CN103484499A - 复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid，进而通过Red重组技术构建了一种复制缺陷型的BmNPV载体。复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法具体为：首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid，再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid；该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以快速构建重组病毒表达目的蛋白。上述复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途是用于构建重组病毒表达目的蛋白。

Description

复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用

技术领域

本发明属于生物技术中利用基因工程方法载体构建的技术领域。 

背景技术

昆虫杆状病毒表达系统主要有两个，一个是应用最为广泛以Sf9、Sf21细胞或苜蓿银纹夜蛾为宿主的AcMNPV载体表达系统，另一个是感染家蚕细胞或幼虫、蛹表达外源基因的家蚕杆状病毒（BmNPV）表达载体系统。在这种表达系统中重组病毒的成功构建是关键。早期的BmNPV载体系统产生重组病毒效率低，需要繁琐耗时的多步筛选步骤。目前主要是以BmBacmid或者线性化的BmNPV为主构建重组病毒，表达目的蛋白。最近还出现了一种利用条件性复制载体转座构建重组BmBacmid的技术，利用这种技术可大大提高筛选重组BmBacmid的成功率。不过，这种操作仍然需要在特定的大肠杆菌中完成，无法脱离这个中间步骤。总之，虽然现在的技术和方法相比较早期的技术有很大进步，但最终成功构建重组病毒还是需要多步操作，相对还是比较繁琐耗时的。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用；本发明利用同源重组的方法构建穿梭载体BmBacmid，进而通过Red重组技术构建一种复制缺陷型的BmNPV载体。利用这种复制缺陷型载体可一步构建重组病毒，无需筛选，从而建立一种快速构建BmNPV重组病毒表达目的蛋白的方法。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建方法，包括以下步骤： 

1）、pMD18-lef2-1629载体构建： 

①、分别进行BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的合成， 

②、利用BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2-1629片段； 

③、构建pMD18-lef2-1629： 

先对lef2-1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体（pMD18-Tsimple），得pMD18-lef2-1629； 

2）、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建： 

①、细菌人工染色体BAC片段的合成 

以bMON14272DNA作为模板，利用KOD FX DNA聚合酶PCR扩增BAC片段，得BAC片段PCR产物； 

②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629： 

先将pMD18-lef2-1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应；pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化，再与酶切回收的BAC片段PCR产物用DNALigation Kit LONG试剂盒进行连接，连接产物转化HST08感受态细胞，得转移载体pMD18-lef2-BAC-1629。 

本发明还同时提供了复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid，再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid；该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以构建（快速构建）重组病毒表达目的蛋白。 

作为本发明的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法的改进： 

家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid的构建为： 

取转移载体pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角体BmNPV病毒DNA混匀后与X-tremeGENE HP转染试剂混合共转染单层家蚕BmN细胞；所得的病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂布于Kan/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养24～48h；然后转印至Amp/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养12h，随机挑取Kan抗性Amp敏感的蓝色单菌落接种Kan LB液体培养基（50μg/mL Kan），37℃摇床中220r/min振荡培养48h；得穿梭载体BmBacmid，含该穿梭载体BmBacmid的DH10B细胞标记为BmDH10B。 

作为本发明的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法的进一步改进：利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid包括以下步骤： 

1）、orf1629基因打靶片段的制备 

根据四方形多角体BmNPV病毒orf1629基因及pKD3质粒中氯霉素抗性基因表达盒序列设计引物；然后以pKD3质粒DNA作为模板，KOD FX DNA聚合酶进行扩增；PCR产物纯化后，得orf1629基因打靶片段； 

2）、Red重组构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid： 

以pKD46-RecA质粒转化BmDH10B感受态细胞，在Amp/Kan LB平板上筛选阳性克隆，得BmDH10B(pKD46-RecA)感受态细胞； 

所述BmDH10B(pKD46-RecA)感受态细胞以orf1629基因打靶片段电转化后，进行筛选培养；得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid。 

本发明还同时提供了利用上述方法构建而得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途，其特征是：用于构建重组病毒表达目的蛋白。 

