CN101283090A - 菌蚋荧光素酶 - Google Patents

Abstract

本发明公开了菌蚋(Arachnocampa)(双翅目)基因组内的基因编码的荧光素酶肽的核苷酸和氨基酸序列。具体地，本发明提供了催化发射光谱在波谱蓝光部分内的发光反应的功能性、依赖ATP的荧光素酶。本发明具体地提供分离的肽和核酸分子，鉴别酶肽的直向同源物和活性子序列的方法，以及鉴别荧光素酶肽的调节物和底物的方法。本发明提供了多种检验方法，其包括使用至少两种依赖ATP的荧光素酶的多报道基因检验。

Description

菌蚋荧光素酶

技术领域

本发明主要涉及荧光素酶。具体地，本发明涉及荧光素酶的蛋白质和肽，其功能是催化依赖ATP的发光反应，该反应在波谱蓝光部分内产生最大强度的发光光谱，本发明还涉及使用这些荧光素酶的检验。在进一方面，本发明涉及自菌蚋(Arachnocampa)属(双翅目)的有机体分离的荧光素酶。

背景技术

使用报道基因分子或标记来定性或定量地监控分子行为是已经确立的。它们见于如下用途的检验中：用于医学诊断，用于检测工业环境中的毒素和其它物质，以及用于生物、生物医学和生物化学的基础和应用研究中。这些检验包括免疫检验、核酸探针分子杂交检验和其中通过在特定启动子控制下的表达而产生报道酶或其它肽的检验。这些检验系统中的报道分子或标记包括放射性同位素、荧光剂、酶和化学发光剂。

使用化学发光来监控或检测所关注行为的检验系统包括测量生物发光酶——荧光素酶的活性的检验。

发光系统是已知的，并分离自许多发光有机体，其包括细菌、原生动物、腔肠动物、软体动物、鱼类、倍足纲节动物、蝇、真菌、蠕虫、甲壳动物和甲虫，特别是Pyrophorus属叩头虫和Photinus、Photuris和Luciola属的萤火虫。其它表现出生物发光的有机体列于WO/2000/024878和1999/049019。另外参见Viviani，V.R.，(2002)Cell.Mol.Life Sci.59：1833-1850，其列举了生物发光的陆生节肢动物和昆虫的性质。

在许多这些有机体中，酶催化单加氧作用，使用产生的自由能，将分子激发至高能态。当激发分子自发地返回基态时，发射出可见光。这种发射的光称为“生物发光”。其在下文中也简称作“发光”。

自最早的研究以来，甲虫荧光素酶(特别是来自常见的北美萤火虫物种Photinus pyralis)已经成为理解生物发光的范例。荧光素酶的基础知识和应用通常是基于源自Photinus pyralis的单一酶，其称作“萤火虫荧光素酶”。但是，全球有大约1800种发光甲虫。因此，Photinuspyralis的荧光素酶是大量各种各样的甲虫荧光素酶的一个例子。已知所有的甲虫荧光素酶均催化同一底物——多杂环有机酸(除非另外指出，其在下文中称作“荧光素”)的反应，该底物转化成高能分子。有可能在每种情况下催化的反应必然伴随同样的机制。

甲虫荧光素酶，包括所谓的萤火虫荧光素酶，均为形成腺苷酸的酶总科的成员。甲虫荧光素酶催化的多步反应与其它形成腺苷酸的酶催化的反应具有一些相似性，上述其它形成腺苷酸的酶是例如酰基-CoA连接酶、各种其它的CoA连接酶(例如4-香豆酸-CoA连接酶)和肽合成酶。

反应第一步是腺嘌呤单磷酸酯(腺苷酰化)与D-荧光素的羧碳加成，形成荧光素化-AMP(luciferyl-AMP)。ATP是AMP的来源，其它反应产物是焦磷酸酯。因此，该反应“依赖ATP”或“ATP依赖性”。推测焦磷酸酯的水解用于驱动反应前进。荧光素-AMP是乙酸和磷酸的混合酸酐。由于腺苷酰基团是良好的离去基团，其是相对反应性的。在类似的酶中，第一步也是羧酸酯在底物分子上的腺苷酰化，无论其为乙酸酯、长链脂肪酸、4-香豆酸酯、还是氨基酸。

在使用CoA的酶的情况下，通常会有CoA巯基对腺苷酸化羧酸的亲核进攻，导致CoA与底物接合。在甲虫荧光素酶的情况下，会有羰基处分子氧的进攻，产生高能二氧杂环丁烷中间体，其随后衰变，释放出通常在波谱绿-黄部分(550-570nm)内的光子加二氧化碳。

荧光素酶具有使其特别可用作生物传感(使用报道系统揭示生物系统的性质)的报道分子的特征。生物传感器(包括生物组分的传感器)中的信号转导通常包括两步过程：通过生物组分的信号产生、和通过电组分的信号转导和放大。信号产生通常通过结合或催化来实现。

