CN108559708B - 强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，本发明通过基因工程的方法通过在地衣芽孢杆菌的基因组内插入氨基酸通透酶YvbW基因，得到地衣芽孢杆菌DW2‑yvbW，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了13％以上。

Description

强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用
技术领域
本发明属于基因工程菌改造技术领域，尤其是一种强化氨基酸通透酶YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法及所得菌株的应用。
背景技术
地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性(GRAS)的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中。鉴于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、工业应用价值高等特点，其在近年来被广泛用来研究。地衣芽胞杆菌属革兰氏阳性菌，其主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等生物化工产品。
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)，D-苯丙氨酸(D-Phe)，异亮组氨酸(His),D-天冬氨酸(D-Asp),天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys),D-谷氨酸(D-Glu)，半胱氨酸(Cys)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)11种氨基酸。杆菌肽又名枯草菌素，其可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素(如青霉素、庆大霉素等)具有协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。
YvbW为芽胞杆菌中的一种氨基酸通透酶，在氨基酸的转运过程中发挥着重要作用。然而，目前的研究并没有解析出YvbW的具体调控机理，并且，关于YvbW具体会影响哪些氨基酸的转运以及YvbW是负责目标氨基酸的转入还是转出均不清楚，再加上，细胞内的氨基酸具有严格、且复杂的调控机制。因此，YvbW是否会影响杆菌肽的产量以及YvbW的表达水平与杆菌肽产量之间的关系均是不可预知的。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)的制备方法，此制备方法通过在地衣芽孢杆菌的基因组内插入氨基酸通透酶YvbW基因(即yvbW基因)，达到了提高杆菌肽产量的目的。
一种强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因片段，再在yvbW基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yvbW表达元件；
(2)同时，以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因的上游同源臂和yvbW基因的下游同源臂；
(3)通过重叠延伸PCR将yvbW基因的上游同源臂、yvbW表达元件和yvbW基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yvbW基因的上游同源臂-yvbW表达元件-yvbW基因的下游同源臂；
(4)采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
(5)准备质粒T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(6)将步骤(4)得到的酶切基因片段和步骤(5)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-yvbW；
(7)将整合质粒T2(2)-yvbW转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yvbW基因的上游同源臂或yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(8)挑选yvbW基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yvbW基因的地衣芽孢杆菌DW2-yvbW(简称：Bacilluslicheniformis DW2-yvbW)；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的yvbW基因为SEQUENCE LISTING中所示。
本发明人首次尝试构建强化yvbW基因表达的地衣芽孢杆菌DW2-yvbW，得到了提高地衣芽胞杆菌DW2的杆菌肽产量的技术效果，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌DW2–yvbW的杆菌肽产量提高了13％以上。本发明的研究结果表明：强化表达氨基酸转运蛋白基因yvbW是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法。
本发明的另一目的在于根据上述强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法构建得到的地衣芽孢杆菌DW2-yvbW在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。
附图说明
图1为步骤(1)得到的yvbW基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为yvbW基因片段；
图2为步骤(1)得到的yvbW表达元件和步骤(2)得到的yvbW基因的上游同源臂、下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为yvbW基因的上游同源臂，泳道3为yvbW表达元件，泳道4为yvbW基因的下游同源臂；
图3为步骤(7)的整合表达载体T2(2)-yvbW进行菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA marker，泳道2为整合表达载体T2(2)-yvbW的菌落PCR验证条带；
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
具体实施方式
一种强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因片段，再在yvbW基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yvbW表达元件；
(2)同时，以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因的上游同源臂和yvbW基因的下游同源臂；
(3)通过重叠延伸PCR将yvbW基因的上游同源臂、yvbW表达元件和yvbW基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yvbW基因的上游同源臂-yvbW表达元件-yvbW基因的下游同源臂；
(4)采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
(5)准备质粒T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(6)将步骤(4)得到的酶切基因片段和步骤(5)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-yvbW；
