palo Alto,California）から入手し
得る。本発明のプラスミドを組み立てる上で、この特定
の宿主域ベクターを使用することは臨界的なことではな
い。例えば、このような目的に有用な他のベクターに
は、pRK290［ディッタ他,1980,プロク・ナトル・アガド
・サイ（Ditta et al.,Proc.Natl.Acad.Sci），77,734
7−7351頁］およびＲ 772［オエケマ他,1983,ネイチャ
ー（Hoekema et al.,Nature），303,179−180頁］が含
まれる。もし、適正に組み立て、植物ゲノムに挿入され
たなら、植物細胞中で融合タンパクが発現され、植物に
抗生物質耐性を与える細菌性酵素のような、所望のポリ
ペプタイドが作られるであろう。 従って、得られたマイクロ−TiプラスミドpCEL44は、
ハイグロマイシン耐性に関して選択が可能であり、かつ
機能的な植物遺伝子を含有するが故に、極めて有用であ
る。選択可能かつ機能的な植物遺伝子の存在に関連し
て、プラスミドpCEL44の特異的な構成は、植物形質転換
系に使用する上でさらに有益な貢献をする。例えば、Ｔ
−DNA境界配列は、本発明のマイクロ−Tiプラスミドの
転写単位が、植物細胞の染色体DNAに移送され、共有結
合的に組み込まれるのを助け；アグロバクテリウム機能
性レプリコンは、効率的なプラスミド複製手段となり、
他の当業者が行なっている同時（共）組み込み工程を不
要なものとし；そして唯一のSal Iクローニング部位
は、所望の遺伝子挿入のための便利な開裂部位となる。 上に説明したベクターは、機能的なホスホトランスフ
エラーゼaph IV遺伝子が存在するため、植物細胞にハイ
グロマイシン耐性を与える。前記ベクターに挿入された
特定のホスホトランスフエラーゼ遺伝子は、〜1.3kb Ba
mH I−Bgl II制限フラグメントであるが、他の既知のホ
スホトランスフエラーゼaph IV遺伝子で置換することも
できる。このような遺伝子には、ラオ等［アンチマイク
ロビアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Reoe
t al.,Antimicrobial Agents and Chemotherapy）、2
4、689〜695頁、1983］によって開示されたものがある
が、これらに限定されない。また、ハイグロマイシン耐
性を与える遺伝子を含有している、多種多様な、プラス
ミドpOW20の制限フラグメントで置き換えることもでき
る。ただしこのような制限フラグメントは、プロモータ
ー領域がその構造遺伝子の転写を行なう様に位置せしめ
る必要がある。ホスホトランスフェラーゼaph IV遺伝子
は、プラスミドpOW20の〜1.3kb BamH I−Bgl IIフラグ
メント上にコードされているので、この〜1.3kb BamH I
−Bgl IIフラグメントを含有するどの制限フラグメント
でも、感受性のある植物宿主細胞に対して、目的の耐性
を与える。前記のすべての遺伝子およびフラグメントは
機能的に等価であり、従って本発明の目的を達成するた
めに使用し、変換し得るということは、当業者の認める
所であろう。 本発明の例示的ベクターを組み立てるために使用する
制限フラグメントは、ライゲーションを容易にする様、
常法通り修飾することができる。例えば、特定のホスホ
トランスフェラーゼaph IVを含有している制限フラグメ
ント、ベクターの複製機能を含有しているDNA、あるい
はプロモーターまたはターミネータ配列を含有している
DNAに、分子リンカーを供給することができる。このよ
うにして後のライゲーションのための特異的な部位を簡
便に構成することができる。 さらに、その性質を変えるため、およびDNAのライゲ
ーションのための種々の制限部位を提供し、または削除
するために、あるヌクレオチドを付加、脱離または置換
することにより、このようなDNAフラグメントの任意の
ものを修飾することができる。当業者は、ヌクレオチド
の化学および遺伝子暗号を理解しているので、特定の目
的にとって、どのヌクレオチドが交換可能か、また、ど
の様なDNAの修飾が望ましいかを知っている。 本発明は、また、ハイグロマイシン耐性の植物細胞を
作成し、得られたそのような細胞を選択する方法であっ
て、 ａ）ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼをコ
ードしている遺伝子を含む本発明の組み換えDNA発現ベ
クターを含有するアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株を植物または植物挿木に接種し；そして、 ｂ）ハイグロマイシン耐性の選択条件下で、該ベクター
によって形質転換された植物細胞を選択することからな
る方法を開示するものである。 本発明の方法により、pCEL44のようなマイクロ−Tiプ
ラスミドを、アグロバクテリウム・チュメファシエンス
の種々の菌株にコンジュゲートする。E.coli K12 RR1
△M15/pCEL44、ヘルパープラスミドpRK2013を含有する
大腸菌（デッタ他、上記）、および野生型Tiプラスミド
pTiAch5を含有しているアグロバクテリウム・チュメフ
ァシエンスLBA4013株を用いて３母株間（トリパレンタ
ル）交配を行なう。本発明の目的からして、特定のヘル
パープラスミド、または特定のA.チュメファシエンス株
の使用に限定するものではない。この点に関して、バグ
ダサリアン等［Bagdasarian et al.,1981.ジーン（Ge
ne），16,237〜247頁］が記載しているヘルパープラス
ミドのいずれかを、プラスミドpRK2013の代りに使用し
てもよい。何故なら、このカナマイシン耐性のヘルパー
プラスミドpRK2013の唯一の機能は、マイクロ−Tiプラ
スミドの移動に関するトランス−コンプリメント（輸送
補助）作用であるからである。同様に、機能性Vir領域
