CN102559760A - 可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，包括如下步骤：1)构建含两个AvrII位点的pBacAvrII2载体；2)构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体：设计一对两端含FseI位点的引物，从DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；3)可线性化穿梭载体BmBacmid的构建：以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得可线性化穿梭载体BmBacmid。

Description

可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法

技术领域

本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。

背景技术

家蚕是一种重要的经济动物，具有易于饲养、成本低廉等特点。以家蚕作为宿主的杆状病毒表达系统表达外源蛋白的产量高、成本低且质量好，因此具有广阔的市场开发前景。并且，这种表达系统安全性好，外源基因表达水平高，并可进行翻译后加工，是一种比较理想的真核表达系统，因此该系统已得到非常广泛的应用。通过改造杆状病毒载体，该系统在重组病毒的构建效率、外源基因的表达水平和表达通量方面不断得到提升。其中，以核型多角体病毒BmNPV为载体的家蚕杆状病毒表达系统也先后发展出可线性化病毒载体、Bacmid穿梭载体，但这些载体均无法用于外源基因的高通量表达。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，本发明所得的BmBacmid既可作为Bac-to-Bac系统的穿梭载体使用，也可作为一种线性化病毒载体使用，并可用于建立一套新型的BmNPV高通量载体表达系统。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，包括如下步骤：

1)、构建pBacAvrII2载体：在pBacPAK8载体上引入限制性内切酶位点FseI和AvrII；从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2(即，pBacAvrII2载体)；

2)、构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体：

设计一对两端含FseI位点的引物，从DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；

3)、家蚕杆状病毒表达载体-----可线性化穿梭载体BmBacmid的构建：

以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，BAC的片段含两个AvrII和FseI酶切位点、且片段两端为多角体基因侧翼序列，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体，所述BmBacmid载体为可线性化穿梭载体BmBacmid。

作为本发明的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法的改进：

步骤1)为：

pBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点；依次进行以下步骤：

①、第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII1载体：

对转移载体pBacPAK8DNA多角体基因启动子3′端侧翼的orf1629基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG，为AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf1629基因的3′端引入第一个AvrII酶切位点；

②、第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体：

在pBacAvrII1载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段DNA序列；序列包含FseI和AvrII两个酶切位点，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。

作为本发明的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法的进一步改进：

步骤3)为依次进行以下步骤：

①、扩增pBACAvrII2载体中BAC片段：

为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAvrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段；以pBACAvrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成BAC片段；

②、线性化BmBacPAK制备：

家蚕杆状病毒BmBacPAK先经蛋白酶K消化后通过苯酚氯仿抽提获得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三个Bsu36I酶切位点，故通过Bsu36I酶切进行线性化，得到Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA；

③、BmBacmid的构建：

将上述步骤①中PCR产物与上述步骤②所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA按照2∶1的分子数之比共转染家蚕BmN细胞，待细胞完全病变后收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA；

以病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂含Kan、IPTG和X-gal的LB平板培养24h，挑取状态良好的蓝斑接种LB液体培养基，振荡培养48小时后提取Bacmid DNA；将提取的Bacmid DNA转染家蚕细胞，产生细胞病变的即为可线性化穿梭载体BmBacmid。

综上所述，本发明首先提供了pBacAvrII2转移载体(即，pBacAvrII2载体)的构建方法：首先在pBacPAK8多克隆位点上游EcoRV和BamHI位点之间引入限制性内切酶位点FseI和AvrII(第一个)；第二步对多角体基因启动子3′端侧翼的orf1629基因进行定点突变，即在其基因的3′端引入另外一个AvrII位点(第二个)，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。

本发明还提供了pBACAvrII2的构建方法：首先，设计引物(含FseI位点)利用PCR从商品化的DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中，从而构建含细菌人工染色体的转移载体pBACAvrII2。

本发明还构建了一种新型家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid：首先以pBACAvrII2为模板，PCR扩增合成两端为多角体基因侧翼序列，中间为BAC的片段(含两个AvrII和FseI酶切位点)，然后将此PCR产物和线性化的BmBacPAK DNA共转染家蚕细胞BmN，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体。

