CN117230066A - 大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体提供大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子及其应用。本发明所提供的启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，命名为GmGRF5‑1pro。本发明通过根癌农杆菌遗传转化系统，用GmGRF5‑1pro表达gGmGRF5‑1:GUS基因，结果表明GmGRF5‑1pro可明显促进大豆的种子、根尖及根瘤中GUS基因的表达量，因而GmGRF5‑1pro在植物的种子、根尖和根瘤中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的种子、根尖和根瘤中特异表达目标基因并提高目的基因的表达量。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体提供大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子及其应用。
背景技术
在组织或器官特异性启动子的驱动下，基因的表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以避免目标基因在其他组织器官中表达所造成的不利影响。
根是植物体吸收水分和营养物质的重要器官，根特异表达系统可用于研究植物的高渗胁迫耐受、植物修复和根际分泌等。Borisjuk等用根特异启动子mas2、GFP和烟草钙网蛋白(calreticulin)基因构建融合表达载体。转基因烟草水培研究结果表明：根细胞不仅能够高效产生GFP，而且可将目的蛋白质分泌到液体培养基中(Borisjuk et al.,1999)。此外，应奇才等运用松树根特异性启动子PmPgRP10驱动CMO/BADH双价基因并转入水稻。对转基因植株根和叶的CMO酶、BADH酶活性及其它生理生化指标进行了测定，结果表明：CMO/BADH双价基因可在根部特异性表达(应奇才，2006)。
GRF是与发育有关的一类转录因子，它通过调节细胞增殖来调节叶片的大小和形状。另外，GRF基因家族可以调节植物根的伸长、种子的大小以及花的发育(Horiguchi etal.,2005)。大豆中也含有生长调节因子(GRFs)家族因子，已经被挖掘到的生长调节因子(GRFs)有26个(Hoe and Hirokazu,2015)，其中有24个GRF带有WRC和QLQ结构域(Omidbakhshfard et al.,2015)。GmGRFs在生长组织中有强烈的表达，根、茎、叶、花、豆荚、芽顶端分生体和发育中的种子均有表达，与大麦中的生长调节因子(GRFs)一样，不同的生长调节因子(GRFs)表达模式及水平有所不同，暗示着这些GRF基因可能存在不同的功能分化。
发明内容
本发明通过对GmGRF5-1启动子的表达模式进行分析，从而为深入研究其功能和应用提供有效手段和途径。具体地，本发明提供大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子及其应用，从而为在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的种子、根尖和根瘤中特异表达目标基因提供有效途径。
为达到以上目的，第一方面，本发明提供了大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子GmGRF5-1pro，其具有：
1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
2)SEQ ID NO.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。
应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的大豆GmGRF5-1基因的启动子(SEQID NO.1)，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸，得到所述启动子的突变序列。
例如在非活性区段，在不改变启动子功能的情况下，进行以下取代方式中的至少一种所获得的核苷酸序列：将第2463位的G取代为A，将第3033位的T取代为A，将第3143位的C取代为A。
第二方面，本发明还提供了含有启动子GmGRF5-1pro的载体、宿主细胞、转化植物细胞或表达盒的生物材料。所述生物材料为植物细胞时，不能单独发展为植株。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，只要适合GmGRF5-1pro的表达即可，例如可以为市售的载体及质粒。
第三方面，本发明还提供了：
启动子GmGRF5-1pro或含有其的上述生物材料在调控下游基因在植物种子、根尖或根瘤特异表达中的应用。
本发明还提供了启动子GmGRF5-1pro或含有其的上述生物材料在提高下游基因在植物种子、根尖或根瘤表达量中的应用。
本发明还提供了启动子GmGRF5-1pro或含有其的上述生物材料在制备转基因植物中的应用。