を有する野生型Tiプラスミドを含有している腫瘍遺伝子
性アグロバクテリウム・チュメファシエンス株であっ
て、自身のTiプラスミドを植物細胞へ転移させ、植物細
胞を形質転換することが可能な菌株を本発明に使用する
ことができる。本発明において使用するのに適当な種々
のアグロバクテリウム・チュメファシエンス株は、一般
に入手可能なものである。たとえば、ATCCカタログ・オ
ブ・ストレインＩ（ATCC Catalogue of Strain
I）、66頁、15版、1982を参照。 本発明の好ましい実施態様では、非腫瘍遺伝子性、即
ち非病原性（avirulent）のアグロバクテリウム・チュ
メファシエンス株を使用する。Ｔ−DNA領域を削除したT
iプラスミドを入れることにより、そのような株を組み
立てることができる。本発明において使用するために入
手し得る特定のアグロバクテリウム・チュメファシエン
ス株は、アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4
404である。この株は、ホーイカーズ（Dr.P.J.J.Hooyka
as）によって開発され、CBS191.83の番号でバーン（Baa
rn）のセントラル・コレクティー・バン・シンメルカル
チュアース（Centrale Collectie van Schimmelcultur
es、CBS）に寄託されている。また、この株は、ノーザ
ン・リージョナル・リサーチ・ラボラトリー（Northern
Regional Research Laboratory）にも寄託されてそ
の一部を構成しており、寄託番号NRRL Ｂ−15920のも
とで、一般的に利用できる。この細菌株にさらされた植
物細胞はクラウンゴールを形成しない。逆に、容易に成
熟植物まで再生されるハイグロマイシン耐性のカルスを
生成する。 アグロバクテリウムで植物組織を感染させることは、
当業界で周知の簡単な技術である。通常、カミソリで切
る、針で穴を開ける、研摩剤でこする等多数の方法のど
れかで、植物に傷をつける。次いで、腫瘍誘発性細菌を
含有する溶液を、この傷に接種する。本発明では、ニコ
チアナ・タバクム（Nicotiana tabacum cv Wisconsi
n 38）の無菌的に先端を切った苗木上にゴールを惹起
させるために、野生型Tiプラスミドおよびマイクロ−Ti
プラスミドpCEL44で構成されるバイナリー（二成分系）
ベクターを含有しているアグロバクテリウムを使用し
た。さらに、ニコチアナ・プラムバージニフォリア（Ni
cotiana plumbaginifolia）およびニコチアナ・タバク
ムcvウィスコンシン38の葉切片からカルス生成を誘導す
るために、マイクロ−TiプラスミドpCEL44を含有する、
非腫瘍遺伝子性のアグロバクテリウム・チュメファシエ
ンス株を使用した。上記の両変種は、ユナイテッド・ス
テイツ・デパートメント・オブ・アグリカルチャーズ・
タバコ・リサーチ・ラボラトリー（United States De
pertment of Agriculture's Tobacco Research La
boratory）、私書箱16G、オックスフォード（Oxfor
d）、ノース・カロライナ（North Carolina）27565か
ら容易に入手できる。アグロバクテリウムを介してTiプ
ラスミドを導入（トランスフォーム）することができる
ならば、いずれの植物からの細胞でも利用できるので、
特定の植物種の細胞を使用することに限定されるもので
はない。たとえば、トマト、ジャガイモ、タバコ、ヒマ
ワリおよびダイズ等の双子葉植物、あるいはユリ科およ
びアマリリス科に属するような単子葉植物から、細胞を
得ることができる。 生じた増殖腫瘍を切り取り、代表的なタバコクローン
からDNAを単離し、BamH I、およびBamH IとHind IIIか
らなる制限酵素で消化し、サザーンブロッティングにか
けた。Ｔ−DNAの構造を分析するためのハイブリダイゼ
ーションプローブとして使用するため、〜1.3kbのBamH
I−Bgl IIハイグロマイシン耐性付与フラグメントを、
ニックトランスレーションにかけた。 ハイグロマイシン耐性と同様に、Tiプラスミドがコー
ドしている他の機能をも発現する植物を再生するため
に、本発明のTiプラスミドで形質転換した植物細胞を使
用する。本発明は、他の植物種または株に由来する有用
な植物遺伝子を導入することにより、植物組織および植
物全体を、遺伝学的に修飾するのに有用であり、このよ
うな植物遺伝子には、貯蔵タンパク、レクチン、並び
に、病気、昆虫および除草剤に対する抵抗性因子、およ
び環境ストレスに対する耐性因子等をコードする遺伝子
が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発
明の、方法、プラスミドおよび形質転換体は、植物中の
遺伝子を導入する新規方法を、植物の品質改良家に提供
し、また植物の発生を研究するための分子プローブを、
植物の分子生物学者に提供するものである。 次に実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。 実施例１ E.coli RR1△M15/pCEL30の培養およびプラスミドpCEL3
0の単離 A.E.Coli RR1△M15/pCEL30の培養 通常の微生物学的操作に従い、アンピシリン50μg/ml
を含むＬ培地（10g/カゼイン加水分解物、5g/酵母
エキス、5g/ NaCl、1g/グルコース、pH7.4）750ml
中で、E.Coli RR1△M15/pCEL30を増殖させる。37℃で
激しく振盪しながら24時間インキュベートした後、培養
物を集める。 B.プラスミドpCEL30の単離 培養物を遠心し、細胞のペレットを、新調した溶菌緩
衝液（50mMトリス−HCl（pH8）、10mM EDTA、9mg/mlグ
ルコース、2mg/mlリゾチーム）50ml中に再懸濁させる。
氷冷下、45分間インキュベートした後、この懸濁液を0.