本发明所构建的BmBacmid载体既能线性化后同源重组构建重组病毒表达蛋白，又可作为穿梭载体构建重组病毒表达蛋白。

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

图1是重组质粒pBacAvrII1的鉴定图；

左图：M.1 kb DNA Ladder；1.AvrII酶切重组质粒pBacAvrII1；右图为测序结果。

图2是重组质粒pBacAvrII2的鉴定图；

左图：M.Low DNA Ladder；1.BamHI和AvrII双酶切重组质粒pBacAvrII2；2.EcoRV酶切重组质粒pBacAvrII2；3.AvrII酶切重组质粒pBacAvrII2；右图为测序结果图。

图3是PCR扩增结果图。

图4是BmBacPAK的图谱。

图5是BmBacPAK的线性化图。

图6是PCR和酶切鉴定图，

左图：pBacPAK8-AcGFP；右图：pFastBac HTB-AcGFP。

图7是共转染后家蚕细胞的荧光情况图；

A.透射光下线性化BmBacmid和pBacPAK8-AcGFP共转染的家蚕细胞；

B.B.荧光显微镜下线性化BmBacmid和pBacPAK8-AcGFP共转染的家蚕细胞。

图8是BmBacmid-AcGFP转染家蚕细胞后的荧光情况图；

A.透射光下转染BmBacmid-AcGFP的家蚕细胞；

B.荧光显微镜下转染BmBacmid-AcGFP的家蚕细胞。

具体实施方式

实施例1、pBacAvrII2载体的构建

pBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点。分两步进行如下：

(1)第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII1载体：

对载体pBacPAK8DNA多角体基因启动子3′端侧翼的orf1629基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG----即AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf1629基因的3′端引入第一个AvrII酶切位点。设计引物如下：

P1：5′-CGGTACGTATTTTAATAATTCATTAAATTTATAATCCCTAGG-3′(下划线部分为AvrII位点)

P2：5′-GAGGATTTAATATTTAAATTCAG-3′；

以pBacPAK8 DNA为模板，进行PCR扩增。PCR反应体系为：

反应程序为：95℃预变性3min；95℃变性30s；55℃退火15s；72℃延伸20s，共30个循环，最后72℃延伸5min。反应结束后，3％琼脂糖凝胶电泳分析。用SwaI和SnaBI分别双酶切PCR产物和pBacPAK8 DNA，并割胶回收。回收产物用T4DNA连接酶连接后转化E.coli TG1感受态细胞，涂氨苄平板过夜培养。次日挑取单菌落，并接种LB液体培养基培养，抽提重组质粒DNA，用PCR方法和SwaI、SnaBI双酶切鉴定重组质粒。重组质粒(即pBacAvrII1载体)交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序。pBacAvrII1载体AvrII单酶切(与预期结果一致)和测序结果如图1。

(2)第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体。

对已成功引入第一个AvrII酶切位点的pBacAvrII1载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段合成的DNA片段(含FseI和AvrII两个酶切位点)，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。

该DNA片段的合成通过设计如下两条寡聚核苷酸来完成：OligoF：5′-ATCggccggccTAGGCC-3′和OligoR：5′-GATCGGCCTAggccggccGAT-3′(ggccggcc为FseI位点；下划线部分为AvrII位点)。将OligoF和OligoR进行互补配对，反应条件为：等浓度(10μM)的OligoF和OligoR各取15μL混匀，95℃变性30min；65℃退火20min。pBacAvrII1用EcoRV和BamHI双酶切并割胶回收，然后与上述合成的DNA片段(OligoF和OligoR互补配对所得)通过T4 DNA连接酶连接。连接产物转化E.coli TG1感受态细胞，涂氨苄平板培养过夜。次日挑取单菌落，并接种LB液体培养基培养，抽提质粒DNA，酶切鉴定后，重组质粒即pBacAvrII2载体交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序。

重组质粒pBacAvrII2以BamHI和AvrII双酶切鉴定时，理论上分析应该会切出一条180bp的小条带，电泳结果显示在150～200bp之间出现了目的条带；用EcoRV进行酶切鉴定时，只会出现一条大小约为5.5kb的DNA条带；用AvrII进行酶切鉴定时，和用BamHI、AvrII双酶切鉴定结果相同(图2左)。序列测定结果显示：目的基因序列中含有第二个AvrII位点，其它序列也和预期相符，说明pBacAvrII2构建成功(图2右)。

