CN116042401A - 从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，包括以下过程：a.构建目标微生物基因组草图；b.从目标微生物的基因组草图中挑选表达方向相反的相邻基因之间部分或全部非编码区域的核酸序列作为目标序列；c.分别获得上游同源臂、下游同源臂及外源抗性基因片段，再将三个片段组装为一条重组DNA片段；d.基因转导，将重组DNA片段加入含目标微生物的菌液中，通过基因转导将重组DNA片段导入目标微生物体内；e.抗性筛选目的菌株，将过程d中的菌液培养后，分散于含所述外源抗性基因对应的抗生素载体上培养，即可分离纯化得到目标微生物。本发明联合生物测序大数据和分子生物学技术，定向指导目标微生物的靶向分离，目的性强，分离纯化效果好。
Description
技术领域
本发明涉及微生物分离技术领域，具体为从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法。
背景技术
从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。
甲烷氧化细菌是能够以甲烷作为唯一碳源和能源进行生长的微生物，是湿地等环境中重要的甲烷生物汇。因此，从纯菌层面开展相关研究对预测未来全球甲烷排放显得尤为重要。目前，甲烷氧化细菌的分离方法包括以下几种：
(1)琼脂糖固体平板涂布法：将富集培养的菌液稀释后，涂布于琼脂糖固体平板，置于含甲烷的密封罐中培养。反复涂布划线得到甲烷氧化细菌单克隆菌落。(Heyer J,etal.Int J Syst Evol Microbiol.2005,55(5):1817–1826.)。
(2)悬浮生物膜分离法：该法用于分离对琼脂糖、pH和温度敏感的甲烷氧化细菌。将富集培养菌液稀释后，经0.2微米聚碳酸酯膜过滤，使微生物吸附固定于膜上。将膜悬浮在特定温度和pH的培养基中。数周后，挑取甲烷氧化细菌单菌落。(Nguyen NL,et al.JMicrobiol.2017,55(10):775–782.)
(3)高通量培养：该方法用于生长速度较快的甲烷氧化细菌。通过稀释后，将菌液分散到96孔板进行培养，经过反复操作可分离获得甲烷氧化细菌。(Hoefman S,etal.Microb Biotechnol.2012,5(3):368–378.)
以上方法都是长时间以甲烷为唯一碳源进行反复培养后，挑取单克隆菌落。然而，现有的分离方法存在以下问题：整体工作量大、培养周期长；存在伴随菌共存的问题，无法完全消除伴随菌，难以达到纯菌水平；分离过程具有严重的偏向性，适用于分离环境样本中具有生长优势的甲烷氧化细菌，而不利于生物量低、生长缓慢的甲烷氧化细菌类群的分离。因此，亟需新的技术手段用于甲烷氧化细菌纯培养物的靶向分离。
在高通量测序技术和生信分析手段高速发展的推动下，来自淡水、海洋、土壤和红树林等环境的混合微生物宏基因组测序数据骤增，为解析不同生境下甲烷氧化细菌生理和生态功能提供了契机。同时，高速发展的基因工程技术也为从基因层面的验证实验提供保障。然而，如何利用现有的技术手段来指导微生物纯培养物的靶向分离，仍然是亟待解决的技术难题。
发明内容
本发明的目的在于提供从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，以提高适用范围，且提高分离得到的目标微生物的纯度。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明公开了从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，包括以下过程：
a.构建目标微生物的基因组草图
提取含有目标微生物的环境样品的基因组DNA，通过宏基因组测序数据构建目标微生物的基因组草图。目标微生物筛选原则是基于特有基因，如代谢酶或转运体蛋白等。
b.挑选目标序列
从目标微生物的基因组草图中挑选表达方向相反的相邻基因之间部分或全部非编码区域的核酸序列作为目标序列。