2N NaOHおよび１％SDSの溶液100mlに混合し、次いでさ
らに５分間氷冷した。3M酢酸ナトリウムをさらに90ml加
え、混合物を60分間氷冷する。 遠心により細胞残渣を除き、上澄液をエタノール500m
lと混合する。−20℃で２時間放置した後、遠心により
核酸をペレット化し、10mMトリス−HCl（pH8）−10mM
EDTA90mlに再懸濁する。 核酸溶液に、塩化セシウム90gおよび10mg/mlエチジウ
ムブロマイド溶液0.9mlを混合し、次いで40,000rpmで24
時間遠心し、プラスミドDNAを精製する。プラスミドDNA
バンドを回収し、さらに40,000rpmで16時間遠心する。
プラスミドDNAバンドを再び回収し、塩化セシウムおよ
びエチジウムブロマイドを通常の方法で除き、次いで90
g/酢酸アンモニウムを含有する２倍量のエタノールを
加えて沈澱させる。ペレット化したDNAを0.2mg/mlの濃
度でTE緩衝液（10mMトリス−HCl（pH8）,1mM EDTA）に
溶解させる。 実施例２ E.coli JA221/pOW20の培養およびプラスミドpOW20の単
離 A.E.coli JA221/pOW20の培養 E.coli RR1△M15について記載した前記実施例１と同
様にして、本細菌を増殖させる。 B.プラスミドpOW20の単離 プラスミドpCEL30について記載した前記実施例１と同
様にして、本プラスミドを調製する。 実施例３ E.coli RR1△M15/pCEL40の構築 A.プラスミドpCEL30のBgl II消化およびウシ腸ホスファ
ターゼによる処理 酵素製造元＊推奨の組成を有する反応液150μ中
で、プラスミドpCEL30DNA5μｇをBgl II制限酵素50単位
で消化する。消化は37℃で90分間行なう。 始めに0.5Mトリス−HCl（pH8）−1mM EDTA8.75μ
を反応物に混合し、次いでウシ腸ホスファターゼ（ベー
リンガー・マンハイム（Boehriger Mannheim））1.25
単位を混合し、37℃で15分間インキュベートする。混合
物を緩衝フェノール、次いでエーテルで抽出し、酢酸ア
ンモニウムを含有する２倍量のエタノールを加え沈澱さ
せる。−70℃で30分間放置した後、DNAをペレット化
し、10μg/mlの濃度でTE緩衝液に再溶解させる。 ＊制限酵素およびその他の酵素は次の供給者から容易
に入手できる。 ベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ，インコーポレ
ィテッド（Bethesda Research Laboratories,Inc.）、
私書箱6010,ロックビル，メリーランド（Box 6010,Roc
kville,Maryland）20850。 ベーリンガー・マンハイム・バイオケミカルズ（Boeh
ringer Mannheim Biochemicals）、7941キャッスルウ
ェイ・ドライブ，ピー・オー・私書箱50816,インデアナ
ポリス，インデアナ（Castleway Drive P.O.Box 508
16,Indianapolis,Indiana）46250。 ニュー・イングランド・バイオ・ラブズ.,インコーポ
レィテッド（New England Bio Labs.,Inc.）、32ト
ザー・ロード，ベバリー，マサチューセッツ（Tozer R
oad,Beverly,Massachusetts）01915 B.プラスミドpOW20のBamH I−Bgl II消化および〜1.3kb
フラグメントの単離 酵素製造元推奨の方法に従い、プラスミドDNA約20μ
ｇを制限酵素BamH IおよびBgl IIで消化する。 消化により得られたDNAフラグメントを、通常のアガ
ロースゲル電気泳動法により分画し、電気泳動中にゲル
に挿入したNA−45DEAE紙（シュライハー・アンド・シュ
エル，インク.,キーン，ニュー・ハンプシャー（Schlei
cher ＆ Schuell Inc.,Keene,New Hampshire）0343
1）に捕獲して単離する。マイクロ遠心管を用い、紙を
おおうに十分な量の高塩緩衝液（1.0M NaCl;0.1mM ED
TA;および20mMトリス,pH8.0）中で紙を５秒間振り回す
ことにより、紙からDNAを溶出させる。時々旋回させつ
つ、紙を55〜60℃で10〜45分間インキュベートする。緩
衝液を除き、紙をさらに緩衝液約50μで洗浄する。こ
のDNAを始めにフェノールで、次いでエーテルで抽出
し、約20μg/mlの濃度でTE緩衝液に再懸濁させる。 C.ライゲーション 0.8単位のT4DNAリガーゼ（BRL）を含有するリガーゼ
緩衝液（50mMトリス−HCl,pH7.6;10mM MgCl2:10mM DTT;
および1mM ATP）15μ中で、ホスファターゼ処理をし
た10ngのBgl II−切断プラスミドpCEL30と、精製した〜
1.3kb BamH I−Bgl IIフラグメント50ngを混合する。こ
の混合液を15℃で一晩インキュベートする。 D.E.coli RR1△M15の形質転換および選別 滅菌した60mMの塩化カルシウム溶液15μにライゲー
ション混合物を混合する。次いで、30mM塩化カルシウ
ム,15％グリセリン中で20倍に濃縮して−70℃で保存し
ておいた、コンピテントE.coli RR1△M15細胞の懸濁液7
0μを加える。60分間氷冷した後、形質転換混合物を4
2℃で２分間熱処理し、次いでＬ培地0.5mlと共に37℃で
90分間インキュベートする。 混合物のサンプルを、50mg/のアンピシリンを含有
するＬ培地に広げ、15g/の寒天で固型化する。次い
で、形質転換した細胞のコロニーが生育するように、こ
のサンプルを37℃で一晩インキュベートする。 E.プラスミドpCEL40を含有するE.coli RR1△M15のクロ
ーンの同定 形質転換により生じたコロニーを、50mg/mlのアンピ
シリンを含有するＬ培地5mlに接種し、37℃で一晩増殖
させる。ホルムズ（Holmes）およびキグレー（Quigle
y）の方法［アナリィティカル・バイオケミストリー（A
nalytical Biochemistry）、114:193頁;1981］に従
い、この培養サンプル1mlよりプラスミドDNAを調製し、
TE緩衝液50μに再溶解する。DNA溶解7.5μと、制限
酵素Hind III,Pst I,Bgl IIおよびBgl II−Hind II混合
品のそれぞれを約５単位および酵素製造元の指示による
他の試薬を含んでいる反応液10μ中でプラスミドを消
化する。適温で60分間放置の後、消化物を通常の方法に
よるアガロースゲル電気泳動によって分析する。制限酵
素によりpCEL40から生じたフラグメントの大きさは第２
図に示したプラスミドの構造と一致する。 実施例４ マイクロ−TiプラスミドpCEL44の構築 A.プラスミドpKT210のEcoR I消化およびホスファターゼ