实施例2、含细菌人工染色体(BAC)的pBACAvrII2载体的构建

根据商品化DH10Bac Bacmid(bMON14272)DNA的BAC片段(含mini-F、LacZa-attTn7和Kanr)的序列合成正向引物P3和反向引物P4(P3、P4均含有FseI酶切位点)，序列如下：

P3：5′-TTGCTGATATCGGCCGGCCTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTG-3′(下划线部分为FseI酶切位点)

P4：5′-CAGGATCGGCCTAGGCCGGCCTTGCCGGGTCCCAGGAAAGGAT-3′(下划线部分为FseI酶切位点)

以提取的穿梭载体Bacmid DNA作为模板，PCR反应体系为：

说明：DH10Bac为Invitrogen公司产品，DH10Bac细胞内含有Bacmid载体和辅助质粒pMON7124。KOD-FX是指KOD-FX DNA聚合酶。

PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；68℃退火和延伸9min，共40个循环，最后72℃延伸10min。pBacAvrII2用FseI酶切并割胶回收后去磷酸化(去磷酸化方法参照Roche公司试剂盒Rapid DNA Dephos & Ligation Kit说明书进行操作)，再与同样酶切回收的PCR产物用Takara公司长片段DNA连接试剂盒连接后转化HST08感受态细胞，涂氨苄平板培养过夜。次日挑取单菌落，并接种LB液体培养基培养，提取质粒DNA，用PCR和FseI酶切鉴定后，重组质粒(即pBACAvrII2载体)交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序。测序结果与预期结果一致(测序图谱略)，说明pBACAvrII2载体已成功构建。

实施例3、家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid的构建

(1)扩增pBACAvrII2载体中BAC片段

为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAvrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段，设计引物如下：P5：5′-ACAAACTGGAAATGTCTATCAATATATAG-3′(含EcoRV位点)和P6：5′-ACACGTTAAATAAAGCTTGGACATATTTAACA-3′(含HindIII位点)

以pBACAvrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成BAC片段，PCR反应体系为：

反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；68℃退火和延伸9min，共30个循环，最后68℃延伸10min，反应结束后，PCR产物进行0.7％琼脂糖凝胶电泳分析(如图3，与预期结果一致)，并割胶回收纯化以备共转染。

(2)线性化BmBacPAK制备

将复苏后的BmBacPAK以MOI＝5的剂量接种方瓶(250mL)培养的单层BmN细胞，27℃培养72h后收集细胞培养上清，4℃、15,000rpm离心10min(重复一次)，取上清；将上清转入超离心管中，4℃、25,000rpm离心30min；弃上清，沉淀重悬于0.5mL 1×TE(pH8.0)中，加入10μL蛋白酶K(20mg/mL)，50℃水浴2h；加入50μL 10％(克/毫升)SDS，50℃水浴过夜；用等体积的苯酚、苯酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1的体积比)各抽提一次，再用氯仿/异戊醇(24∶1体积比)抽提一次；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，混匀；用无菌玻璃弯棒勾出絮状病毒DNA，经70％(体积浓度)乙醇漂洗后晾干，最后溶于200μL 1×TE(pH8.0)中，4℃保存。

上文中的等体积、2倍体积均是相对于上一步骤产物的体积而言。

经上述处理后得到家蚕杆状病毒BmBacPAK DNA，该病毒DNA含有三个Bsu36I酶切位点(图4)，因此可以通过Bsu36I酶切进行线性化。酶切体系为：

混匀，37℃作用12h。

家蚕杆状病毒BmBacPAK用Bsu36I进行酶切后，通过0.7％琼脂糖凝胶电泳后，结果在Marker为4,361bp附近出现一条带，与预期大小(3.3kb)一致；在564～2,027bp之间出现另一条带，与预期的大小(1.1kb)一致(图5)。所得为Bsu36I线性化的BmBacPAK。

(3)BmBacmid的构建

因上述(1)中PCR产物两端为多角体基因侧翼序列，中间为BAC片段(含两个AvrII和FseI酶切位点)，PCR产物和线性化的BmBacPAK具有同源序列，所以共转染BmN细胞时能够发生同源重组。

