CN104878033A - 一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用，属于生物工程技术领域。是将Bacillus cereus磷脂酶C和目标蛋白(包括胞内定位蛋白和胞外定位蛋白)在大肠杆菌中共表达，可提高胞外定位目标蛋白生产强度，实现胞内定位目标蛋白胞外表达，提高生产效率、简化后提取工艺，具有较高的学术意义和应用价值。

Description

一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用

技术领域

本发明涉及一种促进目标蛋白胞外表达的方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

基因工程菌表达的重组蛋白的定位方式有两种：胞内定位，在一系列伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体的蛋白定位在细胞基质中；胞外定位，在核糖体中合成后，目的蛋白在自身的功能序列和宿主菌分泌系统的作用下转运至胞外基质。这两种定位方式中，胞外定位不仅有助于蛋白折叠，还有利于降低包涵体的形成量，同时能够避免下游纯化时的破碎细胞等操作，简化纯化步骤、降低成本，减少杂蛋白对产品的污染。因此，胞外定位在工业生产中较胞内定位有优势。

大肠杆菌(Escherichia coli)表达系统作为目前应用最广泛、研究最透彻的表达系统之一，在培养周期长短、实验操作简便度等方面具有显著优势。天然情况下，大肠杆菌具有I-V型5种蛋白分泌途径，其中研究应用最多的是Ⅰ型和Ⅱ型分泌途径，又以Ⅱ型分泌途径中SecB介导的分泌途径采用较多。通常大肠杆菌中的重组蛋白合成速率是较高的，但是重组蛋白的分泌速率各不相同，很多不能够满足生产需要，因此强化大肠杆菌重组蛋白的分泌效率意义十分重要。

研究表明，Thermobifida fusca角质酶具有磷脂酶B活性，能够水解磷脂酰乙醇胺(PE，大肠杆菌细胞膜磷脂的主要成分)。T.fusca角质酶能够通过破坏大肠杆菌细胞膜使得细胞能够向外进行非特异性渗漏从而达到促进重组蛋白胞外表达的目的。然而，T.fusca角质酶水解磷脂分子的产物之一是溶血磷脂，它有类似表面活性剂的功能，会在发酵过程中诱发大量的泡沫，不利于发酵调控和工业放大。

本发明选取两种重要的工业用酶木聚糖酶和葡萄糖异构酶作为报告蛋白。内切-β-1,4-木聚糖酶可从木聚糖主链内部随机作用于β-1,4-糖苷键，将木聚糖分解成低聚木糖，在食品、饲料、造纸等行业均具有广泛的应用前景。葡萄糖异构酶，又称木糖异构酶，能将葡萄糖、木糖、核糖等醛糖催化异构为相应的酮糖，目前，其主要应用领域为将葡萄糖转化为果糖从而制备果葡糖浆。

发明内容

本发明提供了一种促进重组蛋白胞外表达的方法，是将氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的磷脂酶C基因和目标蛋白基因(包括胞内和胞外蛋白)在宿主菌大肠杆菌中共表达，经发酵培养后收集发酵上清液。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将磷脂酶C基因和目标蛋白基因克隆到表达载体上，得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中得到重组大肠杆菌，重组大肠杆菌发酵培养生产目标蛋白，收集发酵上清液。

所述磷脂酶C基因，在发明的一种实施方式中，来自Bacillus cereus磷脂酶C基因(NCBI编号：CAA45502)。

所述表达载体，在本发明的一种实施方式中，为pETDuet-1、pCOLADuet-1等双启动子载体；pUC系列，pET系列，pT7-7，pGEX等任意一种。

所述重组质粒，在本发明的一种实施方式中，为pET20b(+)-XynA或pET24a(+)-glu。

所述宿主菌，在本发明的一种实施方式中，为E.coli BL21(DE3)、E.coli W3110、E.coliJM109、E.coli JM109(DE3)或E.coli DH5α等任意一种。其中优选E.coli BL21(DE3)。

所述目标蛋白包括胞内定位和胞外定位蛋白。胞内定位蛋白是指在一系列伴侣蛋白的辅助下，合成于核糖体后仍定位在细胞基质中的蛋白，例如：葡萄糖异构酶(GI，NCBI编号：AAZ55638)；胞外定位蛋白是指在细胞内合成后通过宿主菌蛋白分泌途径跨膜转运至胞外的目标蛋白；例如：内切-β-1,4-木聚糖酶(XynA，NCBI编号：AGM16410)。

