DK175506B1 - Chimer gensekvens, som er funktionel i en plantecelle, rekombinant gensekvensudtrykkelsesvektor indeholdende gensekvensen, fremgangsmåde til regenerering af modne planter samt et plasmid - Google Patents

Description

I DK 175506 B1 I

I I

I Den foreliggende opfindelse angår en chimer gense- I

I kvens, som er funktionel i en plantecelle, en re- I

I kombinant gensekvens-planteudrykkelsesvektor, der I

I indeholder den chimere genskevnes, en fremgangsmåde I

I 5 til udvælgelse af en hygromycin-resistent- rekombi- I

I nant DNA-holdig plantecelle, en fremgangsmåde til I

I regenerering af modne planter ud fra udvalgte I

I celler, en fremgangsmåde til frembringelse af hy- I

I gromycin-resistens hos en plantecelle, en frem- I

I 10 gangsmåde til udvælgelse af transformerede planter I

og to plasmider. I

I Den dannelse af krongalle på tokimbladede planter, der I

I skyldes Agrobacterium tumefaciens, er et resultat af I

I 15 en overføring og en covalent integration af et lille I

I segment benævnt transfer-DNA (T-DNA) af et tumor-indu- I

I cerende (Ti) plasmid ind i plantecellernes chromosomale I

DNA. Det overførte T-DNA udtrykkes i planteceller og I

I 20 koc*er f°r flere forskellige polyadenylerede transskrip- I

I tionsprodukter; Nogle af disse transskriptionsprodukter I

I vides at være ansvarlige for opin-syntese og for tumor- I

I vækst. Disse sidstnævnte transskriptionsprodukter inkodes I

I af oncogener. Nogle af transskriptionsprodukterne har I

I 25 vist sig at være af betydning for T-DNA-overføringen. I

I Overføringsmekanismen formodes at involvere gentagne I

I nucleotid-sekvenser, som er tilstede nær T-DNA-grænserne. I

I Så længe disse grænser er tilstede, er det muligt at I

I 3Q indføre en fremmed gensekvens i T-DNA'et af et Ti-plasmid, I

I og genet kan således indføres i genomet af en tumorcelle I

I eller en regenereret plante. I

I Udover T-DNA-sekvenserne er det den generelle opfattelse, I

I at også et artdet system af Ti-plasmid-gener, lokaliseret I

I udenfor T-DNA'et og benævnt VIR (virulens) regionen, I

I spiller en rolle ved mobiliseringen-af T-DNA'et fra I

I bakterien til plantecellen. Tilstedeværelsen af krongalle I

I (tumor) på planter inficeret af en Agrobacterium-stamme, I

2 DK 175506 B1 som både bærer T-DNA og VIR-regioner, har hidtil været det primære middel til at identificere transformerede planteceller. Denne identifikationsmetode har imidlertid en begrænset kommerciel anvendelighed, fordi det ikke 5 er muligt at regenerere hele planter fra krongalle, der indeholder funktionelle oncogener. Der er således ønskeligt og fordelagtigt at udvikle en metode, hvormed man kan introducere og udtrykke fremmede gener i plante-1Q celler uden at være afhængig af tumor-gener til udvælgelse og identifikation af transformerede planteceller.

For øjeblikket kendes en række forskellige metoder til 15 indføring af DNA i planteceller, hvilke metoder giver mere eller mindre gode resultater. Disse metoder omfatter anvendelsen af liposomer til indkapsling af et eller flere DNA-molekyler, plantecellernes kontakt med DNA (som danner komplekser med énten polykationiske substanser 20 eller calciumphosphat) og protoplast-fusionsteknikker.

Den for tiden mest foretrukne teknik involverer udnyttelsen af Ti-plasmider fra Agrobacterium-celler til overføring af en ©nsket gensekvens til en plantecelle. For nylig har 25 forskere fra Monsanto Company eftervist tilgængeligheden af et co-integrant Ti-plasmid til anvendelse ved en metode til transformering af planteceller (se Fraley og Rogers, PCT ansøgning nr. W084/0219). Desuden kendes et binært

Ti-vektorsystem, som er udviklet af Hoekema et al., 30 1983, Nature 303:179.

Den ovennævnte T-DNA-region fra Ti-plasmidet er tilgængelig til indføring af en ønsket gensekvens, 35 som er under kontrol af en funktionel pianteudtryk-kelsesmekaniske. Sådanne chimere gensekvenser er velkendte til ud.trykkelse af både plante- og bakterie-afledte polypeptider. Forud for den foreliggende opfindelsen har man imidlertid aldrig udtrykt et chimert protein, dvs. en heterolog gensekvens, som er sammensme1tet med en hel strukturel plan te-gensekvens eller en del deraf, i en plante-

I DK 175506 B1 I

I 3 I

I celle. Vektor-konstruktionerne ifølge den fore- I

I liggende opfindelse gør det muligt at fremst i 1le" et I

I sådant chimert protein, og den foreliggende opfin- I

I delse bidrager således til den fortsatte udvikling I

I 5 af p1antetransformations systemer . I

I Som der er eftervist for celler fra bakterier og pattedyr, I

I består et af dé primære trin i udviklingen af effektive I

I transformationssysteiner i at konstruere dominante udvælge- I

I ^0 lige markerer. Sådanne markører gør det muligt for celler, I

I der har opnået nye gensekvenser via transformation, at blive

I udvalgt og identificeret på bekvem måde. Med den forelig- I

I gende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte udtrykkel- I

I 15 sesvektorer, som viser, at aminocyclitol-antibiotiket I

I hygromycin B kan danne basis for et sådant udvælgelsespro- I

I gram for transformerede planteceller. I

I Fremgangsmåden til udvælgelse af transformerede plante- I

I 20 celler fra en baggrund af ikke-transformerede celler I

I gør det muligt at addere ikke-udvælgeligt DNA til de I

I omhandlede vektorer, at transformere planteceller med I

I de modificerede vektorer og at udvælge hygromycin-resi- I

I stente transformanter, som indeholder dette ellers ikke- I

I 25 I

I udvælgelige DNA. Eftersom transformationen er en begiven-

I hed, som kun indtræffer yderst sjældent, er en sådan I

I funktionel test en praktisk nødvendighed for at bestemme, I

I hvilken celle eller hvilke celler blandt millioner af I

I 30 celler, der har modtaget det transformerende DNA. I

I Af hensyn til forståelsen af den foreliggende opfindelse

I skal følgende begreber defineres: I

I oc rekombinant DNA-klonende vektor: et vilkårligt autonomt I

I 35

I replikerende middel omfattende (men ikke begrænset til) I

I plasmider og bestående af et DNA-molekyle, hvortil et I eller flere yderligere DNA-segmenter kan knyttes eller

I være knyttet. I

4 DK 175506 B1

Rekombinant DNA-udtrykkelsesvektor: en vilkårlig rekombi-nant DNA-klonende Vektor, hvori der er inkorporeret en eller flere transskriptions- og translations-aktiverende sekvenser.

5 Kodningssekvens for amino-terminal region: den region af DNA'et, som indkoder den del af mRNA'et, hvor translationen til et polypeptid påbegyndes, og hvorfra en del af polypeptidets amino-ende translateres.

^ Chimert protein: et heterologt polypeptid, som kan udvindes, og som er translateret fra RNA, der er indkodet af en gensekvens indeholdende en promotor og en del af en homolog kodningsregion.

15 Grænsesekvens: DNA-sekvens, som indeholder enderne af T-DNA'et.

Replicon med bredt værtsområde: et DNA-molekyle, som kan overføres til og opretholdes i mange forskellige bakterieceller.

20

Konjugation: den proces, hvorved DNA overføres fra en bakterie-af en given type til en bakterie af en anden type gennem celle-til-celle-kontakt.

Krongalle: en plantetumor fremkaldt af-Agrobacterium 25 tumefaciens.

Ti-plasmid: et stort Agrobacterium-plasmid, som frembringer evnen til at inducere tumorer og fremskynder den bakterielle konjugation.

Mikro-Ti-plasmid: et plasmid, der kan undergå replikation i Agrobacterium-stammer, og som indeholder DNA flankeret af T-DNA-grænser.

Ikke-oncogenstamme: en stamme af Agrobacterium tumefaciens, som er ude af stand til at inducere krongalle, men som 35 opretholder VIR-funktionerne.

Transformation: indforing af DNA i en modtagende værtscelle, som ændrer genotypen og medfører en fænotypisk ændring hos den modtagende celle.