c.构建含抗性基因的重组DNA片段
以非编码区域中点作为起点，向两侧分别取核酸序列作为上游同源臂及下游同源臂，设计上游同源臂、下游同源臂以及外源抗性基因的前向引物及后向引物。通过三对引物PCR扩增后，分别获得上游同源臂、下游同源臂及外源抗性基因片段，再将三个片段组装为一条重组DNA片段。
d.基因转导
将重组DNA片段加入含目标微生物的菌液中，通过基因转导将重组DNA片段导入目标微生物体内。
e.抗性筛选目的菌株
将过程d中的菌液经培养后，分散于含所述外源抗性基因对应的抗生素载体上培养，即可分离纯化得到目标微生物。
其中，所述基因转导为电转导、原生质体转化、氯化钙处理、噬菌体或病毒介导中的一种。所述目标微生物为可接受外源DNA片段导入且胞内表达同源重组酶的甲烷氧化细菌、蓝细菌、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母菌中的一种。
优选的，过程d经过富集培养的含有目标微生物的菌液先制备为感受态菌液，再导入重组DNA片段。将目标微生物通过无菌超纯水重复清洗2～4遍，使得目标微生物进入感受态，有利于外源DNA导入。
具体的，感受态菌液的制备步骤为：将富集培养的菌液在5000～6000rpm离心10～15分钟，弃上清保留沉淀；加入无菌超纯水重悬沉淀，经5000～6000rpm离心10～15分钟后，弃上清保留菌体沉淀；也可再重复1～2遍后，加入无菌超纯水重悬，得到感受态的菌液。
在一些实施例中，采用电转导方法将重组DNA片段导入目标微生物的感受态菌液中，具体步骤如下：
d1.取感受态菌液，加入重组DNA片段，混匀后，转移到0.1～0.2cm间距的电击杯中，设置电击的电压为1.0～1.5千伏特、电击时间为2～4毫秒。通过控制电击的参数，导入目标微生物，尤其是重组DNA片段更容易导入甲烷氧化细菌。
d2.电击后，迅速加入目标微生物培养基，重悬菌体，于25℃～35℃的摇床以60～150rpm振荡培养。
优选的，步骤d1中，所述重组DNA片段的加入菌液后DNA浓度为4～10ng/μL。
其中，过程a的具体步骤为：
a1.采集目标微生物原位样品，提取DNA，经高通量测序得到宏基因组测序原始数据。
a2.对宏基因组测序原始数据质控处理获得优质序列，将优质序列拼接组装得到Contigs。
a3.对样本的Contigs分箱、提纯及去冗余，经物种注释后，基于特定代谢酶或转运体蛋白等微生物特有基因挑选目标微生物的基因组草图。对于甲烷氧化细菌，可基于pMMO基因挑选甲烷氧化细菌的基因组草图。
优选的，过程b中所述目标序列的长度为500～2000个碱基对；过程c中上游同源臂及下游同源臂的长度为750～1500个碱基对。
其中，所述抗生素为氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素中的一种或几种。
其中，所述目标微生物为甲烷氧化细菌，从甲烷氧化细菌的基因组草图中挑选天冬酰胺tRNA合成酶和翻译延伸因子P之间的非编码区为目标序列。
进一步的，所述外源抗性基因选用卡那霉素基因，三对引物序列号如下：
上游同源臂前向引物的序列号如SEQ ID NO.1所示；
上游同源臂后向引物的序列号如SEQ ID NO.2所示；
下游同源臂前向引物的序列号如SEQ ID NO.3所示；
下游同源臂后向引物的序列号如SEQ ID NO.4所示；
卡那霉素基因前向引物的序列号如SEQ ID NO.5所示；
卡那霉素基因后向引物的序列号如SEQ ID NO.6所示。
进一步的，过程d中先将先将环境样品中甲烷氧化细菌先经富集培养后制备为感受态菌液，再导入重组DNA片段；富集培养环境样品中甲烷氧化细菌的方法为：取含有甲烷氧化细菌的原位样品2～10克，于超净台转移到含甲烷氧化细菌培养基的培养瓶中，补充甲烷后，于25℃～35℃的摇床150～200rpm富集培养；过程e中将过程d中的菌液经6～12小时的培养后，进行抗性筛选。
由于采用了上述方案，本发明具有以下有益效果：
1、本发明联合生物测序大数据和分子生物学技术，定向指导目标微生物的分离，目的性强，对于生物量低、生长缓慢的目标微生物的分离纯化不受限制。