所述方法，在本发明的一种实施方式中，包括：

(1)获取不含信号肽的磷脂酶C成熟蛋白基因，连接至pMD18-T simple vector，获得质粒pMD18-T-plc；

(2)将pETDuet-1质粒和pMD18-T-plc进行双酶切，连接酶连接过夜后，连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞，得到重组质粒pETDuet-1-plc；

(3)将PETDuet-1-plc和含有目标蛋白基因的重组质粒进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc；

(4)将含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc导入宿主大肠杆菌；

(5)发酵培养步骤(4)构建的重组大肠杆菌生产目标蛋白，收集发酵上清液。

所述发酵培养，在本发明的一种实施方式中，具体是：将种子以5-10％的接种量接种，诱导前培养温度为25-37℃，诱导后培养温度25-37℃，pH6.5-7.5，溶氧20-30％；当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液，所述补料液按指数流加，比生长速率控制在μ＝0.1-0.3h^-1；当菌体干重3-10时，加入5-15g·L^-1甘氨酸；菌体干重15-25时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.05-0.5g·L^-1·h^-1，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。在此条件下进行发酵培养，都能够显著提高目标蛋白的胞外酶活比例。

本发明的有益效果：

(1)利用磷脂酶C中的磷脂酰胆碱特异性磷脂酶C除了具有磷脂酰胆碱活性外，还具有磷脂酰乙醇胺活性的特点，通过共表达Bacillus cereus磷脂酶C，使大肠杆菌细胞膜透性提高，不仅提高了目标蛋白的胞外酶活比例和生产强度，而且不存在产物诱发泡沫的问题，方便了产酶过程调控更有利于工业生产的应用。

(2)胞外定位目标蛋白生产强度显著提高，例如共表达木聚糖酶的重组菌，诱导培养时间从48h可缩短至24h，胞外酶活也从582.7U·mL^-1提高到了893.2U·mL^-1，胞外酶活占总酶活的比例从79％提高到了85％，生产强度从11.6U·mL^-1·h^-1提高到了26.9U·mL^-1·h^-1，而且上罐实验过程中不起泡沫的现象。同时胞内定位目标蛋白的胞外分泌量从0提高到了83％。

具体实施方式

发酵培养基：按1L计，蛋白胨0.9-1.1g，酵母粉1.9-2.1g，(NH₄)₂HPO₄3.9-4.1g，KH₂PO₄13-14g，柠檬酸1.5-2g，无水硫酸镁0.6-0.7g，甘油7.5-8.5g，微量元素液9.5-10.5ml，pH6.8-7.0微量元素液：FeSO₄·7H₂O9.5-10.5g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O2.0-2.5g·L^-1，CuSO₄·5H₂O0.9-1.1g·L^-1，MnSO₄·4H₂O0.45-0.55g·L^-1，Na₂B₄O₇·10H₂O0.2-0.25g·L^-1，CaCl₂1.9-2.1g·L^-1，(NH4)₆Mo₇O₂₄0.09-0.11g·L^-1。

实施例1：磷脂酶C在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达

pETDuet-1-plc重组质粒的构建：将pETDuet-1质粒(购自Novagen公司)和携带有磷脂酶C基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示)的pMD18-T-plc进行Nco I、Hind Ⅲ双酶切，酶切产物割胶回收后，T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109，涂布于氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB琼脂平板，37℃培养8-10h，挑选转化子于氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB液体培养基培养8-10h，提取质粒，得到重组质粒pETDuet-1-plc。

磷脂酶C的表达与制备：将pETDuet-1-plc质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB琼脂平板上37℃培养8-10h，挑选转化子在氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB液体培养基中37℃培养8-10h，后以5％接种量接入TB液体培养基(甘油5g·L^-1，蛋白胨12g·L^-1，酵母膏24g·L^-1，K₂HPO₄12.54g·L^-1，KH₂PO₄2.31g·L^-1)发酵液体培养基(含100μg·mL^-1氨苄青霉素)37℃培养2h后用0.4mM IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导约20h。

