CN107858366A - vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析 - Google Patents

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施定基
隋臣超
苏永政
吴倩萍
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Abstract

本发明涉及属于蓝藻生物工程、藻类分子生物学方向技术领域，特别涉及一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析，并构建穿梭载体的方法。本发明根据eGFP在荧光显微镜下受紫外光或蓝光激发后具有绿色荧光特性，通过构建vp28基因和eGFP基因的融合表达载体，充分利用eGFP基因的这一特性，使得vp28基因在聚球藻7942中的表达易于检测和定量分析，对使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。

Description

vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析
技术领域
本发明涉及属于蓝藻生物工程、藻类分子生物学方向技术领域，特别涉及一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析方法。
背景技术
对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)是养虾业中危害最严重的病毒之一，至今尚无规模应用的有效药物防治，但近年来WSSV防治在免疫上进展较大。VP28蛋白是WSSV囊膜上的主要结构蛋白，2004年以来其编码基因已在8种宿主中表达成功并用作口服剂，本研究根据eGFP在荧光显微镜下受紫外光或蓝光激发后具有绿色荧光特性，通过构建vp28基因和eGFP基因的融合表达载体，充分利用eGFP基因的这一特性，使得vp28基因在聚球藻7942中的表达易于检测和定量分析，使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。
发明内容
本发明公开一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析方法，本发明可以使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。
为解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：
一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达方法，包括如下步骤：
(1)载体的构建：对489质粒进行全序列测序，并整理出489质粒中的酶切位点，先通过KpnI酶切489质粒，再通过限制酶XhoI进行第二次酶切反应；
所述KpnI酶切10μl反应体系中：0×Buffer L：1-2μl，限制酶KpnI：1-2μl，质粒DNA：1-22μl，ddH2O：剩余；37℃保温2-3h，80℃灭活20mins；
所述XhoI酶切10μl反应体系中：0×Buffer L：1-2μl，限制酶XhoI：1-2μl，质粒DNA：1-2μl，ddH2O：剩余；37℃保温2-3h，80℃灭活20-30mins；电泳回收大片段；
(2)vp28+egfp引物设计扩增：设计引物进行PCR并与步骤(2)中大片段连接，经过重叠PCR反应，得到vp28和egfp融合的片段vp28+egfp；
(3)大肠杆菌质粒制备：取30-50μL菌液加入5mL无菌LB培养液,37℃180-220rpm，过夜培养9-12h，将过夜培养的转化后的大肠杆菌用干净的LB培养液充分清洗后提取大肠杆菌质粒；使用引物vp28上游和vp28下游对大肠杆菌质粒与片段vp28+egfp进行PCR得到重组质粒489-vp28-eGFP并对其进行验证。
所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，包括如下步骤：
S1：供体菌大肠杆菌转化与筛选：每50μl大肠杆菌感受态细胞中加入3-5μl重组质粒489-vp28-eGFP，轻轻混匀，冰浴30-40mins后，42℃80-100s热休克，迅速冰浴2-3min使体系冷却，过程中保持体系平稳，加入450-500μlLB培养液，37℃150rpm培养40-50mins；取100μl上述培养后大肠杆菌菌液加入抗生素的LB平板上，正放0.8-1.2h使菌液充分吸收，倒置培养10-12h后进行筛选，得到供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌；
S2：滤膜制备：制备所选蓝藻对应的培养液，将0.45μm滤膜浸泡其中，高压灭菌20mins；
S3：供体菌和辅助菌大肠杆菌的制备：首先分别将1ml步骤S1得到的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与1ml辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液接到40-50ml LB中37℃，200rpm活化2-3h，然后进行离心收菌，回收4-5ml菌用LB冲洗后离心，用400-500μl LB将所收菌重悬，获得重悬后的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液，将重悬后的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液等体积混合后接到40-50ml LB中37℃，200rpm摇菌12-24h，得到含489-vp28-egfp的供体菌大肠杆菌和含辅助质粒PR4-PRL-542的辅助菌大肠杆菌的混合菌液；
S4：蓝藻的准备：取对数期成长蓝藻，室温下离心收藻，悬浮于培养液中，使细胞中浓度为2-5*108个/mL；
S5：取藻：取步骤S4中对数生长期、浓度为2-5*10 8个/mL的蓝藻1.5-2mL，离心2-3mins，获得离心后的蓝藻；
S6：冲洗：将步骤S5中离心后的蓝藻用蓝藻所需的培养液冲洗2次；
S7：重悬：取1-2ml培养液将S6中冲洗后的蓝藻重悬，获得重悬的蓝藻；
S8：接合转移：将步骤S7中重悬的蓝藻和步骤S3中含489-vp28-egfp的供体菌大肠杆菌和含辅助质粒PR4-PRL-542的辅助菌大肠杆菌的混合菌液按照1：10体积比例混合均匀后将其涂于无抗生素的固体培养基上，涂于滤膜上，正置平板30-60mins，使液体完全渗入培养基中，倒置培养1-2天，转移滤膜到含有相应抗生素的固体培养基上，每周更换一次平板，2周后，获得阳性蓝藻；
S9：转基因蓝藻的筛选和转化：将步骤S8中的阳性蓝藻接种到含有相应抗生素的培养液中，抗生素的浓度由低到高，逐渐升高，待生长稳定后，在平板上划得单藻落；筛选时，当从抗生素浓度A到B后，1周后，再回到A。
进一步的，所述的489质粒中含有光系统II的psba启动子。
进一步的，所述步骤S1中抗生素为硫酸卡那霉素，其浓度为80-120μg/ml。
进一步的，所述步骤S2、S4、S6、S7和S9中培养液为为BG-11培养液。
进一步的，所述步骤S4中的蓝藻选自聚球藻7942。
进一步的，所述步骤S8和S9中的固体培养基为BG-11固体培养基。
进一步的，所述步骤S8和S9中抗生素为Kana。
进一步的，所述489质粒的基因序列为：