在本发明中，所用到的引物具体如下： 

lef2基因片段上游引物lef2-F：5'-GTTTCATTTAATGCAACTTTATC-3'，下游引物lef2-R：5'-TGTATAGTGTTGGCCGGCCTAATAAAAAACAAATTTGACA-3'（下划线标示为FseI酶切位点）。 

orf1629基因片段的上游引物1629-F：5'-CAAATTTGTTTTTTATTAGGCCGGCCAACACTATACATTGTTATTAG-3'（下划线为FseI酶切位点），下游引物1629-R：5'-ATGAATTCACCACCATCATCGATGTCTG-3'（下划线标示为EcoRI酶切位点）。 

引物BAC-F：5'-TTGCTGATATCGGCCGGCCTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTG-3'和BAC-R：5'-CAGGATCGGCCTAGGCCGGCCTTGCCGGGTCCCAGGAAAGGAT-3'（下划线标示FseI酶切位点）。 

P_HindIII：5'-TATGTCCAAGCTTTATTTAACGTG-3'。 

KO-1629F： 

（5′-TAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTcctaaggatgggaattagccatggtcc-3′）， 

和KO-1629R： 

（5′-AAAGACGCTGAAAATCATTTGATTTTCGCTCTAACATACCACCCTAAggtgtaggctggagctgcttc-3′）。 

综上所述， 

本发明提供了转移载体pMD18-lef2-1629和pMD18-lef2-BAC-1629的构建方法。 

本发明提供了复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法。 

本发明提供了复制缺陷型BmNPV载体的应用。 

本发明具有如下优点： 

1、相对于线性化载体来说，BmNPV载体RD-BmBacmid通过同源重组拯救产生病毒，是一种正筛选的方法，无需进行重组病毒的筛选和纯化，因而操作更简单，省时省力。 

2、相对于其他Bacmid载体来说，BmNPV载体RD-BmBacmid通过同源重组拯救产生病 毒，无需通过Bac-to-Bac系统构建重组Bacmid，因而操作更直接，省时省力。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1为BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的PCR扩增结果图； 

M：250bp DNA Ladder；1：lef2基因片段PCR产物；2：orf1629基因片段PCR产物。 

图2是重叠PCR合成的lef2-1629片段扩增结果图； 

M1：DL2000；1：lef2和orf1629片段重叠PCR扩增产物（10μL）；2：引物lef2-F和1629-R扩增lef2-1629片段的PCR产物（1μL）；3：凝胶纯化回收的lef2-1629片段；M2：λ-EcoT14I。 

图是3pMD18-lef2-1629的酶切鉴定图； 

M1：250bp DNA Ladder；1：EcoRI和FseI双酶切pMD18-lef2-1629的产物；2：FseI单酶切pMD18-lef2-1629的产物；M2：λ-DNA/HindIII。 

图4是细菌人工染色体BAC片段的扩增结果图； 

M：λ-DNA/HindIII；1：细菌人工染色体BAC的PCR产物。 

图5是转移载体pMD18-lef2-BAC-1629酶切鉴定分析； 

M：λ-DNA/HindIII；1：FseI酶切pMD18-lef2-1629的产物；2：BAC片段；3、4和5：FseI、EcoRI和BamHI分别单酶切pMD18-lef2-BAC-1629的产物。 