I DK 175506 B1 I

I I

I Med den foreliggende opfindelse tilvejebringes funktionelle I

I og udvælgelige mikro-Ti-plasmider. Hygromycin-phosphotrans- I

I ferase (aphIV) genet fra Escherichia coli blev indført

I imellem 5'-promotoren og den tilknyttede kodningssekvens I

I 5 for den amino-terminale region i et octopin-synthetase I

I (OCS) gen og 31-terminator-sekvensen af en nopa1in-synthe- I

I tase-gensekvens. Disse konstruktioner blev samlet I

I imellem T-DNA-grænsefragmenterne i en vektor med I

I bredt værtsområde til dannelse af mikro-Ti-plas- I

I 10 miderne ifølge opfindelsen. I

I Fremgangsmåden til frembringelse af hygromycin- I

I resistens hos en planteceller ejendommelig ved, at I

I man integrerer den chimere gensekvens ifølge op- I

I 15 findelsen i genomet af en hygromycin-sensitiv I

I plantecelle som et funktionelt element af et I

I chromosom eller et plasmid. I

I Opfindelsen illustreres nærmere under henvisning til. I

I 20 tegningen, hvor I

I fig. 1 er et restriktions- og funktionsdiagram for plasmid I

I pCEL30, I

I 25 I

I fig. 2 er et restriktions- og funktionsdiagram for plasmid I

I pCEL40, og I

I fig. 3 er et restriktions- og funktionsdiagram for plasmid I

I 30 pCEl_44. I

I Den rekombinante gensekvens-planteudtrykkelses- I

I vektor er funktionel og udvælgelig i plante og om-

I fatter; I

I 35 I

I 1) en transskriptionsenhed, som er flankeret af I

I transfer-DNA-grænsesekvenser, og som består af I

I en promotor og en tilknyttet kodningssekvens I

I for den amino-terminale region samt en terminator- I

6 DK 175506 B1 signalsekvens, hvilke sekvenser er afledt af en eller flere gensekvenser, som udtrykkes naturligt i en plantecelle; 5 2) en sekvens, der koder for en gensekvens for antibiotisk resistens, og som er lokaliseret imellem promotoren med den tilknyttede kodningssekvens for den amino-terminale region og terminator-sekvensen, og ^ 3) et DNA-fragment indeholdende et replicon, der er funktionelt i Agrobacterium.

Ifølge opfindelsen har man indført et ca. 1,3 kb stort 15 BamHI-Bglll-fragment, der koder for hygromycin-phosphotrans-ferase, i begge orienteringer i et enkeltstående BglII-re-striktionssted i den intermediate kloningsvektor, plasmid pCEL30. Plasmid pCEL30 barer promotor-transskriptionssignalet og de sekvenser, der koder for de første 11 aminosy- 20 rer i ocs-genet. Indføringen af gensekvensen, som indkoder hygromycin-phosphotransferase (aphIU), blev foretaget på en sådan måde, at aflæsningsrammen for den ocs-kodende regiqn blev opretholdt. Det betyder, at aphIV-genet 25 blev sub-klonet ind i Bglll-stedet i plasmid pCEL30, og p.g.a. de specifikke sekvenser, som var involveret, resulterede dette i frembringelse af en Bgll I-BamHI-fusion i umiddelbar nærhed af ocs-genets start-kodon. Den resulterende vektor, plasmid pCEL40, koder for et ocs-aphlV-fusions-30 protein. Når aphIV-genet blev indført med den modsatte orientering, blev der ikke produceret hygromycin-phosphotransferase. Et restriktions- og funktionsdiagram for plasmiderne pCEL30 og pCEL40 er vist på fig. 1 og 2.

35

Plasmid pCEL30 kan på sædvanlig måde isoleres fra Escherichia coli K12 RR1ΔΜ15/pCEL30, som er en stamme, der er deponeret som del af samlingen af stamkulturer hos

I DK 175506 B1 I

I I

I The Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois I

I 61604. Plasmid p0W20, som er en kilde For hygromycin-phos- I

photransferase-gensekvensen, er ligeledes deponeret hos NRRL I

I og kan let isoleres fra E. coli JA221/p0W20. Begge stammer I

5 er tilgængelige for offentligheden som foretrukken kilde I

I og stamreservoir for plasmiderne, og deres deponerings- I

I numre er henholdsvis NRRL B-15915 og NRRL B-15838. I

I Eftersom plasmid pCEL40 ikke er i stand til at undergå I

10 I

replikation i Agrobacterium, blev mikro-T-DNA'et af I

I plasmid pCEL40 først, i form af et EcoRI-fragment, over- I

I ført til en vektor pKT210 med bredt værtsområde. Denne I

I værtsvektor kan fås fra the Plasmid Reference Center, I

I 15 Stanford University, Palo Alto, California 94305. Anven- I

I delsen af en vektor med et specifikt værtsområde er I

I ikke kritisk ved konstruktionen af de omhandlede plasmider. I

I Således findes der andre nyttige vektorer, blandt hvilke I

I H

I man kan nævne pRK290 (Ditta et al., 1980, Proc.^.Nati. I

I Acad. Sci. 7^7:7347-7351 og R772 (Hoekema et al., 1983, I

I Nature 303; 179-180). Når et fusionsprotein på passende I

I måde er samlet og indført i et plante-genom, vil det I

I blive udtrykt i plantecellen under dannelse af et ønsket I

I 25 polypeptid, såsom et bakterielt enzym, som bibringer I

I planten antibiotisk resistens. Det betyder, at det resul- I

I terende mikro-Ti-plasmid pCEL44 er ekstremt nyttigt, I

I fordi det indeholder et udvælgeligt og funktionelt plante- I

I 30 9en f°r hy9romycin-resistens· * forbindelse med tilstede- I

I værelsen af et udvælgeligt og funktionelt plantegen I

I bibringer den enestående konstruktion af plasmid pCEL44 I

I yderligere fordelagtige egenskaber, som kan anvendes I

I i plantetransformationssystemer. For eksempel medvirker I

I 35 T-DNA'ets grænsesekvenser ved overføringen og den covalente

I integration af transskriptionsenheden af det omhandlede I

I mikro-Ti-plasmid i plantecellernes chromosomale DNA. I

I Agrobacterium-stammernes funktionelle replicon indebarer I

8 DK 175506 B1 et effektivt middel til plasmid-replikation og eliminerer det co-integrationstrin, som anvendes af andre fagfolk.

Oet enkeltstående Sall-kloningssted frembyder endvidere et bekvemt kløvningssted, som kan anvendes til indføring 5 af en gensekvens af interesse.

Den ovenfor beskrevne vektor bibringer hygromycin-resistens til planteceller p.g.a. tilstedeværelsen af et funktionelt phosphotransferase-aphIV-gen. Selv om det bestemte phosphotransferase-gen, som er indført i den ovennævnte 10 vektor, er et ca. 1,3 kb stort BamHI-Bglll-restriktions- fragment, kan dette erstattes med andre kendte phosphotrans ferase-aphl U-gener . Sådanne gensekvenser omfatter (men er ikke begrænset til) de gensekvenser, der er beskrevet af Rao et al., 1983, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 15 24:689-695. Endvidere kan man anvende en række forskellige restriktionsfragmenter af plasmid pOU20, som jndeholder den hygromycin-resistens-over førende gensekvens , forudsat at ethvert af disse restriktionsfragmenter er således placeret, at promotor-regionen bevirker en transskription 20 af den strukturelle sekvens. Phosphotransferase-aphlV-gen- et indkodes på 1/1,3 kb BamHI-BgllI-fragmentet af plasmid p0W20, hvilket betyder, at et hvilket som helst restriktions-fragment, som indeholder det ovennævnte v 1,3 kb BamHI-BgllI-fragment, også overfører den ønskede resistens til sensi-25 tive plante-værtsceller. Det vil være indlysende for fagmanden, at alle de ovennævnte gensekvenser og fragmenter er funktionelt ækvivalente, og de kan således anvendes og udskiftes med hinanden til opfindelsens formål.