将纯化后的上述(1)中PCR产物(100ng)与上述(2)所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK(50ng)共转染家蚕BmN细胞(方法参照Roche公司转染试剂FuGENE 6说明书)，待细胞完全病变后(即出现肿胀、脱壁现象)收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA。以100ng病毒基因组DNA电转化(25μF，200Ω，2500V)20μL ElectroMAXDH10B感受态细胞，涂含Kan、IPTG和X-gal的LB平板培养24h，挑取状态良好的蓝斑接种LB培养基，振荡培养48小时后提取Bacmid DNA。将提取的Bacmid DNA转染家蚕细胞，对产生细胞病变的样品(即BmBacmid)进行PCR和测序鉴定。

根据pBACAvrII2中BAC末端序列设计引物P7：5′-CAGACCGTTCCGTGGCAAAGCAA-3′。以产生家蚕细胞病变的Bacmid DNA为模板，以引物P6和P7进行PCR扩增。

PCR反应体系为：

反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s；68℃退火和延伸1min，共30个循环；最后68℃延伸5min。

扩增产物交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序。序列测定结果显示，BmBacmid中含有两个AvrII酶切位点，说明PCR产物与线性化的家蚕杆状病毒BmBacPAK重组成功，即BmBacmid构建成功。测序图略。

此BmBacmid为可线性化穿梭载体BmBacmid。

实施例4、利用构建成功的BmBacmid表达蛋白

本发明所构建的BmBacmid与其他BmBacmid相比，该载体的优点是：线性化后同源重组构建的重组病毒去除了病毒基因组中的BAC片段，从而消除可能对环境造成的污染。

为了验证所构建的BmBacmid的适用性，进行了蛋白表达的实验。在此仅以绿色荧光蛋白AcGFP为例。

(1)重组转移载体pBacPAK8-AcGFP和pFastBac HTB-AcGFP的构建与鉴定

根据获得的绿色荧光蛋白(AcGFP)基因的ORF序列设计引物P8(5′-CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGC-3′)和引物P9(5′-CGGAATTCTCACTTGTACAGCTCATCCATGC-3′)，分别包含BamHI和EcoRI位点。以pAcGFP1 Vector质粒为模板，用引物P8和P9特异性扩增目的片段。

PCR反应体系为：

PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性40s；58℃退火45s；72℃延伸40s，共30个循环，最后72℃延伸10min，反应结束后，进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。纯化后的PCR产物经BamHI和EcoRI双酶切后与经过同样酶切处理(处理方式同上)的pBacPAK8进行连接，连接产物转化E.coli TG1感受态细胞并涂氨苄平板。次日分别挑取单菌落接种培养，提取质粒，用PCR法和BamHI、EcoRI双酶切鉴定重组质粒pBacPAK8-AcGFP(图6)。重组质粒交由上海桑尼生物科技有限公司进行测序，结果正确。

pFastBac HTB-AcGFP载体的构建和鉴定除所使用的转移载体为pFastBac HTB外，其他与pBacPAK8-AcGFP的完全一样(图6)。

(2)BmBacmid线性化后同源重组表达蛋白

家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid(即实施例3所得的可线性化穿梭载体BmBacmid)经测序验证含有两个AvrII酶切位点，因此可以通过AvrII进行酶切，使BmBacmid线性化。

酶切体系为：

混匀，37℃作用12h。得可线性化穿梭载体BmBacmid DNA。

BmBacmid线性化后与pBacPAK8-AcGFP同源重组构建重组病毒BmNPV-AcGFP表达绿色荧光蛋白。将AvrII线性化的BmBacmid DNA和pBacPAK8-AcGFP利用Fugene 6共转染家蚕BmN细胞，27℃孵育3-5天，细胞出现肿胀、脱壁等病变。利用荧光显微镜观察细胞中的荧光情况，结果如图7，说明所构建的BmBacmid可以线性化后同源重组得重组病毒BmNPV-AcGFP，从而表达目的蛋白。