图6是转移载体pMD18-lef2-BAC-1629中lef2-BAC-orf1629的结构图。 

图7是穿梭载体BmBacmid的PCR扩增BAC片段的鉴定图； 

M：λ-DNA/HindIII；1：引物BAC-R和P_HindIII扩增BmBacmid DNA的PCR产物。 

图8是orf1629基因打靶片段的制备图； 

M：DL2000；1：KO-1629F和KO-1629R扩增Cm^r的PCR产物。 

图9是复制缺陷型BmNPV载体（RD-BmBacmid）的PCR鉴定图； 

M：DL2000；1：KO-1629F和KO-1629R扩增产物：2：KO-1629F和P_HindIII扩增产物。 

图10是RD-BmBacmid单独转染的BmN细胞（a）以及其培养上清连续转接3轮的BmN细胞(b、c、d)。 

图11是RD-BmBacmid-AcGFP转染（A）及培养上清转接（B）的BmN细胞发荧光情况。 

图12是RD-BmBacmid同源重组救活的验证图； 

a：RD-BmBacmid和pBacPAK8-AcGFP共转染120h后的BmN细胞，b：共转染后细胞 培养上清转接72h后的BmN细胞。 

图13是重组GFP蛋白的Western Blotting检测图； 

M：预染蛋白分子量标准；1：RD-BmBacmid单独转染后转接的BmN细胞样品；2：共转染后细胞培养上清转接的BmN细胞样品。 

具体实施方式

实施例1、构建含细菌人工染色体的转移载体pMD18-lef2-BAC-1629 

1.pMD18-lef2-1629载体构建 

1.1、BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的合成 

应用Premier5.0软件，根据四方形多角体病毒BmNPV基因组序列（GenBank数据库中登录号：JQ991009.1；或者参照http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201202-788）设计合成lef2基因片段和orf1629基因片段的引物。 

lef2基因片段上游引物lef2-F：5'-GTTTCATTTAATGCAACTTTATC-3'，下游引物lef2-R：5'-TGTATAGTGTTGGCCGGCCTAATAAAAAACAAATTTGACA-3'（下划线标示为FseI酶切位点）。 

orf1629基因片段的上游引物1629-F：5'-CAAATTTGTTTTTTATTAGGCCGGCCAACACTATACATTGTTATTAG-3'（下划线为FseI酶切位点），下游引物1629-R：5'-ATGAATTCACCACCATCATCGATGTCTG-3'（下划线标示为EcoRI酶切位点）。 

以四方形多角体病毒BmNPV DNA为模板，用KOD-Plus-DNA聚合酶（购自东洋纺（上海）生物科技有限公司）和所设计的引物lef2-F和lef2-R、1629-F和1629-R分别进行PCR特异性扩增合成lef2基因片段和orf1629基因片段。PCR反应体系如下： 

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火30s，68℃延伸1min，循环30次；最后68℃延伸10min。反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（结果如图1），利用凝胶回收试剂盒（购自Axygen公司）对PCR产物进行纯化，具体步骤参照试剂盒说明书。 

1.2、重叠PCR合成lef2-1629片段 

上述1.1PCR合成的lef2基因片段3'端与orf1629基因片段5'端有约37bp的重叠，故可通过重叠PCR法融合lef2片段和orf1629片段。首先，重叠PCR合成lef2-1629模板，反应体系如下： 

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性40s，60℃退火30s，68℃延伸2min，循环5次；最后68℃延伸10min，4℃冷却5min。反应结束后，取该PCR反应体系25μL作为模板，进行PCR反应，PCR反应程序相同，循环次数为30次。反应体系如下： 

反应结束后，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物（结果如图2），利用凝胶回收试剂盒（购自Axygen公司）对PCR产物进行纯化，具体步骤参照试剂盒说明书。所纯化的PCR产物即lef2-1629片段。 

1.3、构建pMD18-lef2-1629 

上述1.2中合成的lef2-1629片段为平末端。为了便于克隆到T载体pMD18-T simple（购自宝生物工程（大连）有限公司）中，需对lef2-1629片段3'端加“A”。利用普通PCR反应加“A”，具体反应如下： 

PCR反应程序：72℃孵育30min，4℃保存。利用PCR产物纯化试剂盒（购自Axygen公司）对加“A”产物进行纯化回收，具体步骤参照试剂盒说明书。 

加“A”后的PCR产物可以连接到T载体中，具体方法如下： 

混匀连接反应混合物，25℃室温连接反应1h。取3μL连接产物转化E.coli TG1化学感受态细胞（购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司），蓝白斑筛选重组克隆，并按常规分子克隆的方法培养重组克隆和提取质粒。重组质粒利用EcoRI和FseI(购自New England Biolab公司)进行酶切鉴定，结果如图3所示。EcoRI和FseI双酶切重组质粒产生大小为1kb与3.7kb左右的2条谱带，分别与插入的orf1629片段（约1050bp）以及pMD18T载体（2692 bp）加lef2片段（约950bp）之和一致；FseI单酶切则仅产生大小约为5kb的1条谱带，大致等于pMD18T载体与lef2和orf1629片段之和，故成功构建了pMD18-lef2-1629。 