De restriktionsfragmenter, som benyttes til at konstruere-30 illustrative vektorer ifølge opfindelsen, kan modificeres på i sig selv kendt måde med henblik på at lette ligeringen. For eksempel kan man anbringe molekylære bindere på et bestemt phosphotransferase-aphll'-holdigt restriktions-

I DK 175506 B1 I

i 9 I

I fragment, på det DMA, som omfatter vektorens replikations- I

I funktioner, eller på det DNA, der udgør promotor- eller I

I termina tor-sekvenserne. Man kan således på bekvem måde I

I konstruere specifikke steder, hvor den efterfølgende I

I 5 ligering kan foretages. Desuden kan ethvert af disse _ I

I DNA-fragmenter modificeres ved at addere, eliminere I

I eller substituere bestemte nucleotider med henblik på I

I at ændre de foreliggende karakteristika og at tilvejebringe I

I eller eliminere en række restriktionssteder til li gering I

I ίο I

af DNA. Fagmanden er bekendt med nucleotid-kemien og

I den genetiske kode og vil derfor vide, hvilke nucleotider I

I der kan udskiftes indbyrdes, og hvilke DNA-modifikationer I

I der er ønskelige til et specifikt formål. I

I 15 I

I Fremgangsmåden til udvælgelse af en hygromycin- I

I resistenskombinant DNA-holdig plantecelle er I

H

ejendommelig ved, at man

I a) transformerer udtrykkeslesvektoren ifølge I

I 20 opfindelsen i en agrobacterium tumefacens- I

I stamme, I

I b) indfører den chimere gensekvens af udtryk- I

I kelsesvektoren i en hygromycin-sensitiv I

I 25 plantecelle og I

c) udvælger en celle, som udtrykker hygromycin- I

resistens, ved at dyrke cellen i nærværelse

af en tilstrækkelig mængde hygromyc intilat I

30 forhindre vækst i tilfælde af, at hygromy- I

cin-resistens-gensekvensen ikke er til

stede. I

I overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge opfindelsen I

35 I

blev mikro-Ti-plasmider, såsom pCELAA, konjugeret ind I

i forskellige stammer af Agrobacterium tumefaciens. I

Triparentale parringer blev foretaget med E. coli K12 I

RRLdM15/pCEL4A, en E. coli indeholdende hjælpeplasmidet I

pRK2013 (Ditta et al., supra) og A. tumefaciens LBA4013, I

10 DK 175506 B1 en stamme, der indeholder et Ti-plasmid af vildtype, nemlig pTiAch5. Til opfindelsens formål er anvendelsen af et specifikt hjælpeplasmid eller af en specifik stamme af A. tumefaciens ikke kritisk. I denne sammenhæng kan 5 ethvert af hjælpeplasmiderne, som er beskrevet af Bagda-sarian et al., 1981, Gene 16: 237-247, anvendes i stedet for plasmid pRK2013, eftersom den eneste funktion af dette kanamycin-resistente hjælpplasmid pRK2013 er at trans-komplementere mikro-Ti-plasmidet med henblik på 10 mobilisering. På lignende måde kan en hvilken som helst oncognisk stamme af A. tumefaciens, som bærer et Ti-plasmid af vildtype med en funktionel vir-region, der er i stand til at overføre sit eget Ti-plasmid til en plantecelle og transformere plantecellen, anvendes ifølge 15 opfindelsen. Forskellige stammer af Agrobacterium tumefa ciens, som egner sig til anvendelse i forbindelse med opfindelsen, er offentligt tilgængelige; se f. eks.

ATCC Catalogue of Strain I, side 66 (15. udgave), 1982).

Ved en foretrukken udfør el sesform gør man brug af 20 en ikke-oneogeni sk, eller avirulent, stamme af A.

tumefaciens. En sådan stamme kan konstrueres via modtagelsen af et Ti-plasmid^ hvorfra T-DNA-regionen er blevet udslettet. En særlig stamme af Agrobacterium tumefaciens, som er tilgængelig til 25 anvendelse ifølge opfindelsen, er A. tumefaciens LBA-4404.

Denne stamme er udviklet af Dr. P.J.J. Hooykaas og deponeret hos Centrale Collectie van Schimmeleultures (CBS) i Baarn under nr. CBS191.83. Denne stamme er også deponeret hos Research Laboratory, hvorfra den er tilgængelig 30 for offentligheden under deponeringsnummeret NRRL 8-15920.

Planteceller, som udsættes for denne bakteriestamme, danner ikke krongalle. I stedet dannes hygromycin-resistent callus, som let regenereres i modne planter.

I DK 175506 B1 I

I 11 1

I Den infektion af plantevæv, som skyldes Agrobacterium, I

I er en simpel teknik, som er velkendt for fagmanden. I

I Typisk bibringes plantenetsår, hvilket kan ske på I

I en række forskellige måder, herunder skæring med et

I 5 barberblad, gennemboring med en nål eller gnidning med I

I et slikbemiddel. Såret kodes derefter med en opløsning, I

I der indeholder tumor-inducerende bakterier. Ved den I

I foreliggende opfindelse anvendtes Agrobacterium-stammer, I

I som indeholdt et binært vektorsystem bestående af vild- H

I 10 type-Ti-plasmidet og mikro-Ti-plasmidet pCEL44, til I

I at fremprovokere galle på asceptisk afskårne stiklinger I

I af Nicotians tabacum cv Wisconsin 38. Desuden benyttedes I

I en ikke-oncOgenisk stamme af A. tumefaciens, som indeholdt I

I mikro-Ti-plasmidet pCEL44, til at -inducere callus-produk- I

I 13 tionen fra bladudsnit af Nicotiana plumbagini folia og I

I Nicotiana tabacum cv Wisconsin 38. Begge disse varieteter I

I kan let fås fra the United States Department og Agricul- I

I . ture's Tobacco Research Laboratory, Box 16G, Oxford, I

I North Carolina 27565. Anvendelsen af en celle fra en I

I 20 specifik plantetype er ikke kritisk for opfindelsen, I

I eftersom en celle fra en hvilken som helst plante, til ·Ν I

I hvilken et Ti-plasmid kan transformeres ved hjælp af I

I Agrobacterium-stammer, kan udnyttes, for eksempel kan I

I cellen komme fra en hvilken som helst tokimbladet plante, H

I 25 såsom tomat, kartoffel, tobak, solsikke eller soyabønne, I

I eller fra en enkimbladet plante, såsom medlemmer af I

I familierne Liliaceace og Amaryllidaceae. I

I De resulterende tumorvækster blev udskåret, og DNA’et I

I blev isoleret fra repræsentative tobakskloner, digereret H

I 30 med BamHI og BamHI tilsat Hindi Il-restriktionsenzymer I

I og derefter underkastet Southern blot-behandling. Det fl

I ca. 1,3 kb store BamHI-Bg111-fragment, som overførte H

I hygromycin-resistens, blev translateret i udsnit til H

I anvendelse som hybridiseringsprøve til analysering af I

12 DK 175506 B1 T-DNA-strukturen.

En plantecelle, som er transformeret med et Ti-plasmid i overensstemmelse med opfindelsen, benyttes til at 5 regenerere en plante, som udtrykker hygromycin-resistens såvel som andre funktioner, for hvilke Ti-plasmidet koder. Opfindelsen er nyttig til genetisk modifikation af plantevæv og hele planter ved indføring af nyttige gensekvenser fra andre plantearter eller -stammer, og 10 sådanne nyttige plantegensekvenser omfatter (men er ikke begrænset til) gensekvenser,der koder for forrådsproteiner, lectiner, resistens-faktorer imod sygdomme, insekter og herbicider, faktorer, som bibringer tolerance overfor miljømæssige påvirkninger, og lignende.

15 Fremgangsmåden, plasmiderne og transformanterne ifølge opfindelsen giver planteavlere et nyt middel til at indføre ønskelige gensekvenser i planter, og plante-molekylære biologer får rådighed over molekylære prøver til undersøgelse af planters udvikling.

20

Opfindelsen illustreres nærmere ved de følgende eksempler.

Eksempel 1 25 E. coli RR1åM15/pCEL3Q og isolation af plasmid pCEL30.

A. Dyrkning af E. coli RRlaMl5/pCEL3Q 30 E. coli RR1 Ml5/pCEL30 (NRRL B-15915) blev dyrket i 750 ml l-medium (10 g/l caesin-hydrolysat, 5 g/1 gærekstrakt, 5 g/l NaCl, 1 g/l glucose, pH 7,4) indeholdende ampicillin i en koncentration på 50 mg/ml i overensstemmel-35 se med konventionelle mikrobiologiske procedurer. Kulturen blev indhøstet efter 24 timers inkubering ved 37 °C under kraftig omrystning.