TATGCGCAGTGGGCGCATCACGCTAAAACAGGGGAATATCACGCTCAACGCGGTGCTGGCCGAGGAGATTAACCCGCCCAAGGGTGAGACCCCGTTGAAATGGTTGTTGCTGACCAGCGAACCGGTCGAGTCGCTAGCCCAAGCCTTGCGCGTCATCGACATTTATACCCATCGCTGGCGGATCGAGGAGTTCCATAAGGCATGGAAAACCGGAGCAGGAGCCGAGAGGCAACGCATGGAGGAGCCGGATAATCTGGAGCGGATGGTCTCGATCCTCTCGTTTGTTGCGGTCAGGCTGTTACAGCTCAGAGAAAGCTTCACGCTGCCGCAAGCACTCAGGGCGCAAGGGCTGCTAAAGGAAGCGGAACACGTAGAAAGCCAGTCCGCAGAAACGGTGCTGACCCCGGATGAATGTCAGCTACTGGGCTATCTGGACAAGGGAAAACGCAAGCGCAAAGAGAAAGCAGGTAGCTTGCAGTGGGCTTACATGGCGATAGCTAGACTGGGCGGTTTTATGGACAGCAAGCGAACCGGAATTGCCAGCTGGGGCGCCCTCTGGTAAGGTTGGGAAGCCCTGCAAAGTAAACTGGATGGCTTTCTTGCCGCCAAGGATCTGATGGCGCAGGGGATCAAGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGATGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTAACGCTTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCCCCAAAAAGGCAATCTAATATAGAAATTGCCTTTAATTTTATTATGGTAAATTCATTTCGATTTTTTGGTTCAACATATCAATAATATCTTTTACATCTTTAATATCGGACATTGATTCAAAGGATAATAAAATATTTTTAGACCCTGTTTTTTCCACTGCTAATTTTGTCGATTCATAATAGTCATCATGAGACCCAACTGCATTCTCTTCAATAATGCAGTTAATTTTTTCATCTCTGTCCATTTGAGGGTAAGTTTCAGTGATATAGTCTTTTAAGTATTCTCTCACTTCTTCTTGAGCCGTACTTCTATCAGCATTTAAGTTCGCAATTACAGTTAATTGATGATCAACATCCGAAATATCAATACCATATTGTTGTGCTGTTTTATTATATAGAATTGCATAGCGTTCTTTGGTTTCTAAATTATCCTCCCACTTAAATGTTAAAGGCAGTGCCTTTTTCGCTGCCCACATGACGACTTCTTTTGATGTAGCGGATACATATTGCTTAGGTCCATTCTCACTGTAACAGTGTGGATTAATTGAAACCTTTGGAAAATCATAAAAGTCGTTTTGGGGATGACAATAACCTGTAGTTAATGCGTCATTAATTATTTCATAGCATGCTTCAAATTGTTGTTGCCTTGATGAGATATGACGTCTAAAAAATTCCATTTCGAAATCACTTTCGCAGTCACTAAAACCAAGAATGAAGCGTCCCTCTGACATTTGATCTAATAAACTGGCTTCTTCTGCTACACGTACAGGGTGATGGGTGGTAATTACTTGATTTAATGAACCAATATGTAATTTATTTGTTAACCCTAATAAAAAACCAGCTGCGGTAATAGGTGCTCCAACAATACCATTTTTTGAAAAGTGATGTTCATTAACAAAGGCAGTATTAAAATGATATTTAGTTGAATCAATTAACGTGACAGTCTTTACCATATTATCCAACGTTTCTTCAGATGTTATTCCATCTTTCTGAAAGTTTAGAAAAAATAATCCAAATTTCATAACTTGTTCCTTATTATCTCTAGTATCAAATAAGTAATTTATTTAGGTTCTTTTAAGAAAGGAGCGACTTGTGTCATAAAGCGTCGCATGGAAGCAATTATTTCATCTTCAGTTCCATTAGCTTCAAATCCGCATGTAATGTTTGTAATACCCGTTGCATCAATATCACGTTGAATGATTTCAATACACTGCTCAGGAGTGCCTACAGGGTTAATACCATTGCTATAATCAACACGTCGATTGGTGTTTGTATGTCCTTGTAAAACAAAATCACGCCATTGACCTTTATGATAATCATAACCACGAGTTTGATTGCTATCATTAAAGATATTGGTCGCATTTACATATGAGTCATACCAATTTTTCAGAAACTCCCGACAAACATCTTGCGCCTTTTGTGCATCATCATCAACAGAACAAATATAAGTCATACAATGATCTATTTTAGATATATCATGACCATATTCTGTCGCAATTTCATTATAGAGTTCCATCTGTGCTTTTTTTTCATTAGTACCAATAATCCAACTAAGAACCATTGGTAGCCCTTGTATTGCTAGCCATTCTGTCGTACTTGCGGACTCAGCAGTCATACAGGTTGGTACATTTTTTGAGTACACTTTGGGATATACATCAACCTTAGGAAATTGAATGTAATCACTATCAGAGCTAATGGTTCCTGTCTGTAAGCTTTCCATTATCATCTGGTAGAAATTTTGAGTAATTGCTCGAGACTCTTCCATATCAACACCAAATACTCGAAAATCTTTATGGTATAGCCCTCGAACGGTTCCAAAATTAAAACGACCTTTCGACATTTGATCTAATAATAAAACGTCTTCTAACTGTCGAACTGGGTGTGCTGTCGGAATAACAACCCCCATAGTGCCAACATTTAATGTTTTAGTTCTTCCTAACAGGTTAGCCGCAGCAACAAATAAATTTCCCGTAAGACCAAACT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TATCTCTAAATCCAATAAACCATCATCTAATGCTAAGGCTGCCTTGGTAATGACTCCAACTTATTGATAGTGTTTTATGTTCAGATAATGCCCGATGACTTTGTCATGCAGCTCCACCGATTTTGAGAACGACAGCGACTTCCGTCCCAGCCGTGCCAGGTGCTGCCTCAGATTCAGGTTATGCCGCTCAATTCGCTGCGTATATCGCTTGCTGATTACGTGCAGCTTTCCCTTCAGGCGGGATTCATACAGCGGCCAGCCATCCGTCATCCATATCACCACGTCAAAGGGTGACAGCAGGCTCATAAGACGCCCCAGCGTCGCCATAGTGCGTTCACCGAATACGTGCGCAACAACCGTCTTCCGGAGACTGTCATACGCGTAAAACAGCCAGCGCTGGCGCGATTTAGCCCCGACATAGCCCCACTGTTCGTCCATTTCCGCGCAGACGATGACGTCACTGCCCGGCTGTATGCGCGAGGTTACCGACTGCGGCCTGAGTTTTTTAAGTGACGTAAAATCGTGTTGAGGCCAACGCCCATAATGCGGGCTGTTGCCCGGCATCCAACGCCATTCATGGCCATATCAATGATTTTCTGGTGCGTACCGGGTTGAGAAGCGGTGTAAGTGAACTGCAGTTGCCATGTTTTACGGCAGTGAGAGCAGAGATAGCGCTGATGTCCGGCGGTGCTTTTGCCGTTACGCACCACCCCGTCAGTAGCTGAACAGGAGGGACAGCTGATAGAAACAGAAGCCACTGGAGCACCTCAAAAACACCATCATACACTAAATCAGTAAGTTGGCAGCATCACCGGCTGCCTTCGTCACTGATTGATAAAAATTTCTTAATACAACCAAATTTTCCCCAAGATCATGTGAACTTCCAATTAGCGAATAGAGCTTACAATTACTAGATTCAATGCTATCAATGAGCTCGGTACCCGGATCCGTCCTTGTTATTCAACAGTATAACATGTCTTATACGCCCGTGTCAACCAATATTCATTGAGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGTCGAGAATAGTTAGCGCGCAGTTCGACGGGTGATTGGTCAAACGCAGCGGTTCCCAAGCGAGAGGCAGCGACAGTAACTGGCATTTGCCTAATACTCCTTGTTAAACCAATGTTTTTAGATAGAGCAAGACCCGGAGAAGTAAGTAGAACCCAACACTTAAGCTGAAAACCACTTACCCATCCGGGCCTAGACTAAGCAAAATTAGCTGAGGGCGTTAATTGCGTAGTCGATGTAGTTGTTAGTTTCAGTAGCAGCATCGCCAGTCAAACGGGAATTC
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本发明的有益效果是：
1、本发明根据eGFP在荧光显微镜下受紫外光或蓝光激发后具有绿色荧光特性，通过构建vp28基因和eGFP基因的融合表达载体，充分利用eGFP基因的这一特性，使得vp28基因在聚球藻7942中的表达易于检测和定量分析，对使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。
2、本发明成功构建了vp28基因和eGFP基因融合表达穿梭载体，并检测到VP28蛋白在聚球藻7942中成功表达。
3、因为vp28基因和eGFP基因融合表达，所以可以通过荧光显微镜的方法观察转基因蓝藻的表观，观察eGFP基因的表达，从而定量分析vp28基因在聚球藻7942中的表达。
4、该发明不仅方便分析vp28基因在聚球藻7942中的表达，而且可以避免繁琐的分子、蛋白检测，节约时间与成本，同时也为转vp28基因聚球藻7942作为防治WSSV口服剂的投喂剂量提供依据。
附图说明
图1：489质粒大致酶切位置图。
图2：489质粒酶切鉴定图。
图3：vp28、eGFP、vp28+eGFP片段电泳图。
图4：489-vp28-eGFP重组质粒连接过程。
图5：489-vp28-eGFP质粒PCR验证电泳图。
图6：PDC08、489、489-vp28-eGFP质粒电泳图。
图7：含489-vp28-eGFP质粒大肠杆菌在明场和荧光显微镜下形态。
图8：转化子PCR电泳验证。
图9：vp28蛋白western blot。
图10增强型绿色荧光蛋白(eGFP)western blot。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步说明：
实施例1
对489质粒进行全序列测序，489质粒具体序列的详见序列表，并整理出489质粒中的酶切位点，具体结果如图1所示，主要酶切位点整理如表1所示。用XhoI和KpnI双酶切489质粒，反应体系为:10μl反应体系中：10×Buffer L:2μl，限制酶KpnI：1μl，质粒DNA：2μl，ddH2O：5μl；37℃保温2h，80℃灭活20mins，后用限制酶XhoI再进行第二次酶切反应体系条件相同。如图2所示，得到11.0kbp左右的大片段和1445bp的小片段，电泳回收大片段以进行后续融合表达实验。
表1
实施例2
vp28+egfp的扩增引物设计，具体结果如表2所示，先分别使用引物KPNI-VP28-F/VP28-R和eGFP-2F/XHOI-eGFP-2R扩出两条PCR产物；再以扩出的两条PCR产物作为模板，使用引物KPNI-VP28-F/XHOI-eGFP-2R扩出第三条产物；将第三条产物和酶切后的489质粒连接并构建重组表达载体。经过重叠PCR反应，如图3所示，得到vp28和egfp融合的片段vp28+egfp，大小约为1332bp。
表2
实施例3
大肠杆菌质粒制备：取50μL大肠杆菌菌液加到5mL无菌LB培养液中,37℃190rpm过夜培养。将过夜培养的转化后的大肠杆菌用干净的LB培养液清洗两遍，使用质粒提取试剂盒提取大肠杆菌质粒。如表3所示，使用引物vp28上游和vp28下游对大肠杆菌质粒进行PCR得到重组质粒489-vp28-eGFP并对其进行验证，结果如图4、5所示。
通过核酸电泳检测，由图6可看出PDC08质粒比489质粒较小，符合理论。将vp28+eGFP片段与489质粒连接后得到的重组质粒489-vp28-eGFP，与489空质粒相比较，可看出片段比489空质粒较大。
实施例4
供体菌大肠杆菌转化与筛选：每50μl感受态细胞中加入5μl重组质粒489-vp28-eGFP，轻弹混匀。冰浴30mins后，42℃90s热休克，迅速冰浴2min使体系冷却，过程中切忌摇晃离心管。向离心管中加入450μlLB培养液，37℃45mins 150rpm。取100μl上述培养后菌液加入含有相应抗生素的LB平板上，正放1h使菌液充分吸收，倒置培养12h进行筛选。
对筛选后的大肠杆菌观察在明场和荧光显微镜下的形态，具体结果如图7所示。
滤膜制备：制备BG-11液体培养液，将0.45μm滤膜浸泡其中，高压灭菌20mins；
供体菌和辅助菌大肠杆菌的制备：活化菌：将1mL含489-vp28-egfp的大肠杆菌和1mL含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液分别接到40mL LB中活化2-3h，37℃，200rpm；收菌：7000rpm离心5mins收菌，回收4mL菌，用LB冲洗2次，后10000rpm，5mins；重悬：用400μl LB将所收菌重悬；混合菌：等体积混合含PR4+PRL542的大肠杆菌菌液和含489-vp28-egfp的大肠杆菌菌液；摇菌：于接种前一天晚上摇菌：得到含489-vp28-egfp的供体菌大肠杆菌和含辅助质粒PR4-PRL-542的辅助菌大肠杆菌
蓝藻的准备：取对数期成长野生型聚球藻，室温下5000rpm，离心收藻，悬浮于0.1倍体积的新鲜BG-11培养液中，使细胞中浓度为2-5*108个/mL；
取藻：取对数生长期、浓度为2-5*108个/mL的野生型聚球藻1.5mL，4000rpm离心3mins；
冲洗：用BG-11培养液冲洗2次；
重悬：取1ml BG-11培养液重悬；