2、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建 

2.1、细菌人工染色体BAC片段的合成 

根据bMON14272（即AcMNPV Bacmid，购自Invitrogen公司）中细菌人工染色体BAC片段的序列，应用Premier5.0软件设计一对引物BAC-F：5'-TTGCTGATATCGGCCGGCCTTTTGCTTTGCCACGGAACGGTCTG-3'和BAC-R：5'-CAGGATCGGCCTAGGCCGGCCTTGCCGGGTCCCAGGAAAGGAT-3'（下划线标示FseI酶切位点），用于扩增BAC片段。 

以bMON14272 DNA作为模板，利用KOD FX DNA聚合酶（购自东洋纺（上海）生物科技有限公司）PCR扩增BAC片段。 

PCR反应体系为： 

PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸9min，循环40次；最后68℃延伸10min；4℃保存。用1%的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，结果如图4所示，BAC片段与预期大小（约8.4kb）一致。 

2.2、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629 

上述1.3获得的pMD18-lef2-1629与2.1中BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应，反应体系如下： 

分别混匀，37℃酶切作用4h。pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化(参照Roche公司试剂盒Rapid DNA Dephos&Ligation Kit说明书进行操作)，再与同样酶切回收的BAC片段PCR产物用DNA Ligation Kit LONG试剂盒（宝生物工程（大连）有限公司）进行连接，连接方法参照试剂盒使用说明。连接产物转化HST08 感受态细胞（宝生物工程（大连）有限公司），涂布于Amp/IPTG/X-gal LB固体培养基（100μg/mL Amp、0.1mol/L IPTG、20mg/mLX-gal；LB固体培养基：10g/L NaCl、10g/L Tryptone、5g/L酵母抽提物、1.5%琼脂粉）上筛选，随机挑取蓝色单菌落接种Amp/Kan LB液体培养基（100μg/mL Amp和50μg/mL Kan；LB液体培养基：10g/L NaCl、10g/L Tryptone、5g/L酵母抽提物）培养，提取质粒DNA进行酶切鉴定分析。结果如图5，所提取的质粒经FseI酶切，产生2条谱带，分别是8.4kb的 BAC片段和约5kb的pMD18-lef2-1629片段；经EcoRI酶切，产生大小分别约为2.5kb和10kb的2条谱带；经BamHI酶切后只产生1条约13kb条带。酶切结果均与预期结果一致，故成功构建出转移载体pMD18-lef2-BAC-1629。 

由于BAC片段中EcoRI酶切位点更靠近Kanr基因（约1.5kb），故可以确定转移载体pMD18-lef2-BAC-1629中lef2、BAC和orf1629三个片段的顺序和方向如图6。 

实施例2、穿梭载体BmBacmid的构建 

分别取10μg上述实施例1中获得的转移载体pMD18-lef2-BAC-1629DNA和2μg的四方形多角体BmNPV病毒DNA（病毒DNA的抽提参照文献http://www.paper.edu.cn/releasepaper/content/201202-788），混匀后与20μL X-tremeGENE HP转染试剂（购自Roche公司）混合按使用说明共转染单层家蚕BmN细胞（5×10⁶～7×10⁶个）。转染后，细胞置入27℃常规细胞培养箱中培养。待细胞完全病变后（转染后约5天）收集上清，超速离心（25000×g，60min）分离病毒，并按常规的蛋白酶K消化、酚/氯仿法提取病毒基因组DNA（具体方法例如可参照专利申请号为201210037290.8专利实施例3中BmBacPAK DNA的制备）。以100ng病毒基因组DNA电转化（25μF，200Ω，2500V，5ms）20μL ElectroMAX DH10B感受态细胞（购自Invitrogen公司），涂布于Kan/IPTG/X-gal LB固体培养基上37℃生化培养箱中培养24～48h。然后转印至Amp/IPTG/X-gal LB固体培养基上37℃生化培养箱中培养12h，随机挑取Kan抗性Amp敏感的蓝色单菌落接种Kan/LB液体培养基（50μg/mL Kan），37℃摇床中220r/min振荡培养48h。 

