CN104711231A - 用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，它由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，然后转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到。该重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白经过Ni亲和层析柱进行纯化，分别用5倍柱体积的20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗脱，收集对应流出液后用10KD的超滤膜浓缩。本发明首次构建了用于高效表达Pvs25的重组杆状病毒，为研究间日疟传播阻断候选疫苗提供一种新途径。

Description

用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒及其构建方法

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，以及该病毒的构建方法，以及该病毒所表达的融合蛋白的纯化方法。 

背景技术

疟疾是一种由疟原虫造成的，通过以按蚊为主要媒介传播的全球性急性寄生虫传染病。据世界卫生组织统计，全球大约有3.2亿人口生活在疟疾流行的地区，每年夺去大约100万人的性命并导致4亿人感染，每年感染疟疾致死的人群中，92%为五岁以下的儿童，而每年各国用于疟疾预防和治疗的资金也达到了10亿美元。由于疫区感染人口的流动性和疟原虫抗药性的出现使得传统的药物治疗疟疾方法面临更加严峻的挑战。因而一种全新的疟疾疫苗的研制势在必行，并已成为疟疾防治中的重要内容。 

在已知的很多种疟疾候选疫苗中，传播阻断疫苗的前景是很好的，其中间日疟传播阻断候选抗原中Pvs25在疟疾的传播过程中发挥重要作用，对Pvs25的研究也是很广泛。现在的生物技术常用的生物体是各种种类的酵母菌核大肠杆菌，但是通过大肠杆菌表达出来的Pvs25蛋白在传播阻断实验中并没有检测到有明显的免疫原性和免疫保护性，而用酵母其中的毕赤酵母表达的Pvs25蛋白可以有很好的表达，得到的抗体也可以检测到免疫原性和保护性，而且已经进入了临床I期，但是在进入下一期临床的时候，人体产生了排斥反应。现如今表达的哺乳动物表达系统可以看到效果，但是表达量很低，成本相对较高，不满足大量生产需要。 

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术的不足，提供一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，该病毒在家蚕BmN细胞中传代培养细胞获得F3代病毒，以此F3代病毒接种家蚕五龄幼虫，检测重组杆状病毒Pvs25在家蚕五龄幼虫中的高效表达。此种方法相比较原核的和其他的真核表达系统表达蛋白的方法具有表达量高、安全性好、生产成本低、易于大规模生产操作的特点。 

本发明所采用的技术方案为： 

一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，它由间日 疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。 

具体地，所述Pvs25基因具体插入到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间。 

具体地，所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。 

本发明进一步提供用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25的构建方法，包括以下步骤： 

（1）通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25基因连接到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacHTB-Pvs25； 

（2）将重组转座质粒pFastBacHTB-Pvs25转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定； 

（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25。 

本发明还进一步提供上述重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤： 

（1）选用Ni亲和层析柱，Bindingbuffer平衡后将收集的含目的蛋白的液体上样，室温孵育15min； 

（2）收集穿透液，用10倍柱体积的Bindingbuffer平衡柱子，并收集流出液； 

（3）分别用5倍柱体积的20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗柱子，并收集对应的流出液，然后将每一个咪唑梯度的样品用10KD的超滤膜浓缩至1mL； 

（4）将每一个收集的样品进行制样，然后SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。鉴定结果表明，间日疟传播阻断候选抗原Pvs25融合蛋白在重组杆状病毒BmPvs25内高效表达。 

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果： 

（1）间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因是一个编码217个氨基酸的基因序列，其中含有4个EGF-like结构域，本研究中所用到的是经过优化后的编码137个氨基酸的Pvs25序列，利用经过改造后的Pvs25序列作家蚕杆状病毒系统的研究。本发明首次构建了用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒，利用家蚕五龄幼虫作为生物反应器，使目的蛋白可以达到高表达量，安全性好，生产成本低，产量高，适用于大规模生产。该家蚕杆状病毒高效表达系统表达具有临床应用价值。 

