CN109913515A

CN109913515A - 一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法

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Publication number: CN109913515A
Application number: CN201810396812.0A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 许勇; 占杨杨; 王欢; 石姣; 周梦林; 马昕; 李鑫
Original assignee: Hubei University
Current assignee: Hubei University
Priority date: 2018-04-28
Filing date: 2018-04-28
Publication date: 2019-06-21
Anticipated expiration: 2038-04-28
Also published as: CN109913515B

Abstract

本发明公开了一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ‑谷氨酸产量的方法。通过在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的三个关键基因ribE、ribF和ribH，分别构建了三株FAD强化合成的菌株。在不同的液体发酵条件下，ribE、ribF和ribH过表达使甘油代谢能力比对照菌株分别至少提高了22.02％，20.62％和23.92％，这些重组菌株的聚γ‑谷氨酸产量至少是对照菌株的1.20倍，1.18倍和1.27倍。由此表明，强化FAD合成可显著提高芽胞杆菌甘油代谢，增加聚γ‑谷氨酸合成。该方法能够提高甘油利用来增强目标产物的合成，在利用甘油为原料微生物发酵合成生物基化合物方面具有广泛的应用价值，为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。

Description

一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法

技术领域

本发明涉及基因工程和微生物学技术领域，具体涉及一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法。

背景技术

聚γ-谷氨酸是微生物发酵产生的具有多功能的高分子聚合物，由D-谷氨酸或L-谷氨酸单元通过γ-酰胺键连接而成的阴离子型化合物，具有良好的阳离子螯合、吸水保湿、无毒和可生物降解等特性，可作为药物载体、矿物营养强化剂、絮凝剂、保湿剂、肥料促进剂，用于医药、食品、水处理、化妆品及农业等领域。目前工业化生产聚γ-谷氨酸主要原料为高成本的葡萄糖和谷氨酸等，致使聚γ- 谷氨酸的生产成本较高，严重制约聚γ-谷氨酸相关产业链的快速发展，必须寻求廉价易得的替代性原料。粗甘油是廉价、可再生的生物废弃资源，是非常适合用于发酵生产聚γ-谷氨酸的替代原料。

芽胞杆菌属，包括地衣芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌能够利用甘油发酵合成聚γ-谷氨酸，目前利用甘油发酵聚γ-谷氨酸技术存在着发酵周期长(甘油代谢速度慢)及生产转化率低等问题，限制了甘油的利用。因此，提高甘油代谢速率是甘油作为原料发酵生产聚γ-谷氨酸的关键因素。黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)是微生物细胞内核黄素的活性型，作为某些氧化还原酶的辅基，广泛参与胞内多种氧化脱氢反应，同时可以作为电子传递链传递氢的作用。其氧化型和还原型分别简写为FAD和FADH₂。因此，胞内FAD合成和再生是生物催化和细胞代谢是非常重要的。在黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成是以三磷酸鸟苷和核酮糖5-磷酸为前体，通过嘧啶和蝶啶中间体合成反应生产的中间体，在三个关键酶洛马津合酶、二氧四氢蝶啶合酶和核黄素合酶和双功能核黄素激酶/FMN腺苷酰转移酶的催化下生成FAD，这三个酶分别由ribH、ribE 和ribF基因编码。黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径的强弱与甘油代谢速率及聚γ- 谷氨酸的产量之间的关系并无报道。

发明内容

本发明的目在于提供一种通过在芽胞杆菌中强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成加速甘油代谢，从而提高聚γ-谷氨酸产量的方法，此方法通过在芽胞杆菌中的基因组内强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的关键基因ribE、ribF 和ribH，FAD强化表达菌株甘油代谢速率比对照菌株提高，聚γ-谷氨酸产量比对照菌株提高，该研究结果表明强化表达FAD的合成是一种十分有效的提高微生物利用甘油的速率，提高聚γ-谷氨酸的方法，本研究为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。

本发明第一方面提供了提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，所述关键基因为ribE、ribF、ribH中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述基因ribH核苷酸序列如序列表SEQID NO:3所示。