参照Invitrogen公司Bac-to-Bac系统中Bacmid DNA的抽提方法提取BmBacmid DNA，利用引物BAC-R和P_HindIII（5'-TATGTCCAAGCTTTATTTAACGTG-3'）进行PCR鉴定（PCR体系等同于实施例1中2.1），PCR反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸10min，循环40次；最后68℃延伸10min；4℃保存。结果如图7所示，PCR产生大小约9kb的一个片段，与预期大小一致。并测序鉴定（图略），鉴定阳性者即为穿梭载体BmBacmid，含该穿梭载体BmBacmid的DH10B细胞标记为BmDH10B。 

实施例3：复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建 

1.orf1629基因打靶片段的制备 

根据四方形多角体BmNPV病毒orf1629基因及pKD3质粒中氯霉素抗性基因（Cm^r）表达盒序列设计引物： 

KO-1629F： 

（5′-TAGATTCTGTGCGTTGTTGATTTACAGACAATTGTTGTACGTATTcctaaggatgggaa ttagccatggtcc-3′）， 

和KO-1629R： 

（5′-AAAGACGCTGAAAATCATTTGATTTTCGCTCTAACATACCACCCTAAggtgtaggctggagctgcttc-3′）； 

其中下划线标示orf1629的同源序列（对应读码框位置分别为：1577-1621，1504-1550），小写字体部分为扩增Cm^r表达盒的特异序列。以pKD3质粒DNA作为模板，KOD FX DNA聚合酶扩增（反应体系等同于实施例1中2.1），反应程序为：98℃预变性2min；98℃变性10s，68℃退火30s，68℃延伸1min20s，循环30次；最后68℃延伸7min。PCR产物经纯化后，作为模板重复上述PCR反应。第2次PCR产物经过DpnI（购自New England Biolab公司）消化处理后以PCR产物纯化试剂盒（购自Axygen公司）纯化，纯化产物作为orf1629基因打靶片段（结果如图8），具体方法参照相关试剂使用说明。 

2.Red重组构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid 

以pKD46-RecA质粒（购自Nature Technology Corporation公司）转化上述实施例2中获得的BmDH10B感受态细胞，在Amp/Kan LB固体培养基（50μg/mL Kan、100μg/mL Amp）平板上筛选阳性克隆，随机挑取单菌落接种LB液体培养基，于30℃摇床220r/min振荡培养过夜。然后，取上述培养的上述菌液培养物以体积比1：50接种至100mL Kan/Amp/L-阿拉伯糖LB液体培养基（50μg/mL Kan、100μg/mL Amp和60mmol/L L-阿拉伯糖）中，30℃摇床220r/min振荡培养至OD_600nm达到0.4左右。置于冰上预冷10min后，4℃下4000r/min离心5min，弃上清。然后，用4℃预冷的10%（v/v）甘油重复洗涤3次，最后体积浓缩为1mL即制成电转化感受态细胞BmDH10B(pKD46-RecA)，于-80℃保存备用。制备的BmDH10B(pKD46-RecA)感受态细胞（100μL）以500ng的orf1629基因打靶片段电转化（25μF，200Ω，2500V，5ms）后，加入30℃预热含60mmol/L L-阿拉伯糖的LB液体培养基，置于30℃摇床220r/min培养3h。之后，涂布于Amp/Kan/Cm/IPTG/X-gal LB固体培养基（100μg/mL Amp、50μg/mLKan、100μg/mL Cm、0.1mol/L IPTG、20mg/mL X-gal）上30℃进行筛选培养。培养24h后随机挑取蓝色单菌落，接种Kan/Cm LB液体培养基（50μg/mL Kan和100μg/mL Cm），置于37℃摇床220r/min培养过夜。培养物按照Bacmid DNA的抽提方法提取BmBacmid DNA。分别以引物KO-1629F和KO-1629R、KO-1629F和P_HindIII进行PCR扩增鉴定重组的BmBacmid，进而做测序分析。如图9，KO-1629F和KO-1629R扩增BmBacmid DNA的PCR产物大小与orf1629基因打靶片段基本一致；KO-1629F和P_HindIII扩增产物大小约1.5kb，与预期大小相符，说明打靶成功。测序结果显示，重组BmBacmid的orf1629中敲除的序列和位置都与预期相符 （测序图略）。故复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid构建成功，含有RD-BmBacmid的DH10B细胞即为RD-BmDH10B菌。 

实施例4、复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid复制缺陷性的验证 

本发明中，以绿色荧光蛋白表达为例，但不限于此。 

1.绿色荧光蛋白AcGFP基因的转移载体构建 

参照申请号为201210037290.8专利中实施例4构建重组转移载体pFastBac HTB-AcGFP和pBacPAK8-AcGFP。利用Roche公司的Genopure Plasmid Midi Kit质粒纯化试剂盒分别抽提pFastBac HTB-AcGFP和pBacPAK8-AcGFP DNA。 

2.复制缺陷型BmNPV Bac-to-Bac系统的构建 

参照申请号为201210037290.8专利中实施例4，将转座辅助质粒pMON7124（由DH10Bac细胞分离获得）转化到实施例3步骤2中获得的RD-BmDH10B感受态细胞中，利用Cm/Tet LB固体培养基(100μg/mL Cm和10μg/mL Tet)平板筛选转化子，转化成功的菌种（即在含有氯霉素和四环素LB固体培养基平板上长出菌落）为RD-BmDH10Bac菌。将pFastBacHTB-AcGFP转化到RD-BmDH10Bac感受态细胞中，利用Cm/Tet/Gen/X-gal/IPTG LB固体培养基(100μg/mL Cm、10μg/mL Tet、7μg/mL Gen、0.1mol/L IPTG、20mg/mL X-gal)平板筛选转化子，随机挑取单个白斑接种Cm/Tet/Gen LB液体培养基（100μg/mL Cm、10μg/mL Tet和7μg/mL Gen）培养。参照申请号为201210037290.8专利中实施例4，利用PCR法鉴定重组的RD-BmBacmid。鉴定为阳性（即用M13正反向引物和AcGFP特异引物分别扩增后获得预期大小的DNA片段，具体操作参照Invitrogen公司Bac-to-Bac系统重组Bacmid的鉴定方法）的重组BmBacmid即是RD-BmBacmid-AcGFP。 

3.RD-BmBacmid复制缺陷性的验证 

利用Roche公司的Genopure Plasmid Midi Kit质粒纯化试剂盒分别抽提RD-BmBacmid（实施例3步骤2）和RD-BmBacmid-AcGFP（实施例4步骤2）。各取1μg的RD-BmBamcid和RD-BmBacmid-AcGFP，利用X-tremeGENE HP（3μL）按照使用说明分别转染单层培养的家蚕BmN细胞（1×10⁶个）。转染后，BmN细胞置入27℃细胞培养箱中培养24h，然后更换培养基（若非特别说明，BmN细胞均是在27℃细胞培养箱中以含10%胎牛血清的SF-900II SFM培养基培养）。转染120h后分别取细胞培养上清以1：100体积比转接BmN细胞，重复转接2轮。转染或转接后利用倒置相差显微镜和荧光显微镜观察细胞病变和绿色荧光情况，验证RD-BmBamcid和RD-BmBacmid-AcGFP是否具有复制缺陷性。实验结果发现，RD-BmBacmid单独转染的BmN细胞以及其培养上清连续转接3轮的BmN细胞均没有出现病变，表明 RD-BmBacmid确实无法产生感染性的BmNPV，如图10所示。 