接合转移：将野生型聚球藻和大肠杆菌按照1：10体积比例混合均匀后将其轻轻涂于无抗生素的BG-11固体培养基上，涂于滤膜上，正置平板60mins，使液体完全渗入培养基中，倒置培养2d，小心的转移滤膜到含有Kana(100μg/ml)抗生素的BG-11固体培养基上，每周更换一次平板，2周后，出现阳性；将滤膜转移到含Kana(200μg/ml)的BG-11液体培养液中培养，7d后，将Kana浓度加大至400μg/m，7d后将Kana浓度调整为200μg/ml进行筛选，获得聚球藻转化子。
转基因蓝藻的筛选和转化：将阳性藻接种到含有相应抗生素的培养液中，抗生素的浓度由低到高，逐渐升高，也可将半个滤膜投入，待生长稳定后，在平板上划得单藻落；筛选时，当从抗生素浓度A到B后，1周，再回到A，以保证高转化率；
实施例5
对实施例4获得的聚球藻转化子继代培养后提取鲜藻中489-vp28-eGFP质粒如表4所示，使用引物vp28(根据vp28基因序列设计),eGFP(根据eGFP序列设计),vp28+eGFP(根据vp28、eGFP连接部分序列)这三对引物PCR验证。具体结果如图8所示。
表4
实施例6
提取培养至对数期的转vp28-eGFP聚球藻7942细胞中的可溶性蛋白，用Bradford法测定藻的蛋白浓度，确定蛋白电泳的上样量。Western blot结果显示：野生型、空载体型中没有VP28蛋白表达，而转基因藻中有VP28蛋白条带出现(图9)和eGFP蛋白条带(图10)，结果发现VP28和eGFP这两种蛋白在聚球藻7942体内分别表达，证明VP28蛋白在转基因聚球藻中稳定表达。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 上海海洋大学
<120> vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析
<130> 2017
<141> 2017-11-14
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 12837
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 1
tatgcgcagt gggcgcatca cgctaaaaca ggggaatatc acgctcaacg cggtgctggc 60
cgaggagatt aacccgccca agggtgagac cccgttgaaa tggttgttgc tgaccagcga 120
accggtcgag tcgctagccc aagccttgcg cgtcatcgac atttataccc atcgctggcg 180
gatcgaggag ttccataagg catggaaaac cggagcagga gccgagaggc aacgcatgga 240
ggagccggat aatctggagc ggatggtctc gatcctctcg tttgttgcgg tcaggctgtt 300
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cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga gaaagtatcc atcatggctg 1020
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taccgcagct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc 1920
ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc 1980
gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc 2040
ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata 2100
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acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc 2460
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ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct 2940
tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga 3000
gattatcaaa aaggatcccc aaaaaggcaa tctaatatag aaattgcctt taattttatt 3060
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tatcggacat tgattcaaag gataataaaa tatttttaga ccctgttttt tccactgcta 3180
attttgtcga ttcataatag tcatcatgag acccaactgc attctcttca ataatgcagt 3240
taattttttc atctctgtcc atttgagggt aagtttcagt gatatagtct tttaagtatt 3300
ctctcacttc ttcttgagcc gtacttctat cagcatttaa gttcgcaatt acagttaatt 3360
gatgatcaac atccgaaata tcaataccat attgttgtgc tgttttatta tatagaattg 3420
catagcgttc tttggtttct aaattatcct cccacttaaa tgttaaaggc agtgcctttt 3480
tcgctgccca catgacgact tcttttgatg tagcggatac atattgctta ggtccattct 3540
cactgtaaca gtgtggatta attgaaacct ttggaaaatc ataaaagtcg ttttggggat 3600
gacaataacc tgtagttaat gcgtcattaa ttatttcata gcatgcttca aattgttgtt 3660
gccttgatga gatatgacgt ctaaaaaatt ccatttcgaa atcactttcg cagtcactaa 3720
aaccaagaat gaagcgtccc tctgacattt gatctaataa actggcttct tctgctacac 3780
gtacagggtg atgggtggta attacttgat ttaatgaacc aatatgtaat ttatttgtta 3840
accctaataa aaaaccagct gcggtaatag gtgctccaac aataccattt tttgaaaagt 3900
gatgttcatt aacaaaggca gtattaaaat gatatttagt tgaatcaatt aacgtgacag 3960
tctttaccat attatccaac gtttcttcag atgttattcc atctttctga aagtttagaa 4020