优选的，所述在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因的步骤包括：

S1、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体构建：扩增关键基因ribE、ribF、ribH 中的一种、P43启动子和终止子TamyL，并将其重组到一起构成P43-ribH/ribE/ ribF–TamyL，与载体连接得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ ribF；

S2、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达菌株构建：将表达载体pHY-ribH/ribE/ribF 转入芽胞杆菌，以四环青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，PCR 验证筛选得到过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌。

优选的，所述芽胞杆菌为地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)WX-02，该菌于2008年4月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏中心地址：中国. 武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M208065。

更加优选的，步骤S1中，将P43-ribH/ribE/ribF–TamyL与质粒载体连接，转化DH5α，采用验证引物对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体 pHY-ribH/ribE/ribF。

更加优选的，还包括步骤S3：将过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌进行种子培养、液体发酵；所述液体发酵培养基配方为：10-120g/L甘油；8-30 g/L二水和柠檬酸三钠；0-25g/LNaNO₃；6-20g/L NH₄Cl；0.2-2g/L K₂HPO₄·3H₂O； 0.2-2g/L MgSO₄·7H₂O；0.2-2g/L ZnSO₄·7H₂0；0.2-2g/L CaCl₂；0.1-1.0g/L MnSO₄·H₂O，pH 5.5～8.0；所述液体发酵条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为8％-40％，摇床转速150-240r/min，发酵周期36-96h。

进一步优选的，所述种子培养基为LB培养基，配方为：10g/L蛋白胨；5g/L 酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；所述种子培养条件为：培养温度为37℃，装液量为20％，摇床转速230r/min，培养时间为10h。

本发明第二方面提供了一种聚γ-谷氨酸产量提高的重组芽胞杆菌，所述重组芽胞杆菌是通过在地衣芽胞杆菌中强化表达基因ribE或基因ribF或基因ribH而得到的。

本发明的有益效果为：

本方法采用分子生物学技术，通过在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成途径中的三个关键基因ribE、ribF和ribH，分别构建了三株FAD 强化合成的菌株。在不同的液体发酵条件下，ribE、ribF和ribH过表达使甘油代谢能力比对照菌株分别至少提高了22.02％，20.62％和23.92％，这些重组菌株的聚γ-谷氨酸产量至少是对照菌株的1.20倍，1.18倍和1.27倍。由此表明，强化黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成可以显著提高芽胞杆菌甘油代谢，并增加聚γ-谷氨酸合成。该方法能够提高甘油利用来增强目标产物的合成，在利用甘油为原料微生物发酵合成生物基化合物方面具有广泛的应用价值。本发明提供的一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高地衣芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为实施例1中步骤1和2得到的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000 bp，800bp，500bp，300bp)，泳道2、3、4分为ribE、ribF、ribH基因片段，泳道5、6分为P43启动子、淀粉酶终止子片段；

图2为实施例1中步骤3得到的目的表达元件的琼脂糖凝胶图；其中，泳道 1为DNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000 bp，800bp，500bp，300bp)，泳道2、3、4分为ribE、ribF、ribH表达元件；

图3为实施例1中步骤6得到的表达载体电转PCR验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp， 1500bp，1000bp，800bp，500bp，300bp)，泳道2、3、4分为表达载体pHY-ribE、 pHY-ribF、pHY-ribH电转入地衣芽胞杆菌WX-02PCR验证的琼脂糖凝胶图，所用引物为pHY-F/pHY-R。

具体实施方式

本发明的几个实施例按如下技术路线实施：

1、FAD强化表达载体的构建

以地衣芽胞杆菌中二氧四氢蝶啶合酶编码ribH表达载体的构建方法为例。根据地衣芽胞杆菌WX-02中基因组中的ribH和淀粉酶终止子TamyL序列，设计引物，引物分别为ribH-F/ribH-R和Tamy-F/Tamy-R，根据枯草芽胞杆菌168 基因组中P43启动子序列设计引物，引物为P43-F/P43-R。采用PCR的方法分别扩增出ribH,P43和终止子TamyL；并通过SOE的方法将ribH,P43和TamyL 连到一起，构成P43-ribH-TamyL，随后用Xba1和BamHI双酶切P43-ribH-TamyL 片段，并与经相同内切酶酶切后的T2(ori)质粒连接，转化DH5α。采用验证引物pHY-F/pHY-R对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到ribH的表达载体。采用同样的方法构建了地衣芽胞杆菌WX-02中ribE和ribF的表达载体。