发酵液于4℃，8000rpm离心10min，共表达菌发酵液上清和细胞中的磷脂酶C酶活分别为14.2U·mL^-1和0.7U·mL^-1，胞外酶活占总酶活的95.3％。胞外酶活比例可以评判磷脂酶C提高细胞膜透性引起的酶胞外渗漏的潜力，比例越高越好。根据磷脂酶C自身的胞外酶活所占比例可以对此初步判断。

实施例2：木聚糖酶与磷脂酶C在E.coli中的共表达3L罐发酵

pETDuet-1-plc-XynA重组质粒的构建：PETDuet-1-plc质粒和克隆到pET20b(+)中的NCBI编号为AGM16410的木聚糖酶基因的pET20b(+)-XynA进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB琼脂平板，经37℃培养8-10h，挑选转化子于氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB液体培养基进行培养8-10h，然后提取质粒，得到重组质粒pETDuet-1-plc-XynA。

木聚糖酶的表达与制备：将pETDuet-1-plc-XynA质粒转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB琼脂平板上经37℃培养8-10h，挑选转化子在LB液体培养基中37℃培养8-10h，保藏菌种作为上罐用菌种。

将上述构建的重组菌和对照菌以同样方法进行3L罐发酵实验，培养方法为：从甘油管中吸取100μL菌液，接种于含有100μg·mL^-1氨苄青霉素的工业级LB培养基(装液量50/250mL)中，37℃、200rpm·min^-1培养8h。将种子以10％的接种量接入Infors3L全自动发酵罐中，发酵培养基(微量元素液10.0mL，甘油8.0g·L^-1，(NH4)₂HPO₄4.0g·L^-1，酵母粉(工业级)2.0g·L^-1，柠檬酸1.7g·L^-1，蛋白胨(工业级)1.0g·L^-1，MgSO₄·7H₂O1.4g·L^-1，KH₂PO₄13.5g·L^-1；微量元素液：FeSO₄·7H₂O10.0g·L^-1，ZnSO₄·7H₂O5.3g·L^-1，CuSO₄·5H₂O3.0g·L^-1，MnSO₄·4H₂O0.5g·L^-1，Na₂B₄O₇·10H₂O0.23g·L^-1，CaCl₂2.0g·L^-1，(NH₄)₆Mo₇O₂₄0.1g·L^-1)初始装液量1.2L。诱导前培养温度为37℃，诱导后培养温度28℃，pH7.0，溶氧20％。当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液；流加方式为指数流加，比生长速率控制在μ＝0.2h^-1。当菌体干重约为7.5左右时，加入甘氨酸，加量为10g·L^-1；菌体干重约为25左右时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.1g·L^-1·h^-1。开始诱导后，每3h取样一次，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。

含有质粒pETDuet-1-plc-XynA的重组菌接罐后6h培养基中甘油耗尽，开始流加补料，接罐后15h开始流加乳糖诱导，诱导后24h胞外酶活达到最高值893.2U·mL^-1，占总酶活的85％，生产强度约为26.9U·mL^-1·h^-1。发酵过程中没有明显的起泡现象。含有质粒pETDuet-1-XynA的对照菌接罐后6h培养基中甘油耗尽，开始流加补料，接罐后15.5h开始流加乳糖诱导，诱导后48h胞外酶活达到最高值582.7U·mL^-1，约占总酶活的79％，生产强度11.6U·mL^-1·h^-1。

对这一木聚糖酶来说，若细胞中合成的重组蛋白不能及时转运，就会形成大量的包涵体。磷脂酶C与木聚糖酶共表达时提高了细胞膜的透性，使木聚糖酶能够及时快速的转运至胞外。提高蛋白转运速率同时降低了包涵体形成量，从而提高了木聚糖酶的胞外酶活。对比两者的生产强度及含有质粒pETDuet-1-plc-XynA的重组菌上罐实验过程中不起泡沫的现象，将木聚糖酶与Bacillus cereus磷脂酶C共表达的方法提高了木聚糖酶的生产效率，同时产酶过程调控方便。