I DK 175506 B1 I

I 13 I

I B. Isolation af plasmid pCEL3Q I

I Kulturen blev centrifugeret, og celletabletten blev I

I . I

I resuspenderet i 50 ml frisk fremstillet lyseringspuffer I

I 5 (50 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA, 9 mg/ml glucose, I

I 2 mg/ml lysozym). Efter 45 minutters inkubation på is I

I blev suspensionen blandet med 100 ml af en opløsning, I

I som var 0,2 N med hensyn til NaOH og 1¾ med hensyn til I

I ^ SDS, og derefter holdt på is i yderligere 5 minutter. I

I Der tilsattes yderligere 90 ml 3 M natriumacetat, hvor- I

I efter blandingen blev holdt på is i 60 minutter. I

I Affaldet fra cellerne blev fjernet ved centrifugering, I

I ^ og supernatanten blev blandet med 500 ethanol. Efter I

I 2 timer forløb ved -20 °C blev nucleinsyren omdannet I

I til en tablet ved centrifugering og resuspenderet i I

I 90 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8, 10 mM EDTA. I

I 20 I

I Nucelinsyreopløsningen blev blandet med 90 mg cesiumchlorid I

I og 0,9 ml af en opløsning indeholdende 10 mg/ml ethidium- I

I bromid. Der centrifugeredes med 40.000 omdr. pr. min. I

I i 24 timer for at rense plasmid-DNA’et. Plasmid-DNA-båndet I

I pc I

I blev udvundet og på ny centrifugeret med 40.000 omdr. I

I pr. min. i lu timer. Derefter blev plasmid-DNA-båndet I

I opsamlet på ny og befriet for cesiumchlorid og ethidium- I

I bromid ved velkendte procedurer. Derpå blev plasmid-DNA'et I

I 3Q udfældet med 2 volumener ethanol indeholdende 90 g/liter I

I ammoniumacetat. DNA-tabletten blev opløst i TE-puffer I

I (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM Ε0ΤΑ) til en koncentration I

I på 0,2 mg/ml. I

I Eksempel 2 I

I Dyrkning af Escherichia coli JA221/pQW2Q og isolation I

I af plasmid pQW20 I

14 DK 175506 B1 A. Dyrkning af E. coli JA221/pQW20

Denne bakterie dyrkes som beskrevet for E. coli RR1AM1'5 i eksempel 1 ovenfor.

5 B. Isolation af plasmid pOM20 \

Dette plasmid fremstilles som beskrevet for plasmid 10 pCEL30 i eksempel 1 ovenfor.

Eksempel 3 i

Konstruktion af Escherichia coli RRl£M15/pCEL40 ! 15 ---- A. Bql ΙΙ-diqestion af plasmid pCEL30 og behandling ! med kalvetarm-phosphatase | 20 Fem ^ug plasmid pCEL3C DNA blev digereret med 30 enheder

Bgllt-restriktionsenzym ved omsætning af 150^uliter af forbindelsen som anbefalet af enzym-fabrikanten*.

Digestionen fik lov at forløbe i 90 minutter ved 37 °C.

25

Reaktionsblandingen blev først blandet med 8,75^uliter 0,5 M Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA og derefter med 1,25 enheder kalvetarm-phosphatase (Boehringer Mannheim), 30 hvorpå der inkuberedes ved 37 °C i 15 minutter. Blandingen blev ekstraheret med phenol tilsat en puffer og derefter ekstraheret med ether, hvorefter der udfældedes med to volumener ethanol indeholdende ammoniumacetat. Efter 30 minutters forløb ved -70 °C blev DNA'et omdannet 35 til en tablet og på ny opløst i TE-puffer til en koncentration på 10^ug/ml.

£

Restriktionsenzymer og andre enzymer kan fås fra følgende leverandører:

I DK 175506 B1 I

I 15 i

I Bethesda Research Laboratories, Inc. I

I Box 6010 I

I Rockville, Maryland 20850, USA I

I

I 5 Boehringer Mannheim 8iochemicals I

I 7941 Castleway Orive I

I P.0. Box 50816 I

I Indianapolis, Indiana 46250, USA I

I 10 I

I New England Bio Labs., Inc. I

I 32 Tozer Road I

I Beverly, Massachusetts 0915, USA. I

I ^ B· BamHI-Bql11-digestion og isolation af^l,3 kb fragment- I

I et af plasmid p0W20 I

I Omkring 20^ug plasmid-ONA digereres med restriktionsen- I

I 20 zymerne BamHI og Bglll i overensstemmelse med enzym-leve- I

I randørens anbefalede procedurer. I

I DNA-fragmenterne, som opstår ved denne digestion, fratio- I

I neres ved agarose-gelelektroforese på sædvanlig måde I

I 25 o g isoleres yed indfangning af et stykke NA-45 DEAE I

I papir (Schleicher & Schuell Inc., Keene, New Hampshire I

I 03431) indført i gelen under elektroforesen. ONA'et I

I elueres fra papiret ved at rotere dette i 5 sekunder I

I 2q sammen med en mængde af en puffer med højt saltindhold I

I (1,0 M NaC 1; 0,1 mM EDTA og 20 mM Tris, pH 8,0), som I

I er tilstrækkelig til at dække papiret i en mikrocentri- I

I fuge. Papiret inkuberes ved 55 - 60 “C i 10 - 45 minutter I

I under lejlighedsvis rotation. Derefter fjernes pufferen, I

I qc ^ og papiret vaskes med omkring 50^uliter puffer. DNA'et

I ekstraheres først med phenol og derefter med ether, I

I hvorefter det resuspenderes i TE-puffer til en koncentration I

I på omkring 25^ug/ml. I

16 DK 175506 B1 C. Liqerinq

Ti ng phosphatase-behandlet Bglll-skåret plasmid pCEL30 blev blandet med 50 ng af det rensede \> 1,3 kb 8amHI-5 Bglll-fragment i 15^ul ligase-puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,6; 10 mM MgC^; 10 mM OTT og 1 mM ATP) indeholdende 0,8 enheder TA DNA ligase (8RL). Blandingen blev inkuberet natten over ved 15 °C.

D. Transformation af E. coli RR1&M15 og udvælgelse

Ligeringsblandingen blev blandet med 15^uliter steril 60 mM CaCl-opløsning. Derefter tilsattes 70^uliter af 15 en suspension af kompetente E. coli RRl&M15-celler, som var opbevaret i en koncentration på 20X i 30 mM CaCl og 15¾ glycerol ved -70 °C. Efter 60 minutter på is blev transformationsblandingen varmebehandlet ved 42 °C i 2 minutter og derefter inkuberet med 0,5 ml 20 L-medium i 90 minutter ved 37 °C.

Prøver af blandingen blev udspredt på L-medium indeholdene, de ampicillin i en mængde på 50 mg/liter og derefter 25 bragt til størkning med agar i en mængde på 15 g/liter.

Disse prøver blev derefter inkuberet natten over ved 37 °C for at muliggøre vækst af kolonier fra transformerede celler.

30

E. Identifikation af kloner af E. coli RR1ÅM15 indeholdende plasmid pCELAQ

De kolonier, der opstod ved trans formationen, blev indkodet 35 i 5 ml L-medium, der indeholdt 50 mg/ml ampicillin, og dyrket natten over ved 37 °C. Der fremstilledes plasmid-DNA ud fra prøver på 1 ml af disse kulturer ved hjælp af proceduren beskrevet af Holmes 4 Quigley (Analytical

I DK 175506 B1 I

I I

I Biochemistry 114:193; 1981), og DNA'et blev på ny opløst I

I i 50^uliter TE-puffer. I

I Plasmiderne blev digereret i reaktionsblandinger på I

I lO^uliter bestående af 7,5^uliter af DNA-opløsningen I

I ^ og omkring 5 enheder af hvert af restriktionsenzymerne I

I Hindlll, PstI, Bglll og Bglll plus Hindlll og andre I

I reagenser som foreslået af enzym-leverandørerne. Efter I

I 60 minutters forløb ved passende temperatur blev dige- I

I stionsprodukterne analyseret ved agarose-gelelektrofo- I

I rese under anvendelse, af velkendte procedurer. Størrelser- I

I ne af de fragmenter, som produceredes ud fra pCELAO I

I ved hjælp af restriktionsenzymer, var i overensstemmelse I

I med den på fig. 2 viste plasraid-struktur. I

I Eksempel 4 I

I ^ Konstruktion af mikro-Ti-plasmid pCEL44 I

I * A. EcoRI-diqestion af plasmid pKT210 og phosphatase-behand- I

I ling I

I Fem ^ug plasmid pKT210 blev digereret med 50 enheder I

I EcoRI-restriktionsenzym i 150^uliter af en reaktionsbian- I

I 20 ding som anbefalet af enzym-leverandøren. Efter 90 minut- I

I ters forløb ved 37 °C blev reaktionsblandingen behandlet I

I med kalvetarm-phosphatase som beskrevet i eksempel 3 I

I og opløst i TE-puffer til en koncentration på 10^mg/ml. I

I B. EcoRI-digestion af plasmid pC£L4Q I

I 25 Femten ^uliter af et præparat af plasmid pCEL40 DNA, I

I konstrueret i eksempel 3E, blev digereret med 10 enheder I

I EcoRI-restriktionsenzym i 20^uliter reaktionsblanding I

I ved 37 °C i 90 minutter. Der ekstraheredes med phenol I

18 DK 175506 B1 og derefter med ether. Det digererede DNA blev udfsldet med to volumener ethanol indeholdende ammoniumacetat ved -20 °C og derefter atter opløst i 20^ulit'er TE-puffer.