(3)BmBacmid作为穿梭载体构建新的表达系统表达蛋白

利用BmBacmid转座重组构建重组BmBacmid-AcGFP病毒表达绿色荧光蛋白。将转座辅助质粒pMON7124(由DH10Bac细胞分离获得)转化到含BmBacmid的DH10B感受态细胞中，转化成功的菌种为BmDH10Bac菌。所述含BmBacmid的DH10B感受态细胞由实施例3中鉴定为BmBacmid重组子的DH10B细胞按照常规氯化钙法制备而来。将重组质粒pFastBac HTB-AcGFP转化BmDH10Bac感受态细胞，涂布于含Kan、Gen、Tet、IPTG和X-gal的LB平板上，37℃培养箱内避光培养48h，挑取白色菌落，接种于含上述3种抗生素(即为Kan、Gen、Tet  )的LB液体培养基中，37℃，220rpm振荡培养过夜，然后提取重组BmBacmid DNA(BmBacmid-AcGFP)，用M13通用引物和目的基因正反向引物做PCR鉴定。上述具体方法参照Invitrogen公司Bac-to-Bac杆状病毒表达系统说明书。将重组BmBacmid-AcGFP通过Fugene 6转染家蚕BmN细胞，孵育3-5天，利用荧光显微镜观察荧光，结果如图8，说明BmBacmid可作为穿梭载体成功表达蛋白，这为后续新型表达系统的构建奠定了基础。

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (3)

1.可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是包括如下步骤：

1)、构建pBacAvrII2载体：在pBacPAK8载体上引入限制性内切酶位点FseI和AvrII；从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2；

2)、构建含细菌人工染色体BAC的pBACAvrII2载体：

设计一对两端含FseI位点的引物，从DH10Bac Bacmid上扩增细菌人工染色体BAC片段，插入到pBacAvrII2中；得到pBACAvrII2载体；

3)、家蚕杆状病毒表达载体-----可线性化穿梭载体BmBacmid的构建：

以pBACAvrII2载体为模板，PCR扩增BAC的片段，所述BAC的片段含两个AvrII和FseI酶切位点、且片段两端为多角体基因侧翼序列，然后将PCR产物和线性化的BmBacPAK共转染家蚕细胞，在家蚕细胞内通过同源重组产生重组病毒，从而获得BmBacmid载体，所述BmBacmid载体为可线性化穿梭载体BmBacmid。

2.根据权利要求1所述的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述步骤1)为：

pBacAvrII2载体是在pBacPAK8载体的基础上进行改造，成功引入两个AvrII位点；依次进行以下步骤：

①、第一个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII1载体：

对转移载体pBacPAK8DNA多角体基因启动子3′端侧翼的orf1629基因进行定点突变，将TTTAGG突变为CCTAGG，为AvrII位点，从而在SnaBI和SwaI之间，即在orf1629基因的3′端引入第一个AvrII酶切位点；

②、第二个AvrII位点的引入，构建pBacAvrII2载体：

在pBacAvrII1载体DNA上的EcoRV和BamHI位点之间引入一段DNA序列；所述序列包含FseI和AvrII两个酶切位点，从而构建成含两个AvrII位点的转移载体pBacAvrII2。

3.根据权利要求2所述的可线性化穿梭载体BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述步骤3)为依次进行以下步骤：

①、扩增pBACAvrII2载体中BAC片段：

为了使BAC片段能与线性化BmBacPAK同源重组，故从pBACAvrII2上扩增两端含多角体基因侧翼序列的BAC片段；以pBACAvrII2为模板，用KOD-FX DNA聚合酶PCR扩增合成BAC片段；

②、线性化BmBacPAK制备：

家蚕杆状病毒BmBacPAK先经蛋白酶K消化后通过苯酚氯仿抽提获得病毒DNA，所述病毒BmBacPAK DNA含有三个Bsu36I酶切位点，故通过Bsu36I酶切进行线性化，得到Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA；

③、BmBacmid的构建：

将上述步骤①中PCR产物与上述步骤②所得的Bsu36I线性化的BmBacPAK DNA按照2∶1的分子数之比共转染家蚕BmN细胞，待细胞完全病变后收集培养上清分离病毒，并提取病毒基因组DNA；

以病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂含Kan、IPTG和X-gal的LB平板培养24h，挑取状态良好的蓝斑接种LB液体培养基，振荡培养48小时后提取Bacmid DNA；将提取的Bacmid DNA转染家蚕细胞，产生细胞病变的即为可线性化穿梭载体BmBacmid。

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