2、地衣芽胞杆菌FAD强化合成菌株的构建

以ribH过表达菌株构建方法为例，首先制备地衣芽胞杆菌的感受态细胞，在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5mL LB的PA瓶中，37℃过夜培养，随后以5％的接种量转接至生长培养基中，37℃，200rpm培养至OD600到0.85左右，5500rpm离心6min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500rpm离心6min，重复三次后加入1mL洗涤培养基重悬菌体，分装至灭过菌的1.5mL EP管中， -80℃保存。

将表达质粒pHY-ribH转入地衣芽胞杆菌WX-02中，以四环青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子；PCR验证筛选得到过表达ribH基因的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-ribH。采用同样的方法构建了游离表达空质粒PHY300，ribE 和ribF的过表达菌株，分别为WX-02/pHY300，WX-02/pHY-ribE和 WX-02/pHY-ribE。

3、地衣芽胞杆菌液体发酵条件下甘油含量的测定和聚γ-谷氨酸含量测定

以地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-ribH的液体发酵为例。在平板上活化野生菌及其缺失株，挑菌接至含有50mL液体LB的250mL三角瓶中，37℃，230rpm 培养10h，随后以3％的接种量接种至聚γ-谷氨酸发酵培养基中。

所述聚γ-谷氨酸发酵培养基：60-80g/L甘油，8-20g/L柠檬酸酸钠，5-20g/LNaNO₃，4-12g/L氯化铵，0.2-0.8g/L K₂HPO₄·3H₂O，0.2-0.8g/L MgSO₄·7H₂O， 0.2-0.8g/LZnSO₄·7H₂O，0.2-0.8g/L CaCl₂，0.04-0.1g/L MnSO₄·H₂O，pH 5.5-8.0。

聚γ-谷氨酸发酵条件：发酵温度为37℃，装液量为20％，

摇床转速230r/min，发酵周期48h。

待发酵结束后测定发酵液残留的甘油浓度和聚γ-谷氨酸含量。

所述甘油浓度测定方法如下：使用Agilent 1260液相色谱仪-蒸发光检测器(ELSD)检测；HPLC-ELSD检测条件：色谱柱Inertsil NH₂(250mm×4.6mm， 5μm)，流动相为80％乙腈；流速为1mL/min；洗脱15min；柱温30℃；蒸发光检测器(ELSD)参数：N₂流量1.6L/min，漂移管温度50℃。根据甘油标准品制作的标准曲线计算出发酵液中甘油的含量。

所述聚γ-谷氨酸测定方法如下：发酵液前处理：利用去离子水将发酵液稀释30倍，离心除菌体，再经0.22μm水相滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱检测。凝胶渗透色谱检测条件为：采用TSK Gel G6000PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长 220nm，进样量10μL，流动相为25mM的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比8:1，流速0.5mL/min。根据聚γ-谷氨酸的标准品制作的标准曲线计算出发酵液中聚γ-谷氨酸的含量。

下面结合具体实施案例，进一步阐述本发明。这些实施案例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施案例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。

实施例1

地衣芽胞杆菌FAD强化合成过表达质粒的构建

1、根据地衣芽胞杆菌WX-02基因组DNA序列中的ribE，ribF和ribH基因的基因序列，设计ribE，ribF和ribH基因的引物ribE-F/R，ribF-F/R和ribH-F/R；并以地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板，分别以ribE，ribF和ribH基因引物进行PCR扩增得到ribE(648bp)，ribF(960bp)和ribH(464bp)基因片段。

其中，ribE-F和ribE-R的序列为：

ribE-F：TAAGAGAGGAATGTACACATGAAGACGATACATATTTC、

ribE-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTCTAGATTCCGGCCGGCTTC；

其中，ribF-F和ribF-R的序列为：

ribF-F：TAAGAGAGGAATGTACACATGAAGACGATACATATTTC

ribF-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTCTAGATTCCGGCCGGCTTC.

ribH-F和ribH-R的序列为：

ribH-F：TAAGAGAGGAATGTACACATGAATAAAATAGAAGGTC

ribH-R：TCCGTCCTCTCTGCTCTTTTATTGAAGCGACCGGGT.