C. tigering, transformation og udvælgelse af £. coli 5 RRLÅM25/pCEL44 10 ng phosphatase-behandlet, EcoRI-skåret pKT210 blev ligeret med 5^ul EcoRI-skåret pCEL30 som beskrevet i eksempel 3C og transformeret til E. coli RR1&M15 som beskrevet i eksempel 3D.

10 De transformerede celler blev udvalgt efter deres evne til at vokse på et størknet L-medium indeholdende chloramphenicol i en mængde på lO^ug/liter. De kolonier, der indeholdt pCEL44, blev identificeret ved PstI-,

Hindlll- og BamHI-restriktionsenzymanalyse af deres 15 konstitutive plasmider som beskrevet i eksempel 3E.

Et restriktions- og funktionsdiagram er vist på tegningens fig. 3.

Eksempel 5

Konjugation af pC£L44 til Agrobacterium tumefaciens 20 LBA4013 A. Dyrkning af foraldrestammer

Escherichia coli K12 RRlAMl5/pCEL44 og E. coli pRK2013 blev dyrket natten over ved 37 °C på størknet L-medium. Agrobacterium tumefaciens LBA4013 blev dyrket i to dage 25 ved 28 °C på størknet L-medium.

B. Triparental konjugation og udvælgelse

En løkke af hver af de tre ovenfor beskrevne stammer

I DK 175506 B1 I

I 19 I

I blev blandet i 1 ml af en 30 roM magnesiumsulfatopløsning. I

Derefter blev en dråbe af blandingen anbragt på størknet I

I TY-medium (5 g/liter casein-hydrolysat, 5 g/liter gæreks- I

I trakt, 15 g/liter agar) og inkuberet ved 28 °C natten I

B · 5 over. , I

I Bakterievæksten blev resuspenderet i 3 ml 10 mM magnesium- ’ I

I sulfatopløsning, og 0,1 ml prøver af seriefortyndinger I

I blev udsået på størknet TY-medium indeholdende 100 mg/liter I

I nalidixinsyre og 2 mg/liter chloramphenicol', hvorefter I

I 10 der inkuberedes ved 28 °C. I

I Transkonjuganter gav anledning til individuelle kolonier I

efter 2,-4 dages vækst. Disse kolonier blev indkodet I

I enkeltvis i 25 ml flydende TY-medium indeholdende 100 I

I mg/liter nalidixinsyre og 2 mg/liter chloramphenicol, I

I 15 og der inkuberedes ved 28 °C under omrystning i yderligere I

2 dage. Transkonjuganternes plasmid-indhold blev derefter I

I undersøgt ved metoden beskrevet af Casse et al. (Journal I

I og General Microbiology 113:229-242; 1979). I

I Eksempel 6 I

20 Indføring og udtrykkelse af hyqromycin-resistens i kronqal- I

leceller fra tobak I

Aseptiske tobaksplanter af rendyrket Wisconsin 38 blev I

frembragt på følgende måde: frøene blev steriliseret I

ved behandling i 10 minutter med 10¾ Clorox blegemiddel I

25 efterfulgt af en rensning med 95¾ ethanol og en ekstensiv I

rensning med sterilt vand. Frøene blev plantet på overflad- I

en af et R5-medium, som består af MS major og minor I

salte (Physiol. Plant. l_5:473-497, 1962) med 30 g/1 I

saccharose, 100 mg/1 myo-inositol (Sigma), 2,5 mg/1 I

30 thiamin-HCl (Eli Lilly and Company), 2,5 mg/1 nikotinsyre I

20 DK 175506 B1 (Matheson Coleman Bell), 1,25 mg/1 py'ridoxin-HCl (Lilly) og 1,25 mg/1 Ca-pantothenat (Sigma),. pH 6, størknet med 9 g/1 Difco Bacto agar. De spirende frø blev anbragt på det samme R5-medium, og planterne blev opretholdt 5 ved at foretage vegetative beskæringer ca. hver anden måned, idet stiklingerne blev anbragt i Magenta GA7 kasser. De blev dyrket i en belyst inkubator med en daglængde på 16 timer, en lysintensitet på omkring 150 lux og en temperatur på 26 °C.

10 Med henblik på podning Agrobacterium blev de sterile planter afskåret og befriet for blade med en steril skalpel, hvilket efterlod et stort sår nær toppen og de forlængede afskårne bladstilke. I løbet af nogle få minutter blev en kultur af Agrobacteria tumefaciens 15 LBA 4013/pCEL44 påført de afskårne overflader, indtil en fløde far vet/brun lig akkumulering var synlig med det blotte oje. De podede, sårede planter blev mærket, indelukket i kasser og på ny anbragt i den belyste inkubator.

Man sørgede for at sikre sig, at omgivelsestemperaturen 20 ikke oversteg 30 °C under galle-induktionen.

Femten dage efter podningen var der vokset synlig galle ud af de fleste podede sår på de sterile Wisconsin 38 planter. Disse galle-forekomster blev afskåret individuelt, nummereret og anbragt på R5-medium, som var suppleret 25 med 200^ug/ml af hver af forbindelserne carbenicillin (Sigma) og vancomycin (Vancocin-HCl, Lilly). Denne behandling, som havde til hensigt at dræbe de tumor-fremkaldende bakterier og derved give aseptiske kulturer, involverede en dyrkning af krongalle i mørke ved 25 - 27 °C i 3 30 uger på de ovennævnte antibiotika efterfulgt af yderligere 3 uger i nærvær af disse antibiotika.

Med henblik på at teste responsen af disse krongalle-callus-

I DK 175506 B1 I

I 21 I

I vævskulturer overfor hygromycin blev callus-prøver på I

I 100 mg anbragt på Falcon 1007 petri-skåle, som var fyldt I

I med omkring 15 ml callus-vækstmedium indeholdende MS-salte, I

I 30 g/1 saccharose, 1 mg/1 thiamin-HCl, 100 mg/1 myo-inosi- I

I 5 tol, 9 g/1 Difco Bacto-agar, 1 mg/1 IAA (indol-3-eddikesyre, I

I Sigma), 0,1 mg/1 kinetin (6-furfurylaminopurin, Sigma), I

pH 6. Da disse prøver var blevet steriliseret, tilsattes I

I de ovennævnte koncentrationer af vancomycin og carbenicillin I

I samt 50^,ug/ml hygromycin B (Lilly). Denne test blev I

10 aflæst efter 3 ugers inkubation i mørke ved 27 °C, og I

der opnåedes positive vækst-phenotyper. I

I Eksempel 7 I

I Tilstedeværelse af aphIV-sekvenser i hyqromycin-resistent I

I qallevæv I

I 15 A. ’’Southern Blot" af plante-DNA I

I Nukleart DNA fremstilledes ud fra ca. 10 g gallevæv I

I ved metoden af Rivin et al. beskrevet i "Maize for Biologi- I

I cal Research", side 161-164 (redigeret af Sheridan, I

I publ. Plant Mdlecular Biology Assn; Charlottesville, I

I 20 Virginia, 1982). I 1

I De digerede DNA-fragmenter blev fraktioneret ved konventionel I

Ti yug af hvert DNA blev digereret med 100 enheder af I

hvert af restriktionsenzymerne BamHl og BamHI plus Hindlll I

I i 200^uliter af en reaktionsblanding sammensat som an- I

I befalet af enzym-leverandøren. Efter 4 timers inkubation I

I 25 ved 37 °C blev det digererede DNA udfældet med 400yuliter I

I ethanol, der indeholdt ammoniumacetat, i 30 minutter I

I ved -70 °C. DNA'et fik lov at gå i opløsning natten I

I over ved 4 “C i 25yuliter TE-puffer. I

22 DK 175506 B1 agarose'-gelelektroforese og overført til "GeneScreen'1, en hybridiserings-transfer-membran (New England Nuclear, Boston, Massachusetts), idet man anvendte fabrikantens foreskrifter.