RD-BmBacmid-AcGFP转染72h后有零星的BmN细胞呈分散状发出绿色荧光，但并没有细胞呈现出病变现象；而且，在转接后也没有观察到绿色荧光细胞，如图11。因而，进一步地佐证RD-BmBacmid是复制缺陷性的。 

实施例5：复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的应用 

1、复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可重组救活 

由于RD-BmBacmid是通过Cm^r表达盒插入BmBacmid使复制必需基因orf16293′端部分序列缺失进而失活而来，故可以通过同源重组修复缺失的序列而拯救产生重组病毒。pBacPAK8多克隆位点两侧的序列分别与BmNPV lef2和orf1629有部分序列同源，故可以用来同源重组修复RD-BmBacmid。 

取1μg实施例4步骤1中构建的pBacPAK8-AcGFP DNA与1μg的RD-BmBacmid共转染单层培养的家蚕BmN细胞（1×10⁶个）。转染24h后更换培养基。转染120h后取细胞培养上清以1：100体积比转接BmN细胞，转染或转接后利用荧光显微镜观察细胞病变和绿色荧光情况，验证RD-BmBamcid是否可重组救活。荧光观察发现，RD-BmBacmid与pBacPAK8-AcGFP共转染及其后的细胞培养上清转接的BmN细胞都能观察到细胞病变和绿色荧光（图12）。这些结果表明共转染产生了表达绿色荧光蛋白的重组病毒，故RD-BmBacmid可以通过同源重组救活。 

2、RD-BmBacmid构建重组病毒表达目的蛋白 

收集上述实施例5步骤1中RD-BmBacmid与pBacPAK8-AcGFP共转染后的细胞培养上清（含有重组病毒）转接BmN细胞作为样品，以上述实施例4步骤3中RD-BmBacmid单独转染后培养上清转接的BmN细胞作为对照，用常规Western Blotting方法检测GFP表达情况。简要地，将12%SDS-PAGE凝胶上分离的BmN细胞蛋白条带电转印至PVDF膜(购自Millipore公司)上，经封闭液即含5%脱脂奶粉的TBST(20mmol/L Tris-HCl，500mmol/L NaCl，0.1%Tween-20，pH7.4)孵育1h后，先后用Roche公司的Anti-GFP单抗(以封闭液1：2000体积比稀释)和Bio-Rad公司的HRP标记羊抗小鼠IgG(以封闭液1：3000体积比稀释)室温孵育各1h。最后，于膜上涂加反应底物Immun-Star HRP（购自Bio-Rad公司），封入保鲜膜中，于暗室压入X光片曝光。RD-BmBacmid与pBacPAK8-AcGFP共转染产生重组病毒表达绿色荧光蛋白，才能观察到大量荧光细胞。利用GFP单克隆抗体做免疫印迹，检测到与重组GFP预期大小30kD一致的特异性蛋白印迹（图13），表明共转染产生的重组病毒确实表达了重组GFP蛋白。 

至此，在实施例5中我们可以看出，利用本发明中所构建的RD-BmBacmid无需任何筛选步骤，可一步获得重组病毒，即在家蚕细胞中直接获得重组病毒DNA，从而得到重组病毒，省略了Bac-to-Bac系统重组子的筛选和Bacmid DNA的提取再转染家蚕细胞这两个步骤，也省略了筛选重组病毒这个步骤。而目前市面上所应用的其他家蚕杆状病毒表达系统要么是在大肠杆菌细胞中获得重组Bacmid DNA，然后筛选重组子、提取Bacmid DNA转染家蚕细胞，如Bac-to-Bac杆状病毒系统（Invitrogen公司）；要么在家蚕细胞中直接构建重组病毒DNA，但需要多步筛选才能获得所需的重组病毒，如线性化BmNPV构建重组病毒。 

最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 

<110> 浙江理工大学

 

<120> 复制缺陷型BmNPV载体的构建及应用

 

<160> 8

 

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>lef2基因片段上游引物

 

<400> 1

gtttcattta atgcaacttt atc               23

 

 

<210> 2

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>lef2基因片段下游引物

 

<400> 2

tgtatagtgt tggccggcct aataaaaaac aaatttgac                      39

 