2、本发明通过设计抗性基因，经基因转导将抗性基因插入目标微生物，目标微生物会通过抗性筛选后，排除共生菌污染，获得目标微生物的纯菌株；有效提高了分离纯度。
3、本发明方法可缩短分离纯化整体工作量，简化实验步骤并缩短实验周期，分离效率高。
附图说明
图1是本发明的流程示意图。
图2是本发明过程b挑选目标序列的示意图。
图3是挑选甲烷氧化细菌基因组序列的示意图。
图4是将上游同源臂、下游同源臂及抗性基因片段重组的DNA跑胶结果示意图。
图5是含卡那霉素抗性筛选得到的甲烷氧化细菌菌落的平板图。
图6是筛选得到的甲烷氧化细菌的电镜图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的描述。
如图1所示，本发明公开了从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其整体技术方案为：基于环境样品中混合微生物菌群的宏基因组测序数据，对原始数据质控处理得到高质量序列，将高质量序列组装、分箱并注释后，挑选获得目标微生物的基因组草图筛选基因组中基因表达方向相反且相邻基因之间非编码区长度为500～2000个碱基对长度的区域作为目标序列，构建含有目标微生物基因组序列和抗性基因序列的重组DNA片段，经过基因转导将重组片段导入微生物中。抗性基因片段两段的同源序列会在目标微生物中发生基因重组，从而将抗性基因整合到目标微生物的基因组中，使目标微生物获得抗性，即可通过抗性平板筛选，来靶向获得目标微生物的纯培养物。
本发明的目标微生物可以为可接受外源DNA片段导入且胞内表达同源重组酶的甲烷氧化细菌、蓝细菌、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母菌等微生物。以下以甲烷氧化细菌为例，对本发明的方法进行详细说明。
a.构建目标微生物的基因组草图
a1.提取含有甲烷氧化细菌的原位土壤样品
本实施例中从厦门市同安区莲花镇窑市村的水稻田中采集0～15cm的土壤样品，装入无菌离心管中。使用土壤样品基因组提取试剂盒快速提取土壤样品中微生物的基因组DNA，经高通量测序，得到宏基因组测序原始数据。
a2.对宏基因组测序原始数据质控处理获得优质序列，将优质序列拼接组装得到Contigs。
a3.对样本的Contigs分箱、提纯及去冗余，经物种注释后，以pMMO基因挑选甲烷氧化细菌基因组。
b.挑选目标序列
如图2所示，从甲烷氧化细菌基因组草图中挑选表达方向相反且相邻基因(基因A，基因B)之间的非编码区域长度500～2000个碱基对的位点作为目标序列。
如图3所示，本实施例中挑选的甲烷氧化细菌基因组contig1作为目标菌株的基因组，依据表达方向相反且相邻基因之间的非编码区长度在500～2000个碱基对以上的原则筛选。本实施例选择天冬酰胺tRNA合成酶和翻译延伸因子P之间的非编码区，共612个碱基对。
c.构建含抗性基因的重组DNA片段
以非编码区域中点作为起点，向两侧分别取长度大于500个碱基对的位点作为上游同源臂及下游同源臂，设计上游同源臂、下游同源臂以及外源抗性基因的前向引物及后向引物。
抗性基因可以是广谱抗生素的抗性基因，抗生素可以为氨氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素中的一种或几种。抗性基因为相应抗生素对应的基因，抗性基因可单独或联合使用，可避免甲基营养菌等其他共生菌出现，实现分离甲烷氧化细菌纯培养物。
本实施例中以非编码区中点作为起点，向左取750bp作为上游同源臂，向右取750bp作为下游同源臂，分别设计上游、下游同源臂以及抗性基因卡那霉素的PCR扩增引物，序列如下表1所示。
表1..三对引物序列
通过三对引物PCR扩增后，分别获得上游同源臂、下游同源臂及抗性基因片段，再将三个片段通过融合PCR组装为一条重组DNA片段，DNA跑胶结果如图4所示。将重组片段切胶回收后，经sanger测序验证片段序列。
d.基因转导