2、分别以枯草芽胞杆菌168和地衣芽胞杆菌WX-02的基因组DNA为模板， PCR分别扩增得到P43启动子(所用引物为P43-F和P43-R)和淀粉酶终止子(所用引物为TamyL-F和TamyL-R)。

其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：

P43-F：GACAGCAGCCCGCAAGTTTTCTGAACCGTCTGGATG、

P43-R：CATGAAATTGGAAATTCCGCGACTTCGGCTTTATTCTTTT、

TamyL-F：GACGGTATCGCGGGTGATCTCATTTGATGCCATTCTCG、

TamyL-R：ATCGTATTCCACGCTTTC；

上述步骤1和2所述PCR扩增反应体系、条件分别为：

扩增反应体系均为：5×Fastpfu Buffer 10uL、dNTPs(2mM)5uL、primer F 1uL、primer R 1uL、模板DNA 1uL、Fastpfu酶1uL，ddH₂O，所添加的ddH₂O使得溶液补至50uL；

扩增反应条件均为：95℃ 5min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃延伸X min (X值根据具体片段大小而定，一般1kbp片段延伸1min)，30个循环；72℃ 10 min，4℃ 10min。

PCR反应结束后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，图1为实施例1中步骤1 和2得到的基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，800bp，500bp，300bp)，泳道2、3、4分为ribE、ribF、ribH基因片段，泳道5、6分为P43启动子、淀粉酶终止子片段；

3、步骤1和2中得到的将启动子、目的基因和终止子通过SOE-PCR连到一起(所用引物为P43-F和TamyL-R)，构成完整的ribE，ribF和ribH表达元件 (1449bp)；

所述方法中PCR扩增反应体系、条件分别为：

扩增反应体系均为：5×Fastpfu Buffer 10uL、dNTPs(2mM)5uL、primer F 1uL、primer R 1uL启动子、1uL目的基因、1uL终止子、1uL、Fastpfu酶 1uL，ddH₂O，所添加的ddH₂O使得溶液补至50uL；

扩增反应条件均为：95℃ 5min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃延伸1.5min，6个循环；72℃ 10min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃延伸1.5min，30个循环； 72℃ 10min，4℃ 10min。

PCR反应结束后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，图2为实施例1中步骤3 得到的目的表达元件的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，800bp，500bp，300bp)，泳道2、3、4分为ribE、ribF、ribH表达元件。

4、采用XbaI和EcoRI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段(1443bp)；酶切体系为片段80uL，10×M Buffer 10uL，EcoR I 5uL， Xba I 5uL)；混匀后分成20uL一管，37℃酶切3h。

5、准备质粒pHY-300PLK，并按上述酶切条件同样采用XbaI和EcoRI限制性内切酶对质粒pHY-300PLK进行双酶切得到线性质粒片段(4870bp)；其中，所述的限制性内切酶XbaI和EcoRI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

6、将步骤4得到的酶切基因片段和步骤5得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，酶连温度为16℃，时间为8h，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有100ug/mL氨苄抗生素的LB平板进行筛选，具有氨苄抗性的即为阳性转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：pHY-F和pHY-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1701bp，处出现电泳条带，说明ribE，ribF和ribH过表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：表达载体pHY-ribE，pHY-ribF和pHY-ribH)。

其中，菌落PCR验证引物pHY-F和pHY-R序列为：

pHY-F：GTTTATTATCCATACCCTTAC

pHY-R：CAGATTTCGTGATGCTTGTC

上述菌落PCR扩增反应体系均为：10×easyTaq Buffer 2.5uL、dNTPs(2 mM)2.5uL、primer F 1uL、primer R 1uL、单菌落菌液1uL、easyTaq 0.3 uL，ddH2O，所添加的ddH2O使得溶液补至25uL；

扩增反应条件均为：95℃ 15min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃延伸1.5min， 30个循环；72℃ 10min，4℃ 10min。