本发明还提供了启动子GmGRF5-1pro或含有其的上述生物材料在植物种子、根尖和根瘤发育调节中的应用。
本发明还提供了启动子GmGRF5-1pro或含有其的上述生物材料在植物种质资源改良中的应用。
本发明还提供了启动子GmGRF5-1pro或含有其的上述生物材料在植物育种中的应用。
优选地，上述植物为作物、林木、蔬菜、花卉或牧草。
更优选地，上述植物为作物。最优选为大豆。
第四方面，本发明提供了启动子GmGRF5-1pro序列所用的特异性引物。其包括正向引物：5’-GAATCAGTAGCACCCGTACGTATG-3’(SEQ ID NO.2)；反向引物：5’-TTTGAGACAACAAAAGGAAG GAAG-3’(SEQ ID NO.3)。
第五方面，本发明还提供了，含有上述特异性引物的试剂盒。
可以采用上述特异性引物或试剂盒检测本发明所述的大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子GmGRF5-1pro。
本发明的有益效果在于：
本发明首次分离了大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子GmGRF5-1pro，利用启动子GmGRF5-1pro表达GUS基因，结果表明GmGRF5-1pro可明显促进植物种子、根尖和根瘤中GUS基因的表达量，因而，GmGRF5-1pro在植物的种子、根尖和根瘤具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的种子、根尖和根瘤中特异表达目标基因并能够提高目标基因的表达量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2的克隆中间载体FU76的结构示意图。
图2为本发明实施例2的克隆中间载体FU79-GUS的结构示意图。
图3为本发明实施例2的表达载体pSOY2的结构示意图。
图4为GmGRF5-1pro:gGmGRF5-1:GUS在大豆根尖中的表达结果，图中为转基因大豆根的GUS染色。
图5为GmGRF5-1pro:gGmGRF5-1:GUS在大豆根瘤中的表达结果，图中为转基因大豆根瘤的GUS染色。
图6为GmGRF5-1pro:gGmGRF5-1:GUS在大豆种子中的表达结果，图中为转基因大豆种子不同发育时期的GUS染色。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1大豆GmGRF5-1pro的克隆
本实施例提供大豆GmGRF5-1pro的克隆过程，利用正向引物5’-GAATCAGTAGCACCCGTACGTATG-3’(SEQ ID NO.2)和反向引物5’-TTTGAGACAACAAAAGGAAGGAAG-3’(SEQ ID NO.3)从大豆基因组中PCR扩增并测序获得长度为3195bp的GmGRF5-1pro，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本实施所用PCR扩增体系为：(20μL体系)
0.2μL Primer star Taq酶，10μL 2×缓冲液，1μL dNTP(各2.5mM)，1μL上游引物(10mM)，1μL下游引物(10mM)，1μL DNA模板，5.81μL ddH2O。
本实施例所用PCR程序：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃3min共25个循环；72℃10min。
实施例2大豆GmGRF5-1pro调控下游基因GUS的表达情况
本实施例提供大豆GmGRF5-1pro调控下游基因GUS的表达情况，步骤如下：
使用ABclonal Multif Seamless Assembly Mix(ABclonal，RM20523)将实施例1中PCR扩增得到的3195bp的GmGRF5-1pro(SEQID NO.1)连接至已酶切好的载体FU76上(图1)，获得启动子的入门克隆载体FU76-GmGRF5-1pro。利用引物5'-ATGATGAGTGCAA GTGCAAGAA-3'(SEQ ID NO.4)和5'-TTCATCTGCCAAGGATA AAGGAGA-3'(SEQ ID NO.5)PCR扩增得到GmGRF5-1的基因组序列(gGmGRF5-1)1516bp连接至FU79-GUS(图2)获得gGmG RF5-1:GUS的入门克隆载体FU79-gGmGRF5-1:GUS。
将构建好的FU76-GmGRF5-1pro、Fu79-gGmGRF5-1:GUS与如图3所示的植物表达载体pSoy2等比例混合后通过LR反应(质粒各50ng，LR酶1μl，补H2O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmGRF5-1pro和gGmGRF5-1:GUS构建在pSoy2上，获得双元表达载体pSoy2-GmGRF5-1pro:gGmGRF5-1:GUS，随后将双元表达载体转化至大肠杆菌DH5α中扩繁。
大肠杆菌感受态细胞的转化，包括：
(1)制备含卡那霉素的LB固体培养基；