aaaataatcc aaatttcata acttgttcct tattatctct agtatcaaat aagtaattta 4080
tttaggttct tttaagaaag gagcgacttg tgtcataaag cgtcgcatgg aagcaattat 4140
ttcatcttca gttccattag cttcaaatcc gcatgtaatg tttgtaatac ccgttgcatc 4200
aatatcacgt tgaatgattt caatacactg ctcaggagtg cctacagggt taataccatt 4260
gctataatca acacgtcgat tggtgtttgt atgtccttgt aaaacaaaat cacgccattg 4320
acctttatga taatcataac cacgagtttg attgctatca ttaaagatat tggtcgcatt 4380
tacatatgag tcataccaat ttttcagaaa ctcccgacaa acatcttgcg ccttttgtgc 4440
atcatcatca acagaacaaa tataagtcat acaatgatct attttagata tatcatgacc 4500
atattctgtc gcaatttcat tatagagttc catctgtgct tttttttcat tagtaccaat 4560
aatccaacta agaaccattg gtagcccttg tattgctagc cattctgtcg tacttgcgga 4620
ctcagcagtc atacaggttg gtacattttt tgagtacact ttgggatata catcaacctt 4680
aggaaattga atgtaatcac tatcagagct aatggttcct gtctgtaagc tttccattat 4740
catctggtag aaattttgag taattgctcg agactcttcc atatcaacac caaatactcg 4800
aaaatcttta tggtatagcc ctcgaacggt tccaaaatta aaacgacctt tcgacatttg 4860
atctaataat aaaacgtctt ctaactgtcg aactgggtgt gctgtcggaa taacaacccc 4920
catagtgcca acatttaatg ttttagttct tcctaacagg ttagccgcag caacaaataa 4980
atttcccgta agaccaaact ctgtaaaatg atgttctaag gtccaatatg tatcaaaccc 5040
tacctcttct gaggcgatac caagccgaac aaagcgatcc attacttgct tatgagtttc 5100
acctggtggt tgatacgaaa aacaaatatt tccaaacttc atactctatt cctttttggt 5160
gattctgttt atttaagcca attctaataa ttcattttca atttcatttt ttaatctacg 5220
ctccttaaca gtaatacttg taacgtcctc aaatcgaggt tcaataatgt ctatctctaa 5280
atccaataaa ccatcatcta atgctaaggc tgccttggta atgactccaa cttattgata 5340
gtgttttatg ttcagataat gcccgatgac tttgtcatgc agctccaccg attttgagaa 5400
cgacagcgac ttccgtccca gccgtgccag gtgctgcctc agattcaggt tatgccgctc 5460
aattcgctgc gtatatcgct tgctgattac gtgcagcttt cccttcaggc gggattcata 5520
cagcggccag ccatccgtca tccatatcac cacgtcaaag ggtgacagca ggctcataag 5580
acgccccagc gtcgccatag tgcgttcacc gaatacgtgc gcaacaaccg tcttccggag 5640
actgtcatac gcgtaaaaca gccagcgctg gcgcgattta gccccgacat agccccactg 5700
ttcgtccatt tccgcgcaga cgatgacgtc actgcccggc tgtatgcgcg aggttaccga 5760
ctgcggcctg agttttttaa gtgacgtaaa atcgtgttga ggccaacgcc cataatgcgg 5820
gctgttgccc ggcatccaac gccattcatg gccatatcaa tgattttctg gtgcgtaccg 5880
ggttgagaag cggtgtaagt gaactgcagt tgccatgttt tacggcagtg agagcagaga 5940
tagcgctgat gtccggcggt gcttttgccg ttacgcacca ccccgtcagt agctgaacag 6000
gagggacagc tgatagaaac agaagccact ggagcacctc aaaaacacca tcatacacta 6060
aatcagtaag ttggcagcat caccggctgc cttcgtcact gattgataaa aatttcttaa 6120
tacaaccaaa ttttccccaa gatcatgtga acttccaatt agcgaataga gcttacaatt 6180
actagattca atgctatcaa tgagctcggt acccggatcc gtccttgtta ttcaacagta 6240
taacatgtct tatacgcccg tgtcaaccaa tattcattga gatcctctag agtcgacctg 6300
caggtcgaga atagttagcg cgcagttcga cgggtgattg gtcaaacgca gcggttccca 6360
agcgagaggc agcgacagta actggcattt gcctaatact ccttgttaaa ccaatgtttt 6420
tagatagagc aagacccgga gaagtaagta gaacccaaca cttaagctga aaaccactta 6480
cccatccggg cctagactaa gcaaaattag ctgagggcgt taattgcgta gtcgatgtag 6540
ttgttagttt cagtagcagc atcgccagtc aaacgggaat tcttgaagac gaaagggcct 6600
cttgcgggat atccgtctag atagtcatcg ctcatccctc acctcaaccg ttttgctgcc 6660
taacgaggta gtctaagacc gcgccaattc tgtcgagtgc cgcgctagtg gtacgttggt 6720
actcatcaag ccgtgcttcg gtttgtaatt gcctagcggt aagaatttca aagttctgct 6780