实施例2

地衣芽胞杆菌FAD强化表达菌株的构建

将表达载体pHY-ribE，pHY-ribF和pHY-ribH分别转入地衣芽胞杆菌WX-02 中(该菌保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO： M208065)，具体为：

首先制备地衣芽胞杆菌WX-02感受态，在平板上活化菌种，然后挑菌至含有5～10mL LB的PA瓶中，30～37℃过夜培养，随后以3～5％的接种量转接至生长培养基中，30～37℃，180～200rpm培养至OD₆₀₀到0.80～0.90，5500～7000rpm 离心6～8min收集菌体，用洗涤培养基重悬菌体，5500～7000rpm离心6～8min，重复三次后加入0.8～1mL洗涤培养基重悬菌体，分装至灭过菌的1.5mL EP管中，每管分装80～100uL，-80℃保存。

再将吹干后的电转杯在冰上预冷10～15min，然后将80～100uL的地衣芽胞杆菌BL10感受态细胞与5～10uL重组载体(分别为pHY-ribE，pHY-ribF和 pHY-ribH)混匀后加入电转杯中，冰上预冷3～5min后，2.1～2.4kV条件下点击，电击时间4.8-5.2ms，随后立即加入500～800uL恢复培养基并转移至1.5mL EP 管中。30～37℃，100～110rpm培养3h后涂含20ug/mL四环抗生素LB平板。

将具有四环抗性的转化子挑至相同的抗性平板上进行扩大培养，37℃静置培养6h后即可长出，随后将若干转化子分别挑部分至1.5mL EP管(加有30uL 的ddH₂O)中，沸水浴煮菌10min，然后12000rpm离心2min，上清液作为菌落PCR验证模板待用。

配置菌落PCR体系：ddH₂O 7.7uL，dNTPs 5uL，10×EasyTaq Buffer 5uL， pHY-F1uL，pHY-R 1uL，模板10uL，EasyTaq酶1uL；菌落PCR反应条件为： 95℃ 5min，95℃ 30s，55℃ 30s，72℃延伸1.5min(片段大小1701bp左右)， 30个循环；72℃ 10min，4℃ 10min。

菌落PCR反应结束后进行0.8％琼脂糖凝胶电泳检测，如图3所示，泳道1 为5k DNAmarker(从上到下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000 bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。泳道2～3为不同转化子菌落PCR验证结果条带(1448bp、1760bp和1264bp)，由图可知，成功获得含重组载体的地衣芽胞杆菌并分别命名为WX-02/pHY-ribE，WX-02/pHY-ribF和 WX-02/pHY-ribH)。

实施例3

强化黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成对甘油代谢以及聚γ-谷氨酸产量的影响

本发明人根据上述FAD强化合成的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-ribE、 WX-02/pHY-ribF和WX-02/pHY-ribH在不同发酵培养基中对甘油代谢和聚γ-谷氨酸合成的影响的研究提供了10种实施案例，并在表1中分别列举了实验组1- 实验组10中的发酵培养基的配方。

表1实验组1-实验组10采用发酵培养基的配方表

菌株：WX-02、WX-02/pHY-ribE、WX-02/pHY-ribF和WX-02/pHY-ribH。

种子液准备：在平板上活化野生菌及其缺失株，挑菌接至装液量为20％的液体LB三角瓶中，37℃，230rpm培养10h。

种子液：10g/L蛋白胨，5g/L酵母浸粉，10g/L氯化钠pH7.2-7.4 250 mL三角瓶装液量为50mL。

将准备好的种子液以1％的接种量接种至发酵培养基中(表1)，聚γ-谷氨酸发酵条件为发酵温度为37℃，装液量为20％，摇床转速230r/min，发酵周期 48h。待发酵结束后测定发酵液残留的甘油浓度和聚γ-谷氨酸含量。

所述甘油浓度测定方法如下：使用Agilent 1260液相色谱仪-蒸发光检测器(ELSD)检测；HPLC-ELSD检测条件：色谱柱Inertsil NH₂(250mm×4.6mm， 5μm)，流动相为80％乙腈；流速为1mL/min；洗脱15min；柱温30℃；蒸发光检测器(ELSD)参数：N₂流量1.6L/min，漂移管温度50℃。根据甘油标准品制作的标准曲线计算出发酵液中甘油的含量(如表2-表4所示)。