（2）本发明利用家蚕杆状病毒表达的传播阻断候选疫苗具有翻译后的修饰，可以得到比原核表达相对有正确构象的抗原，可以达到好的免疫原性。 

附图说明

图1所示的是重组转移质粒pFastBacHTB-Pvs25的构建示意图。 

图2所示的是重组转移质粒pFastBacHTB-Pvs25的PCR和双酶切鉴定图，其中M：DNAmarker；1：PCR产物；2:BamHI/XhoI酶切产物。 

图3所示的是家蚕重组杆状病毒BmPvs25的PCR鉴定图，其中M:DNAmarker；1：M13F和M13R为上下游引物PCR结果；2：M13F和目的基因下游为上下游引物PCR结果；3：目的基因上游和M13R为上下游引物PCR结果。 

图4所示的是Pvs25融合蛋白在家蚕BmN细胞中表达的Westernblotting图，其中M：低分子量蛋白标准；1：正常细胞；2：接种了重组BmPvs25的发病细胞。 

图5所示的是Pvs25融合蛋白在纯化各步骤中样品的Westernblotting图，其中M：Marker；1：500mM咪唑洗脱液制样；2：300mM咪唑洗脱液制样；3：200mM咪唑洗脱液制样；4：150mM咪唑洗脱液制样；5：100mM咪唑洗脱液制样；6：50mM咪唑洗脱液制样；7：20mM咪唑洗脱液制样；8：流出液制样；9：穿透液制样。 

序列表信息： 

SEQIDNO：1：上游引物Pvs25-F； 

SEQIDNO：2：下游引物Pvs25-R； 

SEQIDNO：3：上游引物M-13-F； 

SEQIDNO：4：下游引物M-13-R； 

SEQIDNO：5：Pvs25的核苷酸序列。 

具体实施方式

以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明所使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含 义。 

本发明通过PCR的方法扩增获得Pvs25的基因序列，将其插入到载体pFastBacHTB中，获得pFastBacHTB-Pvs25的重组质粒后转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，再转座获得Bacmid-Pvs25，鉴定成功后，脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，然后在细胞内形成重组杆状病毒BmPvs25病毒，进行传代接种复制扩增后得到F3代BmPvs25，Westernblotting鉴定成功后将病毒接种于家蚕五龄幼虫，待虫体发病后收集蚕血淋巴，离心，分离纯化，计算得率。 

以下结合实施例详细阐述本发明的具体内容。 

1、本实施例涉及的各引物，由北京华大基因有限公司合成。 

2、材料： 

pFastBacHTB载体、含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞、家蚕BmN细胞购自Invitrogen公司，T-Pvs25-48质粒为范琦老师馈赠，LB培养平板、培养液购自上海生工生物公司，家蚕五龄幼虫购自浙江中奇生物药业股份有限公司。 

3、主要试剂： 

TaqDNA聚合酶、各类内切酶购自Fermentas公司，羊抗鼠LgG-HRP二抗购自天津三箭生物技术有限公司，脂质体转染试剂CellfectinⅡReagent购自Invitrogen公司，其它使用到的试剂均属于普通市售生物实验试剂。 

实施例1：重组转移质粒pFastBacHTB-Pvs25的构建 

以T-Pvs25-48的质粒为模板，以Pvs25-F（如SEQIDNO：1所示）和Pvs25-R（如SEQIDNO：2所示）为引物进行Pvs25的扩增，并对PCR产物以及pFastBacHTB进行BamHI/XhoI进行双酶切，将两个酶切产物用高效连接酶连接后转化大肠杆菌TG1感受态，涂布平板挑取单菌落扩大培养后提取质粒获得重组转移质粒pFastBacHTB-Pvs25。引物如下： 

Pvs25-F:CGCGGATCCATGGAAGAAAAAAAT 

Pvs25-R:CCGCTCGAGTTAAAGGCATACATTT 

（1）Pvs25基因的ORF扩增 

以T-Pvs25-48的质粒为模板，PCR反应的条件为94℃预变性10min，94℃变性1min，56℃复性延伸30s，30个循环，72℃延伸1min。 

在一个经过灭菌操作的500μL离心管中加入以下成分： 

各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应条件设置30个循环。待反应结束后，1%凝胶电泳鉴定扩增片断，（目的片段长度共414bp，序列如SEQIDNO：5所示，）同时切胶回收Pvs25目的片断。 