処理 酵素製造元推奨の組成を有する反応液150μ中で、
プラスミドpKT210（５μｇ）をEcoR I制限酵素50単位で
消化する。37℃で90分間放置した後、反応物を実施例３
と同様にして、ウシ腸ホスファターゼで処理し、10μg/
mlの濃度になる様、TE緩衝液に再溶解する。 B.プラスミドpCEL40のEcoR I消化 実施例3EプラスミドpCEL40DNA調製品15μを、37℃
で90分間、反応液２μ中のEcoR I制限酵素10単位で消
化する。次いでフェノールで抽出し、次いでエーテルで
抽出する。−20℃で酢酸アンモニウムを含有する２倍量
のエタノールを加え、消化されたDNAを沈澱させ、TE緩
衝液20μに再溶解する。 C.ライゲーション、形質転換およびE.coli RR1△M15/p
CEL44の選別 実施例3Cと同様にして、ホスファターゼ処理したEcoR
I−切断pKT210（10ng）とEcoR I−切断pCEL40（５μ
）をライゲーションし、実施例3Dと同様にして、E.co
li RR1△M15に導入しぃて形質転換する。 10mg/のクロラムフェニコールを含有する固形Ｌ培
地上での増殖能によって形質転換した細胞を選別する。
実施例3Eと同様にして、Pst I、Hind IIIおよびBamH I
による、細胞の構成成分であるプラスミドの制限酵素分
析により、pCEL44を含有するコロニーを同定する。制限
部位および機能地図を添付の第３図に示す。 実施例５ pCEL44のアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4
013への接合 A.親株の増殖 固形Ｌ培地上、37℃で一晩E.coli K12 RR1△M15/pCE
L44およびE.coli pRK2013を増殖させる。固形Ｌ培地
上、28℃で２日間、アグロバクテリウム・チュメファシ
エンスLBA4013を増殖させる。 B.3親株間接合および選別 上記３種の株、１ループづつを30mM硫酸マグネシウム
1ml中で混合する。次いで、固形TY培地（5g/カゼイン
加水分解物、5g/酵母エキス、15g/寒天）上に、こ
の混合物１滴を落とし、28℃で一晩インキュベートす
る。 増殖細菌を10mM硫酸マグネシウム溶液30mlに再懸濁さ
せ、この系列希釈試料0.1mlを、100mg/ナリディキシ
酸および2mg/クロラムフェニコールを含有する固形TY
培地上に広げ、28℃でインキュベートする。 ２〜４日の増殖後、トランス接合体が個々のコロニー
を生じる。これらを、100mg/のナリディキシ酸および
2mg/のクロラムフェニコールを含有する液体TY培地25
mlに、各個に接種し、28℃で振盪しながら、さらに２日
間インキュベートする。次いでカッセらの方法（ジャー
ナル・オブ・ゼネラル・マイクロバイオロジー・113（C
asse et al.,Journal of General Microbi−ology）:22
9−242頁;1979）により、トランス接合体のプラスミド
内容を調べる。 実施例６ タバコクラウンゴール細胞に於けるハイグロマイシン耐
性の導入および発現 栽培品種Wisconsin38の無菌タバコ植物を次のように
生育させる。種子を10％Clorox漂白剤で10分間処理して
滅菌し、95％エタノールですすぎ、次いで多量の滅菌水
ですすぐ。MS主要塩類および副塩類［フィジオル・プラ
ント（Physiol.Plant.），15:473〜497頁,1962］、30g/
のショ糖、100mg/のミオイノシトール（シグマ（Si
gma））,2.5mg/のチアミンHCl（イーライ・リリー（E
li Lilly））,1.25mg/のピリドキシンHCl（リリー
（Lilly））および1.25mg/のパントテン酸カルシウム
（シグマ（Sigma））で構成され（pH6）、9g/のDifco
Bacto寒天で固型化したR5培地の表面に種をまく。発
芽した種は同じR5培地上に摘み取り、約２ケ月毎に、マ
ゼンタ（Magenta）GA7箱中に挿木（ベジタティブ・カッ
ティング）を行なって植物を維持する。日照16時間、照
度150ルックスおよび温度26℃の光照射培養器で、その
挿木を生育させる。 アグロバクテリウムを接種するため、滅菌した外科用
メスを用いて、頭部および葉を切り落とし、頂上および
広がった葉柄に切り口を残す。数分以内に、目で見て切
り口面に淡黄色−褐色の堆積物が観察されるまで、切り
口面にアグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA401
3/pCEL44の培養物を塗布する。切り口をつけ、菌を接種
した植物にラベルを付け、箱に密閉し、光照射培養器に
戻す。コールが誘発される間、周囲温度が決して30℃を
超えないよう注意する。 接種後15日で、Wisconsin38の滅菌植物のほとんどの
接種切り口に、ゴールの生成が認められる。このゴール
を個々に切り取り、番号を付け、カルベニシリン（シグ
マ（Sigma））およびバンコマイシン（バンコシンHCl,
リリー（Lilly））をそれぞれ200μg/ml添加したR5培地
に植える。腫瘍誘起細菌を殺し、無菌培養物を得るため
のこの処理には、上記抗生物質を含有する培地上で３週
間、同培地に移植してさらに３週間、25〜27℃の暗所で
クラウンゴールを培養して行なう。 これらのクラウンゴールのカルス組織培養物のハイグ
ロマイシンに対する感応性を試験するため、MS塩、30g/
ショ糖、1mg/チアミンHCl、100mg/ミオイノシト
ール、9g/ Difco Bacto寒天、1mg/のIAA（インド
ール−３−酢酸；シグマ）および0.1mg/のキネチン
（６−フルフリルアミノブリン；シグマ）（pH6）を含
有するカルス増殖培地約15mlを満たしたFalcon1007ペト
リ皿に、100mgのカルスサンプルを植える。このサンプ
ルを滅菌した後、前記濃度のバンコマイシンおよびカル
ベニシリン、および50μg/mlのハイグロマイシンＢ（リ
リー）を加える。27℃の暗所で３週間インキュベートし
た後この試験の結果を調べ、正の増殖表現型を回収し
た。 実施例７ ハイグロマイシン耐性ゴール組織中のaph IV配列の存在 A.植物DNAのサザーンブロット “マイズ・フォー・バイオロジカル・リサーチ（Maiz
e for Biological Research）”［ダブリュー・エフ
・シェリダン編，パブル・プラント・モレギュラー・バ
イオロジー・アスン；チャーロッテスビレ，バージニア
（ed W.F.Sheridan,publ.Plant Molecular Biology
Assn;Charlottesville,Virginia）,1982］の161〜164頁
に記載されたリビン（Rivin）らの方法により、約10gm
のゴール組織から核DNAを調製する。 酵素製造元推奨組成の反応液200ml中で、BamH Iおよ