(7)将整合质粒T2(2)-yvbW转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yvbW基因的上游同源臂或yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(8)挑选yvbW基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yvbW基因的地衣芽孢杆菌DW2-yvbW(简称：Bacilluslicheniformis DW2-yvbW)；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的yvbW基因为SEQUENCE LISTING中所示。
一种强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法的具体操作步骤为：
1、步骤(1)的具体操作步骤为：
根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的yvbW基因的基因序列，设计yvbW基因的上游引物(yvbW-F)和下游引物(yvbW-R)；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以yvbW基因的上游引物、下游引物进行PCR扩增得到yvbW基因片段(1368bp，如图1所示)；
其中，yvbW-F和yvbW-R的序列为：
yvbW-F：AGGTAAGAGAGGAATGTACACATGGAGAAAGACATGCAGAA
yvbW-R：GAAATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTAAGAAGCGGACGTTTGGC；
再以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增得到P43启动子(所用引物为P43-F和P43-R)和淀粉酶终止子(所用引物为TamyL-F和TamyL-R)，随后将P43启动子、yvbW基因片段和淀粉酶终止子通过SOE-PCR连到一起(所用引物为P43-F和TamyL-R)，得到yvbW基因片段上游连接有P43启动子、同时下游连接有淀粉酶终止子的基因片段，此基因片段即为完整的yvbW表达元件(1950bp，如图2所示)；
其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：
P43-F：GACAGCAGCCCGCAAGTTTTCTGAACCGTCTGGATG
P43-R：TTCTGCATGTCTTTCTCCATGTGTACATTCCTCTCTTACCT
TamyL-F：CGGCCAAACGTCCGCTTCTTAAAAGAGCAGAGAGGACGGATT
TamyL-R：GCACATCGGTCAGAACAGAATAATCGTATTCCACGCTTTC
2、步骤(2)的具体操作步骤为：
根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的yvbW基因的上、下游序列，设计yvbW基因的上游同源臂引物(A-F和A-R)、下游同源臂引物(B-F和B-R)；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以yvbW基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到yvbW基因的上游同源臂(584bp，如图2所示)和yvbW基因的下游同源臂(536bp，如图2所示)；
其中，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：
A-F：CGGGATCCCAGACACTTTTTCAAGGATGAGCGG、
A-R：CATCCAGACGGTTCAGAAAACTTGCGGGCTGCTGTC、
B-F：GAAAGCGTGGAATACGATTATTCTGTTCTGACCGATGTGC、
B-R：GCTCTAGATGTCCAATCGGTCTCAGCAGCCTTT；
3、步骤(3)的具体操作步骤为：
通过重叠延伸PCR将yvbW基因的上游同源臂、yvbW表达元件和yvbW基因的下游同源臂连接到一起(所用引物为A-F和B-R)，构成目的基因片段(3070bp)，该目的基因片段的排列顺序为：yvbW基因的上游同源臂-yvbW表达元件-yvbW基因的下游同源臂；
4、步骤(4)的具体操作步骤为：
采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段(3068bp)；
5、步骤(5)的具体操作步骤为：
准备质粒T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori(其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441)进行双酶切得到线性质粒片段(4250bp)；其中，所述的限制性内切酶BamHI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
6、步骤(6)的具体操作步骤为：
将步骤(4)得到的酶切基因片段和步骤(5)得到的线性质粒片段经DNA连接酶(市售的DNA连接酶均可，通常为T4DNA连接酶)进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在3220bp处出现电泳条带，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：整合表达载体T2(2)-yvbW，如图3所示)；
7、步骤(7)的具体操作步骤为：
将整合表达载体T2(2)-yvbW转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在3220bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体T2(2)-yvbW成功转入地衣芽孢杆菌DW2中，此时，该转化子为阳性转化子(即转入了整合表达载体T2(2)-yvbW的地衣芽孢杆菌DW2)；
8、步骤(8)的具体操作步骤为：
将步骤(7)得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和YvbW-KYR为引物(或以T2-R与YvbW-KYF为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1348bp或3698bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，YvbW-KYF和YvbW-KYR的序列为:
YvbW-KYF：TCCGATGCACATCAGGTTTGCAA、
YvbW-KYR：CGGCTGCCCCGTGCCGTTTCT；
9、步骤(9)的具体操作步骤为：
将步骤(8)得到的PCR检测出现1348bp条带的单交换菌株和步骤(9)得到的PCR检测出现3698bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为YvbW-KYF和YvbW-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在1358bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌DW2；在3308bp处出现电泳条带时，说明yvbW基因成功整合到地衣芽孢杆菌DW2的基因组上，该转化子为阳性转化子。本发明的转化子的菌落PCR验证结果为：在3308bp处出现电泳条带，证明该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的yvbW整合菌株(即地衣芽胞杆菌DW2-yvbW)。
本发明人根据上述地衣芽胞杆菌DW2-yvbW在抗菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
其中，上述实施例中均采用本发明专利方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-yvbW菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵的培养基(实施例1-14中的种子发酵的培养基均为液体培养基，若需要种子发酵培养基为固体培养基时，仅需在原有的种子发酵的培养基(即液体培养基)的配方的基础上加琼脂15～18g/L即可)后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。