(2)取出贮存于-80℃的大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴中融化后，加入5μl连接产物(上述构建完成的双元表达载体)轻轻混匀，冰浴中放置30分钟；
(3)将步骤(2)中含有连接产物和感受态细胞的体系在42℃热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300μl不含抗生素的LB液体培养基，37℃摇床振荡培养1小时(160rpm)，获得混合培养液；
(4)取适量混合培养液均匀涂于选择性培养基上，37℃倒置培养16小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μl选择性液体LB培养基中摇菌培养；
(5)PCR检测筛选到的阳性克隆扩繁提质粒pGmGRF5-1pro:gGmGRF5-1:GUS后转化农杆菌EHA105。
本实施例参照王侃等人(Paz,M.,Wang,K.Soybean transformation andregeneration using half-seed explants.US Patent#7,473,822(Issued January 6,2009))的大豆转化方法将pGmGRF5-1pro:gGmGRF5-1:GUS转入大豆Williams 82品种中，获得遗传转化材料7株。
本实施例中，遗传转化材料即大豆转化株的GUS染色方法为：
(1)将组织样品加入90％丙酮中，置于冰上20-30分钟；
(2)经丙酮处理后，用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)、2mM K4Fe[CN]6及2mM K3Fe[CN]6溶液润洗组织；
(3)将样品放在X－Gluc染色液中(50mM磷酸缓冲液，pH7.2)，1mM X-gluc,2mMK4Fe[CN]6,2mM K3Fe[CN]6)，抽气10分钟，然后37℃染色过夜；
(4)第二天用70％乙醇脱色；
(5)在载玻片上加几滴HCG溶液，将脱色后的样品置于其中；
(6)压片，透明15分钟或者过夜透明(根据组织的发育时期而定)。
本实施例所用的GUS染色液配方为：
20mM X-gluc(MW＝521.8)；
用DMSO或N,N-二甲基甲酰胺溶解，100mg X-gluc需用9.58ml DMSO溶解，终浓度为20mM。
50mM磷酸缓冲液(pH7.0)：
A液：NaH2PO4·2H2O 3.12g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；
B液：Na2HPO4·12H2O 7.17g溶于无菌蒸馏水，定容至100ml；
取39mlA液与61mlB液混合。
染色液配制：5mM铁氰化钾；5mM亚铁氰化钾；10mM EDTA；50mM磷酸缓冲液；1mM X-gluc。
GUS活性分析表明，GmGRF5-1pro在植物的根尖(图4)和根瘤(图5)中特异表达；此外，伴随着种子的发育进程，在种子中的表达逐渐增强(图6)。
本发明实施例的实验数据证实了，本发明提供的组织特异性启动子GmGRF5-1pro可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的种子、根尖和根瘤中特异表达目标基因。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.大豆种子、根尖和根瘤特异表达的启动子GmGRF5-1pro，其特征在于，其具有：
1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或
2)SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子是进行以下取代方式中的至少一种所获得的核苷酸序列：将第2463位的G取代为A，将第3033位的T取代为A，将第3143位的C取代为A。
3.含有权利要求1或2所述启动子GmGRF5-1pro的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞、转化植物细胞或表达盒。
4.权利要求1或2所述的启动子GmGRF5-1pro或权利要求3所述的生物材料在调控下游基因在种子、根尖或根瘤特异表达中的应用。
5.权利要求1或2所述的启动子GmGRF5-1pro或权利要求3所述的生物材料在提高下游基因在植物种子、根尖或根瘤表达量中的应用。
6.权利要求1或2所述的启动子GmGRF5-1pro或权利要求3所述的生物材料在制备转基因植物中的应用。
7.权利要求1或2所述的启动子GmGRF5-1pro或权利要求3所述的生物材料在植物种子、根尖和根瘤发育调节中的应用。
8.权利要求1或2所述的启动子GmGRF5-1pro或权利要求3所述的生物材料在植物种质资源改良中的应用。
9.用于克隆权利要求1或2所述的启动子GmGRF5-1pro的特异性引物，其特征在于，包括：
正向引物：5’-GAATCAGTAGCACCCGTACGTATG-3’；反向引物：5’-TTTGAGACAACAAAAGGAAGGAAG-3’。
10.含有权利要求9所述特异性引物的试剂盒。
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