gatggatttg aactgtttgc aacaatgctt ctgcggttgc gcggagttct gtaaccgatg 6840
tgcggaggtc ggcattcact gcaacttggc tgtctaacgc agcttctatt ctggctagtc 6900
tgtcttcgct catgctgccc cctgcttgtc ttggttgtcc ttggcttctt gttccatttg 6960
ttctttaaca actcgtgtga gtaagaaagc ggcaagatta gccaacggtc ttccttcctc 7020
agacgctcgg ttagcaatcc attggtaaat ttcagcttct agagtgactg ctattctccc 7080
tttattggtt ggcatgacgt ttggtgtact cctgagtcca tatcatacac cttgtgcaaa 7140
gagtgattga caaatgtact aatcggcagt aatagtatag agtgtattaa gtgtacaccg 7200
agtatatgac cgaagtacag accgtcaaca atggcactgt acccgttttt aatgcgggta 7260
aaagtgccag taaaaaactg cgtcgtaatc tgccttcgct gccatccaac ccaggcgcga 7320
gtgagatgag tgacgtgagc tattcctgca aagttgatgc cagcccgact gtgtgggatg 7380
ctttaccgct atacagcccg tttagcttat cggctgatgg cagttaccca atggtcaagg 7440
tgacgcgctc aaaagcctgc gaactgagaa ccgggaaatc aatcctggtc ggttcgggtc 7500
gttgctaccg agtgattttt tgatgacgat tcaccttaaa ggtgaatcgc actgattcct 7560
gtggactgcc tcgtaaacac ccactggaat cgcctacata atgaaggaca taattatcat 7620
gacagataga ccactcaccg agaaagagca gcaagtcatc tctgagtttg aaacggcgcg 7680
tcctggcttg ggtgcaattg ccgaacaaaa cattattaat aataatgtca ccggctgggc 7740
tgacattatc gctgatactc cggctgaaga actcgtcgcc aatgaaggga ctgccagcaa 7800
cagttttatg taccggagaa tcggctaatg aacgagcgac tttaccaagt atccttgaca 7860
gagttaacta aagttggtgt cccgcaagcg atagccgaac aagcgtcctt agtcgtagcc 7920
aacgatgacc ctacaaaacc caatcttggc agaacacccc aagcccaaga agcggtcaat 7980
gcggctatga ctcactacca cgctaatcaa cagggagtaa gtcaataatg agcgatcgcc 8040
agtttctatt tttaggactg gcggccgccg ccgtcagtct gtggtatcaa aaccagcaaa 8100
cagagttaca agcacagtta aatacctgtc gcgctcaact gcaaggcttt aaagacgggg 8160
tgatttatgg caaatgactg gattgaaatg cacttgccta gtcgtcaaca gctaggcagg 8220
tttttactgt ggggattggg gcgattaact tttagtgcca gcatattttt atttgatgcc 8280
acgtcttacg ctttgcaaac agcgttaaca gtggtgaagt ggtgtagaca gtctgtatac 8340
aacttggtca aagtttacga ccaattgccc tatgctggca cttacggcgc ggctatcatt 8400
gacactaccg ccgtcaccct tgcggtcgaa ccagagggaa tcatcaccga cttgatgcaa 8460
gctctgtctg gtaagcactg tttaatagtt ggggatacgg gaactggcaa aagcaccata 8520
gcccaatggc ttgcttatca agtcgggggt gaggtgacag tctatgacgc tgacgctgca 8580
ccggacgagt ggacggggtt aaatgtcatt ggccgccgtg gtgactttga ggctatacag 8640
tcgggcatgg ctgctgacct ggaggaattg cagcgccgga ttgagctacg gggtgagtct 8700
ggggataagg cactagcagg aaaagaaagc gttttaattg ctgaagaact gccactgctg 8760
agagatgaag tcgagatagc aaccgaatgg ctcatcaaac acgccaggcg cggccgcaag 8820
cccaagcgtt ttgttattgg gctgactcaa gatgataatg tcaagacctt aggtatcgag 8880
ggtgaaggcg gtgtccgtaa gtgttttagg atgttacgcc tgggtaagtt tgcagttagc 8940
cacgccaagt ccttaaaaga ccttgccctt gtggagtggt taaagtcggg gaaatatcgc 9000
tgcatggtgg atgatatgcc gtgtcagtta ccagatgtaa gcagttacaa aatggttatg 9060
ccccggttac agtctgtaac cagttttcag ccactccaaa cggctcaacc gacctcagaa 9120
caagcattac agcccgtttc atccctccca gaaccaagag atgaaaccct agcaaaagtg 9180
gtaaaagcct gtctggaagc gggtttttca gaaagtaagg tgattaaaga aattttgggc 9240
tatcaaggcg ggcgttacca agaaggtaaa tcgctactgg aaaaacttaa ggatttgtag 9300
cggtgcggtt tagcattgac tgttacttgc tgtacaagga taattttctc aaagcggaat 9360
ggtgttaaac ccgattatta gagtcgtcat agcaaaagct tgaaaactgg caagggtgta 9420
ctggttttcg ttctttttgg ttctaatggt tattttttac cagtttattt agtaataacc 9480
gagtgccaag tttcttgttt tacatagcaa agttagcaaa aaacattttg ccgtgaattt 9540