本过程为将重组DNA片段导入经富集培养的含有目标微生物的菌液中。基因转导的物理方式有很多，如电转导、磷酸沉淀、原生质体转化、氯化钙处理、噬菌体或病毒介导等方法。本实施例中采用电转导的方式对甲烷氧化细菌进行基因转导。
在基因转导前需要将环境样品中甲烷氧化细菌富集培养和制备感受态，通过将菌液制备为感受态，有利于外源DNA导入。
d1.富集培养
取2～10克原位土壤样品，于超净台转移到培养瓶中，加入无菌玻璃珠和50毫升甲烷氧化培养基，密封，再补充50毫升甲烷，于30℃摇床150～200rpm富集培养。
d2.制备感受态的甲烷氧化细菌
将富集培养的上层菌液经无菌筛捐过滤，5000～6000rpm离心10～15分钟后，去上清保留菌体沉淀。再用无菌的超纯水重悬沉淀，5000～6000rpm离心10～15分钟后，去上清保留菌体沉淀。加入50～100μL无菌超纯水重悬沉淀，得到感受态的甲烷氧化细菌。
d3.电转导
取50～80μL感受态甲烷氧化细菌，加入2μL重组DNA片段(DNA含量为4～10ng/μL)，混匀后，转移到0.1～0.2cm的电击杯中，设置电击参数：压力1.0～1.5千伏特、电击时间2～4毫秒。电击后，迅速加入1毫升甲烷氧化细菌培养基，重悬菌体，小心地转移到含甲烷氧化细菌培养基的培养瓶中，补充10毫升甲烷，于30℃摇床以60～150rpm振荡培养。
e.抗性筛选目的菌株
将过程d电转导后的菌液培养6～12小时后，将菌液以5000～6000rpm离心10～15分钟，去上清，加入50μL培养基重悬后，全部涂布于含抗生素的甲烷氧化细菌培养基的固体平板上，将平板置于充满甲烷的厌氧罐中静置培养；因为DNA重组片段中含有甲烷氧化细菌的自身基因，所以甲烷氧化细菌会把DNA重组片段识别为自身基因，从而将DNA重组片段整合到自身基因组上，使抗性基因得到正常表达，保护甲烷氧化细菌不会被抗生素所杀灭，而共生菌没有获得抗性基因，会被抗生素所杀灭。约4～6天后，如图5所示，可观察到平板上有微生物菌落形成，即为分离纯化得到的甲烷氧化细菌。
将本实施例得到的纯化细菌进行鉴定和形态观察：挑取平板上的单克隆菌落于液体甲烷氧化培养基培养，2天后，收集菌体，通过16S rDNA测序进行菌种鉴定，比对结果为Methylomonas属；通过电镜观察纯化后菌体的形貌，见图6所示。
综上，本发明联合宏基因组学数据和分子生物学技术，建立了一种基于基因组草图数据靶向分离甲烷氧化细菌的方法体系，可定向在非编码区插入抗性基因，用于指导从环境样品中靶向分离纯化目标微生物，分离的纯度高，周期短，实用性好。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (13)
1.从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：包括以下过程：
a.构建目标微生物的基因组草图
提取含有目标微生物的环境样品的基因组DNA，基于宏基因组测序数据构建目标微生物的基因组草图；
b.挑选目标序列
从目标微生物的基因组草图中挑选表达方向相反的相邻基因之间部分或全部非编码区域的核酸序列作为目标序列；
c.构建含抗性基因的重组DNA片段
以非编码区域中点作为起点，向两侧分别取核酸序列作为上游同源臂及下游同源臂，设计上游同源臂、下游同源臂以及外源抗性基因的前向引物及后向引物；
通过三对引物PCR扩增后，分别获得上游同源臂、下游同源臂及外源抗性基因片段，再将三个片段组装为一条重组DNA片段；
d.基因转导
将重组DNA片段加入含目标微生物的菌液中，通过基因转导将重组DNA片段导入目标微生物体内；
e.抗性筛选目的菌株
将过程d中的菌液培养后，分散于含所述外源抗性基因对应的抗生素载体上培养，即可分离纯化得到目标微生物。
2.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：所述基因转导为电转导、原生质体转化、氯化钙处理、噬菌体或病毒介导中的一种。
3.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：所述目标微生物为可接受外源DNA片段导入且胞内表达同源重组酶的甲烷氧化细菌、蓝细菌、芽孢杆菌、假单胞菌、酵母菌中的一种。