实施例3：葡萄糖异构酶与磷脂酶C在E.coli中的共表达3L罐发酵

pETDuet-1-plc-glu重组质粒的构建：将pETDuet-1-plc质粒和克隆到pET24a(+)中的NCBI编号为AAZ55638的葡萄糖异构酶基因的pET24a(+)-glu进行Nde I和Xho I双酶切，酶切产物割胶回收后，再用T4连接酶16℃连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，转化产物涂布氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB琼脂平板，经37℃培养过夜，挑选转化子于氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB液体培养基进行培养，然后提取质粒，得到重组质粒pETDuet-1-plc-glu。

葡萄糖异构酶的表达与制备：将pETDuet-1-plc-glu转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，在氨苄青霉素含量100μg·mL^-1的LB固体平板上经37℃培养8-10h，挑选转化子在LB液体培养基中37℃培养8-10h，保存菌种作为3L罐实验种子。

将上述构建的重组菌进行3L罐发酵实验，培养方法为：从甘油管中吸取100μL菌液，接种于含有100μg·mL^-1氨苄青霉素的工业级LB培养基(装液量50/250mL)中，37℃、200rpm·min^-1培养8h。将种子以10％的接种量接入Infors3L全自动发酵罐中，初始装液量1.2L。诱导前后培养温度均为37℃，pH7.0，溶氧20％。当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液；流加方式为指数流加，比生长速率控制在μ＝0.2h^-1。当菌体干重约为7.5左右时，加入甘氨酸，加量为10g·L^-1；菌体干重约为25左右时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.1g·L^-1·h^-1。开始诱导后，每3h取样一次，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。

重组菌接罐后6.5h培养基中甘油耗尽，开始流加补料，接罐后15.5h开始诱导，诱导后24h培养基中酶活达到最高30.1U·mL^-1，约占总酶活的83％，而同样条件下没有共表达磷脂酶C的菌株的胞外分泌为零。3L罐实验过程中没有出现明显的起泡现象。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种促进目标蛋白胞外表达的方法，其特征在于，所述方法是将氨基酸序列为SEQ IDNO.1所示的磷脂酶C基因和目标蛋白基因在大肠杆菌表达系统中共表达。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：将磷脂酶C基因和目标蛋白基因克隆到表达载体上，得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌中得到重组大肠杆菌，重组大肠杆菌发酵培养生产目标蛋白，收集发酵上清液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述表达质粒为pETDuet-1、pCOLADuet-1、pUC系列、pET系列、pT7-7或pGEX中的任意一种。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述宿主菌为E.coli BL21(DE3)、E.coliW3110、E.coli JM109、E.coli JM109(DE3)或E.coli DH5α。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白是天然在细胞内表达的蛋白质或者天然分泌至细胞外的蛋白质。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述目标蛋白为木聚糖酶或葡萄糖异构酶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具体是：(1)获取不含信号肽的磷脂酶C成熟蛋白基因，连接至pMD18-T simple vector，获得质粒pMD18-T-plc；

(2)将pETDuet-1质粒和pMD18-T-plc进行双酶切，连接酶连接过夜后，连接产物转化入E.coli JM109感受态细胞，得到重组质粒pETDuet-1-plc；

(3)将PETDuet-1-plc和含有目标蛋白基因的重组质粒进行双酶切，连接酶连接过夜，连接产物转化E.coli JM109感受态细胞，得到含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc；

(4)将含有目标蛋白基因的重组质粒pETDuet-1-plc导入宿主大肠杆菌；

(5)发酵培养步骤(4)构建的重组大肠杆菌生产目标蛋白，收集发酵上清液。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述发酵培养具体是：将种子以5-10％的接种量接种，诱导前培养温度为25-37℃，诱导后培养温度25-37℃，pH 6.5-7.5，溶氧20-30％；当发酵初始碳源甘油基本消耗完时，开始流加补料液，所述补料液按指数流加，比生长速率控制在μ＝0.1-0.3h^-1；当菌体干重3-10g·L^-1时，加入5-15g·L^-1甘氨酸；菌体干重15-25g·L^-1时，开始诱导，诱导方法为恒速流加乳糖，乳糖加量0.05-0.5g·L^-1·h^-1，测定菌体干重和培养基中酶活变化，培养基中酶活不再上升时，发酵过程结束。

9.根据权利要求1-8任一所述方法得到的目标蛋白。

10.权利要求9所述目标蛋白在食品、饲料、造纸领域的应用。