びBamH I−Hind III混合の制限酵素それぞれ100単位
で、各DNA10μｇを消化する。37℃で４時間インキュベ
ートした後、酢酸アンモニウムを含有する400μのエ
タノールを加え、−70℃で30分間、消化したDNAを沈澱
させる。このDNAを、TE緩衝液25μ中に、４℃で一晩
溶解させる。 消化したDNAフラグメントを通常のアガロースゲル電
気泳動で分画し、製造元のプロトコールに従い、ジーン
スクリーン（Gene Screen）、即ちハイブリゼーション
移行メンブラン（ニュー・イングランド・ニュークレア
ー，ボストン，マサチューセッツ（New England Nucle
ar,Boston,Massachusetts））に移し換える。 B.プラスミドpOW20の1.3kbフラグメントからのプローブ 実施例3B記載の方法により精製した、プラスミドpOW2
0のフラグメントから、ハイブリダイゼーションプロー
ブを作る。通常の方法（マニアティス他,1982・モレキ
ュラー・クローニング，コールド・スプリング・ハーバ
ー・ラボラトリー，コールド・スプリング・ハーバー，
ニューヨーク（Maniatis et al.,1982Molecular Cloni
ng,Cold Spring Harbor Laboratory,Coid Spring Ha
rbor,New York）を参照）により、DNase IおよびDNAポ
リメラーゼを使用し、プローブがDNA0.2μｇあたり20μ
Ciの［32−Ｐ］dCTPを持つように、フラグメントをニッ
クトランスフレーションする。 C.aph IV配列相同体（ホモロギー）検出のためのハイブ
リダイゼーション 0.75M NaCl、75mMクエン酸ナトリウム、25mMリン酸ナ
トリウム（pH6.7）、2g/フィコール（Ficoll）400、2
g/ポリビニルピロリドン360、2g/ウシ血清アルブミ
ン、１％ジデシル硫酸ナトリウム、10％硫酸デキストラ
ン、50％ホルムアルデヒドおよび250mg/の変性した、
超音波処理ウシ胸腺DNAを含有する溶液中で、42℃で一
晩、前記植物DNAフラグメントを含有しているジーンス
クリーンをプレハイブリダイズする。 ハイブリダイゼーションは、同一組成の新鮮な溶液中
で、熱変性した前記プローブDNA（溶液25mlあたり0.2μ
ｇ）を追加して行なう。42℃で一晩インキュベートした
後、このジーンスクリーンメンブランをGS緩衝液（0.3M
NaCl、60mMトリス−HCl、2mM EDTA、pH8）で２回洗浄
する。各洗浄は室温で１時間行なう。次いでメンブラン
を、１％SDSを添加した0.1×GS緩衝液で、70℃、１時
間、厳密に洗浄する。この操作を繰り返し、次いで室温
下、0.1×GS緩衝液でさらに２回ジーンスクリーンを洗
浄する。メンブランを吸収乾燥し、−70℃で強化したス
クリーンを用いて一晩Ｘ線フィルムに露出する。 実施例８ 植物の再生 A.非クローン化ゴール組織からの再生 制限レベルのハイグロマイシンＢの存在下で、強い増
殖を示す非クローン化ゴール組織について、選択圧下で
植物再生を誘起する処理を行なう。この処理は、0.3mg/
IAA、10mg/ 2−ip（６−γ，γ−ジメチルアリル
アミノプリン，ギブコ＊（Gibco））、100mg/ミオイ
ノシトール、1mg/チアミンHCl（pH6）および30g/シ
ョ糖を含有し、0.9％Difco Bacto寒天に50μg/mlのハイ
グロマイシンを加えて固形化したMS培地上に、カルス組
織のかけらを置いて行なう。この処理物を１ケ月間光照
射インキュベーター中に置き、次いで組織中の暗緑色の
発芽領域を選別し、同一の高濃度のサイトキニン、ハイ
グロマイシンを添加した培地に移し換え、さらに１ケ月
光照射下でインキュベートする。抗生物質を加えた再生
培地上で、上記の２期間が経過した後、単一の植物体を
切り取るために苗木の緑がかった発芽部分を切り取り、
滅菌触媒を生育させるため、固形培地上、光照射下でさ
らに培養する。３種の異なる組織系統から十分に生育し
た植物が得られたら、この植物中のハイグロマイシン耐
性遺伝子の発現を、次の様にして試験する。約1cm平法
の葉片を切り出し、ハイグロマイシン含有あるいは非含
有のカルス増殖培地上に置く。 対照組織は、ここでのクラウンゴールを誘導する実現
の出発材料である、無菌Wisconsin38の植物の葉片であ
る。これらの標品を27℃の暗所でインキュベートする。
３週間後、抗生物質を含有しない培地では、Wisconsin3
8およびゴール組織から再生した植物は両方共、葉細胞
の拡大および葉片移植体の端部でのカルス増殖を示す。
しかし、抗生物質を含有する培地では、対照のWisconsi
n38の葉は細胞分裂を開始することができず、褐色とな
り、枯れかかっていた。一方、ハイグロマイシン耐性の
ゴール培養物から選択圧下で再生した植物の葉は、ハイ
グロマイシンを含有しない皿での結果に匹敵する、細胞
の拡大、増殖およびカルス生成を示した。これらの結果
は、再生植物がpCEL44起因のハイグロマイシン耐性遺伝
子を含有し、かつ発現可能であるということを示してい
る。 ＊植物の培地および補助剤はギブコ、グランドアイラ
ンド、ニューヨーク（Gibco,Grand Island,Now York）
より容易に入手できる。 B.ハイグロマイシンタ耐性ゴールの単細胞から誘導され
たクローン 抗生物質を含有しない1/.1培地（MS塩、1mg/ IAA、
0.1mg/カイネチン、0.9g/ Difco Bacto寒天、100ml
/ミオイノシトール、1mg/チアミンHCl、30g/ショ
糖、pH6をオートグレーブで滅菌し、Falcon1005ペトリ
皿に50ml/皿で配分する）上で、１ケ月毎に継代培養し
ながら、27℃の暗所でハイグロマイシン耐性のクラウン
ゴール系統を維持する。寒天なしで調製し、125mlの三
角フラスコに50ml/フラスコの割合で配分し、泡止めの
栓をした、上記と同一の培地に、上記培養系統のサンプ
ルを分散させる。この様にして開始した懸濁培養を、27
℃の暗所、135rpmの旋回振盪器中で振盪する。１週間
後、カルスの固い塊を除き、クラウンゴール細胞の懸濁
培養物を１週間単位で、新しい液体培地に1:1で分配し
て継代培養する。これらの短期間懸濁物は、それがカル
スの塊にもどるまで、１ケ月間振盪培養してもよい。 単細胞誘導クローンを生成させるために、以下のよう
にして、これらの培養物からプロトプラストを調製し、
次いで極端に低密度で培養する。細胞を濃縮するため
に、短期間懸濁培養物を軽く遠心し、上澄液の増殖培地
を除き、5mlの濃縮した細胞に、６％w/vセルリジン（オ
ノヅカR10、キンキヤクルト（Onozuka、Kinki Yakult M
fg.）、日本）、１％w/vマセラーゼ［マセロザイムR1