这些生物化学现象转变成电信号，通常是基于电化学或热量检测方法，其受到生物化学反应的自由能变化的限制。对于大多数反应来说，这小于两分子ATP水解的能量，或大约70kJ/摩尔。但是，荧光素酶引起的发光载有高得多的能量含量。萤火虫荧光素酶催化的反应发出的光子(560nm)具有214Kj/爱因斯坦。萤火虫荧光素酶以很高的效率和出色的信噪特性将化学能转化成光。每分子D-荧光素的量子效率为0.88(Seliger和McElroy 1960；Seliger和W.D 1960)。因此这种酶是极为有效的化学能转导物。

但是，已知的依赖ATP的荧光素酶，如甲虫荧光素酶，在相对较窄的发射光谱范围内发光。已知的甲虫荧光素酶中无一在小于或等于530±5nm的波长下以最大发射强度发光(Viviani 2002；Nakatsu等人2006)。事实上，对已知荧光素酶的结构修饰使发射光谱能量降低(即，降至较大波长处的最大发射强度)，但不增加发射光谱的能量(即，至较短波长处)。目前认为结构修饰如何改变发射光谱的进一步信息可以参见Nakatsu等人(2006)。

荧光素酶已经从各种来源中直接分离出，其cDNA已有报道。参见，例如：de Wet等人，Molec.Cell.Biol 7，725-737(1987)；Masuda等人，Gene 77，265-270(1989)；Nakatsu等人(2006)；和Wood等人，Science 244，700-702(1989)。在已有编码荧光素酶的cDNA的情况下，通过从已经转化成表达cDNA的培养物或类似物中的细菌(例如大肠杆菌(E.coli))、酵母、哺乳动物细胞分离来制备大量的荧光素酶对技术人员来说完全是很简单的。或者，在适当启动子和其它表达控制信号的控制下，cDNA可以在这样的细胞中用于提供荧光素酶(从而最终催化生物发光)作为信号，以指示启动子的活性。而启动子的活性可以反过来反映出寻求监控的另一因素，例如诱导或抑制启动子活性的物质的浓度。近来出现的各种从编码蛋白的核酸制造该蛋白的无细胞系统，也可以用于制造荧光素酶。

通过将这种cDNA的表达和随后产生酶与遗传行为偶联，很容易获得编码荧光素酶的cDNA，使得有可能在用于对与转录和翻译有关的这种遗传行为进行信号传达、监控或测量的检验中使用荧光素酶作为报道基因。

例如，萤火虫荧光素酶已经广泛用于检测真核生物和原核生物中的启动子活性。发光反应所需的底物，包括荧光素或其它底物、氧和ATP是可获取的，或很容易在活细胞内获得。

多报道基因检验

常常使用多、双(或双重)报道基因来提高实验精确度。术语“双报道基因”是指在单一系统中同时表达并测量两种单独的报道酶。术语“多报道基因”是指在单一系统中同时表达并测量两种或更多种单独的报道酶。当一起使用时，两种或更多种单独的报道酶可以称作“共报道基因”。目前得益于多报道基因检测的例子包括在遗传上操纵以同时表达两种不同报道基因的单独的细胞或细胞群(例如分散在培养物中的细胞、分离的组织或整个动物)。更常见地，一个基因的活性报道特定实验条件的影响，而第二个报道基因的活性提供内部对照，从而可以对全套的实验值进行归一化。实验报道基因的活性相对于内部对照的活性的归一化，使得诸如细胞生活力或转染效率差异造成的实验可变性得以最小化。可变性的其它来源，例如移液体积的差异、细胞溶解效率和检验效率，可以有效地消除。因此，通过减少外部影响，双报道基因检验常常使实验数据的解释更为可靠。

可以得益于双酶报道基因技术的无细胞重构系统，是从编码实验和对照报道酶的独立遗传材料的同时翻译或偶联转录和翻译得到的细胞溶解产物。免疫检验可以类似地指定用于在单一样品内双重报道实验值和对照值。

目前，编码萤火虫荧光素酶(luc)、海肾(Renilla)荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-半乳糖苷酶(lacZ)、β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)和各种磷酸酶例如分泌的碱性磷酸酶(SEAP)和子宫运铁蛋白(Uf；酸性磷酸酶)的基因已经被组合，并用作遗传活性的共报道基因。以下参考文献提供了用于遗传活性双报道目的的以组合形式使用的这些各种报道基因的代表性例子：luc和GUS：Leckie，F.，等人，1994；luc和CAT，luc和lacZ：Jain，V.K.和Magrath，I.T.，1992；CAT和lacZ：Flanagan，W.M.，等人，1991。另外参见Promega Dual-Luciferase^TM报道基因检验系统、Dual-Glo^TM荧光素酶检验系统，描述于其技术手册中：Instructions for use of Products E2920，E2940，and E2980，revised 1/06，Part Number TM058；和Wood，K.V.，(1998)The Chemistry ofBioluminescent Reporter Assays，Promega Notes 65，第14页；以及Promega pGL3荧光素酶报道基因载体(获自Promega Corporation，Madison，Wis.)；以及美国专利第5,744,320号和第5,670,356号。