（2）重组转移质粒的构建 

将上述（1）中获得的Pvs25基因与pFastBacHTB载体分别双酶切后进行连接，形成pFastBacHTB-Pvs25。重组转移质粒pFastBacHTB-Pvs25的构建示意图如图1所示。通过PCR和双酶切的方法分析鉴定以及双向测序基因序列完全正确，证明构建成功。图2所示的是重组转移质粒pFastBacHTB-Pvs25的PCR和双酶切鉴定图。 

实施例2：家蚕重组杆状病毒BmPvs25的获得 

鉴定成功的pFastBacHTB-Pvs25转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，在含有庆大霉素和氨苄青霉素的固体LB培养皿上涂板，12h后挑取生长状态良好的单菌落进行扩大培养，异丙醇抽提重组杆状病毒的Bacmid，并用M13（M13-F如SEQIDNO：3所示，M13-R如SEQIDNO：4所示）和目的基因交叉作为对应引物做PCR鉴定。 

将鉴定成功的重组Bacmid用脂质体介导法转染家蚕BmN细胞(方法参照Invitrogen公司脂质体转染试剂CellfectinⅡReagent说明书)，待细胞发病后（20×显微镜观察细胞悬浮状态）收集细胞病毒夜为一代病毒，于4℃保存。并取一定量制样进行病毒基因组的提取和PCR鉴定，如图3所示，鉴定成功即获得了BmPvs25重组杆状病毒株。 

实施例3：Pvs25融合蛋白在家蚕BmN细胞中的表达 

将重组杆状病毒BmPvs25以10×MOI的剂量感染家蚕BmN细胞进行病毒扩增，感染3天后，收集病毒液，经分离纯化，取40μL加入10μL的5×蛋白质上样缓冲液100℃经水浴煮10min，取加热后的混合液10μL进行SDS-PAGE和Westernblotting分析（一抗为原核表达融合目的蛋白制备的鼠抗，二抗为羊抗鼠LgG-HRP），结果表明，该家蚕重组杆状病毒成功表达Pvs25融合蛋白，见图4。 

实施例4：Pvs25融合蛋白在家蚕五龄幼虫中的表达 

将家蚕重组杆状病毒BmPvs25以10×MOI的剂量感染BmN细胞进行病毒扩增后分装病毒，按约为1×10PFU/条针刺接种法接入家蚕五龄幼虫（本实施例接种200头），感染5-7天后，幼虫出现明显发病症状后收集家蚕蚕血淋巴（共收集到30ml），经12000rpm低温离心40min后收集上清进行Westernblotting的鉴定蛋白是否表达：取高速离心后的上清与5×的蛋白上样缓冲液，100℃经水浴煮10min，取15μL进行Westernblotting分析，结果表明该重组杆状病毒在家蚕五龄幼虫中成功表达Pvs25融合蛋白。 

实施例5：Pvs25融合蛋白的纯化 

实施例4接种了200头五龄家蚕，共得到30mL的蚕血淋巴，我们对这30mL蚕血淋巴进行蛋白纯化。 

由于构建的重组杆状病毒BmPvs25用到的Bac-to-Bac系统载体含有His标签，所以我们用Ni亲和层析柱进行目的蛋白的纯化，步骤如下： 

（1）每个柱子装有约2mL的填料，Bindingbuffer平衡后将收集的蚕血上样，室温孵育15min； 

（2）收集穿透液制样备用，用10倍柱体积的Bindingbuffer平衡柱子，并收集流出液制样备用； 

（3）分别用5倍柱体积的20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗柱子，并收集对应的流出液。将每一个咪唑梯度的样品用10KD的超滤膜浓缩至1mL后分别制样进行检测。 

（4）将每一个样品进行SDS-PAGE和Westernblotting鉴定，结果如图5所示。 

通过纯化后浓缩得到相对较纯的Pvs25融合蛋白为0.5mg，所以通过计算可以得到Pvs25通过杆状病毒表达系统在家蚕五龄幼虫的表达可以达到约17μg/mL的蛋白。 