5 b ., Prøvning af 1,3 kb fragmentet af plasmid ρ0ίΙ20

En hybridiseringsprøve fremstilles ud fra fragmentet af plasmid p0W20, renset som i eksempel 3B. Fragmentet translateres i udsnit ved konventionelle procedurer (se Maniatis et al., 1982 Molecular Cloning, Cold Spring 10 Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) ved brug af DNase I og DNA-polymerase, således at prøven indeholder ca. 20^uCi [32-P]dCTP pr. 0,2yug DNA.

C. Hybridiserinq til påvisning af aphIV sekvens-homoloqi

GeneScreen indeholdende plante-DNA-fragmenter blev præhy-15 bridiseret natten over ved 42 °C i en opløsning indeholden de 0,75 M NaCl, 75 mM natriumcitrat, 25 mM natriumphosphat, pH 6,?, 2 g/1 Ficoll 400, 2 g/1 polyvinyIpyrrolidon 360, 2 g/1 okseserumalbumin, 1¾ natriumdodecylsulfat, 10¾ dextransulfat, 50¾ formamid og 250 mg/1 denatureret, 20 sonisk behandlet kalvethymus-DNA.

Hybridiseringen foregik i en frisk opløsning med samme sammensætning, men suppleret med varmedenatureret prøve-DNA (0,2^ug pr. 25 ml opløsning). Efter inkubation natten over ved 42 °C blev GeneScreeen memebranen vasket to 25 gange med GS-puffer (0,3 M NaCl, 60 mM Tris-HCl, 2 mM

EDTA, pH 8). Hver udvaskning gennemførtes i løbet af en time ved stuetemperatur. Derefter blev membranen vasket omhyggeligt med 0,1 x GS-puffer suppleret med IS SDS i en time ved 70 °C. Dette trin blev gentaget, 30 hvorefter membranen blev vasket yderligere to gange

I DK 175506 B1 I

I 23 I

I ved stuetemperatur roed 0,1 x GS-puffer. Efter torring I

I af membranen blev denne udsat for røntgenfilm med for- I

I stærkningsskærm natten over ved -70 °C. I

I Eksempel 8 I

I 5 Regenerering af planter I

I A. Regenerering ud fra ikke-klonet qallevav I

I Ikke-klonet gallevæv, som havde udvist kraftig vækst I

I i nærværelse af et restriktivt niveau af hygromycin I

B, blev udsat for en behandling, der havde til formål I

I 10 at inducere en regenerering af planten under selektivt I

I tryk. Denne behandling bestod i, at man anbragte stykker I

I af callus-væv på MS-medium med 0,3 mg/1 IAA og 10 mg/1 I

I 2-ip (6-gamma, gamma-diméthylallylaminopurin, Gibco*), I

I 100 mg/1 royo-inositol, 1 mg/1 thiaroin-HCl, pH 6, 30 I

15 g/1 saccharose, størknet med 0,9¾ Difco Bacto-agar plus I

I 50yug/ml hygromycin. Disse præparater blev anbragt i I

I en belyst inkubator i en måned, hvorefter mørkegrønne I

I og spirende områder af vsv blev udvalgt og overført I

I til det samme medium, som havde et højt indhold af cyto- I

I 20 kinin, og som var suppleret med hygromycin, med henblik I

på endnu en måneds inkubation i lyset. Efter disse to I

I I

I passager på regenerer ingsmediiim og antibiotikum blev I

I alle grønne, spirende klumper af kimplanter afskåret I

med henblik på udskæring af enkeltplanter, som yderligere I

25 blev dyrket på fast R5-medium til opnåelse af steril I

plantevækst i lyset. Da der var opnået veludviklede I

planter ud fra tre forskellige vævslinier, blev udtrykkel- I

sen af hygromycin-resistens-genet i disse planter testet I

som følger: bladstykker med en størrelse på omkring I

30 1 cm2 blev udskåret og anbragt på callus-vækstmedium I

roed eller uden hygromycin. Kontrolvævet var bladstykker I

DK 175506 B1

2U

fra de aseptiske Wisconsin 38 planter, somvar udgangsmateriale for disse krongalle-induktionsforsøg. Disse præparater blev inkuberet i mørke ved 27 °C. Efter tre ugers forløb udviste Wisconsin 38 og de regenererede 5 gallevæv-planter begge en forstørrelse af bladcellerne og en callus-vækst langs kanterne af de explanterede bladstykker i.antibiotikum-frit medium. I mediet, der indeholdt antibiotikum, var det som kontrol anvendte Wisconsin 38-bladmateriale imidlertid ude af stand til 10 at påbegynde celledelingen, og materialet var brunt og døende, mens bladene fra planter, der var regenereret under selektivt tryk ud fra hygromycin-resistente galle-kulturer, udviste celledeling, vækst og callus-produktion, der lod sig sammenligne med prøverne uden hygromycin.

13 Disse resultater viser, at de regenererede planter inde holder (og kan udtrykke) hygromycin-resistens-gensek-vensen fra pCEL44.

*

Plantemedier og supplerende bestanddele kan fås fra Gibco, Grand Island, New York.

2Q B. Enkeltcelle-afledte kloner fra hyqromycin-resistent galle

Hygromycin-resistente krongallelinier blev holdt i mørke ved 27 °C uden antibiotika, men med månedlige subkulturer på medium 1/0,1 (MS-salte med 1 mg/1 IAA og 0,1 rog/1 25 kinetin, 0,9 g/1 Difco Bacto agar, 100 mg/1 myo-inositol, 1 mg/1 thiamin-HCl og 30 g/1 saccharosepH 6, autoklaveret til sterilisation og dispenseret 50 ml/skål i Falcon 1005 petri-skåle). Prøver Fra disse dyrkningslinier blev dispergeret i det samme medium, som var fremstillet 30 uden agar og dispenseret (50 ml/kolbe) i 125 ml erlenmeyer-kolber, som blev lukket med skumstandsende propper. Suspensionskulturer, som blev opstartet på denne måde,

I DK 175506 B1 I

I 25 I

I blev omrystet med 135 omdr. pr. min. i et roterende I

I rysteapparat i mørke ved 27 °C. Efter en uge blev de I

I hårde klumper af callus fjernet, og suspensionskulturerne I

af krongalleceller blev hver uge delt 1:1 i friskt flydende I

I 5 medium. Oisse korttidssuspensioner kan også dyrkes i I

en måned, inden de omdannes til ca 1 lus-klumper i ryste-. I

I kulturerne. I

I Hed henblik på at frembringe enkeltcelle-afledte kloner I

I fremstilledes protoplaster ud fra disse kulturer, hvorefter I

I 10 protoplasterne blev dyrket ved en.ekstremt lav popula- I

tionsdensitet som følger: korttidskulturerne i suspension I

I blev centrifugeret let for at koncentrere cellerne. I

I Derefter blev vakstmediet i supernatanten fjernet, og I

I 5 ml sammenpressede celler blev blandet med 25 ml af . I

I 15 en filtersteriliseret enzymblanding bestående af 6¾ I

I w/v cellulysin (Onozuka R10, Kinki Yakult Mfg., Japan), I

I 1¾ m/v macerase (Sigma) og mM MES (2-(N-morpholion)-ethan- I

sulfonsyre, Sigma), pH 5,8. Blandingen af celler og I

I enzymer blev anbragt i en Falcon 1005 petri-skål.og I

I 20 inkuberet i 4,5 timer ved stuetemperatur under langsom I

I rotationsomrystning (50 omdr. pr. min.). Da en mikrosko- I

I pisk observation viste en frigivelse af protoplaster, I

I blev præparatet filtreret igennem sigter med maskevidder I

I på 259 og 231yum (W.S. Tyler, Inc. Mentor, Ohio) og I

I 25 blandet i forholdet 1:1 med et dyrkningsmedium for proto- I

I plaster, som var.op til 25¾ (w/v) med hensyn til 25¾ I

I w/v Ficoll DL (Sigma), der er en syntetisk vandopløselig I

I copolymer af saccharose og epichlorhydrin med en vægtba- I

I seret gennemsnitlig molekylvægt på omkring 400.000. I

I 30 Denne blanding blev anbragt i bunden af et rundbundet I

I centrifugeglas og overlagt med nogle få milliliter af I

I det samme protoplast-dyrkningsmedium, som var indstillet I

I til 8¾ (w/v) Ficoll, og sluttelig med et tyndt 1-2 I

I ml lag af protoplast-dyrkningsmediet, som var indstillet I

26 DK 175506 B1 til 2% (w/v) Ficoll. Alle Ficol1-holdige opløsninger var på forhånd blevet filtersteriliseret. Disse diskontinuerte densitetsgradient-præparater blev tillukket og centrifugeret i en centrifuge med svingende kurv 5 ved omgivelsestemperatur og ved 50 x G i 30 minutter.