所述聚γ-谷氨酸测定方法如下：

发酵液前处理：利用去离子水将发酵液稀释30倍，离心除菌体，再经0.22μm 水相滤膜过滤后进行凝胶渗透色谱检测。凝胶渗透色谱检测条件为：采用TSK Gel G6000PWXL凝胶渗透色谱柱，检测波长220nm，进样量10μL，流动相为 25mM的无水硫酸钠和乙腈的混合液，体积比8:1，流速0.5mL/min。根据聚γ- 谷氨酸的标准品制作的标准曲线计算出发酵液中聚γ-谷氨酸的含量(如表2-表4 所示)

如表2-表4可知，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌WX-02/pHY-300来说，采用本发明的强化FAD合成三个关键基因ribE、ribF和ribH，其相应的工程菌在聚γ-谷氨酸生产发酵的菌液中聚γ-谷氨酸的产量分别比对照菌株至少提高了20.33％、17.46和26.64％，同时显著提高了甘油的消耗速率，其甘油消耗量比对照菌株分别至少提高了22.02％、20.62％和23.92％。结果表明强化地衣芽胞杆菌黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)合成可以显著提高地衣芽胞杆菌甘油代谢，增加聚γ-谷氨酸合成。该方法能够提高甘油利用来增强目标产物的合成，在利用甘油为原料微生物发酵合成生物基化合物方面具有广泛的应用价值。本发明提供了一种通过强化黄素腺嘌呤二核苷酸的合成提高地衣芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，为微生物高效利用甘油合成生物基化学品提供了一种新策略。

表2WX-02/pHY-ribE和对照菌的甘油消耗量和聚γ-谷氨酸产量对比

表3WX-02/pHY-ribF和对照菌的甘油消耗量和聚γ-谷氨酸产量对比

表4WX-02/pHY-ribH和对照菌的甘油消耗量和聚γ-谷氨酸产量对比

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 湖北大学

<120> 一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法

<141> 2018-04-27

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 648

<212> DNA

<213> Bacillus lichenifomis WX-02

<400> 1

atgtttacag gcatcattga agaagtcgga acgattttgg acatgaaaaa ggcgggaagc 60

gccatgtctt tagtcattca atccaacaaa gtgatcgaag atgtgaagct cggcgacagc 120

attgctgtca acggagtctg cctgaccgta aatgagttcg gttccagcag tttcacggcg 180

gatgtcatgc ttgaaacgct gaaagcaaca tcactcggca cattgaaaaa aggaagccgc 240

gtcaatcttg aacgggcgat ggcggcaaac ggccgcttcg gcgggcatat ggtttcgggg 300

catgtcgacg gcactgcatc gatcgttcgc atagaaaaag cggcaaacac cgtatactat 360

gatttaaaac ttgacccttc actggccaaa atgcttgtgt taaaaggttc gatcgccgta 420

gacggcgtca gcctcaccat attcggactg acggaggatc aggtaacagt ctcgcttatc 480

ccgcacacat tggatgaaac gatttttcct gcaaaaaagg tcggaagcat cgtcaacatc 540

gagtgcgata tgatcggcaa atacatttac cgctttctcc accaaacaaa acaagaaaaa 600

caggcacagg cattgactga agcattcttt aaagaaaacg ggttttaa 648

<210> 2

<211> 960

<212> DNA

<213> Bacillus lichenifomis WX-02

<400> 2

atgaagacga tacatatttc ccacccacac gacttgaagc gtgaggattt tccgacatca 60

gttatggcat taggttattt tgacggtgtt cacctgggac atcagcaagt gattcttaca 120

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caggatcaaa aggtaagctc cacgaggatc cgcagcgttc tgggagccgg tgacgtcgag 540

tacgctgctg aactgctcgg caggccgtac catgtgaaag gctttgtgat ccacggcgat 600

aaaagaggcc gcacgatcgg atttccgacc gcgaatatcg gccttaaaga cacatacatc 660

gtcccgccga caggtgtgta cgccgttaaa gccgaaatcg gcggcgctgt ctacaacggc 720

gtctgcaatg tcggatacaa gccgacgttt tacgaaaaac ggccgggtca gccttcaatc 780

gaagtcaact tattcgattt tgaccgtgac atatacggct ccgaaatcaa ggttgaatgg 840

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tctagagaca aagaagaagc gatccgcttc ttcagagagc ggaagccggc cggaatctag 960