综上所述，本发明旨在叙述一种可以高效表达Pvs25的真核表达方法。相比较其他的真核表达载体，此方法是现在所研究的除酵母高效表达后外的另一种可以高效表达的方法，但是酵母表达的抗原在进入临床II期没有成功，所以此种方法就可以为研究间日疟传播阻断候选疫苗Pvs25提供一种新途径。 

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。 

序列表： 

SEQIDNO：1 

CGCGGATCCATGGAAGAAAAAAAT 

SEQIDNO：2 

CCGCTCGAGTTAAAGGCATACATTT 

SEQIDNO：3 

GTTTTCCCAGTCACGAC 

SEQIDNO：4 

CAGGAAACAGCTATGAC 

SEQIDNO：5 

ATGGAAGAAAAAAATGAATGCAAGAAAGAAACCCTAGGCAAAGCATGCGGGGAATTTGGCCAGTGTATAGAAAACCCAGACCCAGCACAGGTAAACATGTACAAATGTGGTTGCATTGAGGGCTACACTTTGAAGGAAGACACTTGTGTGCTTGATGTATGTCAATACAAAAATTGTGGAGAAAGTGGCGAATGCATTGTTGAGTACCTCTCGGAAATCCAAAGTGCAGGTTGCTCATGTGCTATTGGCAAAGTCCCCAATCCAGAAGATGAGAAAAAATGTACCAAAACGGGAGAAACTGCTTGTCAATTGAAATGTAACACAGATAATGAAGTCTGCAAAAATGTTGAAGGAGTTTACAAGTGCCAGTGTATGGAAGGCTTTACGTTCGACAAAGAGAAAAATGTATGCCTT 

Claims (5)

1.一种用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：由间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因插入到pFastBacHTB载体并通过转座与穿梭载体Bacmid的基因组进行同源重组，获得重组杆状病毒基因组DNA，然后将重组杆状病毒基因组DNA转染家蚕细胞，在家蚕细胞内包装得到表面展示有间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒。

2.根据权利要求1所述的用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：所述Pvs25基因具体插入到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间。

3.根据权利要求1所述的用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25，其特征在于：所述家蚕细胞为家蚕BmN细胞。

4.权利要求1-3中任一权利要求所述的用于表达间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）通过PCR扩增的方法得到间日疟传播阻断候选抗原Pvs25基因，然后将Pvs25基因连接到pFastBacHTB载体的BamHI酶切位点和XhoI酶切位点之间，得到重组转座质粒pFastBacHTB-Pvs25；

（2）将重组转座质粒pFastBacHTB-Pvs25转化含杆状病毒穿梭载体Bacmid的大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，进行同源重组，在含有卡那霉素、庆大霉素、四环素、X-gal和IPTG的LB培养平板上进行蓝白斑筛选，避光培养40-48h后挑取白斑，白斑继续培养24-48h后抽提重组杆状病毒基因组DNA进行PCR鉴定；

（3）取步骤（2）鉴定正确的重组杆状病毒基因组DNA通过脂质体介导法转染家蚕BmN细胞，发病后获得一代病毒悬液，提取病毒基因组再次进行PCR鉴定，鉴定正确的即为表面展示间日疟传播阻断候选抗原Pvs25的重组杆状病毒BmPvs25。

5.权利要求1-3任一权利要求所述的重组杆状病毒BmPvs25所表达的融合蛋白的纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）选用Ni亲和层析柱，Bindingbuffer平衡后将收集的含表达的融合蛋白的液体上样，室温孵育15min；

（2）收集穿透液，用10倍柱体积的Bindingbuffer平衡柱子，并收集流出液；

（3）分别用5倍柱体积的20mM、50mM、100mM、150mM、200mM、300mM、500mM的咪唑洗柱子，并收集对应的流出液，然后将每一个咪唑梯度的样品用10KD的超滤膜浓缩至1mL；

（4）将每一个收集的样品进行制样，然后SDS-PAGE和Westernblotting鉴定。