ccatctgtaa aaagcgtcac ggcgaaattc agtatttagt aaatacaaaa ataagtcaaa 9600
cgttgatcat gcaacacttt ggcgtacaat tgattgaaaa ttttgccgat aggcaaagtt 9660
taaattacct attaaaaaaa gttcagtgct tgggggttgt tatgctactt aaccgaagct 9720
aaataaaaca cacatacaca gaattgttac cacaccaaac accaaacaga aaaaacgtgc 9780
tttgaattta tcaattaatg ggtgtagtta acaagtttta tttagcttca ggttaagcaa 9840
ataacattca ataggtactg gactgagaca tttccaaatg atcagcccag aaagcttaaa 9900
tacaaatgta tcactaaccc tgcttacaag ggaactacaa actgaaataa ttcttggcac 9960
ttacacggtc agggtacaca ctcgcattgg tcgagaacct tgtgcgcggt tgtggtattt 10020
gtgtcgagcg cttgataagg atgggtctgg tcatttaaca ttgccattgc ctgtagtaca 10080
gacgttctta gattgtagtg ataagtctgt ttaccgttgg ttacaggatg gaaaaaaaat 10140
aggagcattc cgccgctaca aaattaaagc aggaatgata accgtctact tgggcggtat 10200
gtttcaagtt tgttacaacc taaatttaaa aagatggggt gatgttgcag tagtgccttt 10260
agtccaagtg ttaagcgatt tacgctcact gaccactggc atagtcacac aaagctttca 10320
acaaaagagc cgctatgcgg ccaacagaca acttaaacca gagtacagaa aactttttgg 10380
agcgccacac ccgaacgagc tagtgaagga cacaaggcaa tcctctctta aatcgccaga 10440
gggggaagta ccttgtgtac ttcacattag ttcgtcgcgg atattcgtct caaaaagttt 10500
catccactat ggtacatctc aaaaagctgt cagctgtgag ttgggtattc acaagcgcac 10560
agtgcgacga catcaaaagc agctgggcat gaatcgccgt caactttgcc aagccaaaat 10620
tgagtacaat caactccggc acgctcggaa taatgacgcg tctgaatttt gggctttcac 10680
tggaaccaaa actgatatcg gttatcaagt tatgggtgac gcggttgtgt tttctgatgg 10740
cattgcccct ggagccaaaa agagacagcc caacacttac caaattgacg cgactgaatt 10800
tgacggtcga ttattcaaag tgggtgacaa ggtgttcatg aatcggtgca acatctaccg 10860
cgaacaattc accctaacaa cgatgtcagc agcacggcgg aagtaccatt tcaaactgtc 10920
acagtgccac ttcagcgaaa atcgagccgg tcgggtaggc aaccgttttg taataggttg 10980
ccactctggc gagatatgaa ggacattttt aagaattttt ttttagcgtg aaatgctgcg 11040
gcaaccagta tagtgatcga cacgaactag tgcagcatga ccgagagcct atagggtcgc 11100
ggctttttgg caatagagat cgtatgcaga tcatgcgtag tactttcttc gaccttaacc 11160
ccaaagaaag cttattagat ggagaaggtc acaattagaa aatattcatc gtcccgattg 11220
acccttaacc tttaatcggt ttccacttgt aaaaaattcg gcgagccatt cttcttaacc 11280
ctcagagtcg aacttcatac aagaatatac aaaccctttg ggtttaccac taaaacaacg 11340
gcgataaaaa cctaataggt ttccacagaa acgtctaagg atttaggcgt gttgttttgg 11400
ggcaatttga gaaaatatta aaccagtcac aagttaactt gtcgaagaaa tattgcagca 11460
ttctgcaaca cagggaaagg tataacgttt ccaaagtccg gaacgtgtgc agagttctag 11520
aaccgatgga tactttaaaa gtatcctcaa gtgtagagcg tgtgtttagg ctgcgtcttt 11580
ttttagcacc cataggggtc taaacagcgt tggcgtacat tagaagccaa tcacggatac 11640
agctttgcgt cgctgttcgg gtgtaacttc aagatagcgt tgcagtgtgc caaggtcatt 11700
gtgaccggat atctcttgaa tgtgtcgcaa cgggataccg gcgctagaca tttggttgag 11760
ggcagtacgg cggaaactgt gggtactgat gccttctagc ccgattcttt tggctgcatc 11820
gcgcaagatt ttatccgccg cgtatcgcgt gagcctatcg ctgactcccc tcatgccagg 11880
gaacagggtt cccggtttgg ggtgatagtc agccatgagt gcggctagtc ctggctggat 11940
gtcaaccacg cgggttttga gtttcccttt ggtggtagac ttcctaaagg ttagtgtttc 12000
gcctttaatg tccgttgttt ggagtgctag agcttcacta acgcggcaac cggtgaatag 12060
acagatgcca aacaaaacgc gatcgcgcgg tgtggtgaat ccgtcgctaa acagtcgcct 12120
gagttcgtcg gaggtgagta ttttggctcg tccgttgccg ttaaccttca taacccttac 12180
agattaagca ttccaatact ctacacgtta tctgcatttt gtggaattgg tggctatatc 12240