0、キンキヤクルト（Macerozyme、Kinki Yakult）提
供］、９％w/vマンニトール（シグマ）、3mM MES（２−
（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸、シグマ）（pH
5.8）を含有する濾過滅菌した酵素混合物25mlを混合す
る。細胞と酵素の混合物をFalcon1005ペトリ皿に入れ、
50rpmの低回転振盪をしながら、室温で4.5時間インキュ
ベートする。顕微鏡でプロトプラストの放出を確認した
後、すきまサイズ259および231ミクロンの金網ふるい
（ダブリューエス・タイラー、インク・オブ・メンタ
ー、オハイオ（W.S.Tyler,Inc.of Mentor,Ohio））で
この標品を濾過し、25％w/v Ficoll DL（シグマ）（重
量平均分子量が約400,000となるように合成した水溶性
のショ糖とエピクロルヒドリンの共重合体）となるよう
に作ったプロトプラスト培養用培地と1:1で混合する。
この混合物を丸底ガラス製の遠心管の底に入れ、８％w/
v Ficollとなるように作った同一のプロトプラスト培養
用培地数mlを上層に浮かべ、最後に２％w/v Ficollとな
るように作ったプロトプラスト培養用培地１〜2mlの薄
い層を浮かべる。Ficollを含有する溶液はすべてフィル
ター滅菌しておく。この非連続的密度勾配の調製物を、
回転バケット中、周囲温度、50XGで30分間遠心する。プ
ロトプラストが最上層となり、本実験では、1mlあたり
２×105個という高濃度の生存細胞を、大口径のパスツ
ールピペットを使って集めた。使用するプロトプラスト
培養の培地はKP［カオおよびミカイルークのK3培地，プ
ランタ（Kao ＆ Michayluk,planta），120:250−227頁,
1974］であって、ミュラー（Muller）らの文献［フィジ
オロジー・オブ・プラント（physiol・Plant）、57:35
−41頁、1983］に記載されているカボッチェ（Caboch
e）の方法により、マンニトールで浸透圧を、5Mに改良
したものである。 このようにして集めたプロトプラストを、高濃度（集
めた時のままの）で、Falcon3001皿に1mlづつ入れ、26
℃の暗所で培養する。６日後、増殖性、致死的染料エバ
ンス青（シグマ）を排除するか否かにより決定される細
胞生存能力、および細胞壁の形成および分裂について調
べる。細胞の直径は顕微鏡で測定する。標品を、107ミ
クロン直径の金網製フィルターで濾過する。標品に細胞
集合体が存在しないことを確認する。マンニトールを使
用して、培養培地と同一の浸透力に調整したカボッチェ
（前記）のＣ培地1mlあたり、最終的に約100の生存細胞
密度となるように、細胞数を数えながら、細胞を順次希
釈する。この希釈物をペトリ皿に一皿あたり約15ml入
れ、光照射下でインキュベートする。単細胞誘導コロニ
ーは、ある培養物からは１ケ月以内に、他の培養物から
は２ケ月後に得られた。このコロニーを大口径パスツー
ルビペットを使って液体培地から取り出し、液体培地1
/.1に浸したWhatman＃３濾紙上に置く。この濾紙上の培
養物を、必要なら液体培地を添加しながら、さらに１ケ
月光照射下でインキュベートし、次いで固形培地1/.1上
に取り出し、27℃の暗所で培養する。 単細胞から誘導したカルス培養物のハイグロマイシン
耐性の発現を試験するため、一対のクローン化カルス組
織系統サンプルを、50μg/mlのハイグロマイシンＢを含
有する1/.1固形培地および抗生物質を含有しない同一培
地に置く。27℃の暗所で３週間培養した後、対の培養物
を比較する。56例の内52例で、50μg/mlのハイグロマイ
シンＢの存在下でも、非存在下と同様に生育し、ハイグ
ロマイシン耐性を示した。 C.クローン化した組織からの再生 実施例8Bの、単細胞をクローニングするプロトプラス
ト法により誘導した、ハイグロマイシン耐性のカルス組
織培養物を、再生プロトコールにかけることができる。
MS塩、100mg/ミオイノシトール、1mg/チアミン−HC
l、0.3mg/ IAA、10mg/ 2−ip、0.9g/ Difco Bact
o寒天および30g/ショ糖（pH6）を含有する固形培地上
にカルス片を置き、光照射下で１ケ月間培養する。緑の
発芽組織片を再度同一の培地で継代培養する。このよう
にして生育させた苗木を、光照射下で十分に生育した植
物まで育てるため、実施例６に記載したR5培地で培養す
る。得られた植物に対して、実施例8Aと同様に、ハイグ
ロマイシンを含有するカルス増殖培地の上に葉片移植体
を置き、暗所でインキュベートすることにより、プラス
ミドpCEL44より導入したハイグロマイシン耐性遺伝子の
発現を試験する。この植物は実施例８と同様、葉片移植
体の切り口上に葉細胞の拡大およびカルスの生成を見
せ、ハイグロマイシン耐性遺伝子の発現を示した。 この植物を土に移植し、この植物が、ハイグロマイシ
ン耐性遺伝子のメンデル性遺伝子をすることを証明する
ため、温室で、生殖能を有する成熟体まで生育させる。
この操作により、pCEL44を含有する二重（バイナリー）
ベクターが、腫瘍を誘起する発ガン遺伝子を伴うことな
く、ハイグロマイシン耐性遺伝子だけを転移させるここ
ができることが証明され、かくして性的能力のある植物
に再生することが可能な植物細胞中に、希望する特性を
導入する新規かつ有用な方法が提供されたのである。 実施例９ アグロバクテリウム・チュメファシエンスLB4405へのpC
EL44の接合 実施例５と同様にして、E.coli K12 RR1△M15/pCEL
44、E.coli pRK2013およびアグロバクテリウム・チュ
メファシエンスLBA4405の３親株間接合を行なう。20mg/
リファンピシンおよび2mg/クロラムフェニコールを
含有するTY固形培地上でトランス接合体を選別する。 実施例10 カルス中へのハイグロマイシン耐性の導入および発現 A.ニコチアナ・プラムバギニフオリア（Nicotiana plu
mbaginifolia） ニコチア・プラムバギニフオリアの種子をエタノール
に短期間さらして滅菌し、0.5％Chlorox漂白剤で３分間
処理する。滅菌水ですすいだ後、0.5mg/のギベレリン
酸を含有する溶液中で、１時間種子をインキュベートす
る。次いで、0.6％フィトアガー（phytagar）で固形化
したMS培地に種を蒔く。27℃、日照時間16時間、照射強
度約700ルックスの条件で生育させる。 ３ケ月経過した植物から約1cm平方の葉部を切り取
り、切り口にアグロバクテリウム・チュメファシエンス
LB440/pCEL44の培養物を塗布する。1mg/ナフタレン酢
酸（NAA）および0.1mg/ベンジルアデニン（BA）を含
有する固形MS培地上、27℃の暗所で３日間、感染部分を
インキュベートする。次いで、200mg/バンコマイシン