本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为A:B＝35:65(A相：100mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300mL水中混合均匀；B相：520mL甲醇与40mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；紫外检测器波长：254nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量(见表2)。
表2
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2-yvbW的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升(提高13％以上)，说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法及所得菌株及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 1368
<212> DNA
<213> 地衣芽胞杆菌DW2(Bacillus licheniformis)
<400> 2
atggagaaag acatgcagaa gctcgagcgc acaatgacat cgcggcatat tatgatgatg 60
gcattgggcg gagccattgg agcaggatta tttaaaggaa gcagcaaagc gatcgatttg 120
gcggggcctt cggtcatgat cgcctacttg atcggcggcg tgattttgct gtttatcatg 180
caggggcttg ccgagatggc tgtccgaaac agtgaagcca gaacattcag ggatcttgtt 240
caatcaatat tagggccgta tgccgcttat tttttagact ggatatactg gaaaatgtgg 300
gttctcaata ttgcggcaga ggctgttgtc gccgcgatat ttttgcagta ctggctgccg 360
gggctgccga tctgggtgct ggcgctgttc gtttcactcg tcattacgag cgtgaatttg 420
ctttctgtca aaagctttgc cgagacggaa tactggcttg cccttattaa aatcacagtg 480
attgtcgtct ttattatatc cggatttatc ttgttatttt tctcttttgg acaacactca 540
gctgttggtt ttactcattt gacagaccat ggcggcttct tcccgaatgg cgccggaggg 600
ctgattacag ccatgctagt tgtgatctat tcctatggcg gaaccgaaat tatcggggtg 660
acactggcgg aaaccaaaaa ccctgagaag gtcgtgccta aagccgtgcg tggaacgttg 720
acgcgcatta ttgcttttta tcttctgccg tttttcgtga tcgtcagctt gattccatgg 780
aatcaagtca acggtgtgtc ggagagtcct tttgttatgg tctttaagat gatcggcatt 840
cccggagcgg atcatttgat gaatgcggtc attttactgg cggtcatttc ttcgatgaac 900
tcagggcttt acggcgcctc ccgaataatg tatacacagg catcagacgg aagaatgccg 960
aaaatctttt cgagactttc cgtgagaaaa gtgccggttt attcgattct attatgtact 1020
tctttcttat acttgggcgt attgttttca ctgtttgccg gcagccaaac gtttgaatat 1080
ttgatggggt ctctcggcta taccgtcctt gtgatctgga tgctgattgc cgctgcccat 1140
ttaaaatcga ggaaacggaa tcaaacagcg gggaacggct actatgtcaa atggttccct 1200
tatacgactt ggctggcaat catttcactg acagcgatac tgatcggtgt catcctgacc 1260
acatcgattg tcattacatt ggtgacggcg ggaatctatc tgctcattag cgctgcttat 1320
ttctttaaag gaaggaacca gacagccggc caaacgtccg cttcttaa 1368

Claims (3)

1.强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，所述的强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法，包括以下步骤：
(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因片段，再在yvbW基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yvbW表达元件；
(2)同时，以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yvbW基因的上游同源臂和yvbW基因的下游同源臂；
(3)通过重叠延伸PCR将yvbW基因的上游同源臂、yvbW表达元件和yvbW基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yvbW基因的上游同源臂-yvbW表达元件-yvbW基因的下游同源臂；
(4)采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；
(5)准备质粒T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(6)将步骤(4)得到的酶切基因片段和步骤(5)得到的线性质粒片段经DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-yvbW；
(7)将整合质粒T2(2)-yvbW转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yvbW基因的上游同源臂或yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(8)挑选yvbW基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yvbW基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yvbW基因的地衣芽孢杆菌DW2-yvbW；
其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养
物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的yvbW基因为SEQUENCE LISTING中所示；
根据所述的强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌的制备方法构建得到地衣芽胞杆菌DW2-yvbW；
所述强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌DW2-yvbW在抗菌肽生产中的应用，该应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
2.根据权利要求1所述的强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。
3.根据权利要求1所述的强化YvbW表达的地衣芽胞杆菌在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。
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