任何多报道基因检验的性能受到构成的酶化学的特性和相容性、以及分别的结果相互关联能力的限制。完全不同的酶要求或检验条件可以指示共报道基因不能用于集成的单一检验混合物或单管格式。理想地，多报道基因系统将会包括至少两个具有相容要求的酶检验，例如化学、温度、处理要求、速度、敏感性、检测仪器等。

在满足多报道基因系统理想要求的尝试中，在生物发光报道基因系统中可以一起使用不同荧光素酶的克隆，特别是单一属或种的荧光素酶。但是，区分混合物中每种荧光素酶的能力受到其发射光谱宽度的限制。使用两种或更多种不同荧光素酶作为报道基因的系统需要荧光素酶的发光颜色有可测量的差异。

发光颜色差异的一个例子发生在Pyrophorus plagiophthalamus-加勒比本地产的一种大的叩头虫。参见，例如，公开于2003年9月4日的美国专利申请第20030166905号。该甲虫具有两套发光器官，一对在前胸的背侧表面上，一个单独的器官在腹部的腹侧全裂口中。已经从腹部器官中分离出四种不同的荧光素酶克隆，并命名为LucPplGR、LucPplYG、LucPplYE和LucPplOR。这些酶催化的荧光素-荧光素酶反应产生绿色至橙色的光。

这四种荧光素酶催化的荧光素酶-荧光素反应的光谱数据显示出发射绿光(峰强度：546纳米)、黄绿光(峰强度：560纳米)、黄光(峰强度：578纳米)和橙光(峰强度：593纳米)的4个几乎等距的重叠的峰。如本文所用，例如，峰强度：546纳米，是指荧光素酶催化的发光反应产生的发光光谱的最大发射发生在546纳米处或附近。该上下文的术语“附近”是指峰或最大强度发生处波长(也称为λ-max)的波长测量中的正常精度限制。正常精度限制为，例如，正负5纳米(即±5nm)

不幸的是，尽管这些荧光素酶发出的光的峰强度的波长范围超过大约50nm，即使在546nm和593nm处的峰之间也存在相当大的光谱重叠。因此增加所采用的发光反应之间峰强度波长的差异是极为合意的，以在使用两种或更多种荧光素酶的系统中得到更高的测量精度。具体地，催化产生的最大强度等于或小于大约530nm的发光反应的新的荧光素酶是极为合意的。等于或小于大约530nm的峰强度在波谱的蓝光部分内。

在满足这一需求的一种尝试中，已经在具有萤火虫荧光素酶的双报道基因系统中开发出海肾(sea pansy)Renilla reniformis的发射蓝光的发光系统。海肾(Renilla reniformis和密切相关的种)的发光在蓝光光谱内，这在一些应用中提供了相对于黄绿发光的优势。海肾光反应的化学与甲虫的不相关，反应中间体通过不同于甲虫荧光素酶的途径产生。具体地，海肾荧光素酶催化腔肠素(coelenterazine)到腔肠素酰胺(coelenteramide)的氧化，在480nm处发出蓝光。可能涉及二氧杂环丁烷中间体，但不发生腺苷酰化。海肾荧光素酶在进化上与甲虫荧光素酶或形成腺苷酸的酶不相关。参见，例如，美国专利第5,292,658号和第5,418,155号。

海肾荧光素酶的优势和局限

海肾荧光素酶/腔肠素系统作为基因表达报道基因的主要优势在于，其使用不同于甲虫荧光素的底物在蓝光光谱内发光。因此，海肾荧光素酶可以与甲虫荧光素酶/荧光素一起用于双标记实验。参见，例如，美国专利第5,744,320号。然而，在其它方面，海肾荧光素酶则劣于甲虫荧光素酶，因为腔肠素底物表现出低水平的非酶促发光。该水平的自发光根据环境的疏水性变化，这两个现象一起严重限制了检验的绝对灵敏度。

甲虫荧光素酶不会受困于这一缺陷，推测是因为可氧化的底物(荧光素化-AMP)从不会发现游离在溶液中，而是如上文所述，随着酶上发生的氧化而合成，同时被荧光素酶紧密结合，随后非常短龄。

海肾荧光素酶的其它缺点在于，其不能直接用于有关ATP定量的应用，因为反应不使用ATP。另外，海肾荧光素酶在活性或未淬灭的甲虫荧光素酶的存在下不能经受连续双标记检验。