および200mg/カルベニシリンを添加した同一培地に感
染部分を移植する。１ケ月間増殖させた後、1mg/mlNA
A、0.1mg/ml BAおよび50mg/ハイグロマイシンＢを含
有するMS培地に、カルス片を移植し、インキュベートを
続ける。 ３週間後、0.1mg/ NAAおよび1mg/ BAを添加した
固形MS培地に、カルスの小片を移植し27℃、日照時間16
時間でインキュベートし、苗条を再生させる。この苗条
を、根の生育促進剤を含有しない固形MS培地に移植す
る。 B.ニコチアナ・タバクム（Nicotiana tabacum） タバコカルスの懸濁培養液（NT575）の一部を、固形
培地（実施例8Cの記載の）に流し込む。過剰の水を除去
した後、２層の滅菌Whatman＃１濾紙を細胞上に置く供
給細胞層系を組み立てる。細胞を26℃の暗所で一晩イン
キュベートする。 アグロバクテリウム・チュメファシエンスLBA4404/pC
EL44培養物を、2mg/のクロラムフエニコールを含有す
るTY培地上で増殖させる。5g/カゼイン加水分解物お
よび3g/酵母エキスを含有する液体培地に、単離した
細胞を移し、旋回振盪器中、26℃で一晩振盪する。３ケ
月経過した植物から約1cm平方の葉部を切り取り、この
細菌の液体培養物に６〜８分間浸し、吸収乾燥し、次い
で上で調製した供給細胞層系をおおう濾紙の上に置く。 光照射下、26℃で２日間、この葉片をインキュベート
した後、取り上げ、カルベニシリンおよびバンコマイシ
ンを各200μg/ml含有する再生培地に移植する。この培
地上、光照射下でさらに12日間経過させた後、50μg/ml
のハイグロマイシンを含有する同一培地に、葉片を移植
する。この移植体を、光照射下、26℃で更に３ケ月間培
養する。 ハイグロマイシン含有培地上で、このように処理した
葉片から、苗が再生し、生育する。前記と同様に、ただ
し逆の方向にハイグロマイシン耐性遺伝子を含有してい
るアグロバクテリアで処理した葉片からは苗は生育しな
い。 このような葉の部分から植物体を摘み取り、ホルモン
を含有しないR5培地で生育させ、実質的に実施例8Aと同
様にして、50μg/mlのハイグロマイシンＢを含有するカ
ルス増殖培地に葉片を移植して、ハイグロマイシン耐性
を試験する。再生培地の代わりにカルス増殖培地（実施
例10A）を使用する以外は、上記と同様にして葉部を処
理する。バンコマイシンおよびカルベニシリンを各200
μg/ml添加したカルス増殖培地でこの葉部を増殖させ
る。このようにして調製したものを26℃の暗所で２週間
インキュベートし、次いで50μg/mlのハイグロマイシン
Ｂを添加した培地に移植する。ハイグロマイシン耐性
は、抗生物質を含有する培地でカルスが増殖すること、
および実施例７で示したように、aph IV配列で植物DNA
のサザーンブロットをプローブすることによって証明さ
れる。
【図面の簡単な説明】
第１図はプラスミドpCEL30（7.15kb）の制限サイトおよ
び機能地図、第２図はプラスミドpCEL40（8.45kb）の制
限サイトおよび機能地図、第３図はプラスミドpCEL44
（17.5kb）の制限サイトおよび機能地図である。
び機能地図、第２図はプラスミドpCEL40（8.45kb）の制
限サイトおよび機能地図、第３図はプラスミドpCEL44
（17.5kb）の制限サイトおよび機能地図である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 特開 昭58−13598（ＪＰ，Ａ)
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅ
ｓ．，Ｖｏｌ．12，Ｎｏ．22（1984)
ｐ．8711−8721
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 15/65
A01H 5/00
C12N 5/10
ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．（ａ）暗号領域（ｃ）の５′側にある植物発現プロ
モーター配列、 （ｂ）暗号領域（ｃ）の３′側にあるターミネータ信号
配列、 （ｃ）該植物発現プロモーター配列（ａ）と該ターミネ
ータ信号配列（ｂ）の間に位置しているハイグロマイシ
ン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の暗
号領域 からなり、植物細胞内での該暗号領域の発現により該植
物にハイグロマイシン耐性を与え、該ハイグロマイシン
耐性により該植物細胞の選択を可能とすることを特徴と
する植物細胞において機能的なキメラ遺伝子。 ２．該植物発現プロモーター配列が天然のプロモーター
配列であり、該プロモーター配列に天然に結合した遺伝
子のアミノ末端領域−暗号化領域まで延びかつそれを含
むプロモーター領域の３′側の天然の配列をさらに含
み、該ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子の暗号領域が正しい読み枠内でアミノ末端領域−暗
号化配列に融合している第１項記載のキメラ遺伝子。 ３．該プロモーター配列がオクトピン・シンセターゼ遺
伝子からのものである第１項または第２項記載のキメラ
遺伝子。 ４．該天然のプロモーター配列および天然のプロモータ
ー配列に天然に結合した３′側の天然配列がオクトピン
・シンセターゼ遺伝子からのものである第２項記載のキ
メラ遺伝子。 ５．該ターミネータ信号配列がノパリン・シンセターゼ
・ターミネータ信号配列である第１項〜第４項のいずれ
かに記載のキメラ遺伝子。 ６．該アミノ末端領域−暗号化配列が、開始コドンを含
むメッセンジャーRNAをコードしている第２項または第
４項記載のキメラ遺伝子。 ７．該アミノ末端領域−暗号化配列が、オクトピン・シ
ンセターゼ遺伝子の最初の11アミノ酸をコードしている
第６項記載のキメラ遺伝子。 ８．ハイグロマイシン耐性を付与する暗号領域が、プラ
スミドpOW20の〜1.3kb BamH I−Bgl II制限フラグメン
トから誘導される第１項〜第７項のいずれかに記載のキ
メラ遺伝子。 ９．（ａ）暗号領域（ｃ）の５′側にある植物発現プロ
モーター配列、 （ｂ）暗号領域（ｃ）の３′側にあるターミネータ信号
配列、 （ｃ）該植物発現プロモーター配列（ａ）と該ターミネ
ータ信号配列（ｂ）の間に位置しているハイグロマイシ
ン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の暗
号領域 からなり、植物細胞内での該暗号領域の発現により該植
物にハイグロマイシン耐性を与え、該ハイグロマイシン
耐性により該植物細胞の選択を可能にする植物細胞にお
いて機能的なキメラ遺伝子と、レプリコンを含むDNAフ
ラグメントを含有する組換えDNA植物発現ベクター。 １０．該植物発現プロモーター配列が天然のプロモータ