Protoplasterne blev aflejret ved toppen og opsamlet med en pasteur-pipette med stor indre diameter i en høj populationsdensitet, nærmere bestemt 2 x 10^ levedygtige celler pr. ml i dette eksperiment. Det anvendte 10 protoplast-dyrkningsmedium var KP (medium K3 fra Kao 4 Michayluk, Planta 120:215-227, 1976, som modificeret Caboche i Muller et al., Physiol. Plant. ^7:35-61, 1983), indstillet til en osmotisk styrke på 0,5 M med mannitol.

De således opsamlede protoplaster blev dyrket ved den 15 høje populationsdensitet (som indsamlet) i portioner på 1 ml i Falcon 3001 skåle i mørke ved 26 °C. Efter 6 dage blev de undersøgt for vækst, celle-levedygtighed, som bestemt ved udelukkelse af den vitale farve Evans blue (Sigma), samt vægdannelse og celledeling. Proto-20 plasternes diameter blev målt under mikroskop. Præparatet blev filtreret igennem et trådfilter med en maskevidde på lOT^um. Derefter blev præparatet undersøgt for fravær af celleaggregater. Cellerne blev derefter underkastet en serievis fortynding, samtidigt med at populationsden-25 siteten blev optalt, indtil en endelig populationsdensi tet på omkring 100 levedygtige celler pr. ml i medium C fra Caboche, supra, som var blevet indstillet til den samme osmotiske styrke som dyrkningsmediet ved hjælp af mannitiol. Omkring 15 ml pr. skål blev udsået og 30 anbragt i den belyste inkubator. Der opnåedes enkeltcelle afledte kolonier i løbet af en måned med nogle kulturer og i løbet af 2 måneder med andre kulturer. Disse kolonier blev opsamlet fra det flydende medium ved hjælp af en pasteur-pipette med stor udboring og anbragt på et Whatman

I DK 175506 Β1 I

Η

I 27 I

I #3 filterpapir gennemblødt med det flydende medium 1/0,1. I

I Disse papir-understøttede kulturer blev fortsat i lyset I

I i endnu en måned under tilsætning af det flydende medium I

I til papiret efter behov. Derefter blev kulturerne anbragt I

I 5 på et fast medium 1/0,1 og dyrket i mørke ved 27 °C. I

I I en test for udtrykkelse af hygromycin-resistent i I

I enkeltcelle-afledte ca1lus-kul turer blev parrede prøver I

I af klonede linier af callus-usv udspredt på et fast I

I medium 1/0,1 med SO^ug/ml hygromycin B og på det samme I

I 10 medium uden tilstedeværende antibiotikum. Efter 3 dages I

I dyrkning ved 27 °C blev de to skåle sammenlignet. I I

I 52 ud af 56 tilfælde udviste callihygromycin-resistens I

I ved dyrkning, både med og uden 50yug/ml hygromycin B. I

I C. Regenerering fra klonet væv I

I 15 De hygromycin-res istente callus-vævskul turer opnået I

I ved proioplast-metoden til enkeltcellekloning i afsnit I

I 8B kan underkastes et regenereringsprogram. Callus-stykker- I

I ne anbringes på et fast medium indeholdende HS-salte,

I 100 mg/1 myo-inositol, 1 mg/1 thiamin-HCl, 0,3 mg/1 I

I 20 IAA, 10 mg/1 2-ip, 0,9 g/1 Difco Bacto-agar og 30 g/1 I

I saccharose, pH 6, og dyrkes i lys i en måned. Grønne I

I og spirende vævsstykker dyrkes på ny på det samme medium.

I De kimplanter, der herved dannes, overføres til. R5-medium, I

I beskrevet i afsnit 6 ovenfor, således at de kan udvikle H

I 25 sig til velformede planter i lyset. De opnåede planter H

I afprøves for udtrykkelse af gensekvensen for hygromycin-reistens

I fra plasmid pCEL44 ved at inkubere udplantede bladstykker I

I i mørke på callus-vækstmedium indeholdende hygromycin H

I som beskrevet i afsnit 8A ovenfor. Planterne viser udtryk-

I 30 kelse af gensekvensen for hygromycin-resistens ved at fremvise I

I bladcelleekspansion og callus-dannelse på de skarne I

I kanter af de udplantede bladstykker (som i afsnit 8A). I

28 DK 175506 B1

Disse planter udplantes i jord og gøres formeringsmodne i drivhus, således at der kan eftervises en Mendelsk arvelighed af gensekvensen for hygromycin-resistens. Dette beviser, at den binære vektor, der indeholder pCEL44, 5 kun kan overfore genet for hygromycin-resistens uden de tumor-inducerende oncogener, hvilket indebærer en ny og nyttig metode til at inkorporere ønskede karaktertræk i planteceller, der derefter kan regenereres til formeringskompetente planter.

10 Eksempel 9

Konjugation af pCEt44 til Aqrobacterium tumefaciens LBA4404

En triparental krydsning imellem E. coli K12 RR1AH15, E. coli p R K 2 013 og A. tumefaciens LBA4404 (NRRL 8-15920) 15 blev foretaget som beskrevet i eksempel 5. Transkonjugant- erne blev udvalgt på størknet TY-medium indeholdende 20 mg/1 rifampicin og 2 mg/1 chloramphenicol.

Eksempel 10

Indføreinq og udtrykkelse af hygromycin-resistens i 20 callus A. Nicotiana plumbaqinifolia

Frø af N. plumbaginifolia blev steriliseret ved en kortvarig udsættelse for ethanol efterfulgt af en 3 minutter lang behandling med 0,5¾ Chlorox blegemiddel. Efter 25 rensning med sterilt vand blev frøene inkuberet i en time i en opløsning indeholdende 0,5 mg/ml gibberillinsyre. Derefter blev frøene udplantet på M5-medium, som var bragt til størkning med 0,6% Phytagar. Planterne blev

I DK 175506 B1 I

I 29 I

I dyrket ved 27 °C med en daglængde på 16 timer og ved I

I en lysintensitet på omkring 700 lux. I

I Bladstykker på omkring 1 cm* blev udskåret af 3 måneder I

I gamle planter, og de skårne kanter blev smurt med en I

I 5 kultur af Agrobacterium tumefaciens LBA44G4/pCEL44. I

I De inficerede sektioner blev inkuberet på størknet MS- I

I medium indeholdende 1 mg/liter napthaleneddikesyre (NAA) I

I og 0,1 mg/liter benzyladenin (BA) i 3 dage i mørke ved I

I 27 °C. Bladstykkerne blev derefter overført til det I

I 10 samme medium suppleret med 200 mg/liter vancomycin og I

I 200 mg/liter carbenicillin. Efter vækst i en måned blev I

I ca1 lus-stykker overført til MS-medium med 1 mg/ml NAA, I

I 0,1 mg/ml BA og 50 mg/liter hygromycin B, hvorefter I

I inkubationen blev fortsat. I

I 15 Efter 3 ugers forløb blev små stykker callus podet I

I på størknet MS-medium suppleret med 0,1 mg/liter NAA I

I og 1 mg/liter BA, og der inkuberedes ved 27 °C i lyset I

I med en daglængde på 16 timer med henblik på regenerering I

I af planteskud. Skuddene overførtes til størknet MS-medium I

I 20 uden supplerende tilsætninger til fremskyndelse af rod- I

I væksten.