tattgattct tcgtatgctt tctgttgaaa gccagtgcta gtttagccaa gcttatcaat 12300
cgttgcacgg taaaatcagg ctttcgacgt aaggacagaa ttttgataac ttcagcttat 12360
gttgtctcct gaagaaagca actctttgat aaacgcgtcg atggctttcc cggcggctga 12420
ctgcctaccc atttttagct tattgagggt gcgatcgcgg gttgcctcca atttgtctag 12480
attgtctata ctattgtcta tattctttct gtcttgcccg gtagcttgtc cttctgcctg 12540
aactaccggg ctttcgattt tccccgcagt tcctccagtt gcgattgaag tttgtctaga 12600
cgtgttgcta gattatcttc tatacgcttg tctataaatt catctatatt gtctagatta 12660
ttagttgtga ctttatctag acgttgttca atattgtcta tacgctgttc gagggatgtg 12720
tctagatggg tgggagtgtg agaagtggga gtattaaacc tgttacctgc caaataccaa 12780
cgaacaaatt ctgttaacag tgctgaggcg ttggaacttt cagaactagc aaggttt 12837

Claims (8)

1.一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达方法，包括如下步骤：
(1)载体的构建：对489质粒进行全序列测序，并整理出489质粒中的酶切位点，先通过KpnI酶切489质粒，再通过限制酶XhoI进行第二次酶切反应；电泳回收大片段；
所述KpnI酶切10μl反应体系中：0×Buffer L：1-2μl，限制酶KpnI：1-2μl，质粒DNA：1-22μl，ddH2O：剩余；37℃保温2-3h，80℃灭活20mins；
所述XhoI酶切10μl反应体系中：0×Buffer L：1-2μl，限制酶XhoI：1-2μl，质粒DNA：1-2μl，ddH2O：剩余；37℃保温2-3h，80℃灭活20-30mins；
(2)vp28+egfp引物设计扩增：设计引物进行PCR并与步骤(2)中大片段连接，经过重叠PCR反应，得到vp28和egfp融合的片段vp28+egfp；
(3)大肠杆菌质粒制备：取30-50μL菌液加入5mL无菌LB培养液,37℃180-220rpm，过夜培养9-12h，将过夜培养的转化后的大肠杆菌用干净的LB培养液充分清洗后提取大肠杆菌质粒；使用引物vp28上游和vp28下游对大肠杆菌质粒与片段vp28+egfp进行PCR得到重组质粒489-vp28-eGFP。
2.一种权利要求1所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，包括如下步骤：
S1：供体菌大肠杆菌转化与筛选：每50μl大肠杆菌感受态细胞中加入3-5μl重组质粒489-vp28-eGFP，轻轻混匀，冰浴30-40mins后，42℃80-100s热休克，迅速冰浴2-3min使体系冷却，过程中保持体系平稳，加入450-500μlLB培养液，37℃150rpm培养40-50mins；取100μl上述培养后大肠杆菌菌液加入抗生素的LB平板上，正放0.8-1.2h使菌液充分吸收，倒置培养10-12h后进行筛选，得到供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌；
S2：滤膜制备：制备所选蓝藻对应的培养液，将0.45μm滤膜浸泡其中，高压灭菌20mins；
S3：供体菌和辅助菌大肠杆菌的制备：首先分别将1ml步骤S1得到的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与1ml辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液接到40-50ml LB中37℃，200rpm活化2-3h，然后进行离心收菌，回收4-5ml菌用LB冲洗后离心，用400-500μl LB将所收菌重悬，获得重悬后的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液，将重悬后的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液等体积混合后接到40-50ml LB中37℃，200rpm摇菌12-24h，得到含489-vp28-egfp的供体菌大肠杆菌和含辅助质粒PR4-PRL-542的辅助菌大肠杆菌的混合菌液；
S4：蓝藻的准备：取对数期成长蓝藻，室温下离心收藻，悬浮于培养液中，使细胞中浓度为2-5*108个/mL；
S5：取藻：取步骤S4中对数生长期、浓度为2-5*10 8个/mL的蓝藻1.5-2mL，离心2-3mins，获得离心后的蓝藻；
S6：冲洗：将步骤S5中离心后的蓝藻用蓝藻所需的培养液冲洗2次，获得冲洗后的蓝藻；
S7：重悬：取1-2ml培养液将步骤S6中冲洗后的蓝藻重悬，获得重悬的蓝藻；
S8：接合转移：将步骤S7中重悬的蓝藻和步骤S3中含489-vp28-egfp的供体菌大肠杆菌和含辅助质粒PR4-PRL-542的辅助菌大肠杆菌的混合菌液按照1：10体积比例混合均匀后将其涂于无抗生素的固体培养基上，涂于滤膜上，正置平板30-60mins，使液体完全渗入培养基中，倒置培养1-2天，转移滤膜到含有相应抗生素的固体培养基上，每周更换一次平板，2周后，获得阳性蓝藻；
S9：转基因蓝藻的筛选和转化：将步骤S8中的阳性蓝藻接种到含有相应抗生素的培养液中，抗生素的浓度由低到高，逐渐升高，待生长稳定后，在平板上划得单藻落；筛选时，当从抗生素浓度A到B后，1周后，再回到A。
3.根据权利要求1所述的一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达方法，其特征在于：所述的489质粒中含有光系统II的psba启动子。
4.根据权利要求2所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，其特征在于：所述步骤S1中抗生素为硫酸卡那霉素，其浓度为80-120μg/ml。
5.根据权利要求2所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，其特征在于：所述步骤S2、S4、S6、S7和S9中培养液为为BG-11培养液。
6.根据权利要求2所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，其特征在于：所述步骤S4中的蓝藻选自聚球藻7942。
7.根据权利要求2所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，其特征在于：所述步骤S8和S9中的固体培养基为BG-11固体培养基。
8.根据权利要求2所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，其特征在于：所述步骤S8和S9中抗生素为Kana。
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