4.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：过程d中含有目标微生物的菌液先经富集培养后制备为感受态菌液，再导入重组DNA片段。
5.如权利要求4所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：感受态菌液的制备步骤为：将富集培养的菌液在5000～6000rpm离心10～15分钟，弃上清保留沉淀；加入无菌超纯水重悬沉淀，经5000～6000rpm离心10～15分钟后，弃上清保留菌体沉淀；加入50～100μL无菌超纯水重悬，得到感受态的菌液。
6.如权利要求4或5所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：采用电转导方法将重组DNA片段导入目标微生物的感受态菌液中，具体步骤如下：
d1.取感受态菌液，加入重组DNA片段，混匀后，转移到0.1～0.2cm间距的电击杯中，设置电击的电压为1.0～1.5千伏特、电击时间为2～4毫秒；
d2.电击后，迅速加入目标微生物培养基，重悬菌体，于25℃～35℃的摇床60～150rpm振荡培养。
7.如权利要求6所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：步骤d1中，所述重组DNA片段的加入菌液后DNA浓度为4～10ng/μL。
8.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于，过程a的具体步骤为：
a1.采集目标微生物原位样品，提取DNA，经高通量测序得到宏基因组测序原始数据；
a2.对宏基因组测序原始数据质控处理获得优质序列，将优质序列拼接组装得到Contigs；
a3.对样本的Contigs分箱、提纯及去冗余，经物种注释后，基于目标微生物的特定代谢酶或转运体蛋白挑选得到目标微生物的基因组草图。
9.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：过程b中所述目标序列的长度为500～2000个碱基对；过程c中上游同源臂及下游同源臂的长度为750～1500个碱基对。
10.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：所述抗生素为氨苄青霉素、卡那霉素、链霉素、庆大霉素中的一种或几种。
11.如权利要求1所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：所述目标微生物为甲烷氧化细菌，从甲烷氧化细菌的基因组草图中挑选天冬酰胺tRNA合成酶和翻译延伸因子P之间的非编码区为目标序列。
12.如权利要求11所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于，所述外源抗性基因选用卡那霉素基因，三对引物序列号如下：
上游同源臂前向引物的序列号如SEQ ID NO.1所示；
上游同源臂后向引物的序列号如SEQ ID NO.2所示；
下游同源臂前向引物的序列号如SEQ ID NO.3所示；
下游同源臂后向引物的序列号如SEQ ID NO.4所示；
卡那霉素基因前向引物的序列号如SEQ ID NO.5所示；
卡那霉素基因后向引物的序列号如SEQ ID NO.6所示。
13.如权利要求12所述的从环境样品中靶向分离纯化目标微生物的方法，其特征在于：过程d中先将环境样品中甲烷氧化细菌经富集培养后制备为感受态菌液，再导入重组DNA片段；富集培养环境样品中甲烷氧化细菌的方法为：取含有甲烷氧化细菌的原位样品2～10克，于超净台转移到含甲烷氧化细菌培养基的培养瓶中，补充甲烷后，于25℃～35℃的摇床150～200rpm富集培养；过程e中将过程d中的菌液经6～12小时的培养后，进行抗性筛选。
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