ー配列であり、該プロモーター配列に天然に結合した遺
伝子のアミノ末端領域−暗号化領域まで延びかつそれを
含むプロモーター領域の３′側の天然の配列をさらに含
み、該ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子の暗号領域が正しい読み枠内でアミノ末端領域−暗
号化配列に融合している第９項記載のベクター。 １１．該プロモーター配列がオクトピン・シンセターゼ
遺伝子からのものである第９項または第10項記載のベク
ター。 １２．該天然のプロモーター配列および天然のプロモー
ター配列に天然に結合した３′側の天然配列がオクトピ
ン・シンセターゼ遺伝子からのものである第10項記載の
ベクター。 １３．該ターミネータ信号配列がノパリン・シンセター
ゼ・ターミネータ信号配列である第９項〜第12項のいず
れかに記載のベクター。 １４．該アミノ末端領域−暗号化配列が、開始コドンを
含むメッセンジャーRNAをコードしている第10項または
第12項記載のベクター。 １５．該アミノ末端領域−暗号化配列が、オクトピン・
シンセターゼ遺伝子の最初の11アミノ酸をコードしてい
る第14項記載のベクター。 １６．ハイグロマイシン耐性を付与する暗号領域が、プ
ラスミドpOW20の〜1.3kb BamH I−Bgl II制限フラグメ
ントから誘導される第９項〜第15項のいずれかに記載の
ベクター。 １７．該ベクターが、アグロバクテリウム中で機能的な
レプリコンを含有している第９項〜第16項のいずれかに
記載のベクター。 １８．該レプリコンが、プラスミドpKT210の〜11.8kb E
coR Iフラグメントから誘導される第17項記載のベクタ
ー。 １９．該ベクターがプラスミドである、第９項〜第18項
のいずれかに記載のベクター。 ２０．該ベクターがマイクロ−Tiプラスミドである、第
19項記載のベクター。 ２１．該ベクターが下記の図 で示される制限部位および機能地図を有するプラスミド
pCEL44である第20項記載のベクター。 ２２．該ベクターが、オクトピン・シンセターゼ・プロ
モーター配列およびノパリン・シンセターゼ・ターミネ
ータ信号配列を含むプラスミドpCEL30（NRRL B−1591
5）のBal II消化物と、大腸菌ハイグロマイシン・ホス
ホトランスフェラーゼ遺伝子の暗号化配列からなるプラ
スミドpOW20（NRRL B−15838）の1.3kb BamH I−Bal II
フラグメントのライゲートによって得られるプラスミド
pCEL40である第９項記載のベクター。 ２３．（ａ）暗号領域（ｃ）の５′側にある植物発現プ
ロモーター配列、 （ｂ）暗号領域（ｃ）の３′側にあるターミネータ信号
配列、 （ｃ）該植物発現プロモーター配列（ａ）と該ターミネ
ータ信号配列（ｂ）の間に位置しているハイグロマイシ
ン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の暗
号領域 からなる植物細胞において機能的なキメラ遺伝子が組込
まれ、そのキメラ遺伝子の発現によってその選択が可能
なハイグロマイシン耐性が付与された植物細胞。 ２４．該植物発現プロモーター配列が天然のプロモータ
ー配列であり、該プロモーター配列に天然に結合した遺
伝子のアミノ末端領域−暗号化領域まで延びかつそれを
含むプロモーター領域の３′側の天然の配列をさらに含
み、該ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子のコード領域が正しい読み枠内でアミノ末端領域−
暗号化配列に融合している第23項記載の植物細胞。 ２５．該プロモーター配列がオクトピン・シンセターゼ
遺伝子からのものである第23項または第24項記載の植物
細胞。 ２６．該天然のプロモーター配列および天然のプロモー
ター配列に天然に結合した３′側の天然配列がオクトピ
ン・シンセターゼ遺伝子からのものである第24項記載の
植物細胞。 ２７．該ターミネータ信号配列がノパリン・シンセター
ゼ・ターミネータ信号配列である第23項〜第26項のいず
れかに記載の植物細胞。 ２８．該アミノ末端領域−暗号化配列が、開始コドンを
含むメッセンジャーRNAをコードしている第24項または
第26項記載の植物細胞。 ２９．該アミノ末端領域−暗号化配列が、オクトピン・
シンセターゼ遺伝子の最初の11アミノ酸をコードしてい
る第28項記載の植物細胞。 ３０．ハイグロマイシン耐性を付与する暗号領域が、プ
ラスミドpOW20の〜1.3kb BamH I−Bgl II制限フラグメ
ントから誘導される第23項〜第29項のいずれかに記載の
植物細胞。 ３１．（ａ）暗号領域（ｃ）の５′側にある植物発現プ
ロモーター配列、 （ｂ）暗号領域（ｃ）の３′側にあるターミネータ信号
配列、 （ｃ）該植物発現プロモーター配列（ａ）と該ターミネ
ータ信号配列（ｂ）の間に位置しているハイグロマイシ
ン・ホスホトランスフェラーゼをコードする遺伝子の暗
号領域 からなる植物細胞において機能的なキメラ遺伝子が組込
まれ、そのキメラ遺伝子の発現によってその選択が可能
なハイグロマイシン耐性が付与された植物細胞を含有す
る、ハイグロマイシン耐性の、アグロバクテリウム属微
生物による感染に感受性の双子葉植物。 ３２．該植物発現プロモーター配列が天然のプロモータ
ー配列であり、該プロモーター配列に天然に結合した遺
伝子のアミノ末端領域−暗号化領域まで延びかつそれを
含むプロモーター領域の３′側の天然の配列をさらに含
み、該ハイグロマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺
伝子のコード領域が正しい読み枠内でアミノ末端領域−
暗号化配列に融合している第31項記載の植物。 ３３．該プロモーター配列がオクトピン・シンセターゼ
遺伝子からのものである第31項または第32項記載の植
物。 ３４．該天然のプロモーター配列および天然のプロモー
ター配列に天然に結合した３′側の天然配列がオクトピ
ン・シンセターゼ遺伝子からのものである第32項記載の
植物。 ３５．該ターミネータ信号配列がノパリン・シンセター
ゼ・ターミネータ信号配列である第31項〜第34項のいず
れかに記載の植物。 ３６．該アミノ末端領域−暗号化配列が、開始コドンを
含むメッセンジャーRNAをコードしている第32項または
第34項記載の植物。 ３７．該アミノ末端領域−暗号化配列が、オクトピン・
シンセターゼ遺伝子の最初の11アミノ酸をコードしてい
る第36項記載の植物。 ３８．ハイグロマイシン耐性を付与する暗号領域が、プ
ラスミドpOW20の〜1.3kb BamH I−Bgl II制限フラグメ
ントから誘導される第31項〜第37項のいずれかに記載の
植物。
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