 

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>orf1629基因片段的上游引物

 

<400> 3

caaatttgtt ttttattagg ccggccaaca ctatacattg ttattag                   47

 

 

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223>orf1629基因片段的下游引物

 

<400> 4

atgaattcac caccatcatc gatgtctg              28

 

 

<210> 5

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物BAC-F

 

<400> 5

ttgctgatat cggccggcct tttgctttgc cacggaacgg tctg              44

 

 

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物BAC-R

 

<400> 6

caggatcggc ctaggccggc cttgccgggt cccaggaaag gat                  43

 

 

<210> 7

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物KO-1629F

 

<400> 7

tagattctgt gcgttgttga tttacagaca attgttgtac gtattcctaa ggatgggaat                 60

tagccatggt cc                                                         72

 

 

<210> 8

<211> 68

<212> DNA

<213> 人工序列

 

<220>

<223> 引物KO-1629R

 

<400> 8

aaagacgctg aaaatcattt gattttcgct ctaacatacc accctaaggt gtaggctgga                   60

gctgcttc                                                                 68

 

 

Claims (5)

1.转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1）、pMD18-lef2-1629载体构建：

①、分别进行BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段的合成，

②、利用BmNPV lef2基因片段和orf1629基因片段重叠PCR合成lef2-1629片段；

③、构建pMD18-lef2-1629：

先对lef2-1629片段3'端加“A”，所得的加“A”后的PCR产物连接到T载体，得pMD18-lef2-1629；

2）、转移载体pMD18-lef2-BAC-1629的构建：

①、细菌人工染色体BAC片段的合成

以bMON14272DNA作为模板，利用KOD FX DNA聚合酶PCR扩增BAC片段，得BAC片段PCR产物；

②、BAC片段克隆到pMD18-lef2-1629：

先将pMD18-lef2-1629与BAC片段PCR产物分别用FseI进行单酶切反应；pMD18-lef2-1629酶切产物割胶回收后去磷酸化，再与酶切回收的BAC片段PCR产物用DNALigation Kit LONG试剂盒进行连接，连接产物转化HST08感受态细胞，得转移载体pMD18-lef2-BAC-1629。

2.复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，其特征是：首先构建家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid，再利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid；该复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid可以构建重组病毒表达目的蛋白。

3.根据权利要求2所述的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述家蚕杆状病毒穿梭载体BmBacmid的构建为：

取转移载体pMD18-lef2-BAC-1629DNA和四方形多角体BmNPV病毒DNA混匀后与X-tremeGENE HP转染试剂混合共转染单层家蚕BmN细胞；所得的病毒基因组DNA电转化ElectroMAX DH10B感受态细胞，涂布于Kan/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养24～48h；然后转印至Amp/IPTG/X-gal LB固体培养基上培养12h，随机挑取Kan抗性Amp敏感的蓝色单菌落接种Kan LB液体培养基（50μg/mL Kan），37℃摇床中220r/min振荡培养48h；得穿梭载体BmBacmid，含该穿梭载体BmBacmid的DH10B细胞标记为BmDH10B。

4.根据权利要求3所述的复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的构建方法，其特征是：

所述利用Red重组技术敲除病毒复制必需基因orf1629的部分序列，从而构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid包括以下步骤：

1）、orf1629基因打靶片段的制备

根据四方形多角体BmNPV病毒orf1629基因及pKD3质粒中氯霉素抗性基因表达盒序列设计引物；然后以pKD3质粒DNA作为模板，KOD FX DNA聚合酶进行扩增；PCR产物纯化后，得orf1629基因打靶片段；

2）、Red重组构建复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid：

以pKD46-RecA质粒转化BmDH10B感受态细胞，在Amp/Kan LB平板上筛选阳性克隆，得BmDH10B感受态细胞；

所述BmDH10B感受态细胞以orf1629基因打靶片段电转化后，进行筛选培养；得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid。

5.如权利要求2～4任一方法构建而得复制缺陷型BmNPV载体RD-BmBacmid的用途，其特征是：用于构建重组病毒表达目的蛋白。

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