I B. Nicotiana tabacum I

En del af en callus-suspensionskultur fra tobak, NT575,

blev udhældt over faste medier (beskrevet i eksempel I

.’.25 8C). Efter fjernelse af overskydende vand konstrueredes

et lavdelt fødesystem, hvori to lag steriliseret Whatman I

(ti filterpapir blev anbragt over cellerne. Derefter

blev cellerne inkuberet i mørke natten over ved 26 °C. I

En kultur af Agrobacterium tumefaciens LBA-4404/pCEL44 I

30 blev dyrket på TY-medier med 2 mg/liter chloramphenicol. I

30 DK 175506 B1

Isolaterne blev overført til et flydende medium, der indeholdt 5 mg/liter casein-hydrolysat og 3 g/liter gærekstrakt, og rystet natten over i et roterende ryste-apparat ved 26 °C. Bladudsnit på omkring 1 cm* blev 5 udskåret fra 3'måneder gamle planter og neddykket i den Flydende bakteriekultur i 6 - 8 minutter. Efter tørring blev bladstykkerne anbragt på det overlagte filterpapir i det ovenfor fremstillede laA/delte føde-system.

10 Bladstykkerne blev inkuberet i lys i 26 °C i 2 dage, hvorefter de blev fjernet og anbragt på et regenererings-medium indeholdende 200yum/ml af hver af forbindelserne carbenicillin og vancomycin. Efter yderligere 12 dage i lys på dette medium blev bladstykkerne overført til 15 det samme medium indeholdende 50yug/ml hygromycin. Disse plader blev dyrket i lys ved 26 °C i yderligere 3 måneder. .

Kimplanterne blev regenereret og voksede ud på det hygromy-cin-holdige medium fra de behandlede bladstykker. De stykker, som var blevet behandlet på samme måde, men 20 med en Agrobacterium-stamme indeholdende genet for hygro- mycin-resistens med omvendt orientering, gav ikke nogen kimplanter.

Planterne blev opsamlet fra disse bladstykker, dyrket i hormon-frit R5-medium og testet for hygromycin-resistens 25 ved udplantning af bladstykker på callus-vækstmedium indeholdende 50yug/ml hygromycin 8, i det væsentlige som beskrevet i eksempel 8A.

Tilsvarende bladstykker behandles på samme måde som beskrevet ovenfor, idet der dog anvendes et callus-vækstme-30 dium (eksempel 10A) i stedet for regenereringsmediet.

Disse bladstykker dyrket i callus-vækstmedium suppleret

I DK 175506 B1 I

I I

I me^ 200^ug/ml af hver af forbindelserne vancomycin og I

I carbenicillin. Oisse præparater dyrkes i mørke ved 26 I

I °C i 2 uger, hvorefter .de flyttes til det supplerende I

medium, der indeholder 5Ci^ug/ml hygromyc.in B. Hygromycin- I

I 5 resistensen eftervises ved at dyrke callus på medier, I

I der indeholder antibiotika, og ved at underkaste plante- I

DNA'et "Southern blot" roed aphlV-sekvensen som beskrevet I

I i eksempel 7.’ I

Claims (21)

1. Chimer gensekvens, som er funktionel i en plantecelle kendetegnet ved, at det omfatter en koden-5 de region, som bibringer cellen hygromycin-resistens, hwilken hygromycin-resistens er i stand til at denne basis for udvælgelse af cellen.

2. Gensekvens ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det står i forbindelse med (a) en promotor-sekvens og (b) en terminator-signalsekvens med den begrænsning, at sekvenserne (a) og (b) er lokaliseret på en sådan ^ måde, at de kan udtrykke den kodende region, som tilvejebringer hygromycin-resistens.

3. Gensekvens ifølge krav 2, kendetegnet ved, at der til promotoren er knyttet en sekvens, der koder 20 for den amino-terminale region, og som er knyttet til promotoren, når denne er naturligt forekommende.

4. Gensekvens ifølge krav 2 eller 3, kendetegnet ved, at den tilknyttede promotor hidrører fra et octo-25 pi n-syntase-gen.

5. Gensekvens ifølge ethvert af kravene 2-4, kendetegnet ved, at sekvensen som koder for den amino-ter- 30 minale region, og som er knyttet til promotoren, hidrører fra et octopin-syntase-gen.

6. Gensekvens ifølge ethvert af kravene 2-4, kendete g-2g net ved, at den tilknyttede terminator-signalsekvens er en nopalin-syntetase-terminator. I DK 175506 B1 I I .33 I

7. Gensekvens ifølge krav 6, kendetegnet ved, at I I den tilknyttede promotor hidrører fra et octopin-syn- I I tetase-gen, og at den tilknyttede terminator-signalse- I I kvens er en nopalin-syntetase-terminator . I I I

8. Gensekvens ifølge ethvert af kravene 3-7, kendete g- I net ved, at den · tilknyttede sekvens, som koder for I I den amino-terminale region, også koder for et messenger- I RNA, der udgør et start-codon. I I 10 I

9. Gensekvens ifølge ethvert af kravene 3-8, kendete g- I net ved, at sekvensen, der koder for den amino-ter- I minale region, også koder for de første 11 aminosyrer I I 15 i octopin-syntetase-genet. I H 10, Gensekvens ifølge ethvert af kravene 1-9, kendete g- I I net ved, at den kodende region, som fremkalder hy- I I gromycin-resistens, hidrører fra;det ca. 1,3 kb lange I I BamHI-BglII-restriktions fragment af plasmid p0U20. I

11. Rekombinant Gen-planteudtrykkelsesvektor, k e η - I I detegnet ved, at den om fatter den chimere gensekvens I I 25 ethvert af kravene 1 til 10 og et DNA-fragment, I I der indeholder et replicon. I

12. Vektor ifølge krav 11, kendetegne t ved, I I at DNA-fragmentet indeholder, et replicon, der er funk- I I 30 tionelt i Agrobacterium. I

13. Vektor ifølge krav 12, kendetegne t ved, I I at replicon’et hidrører fra det ca. 11,8 kb lange EcoRI- I I fragment af plasmid pKT210. I

14. Vektor ifølge ethvert af kravene 11-13, kende- I I tegnet ved, at den er et plasmid. I DK 175506 B1

15. Vektor ifølge krav 14, kendetegnet ved, at den er et mikro-Ti-plasmid.

16. Vektor ifølge krav 13, kendetegnet vedi 5 at den er plasmid pCEL44 opbygget som vist på fig. >.

17. Fremgangsmåde til udvælgelse af en hygromycin-resi-steht rekombinant DNA-holdig plantecelle, kende- JO tegnet ved, at man (a) transformerer udtrykkelsesvektoren ifølge krav 12 i en Agrobacterium tumefaciens-stamme, 15 (b) indfører den chimere gensekvens af udtrykkelsesvektoren i en hygromycin-sensitiv plantecelle og (c) udvælger en celle, som udtrykker hygromycin-resi-20 stens, ved at dyrke.„cellen i nærværelse af en tilstrækkelig mængde hygromycin til at forhindre vækst i tilfælde af, at hygromycin-resistens-genet ikke er til stede. 25

18. Fremgangsmåde til regenerering af modne planter ud fra udvalgte celler, kende tegnet ved, at man udvælger en hygromycin-res i s tent plante, som indeholder rekombinant DNA, ved fremgangsmåden ifølge 3Q krav 17, hvorefter man dyrker den udvalgte celle under egnede betingelser og regenererer den modne plante. 1 Fremgangsmåde til frembringelse af hygromycin-re- sistens hos en plantecelle, kendetegnet ved, 35 at man integrerer den chimere gensekvens ifølge ethvert af kravene 1 til 10 i genomet af en hydromycin-sensitiv plantecelle som et funktionelt element af et chromosom eller et plasmid. I DK 175506 B1 I I 35 I

20. Fremgangsmåde til udvælgelse af transformerede plan- I I teceller fra planteceller, som ikke er blevet transfor- I meret, kendetegne t ved, at man frembrin-ger I B hygromycin-resistens hos plantecellerne ved fremgangs- I I 5 I måden ifølge krav 19, hvorefter man inkuberer cellerne I i et medium, der indeholder en mængde hygromycin, som I B er tilstrækkelig til at forsinke væksten af de plante- I fl celler, som ikke er blevet transformeret. I

10 I

21. Plasmid pCEL30 (NRRL B-15915) opbygget som vist I B på fig. 1. I

22. Plasmid pCELAO, opbygget som vist på fig. 2, k e η- I B ^ detegnet ved, at det er fremstillet ved lige- I B ring af BglII-digestionsproduktet af plasmid pCEL30 I B og det ca. 1,3 kb lange BamHI-BglII-fragment af plas- I I mad p0W20 (NRRL 6-15838). I B 20 I B 25 I I 30