<210> 3

<211> 464

<212> DNA

<213> Bacillus lichenifomis WX-02

<400> 3

atgaataaaa tagaaggtca tgtaattgga acagatttga aaattgggat cgttgtgtca 60

aggttcaacg attttattac aagcaaactt ctaagcggcg cagaagacac gctgttgaga 120

catggggtca aagctgatga tattgatgtc gcctgggttc ccggcgcttt cgaaattccg 180

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ttatcagagg agcgacaagc cactatgact atgtctgcaa tgaagcggct aaggggattg 300

cagcgagcag catgtcaaca ggcgttccgg tgatcttcgg cgtattgacg acagacacga 360

tcgagcaggc ggtcgaacgc gccggaacaa aagccggaaa taaaggtgca gaagctgccg 420

cggcagcgat tgaaatggcg aacctgaccc ggtcgcttca ataa 464

Claims

1.一种提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤包括：在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因，所述关键基因为ribE、ribF、ribH中的一种，所述基因ribE核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，所述基因ribF核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示，所述基因ribH核苷酸序列如序列表SEQ IDNO:3所示。

2.根据权利要求1所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述在芽胞杆菌中强化表达黄素腺嘌呤二核苷酸合成途径中的关键基因的步骤包括：

S1、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体构建：扩增关键基因ribE、ribF、ribH中的一种、P43启动子和终止子TamyL，并将其重组到一起构成P43-ribH/ribE/ribF–TamyL，与载体连接得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ribF；

S2、黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达菌株构建：将表达载体pHY-ribH/ribE/ribF转入芽胞杆菌，以四环青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，PCR验证筛选得到过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌。

3.根据权利要求1所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述芽胞杆菌为产聚γ-谷氨酸的地衣芽胞杆菌WX-02，该菌保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M208065。

4.根据权利要求2所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：步骤S1中，将P43-ribH/ribE/ribF–TamyL与质粒载体连接，转化DH5α，采用验证引物对转化子进行菌落PCR验证，并对阳性转化子克隆抽质粒进行双酶切和测序验证，最终得到黄素腺嘌呤二核苷酸强化表达载体pHY-ribH/ribE/ribF。

5.根据权利要求2所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：还包括步骤S3：将过表达ribH、ribE、ribF中一种的芽胞杆菌进行种子培养、液体发酵；所述液体发酵培养基配方为：10-120g/L甘油；8-30g/L二水合柠檬酸三钠；0-25g/LNaNO₃；6-20g/L NH₄Cl；0.2-2g/L K₂HPO₄·3H₂O；0.2-2g/L MgSO₄·7H₂O；0.2-2g/L ZnSO₄·7H₂0；0.2-2g/L CaCl₂；0.1-1.0g/L MnSO₄·H₂O，pH 5.5～8.0；所述液体发酵条件为：发酵温度为30-40℃，装液量为8％-40％，摇床转速150-240r/min，发酵周期36-96h。

6.根据权利要求5所述的提高芽胞杆菌甘油代谢增加聚γ-谷氨酸产量的方法，其特征在于：所述种子培养基为LB培养基，配方为：10g/L蛋白胨；5g/L酵母浸出粉；10g/L氯化钠；pH 7.0-7.2；固体培养基加琼脂18g/L；所述种子培养条件为：培养温度为37℃，装液量为20％，摇床转速230r/min，培养时间为10h。

7.一种聚γ-谷氨酸产量提高的重组芽胞杆菌，其特征在于：所述重组芽胞杆菌是通过在地衣芽胞杆菌中强化表达基因ribE或基因ribF或基因ribH而得到的。