Orfelia fultoni

Orfelia fultoni是一种发现于北美的生物发光蝇(双翅目)(Fulton，1941)。其通常的生物性质与下一部分描述的菌蚋属澳大拉西亚蝇非常相似。根据Viviani，Hasting等人(Viviani，Hastings等人2002)，Orfelia发出λmax＝460nm的蓝光，波长比来自其它昆虫的光要短。有趣的是，Orfelia发光不依赖于ATP，该特性区别于所有其它昆虫的发光，其由一些温和的还原剂刺激。Viviani，Hastings等人已经在生物化学上部分表征了Orfelia的荧光素酶(Viviani，Hastings等人.2002)。

菌蚋

遍及东澳大利亚在受保护的栖息地存在有发射蓝光的萤火虫，这是澳大利亚土著数万年来已知的。密切相关的物种以壮观的浓度出现在新西兰。萤火虫使用其蓝色发光引诱猎物进入粘性网中，其是keroplatid蝇的幼虫。但是，最初的欧洲的描述将其误认为与欧洲的萤火虫雌大萤火虫(Lampyris noctiluca，鞘翅目，荧科昆虫)相关的甲虫的幼虫。目前认识的澳大拉西亚萤火虫(双翅目：菌蚊科(Keroplatidae)：菌蚋亚科(Arachnocampinae))的物种(Baker 2004；Harrison 1966；Pugsley 1983)部分列于表1。

表1

名称属(亚属)种(权威)
	菌蚋(Campara)richardsae(Harrison)
菌蚋(菌蚋)tasmaniensis(Ferguson)
	菌蚋(Campara)girraweenensis(Baker)
菌蚋(Campara)gippslandensis(Baker)
	菌蚋(Campara)otwayensis(Baker)
菌蚋(Campara)tropicus(Baker)
	菌蚋(菌蚋)buffaloensis(Baker)
菌蚋(Campara)flava(Harrison)
	菌蚋(菌蚋)luminosa(Skuse)

根据(Shimomura，Johnson等人，1966)，菌蚋发射光谱的最大值为487±5nm，这非常符合A.richardsae呈现的校正发射光谱(Lee 1976)。Viviani，Hastings等人(2002)提出A.flava的发射最大值为484nm。Lee(1976)也表明菌蚋荧光素酶的发光受ATP激发，并要求Mg⁺⁺。短波长的发射表明菌蚋荧光素酶底物不同于甲虫荧光素(Wood 1983)，事实上，尚未证实甲虫D-荧光素刺激菌蚋荧光素酶(Lee 1976；Wood1983；Viviani，Hastings等人，2002)。

Wood(1983)表明，耗尽的菌蚋光器官的冷提取物的发光可以通过加入热处理过的提取物而再生。Viviani，Hastings等人(Viviani，Hastings等人2002)能够使用酸性乙酸乙酯提取一些菌蚋荧光素，并使用TLC进行部分分离。关于天然菌蚋荧光素尚不能得到结构信息。根据Viviani，Hastings等人(2002)，菌蚋荧光素酶的分子量通过凝胶过滤推测为36kDa，即大约是萤火虫荧光素酶分子量(其为62kDa)的一半(Conti，Franks等人1996)。

发明内容

一方面，本发明提供一种分离的肽，其包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供一种分离的肽，其包括选自SEQ ID NO：2、SEQ IDNO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中该变体由以下核酸分子编码，该核酸分子在严格条件下与序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。

另一方面，本发明提供一种分离的肽，其包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中该直向同源物由以下核酸分子编码，该核酸分子在严格条件下与序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。

再另一方面，本发明提供一种分离的肽，其包括的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列的片段。在具体的实施方式中，本发明包括分离的肽，其具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列共享至少70％、80％或90％的同一性。在一些优选的实施方式中，本发明的分离的肽的分子量大于36千道尔顿(kD)。这些肽可以称为“本发明的肽”。

在特别优选的实施方式中，本发明提供本发明的肽的酶活性部分，其造成发光反应的催化，该发光反应的光谱在小于或等于530±5nm的波长处表现最大发射。在特别优选的实施方式中，发光反应依赖于ATP。

如本文所示，±5nm反映出这种波长可以明确的典型精度。具体地，优选实施方式发光反应产生最大发射强度在小于或等于520±5nm、510±5nm、500±5nm或490±5nm的波长处的发射光谱。表现出这些荧光素酶活性的这些肽可以称为本发明的“活性荧光素酶”或“表现荧光素酶活性的本发明的肽”、“功能性荧光素酶”或“GW荧光素酶”。

在优选的实施方式中，本发明提供一种表现荧光素酶活性的分离的肽，其中荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应，该发光反应产生最大发射强度在小于或等于530±5nm的波长处的发射光谱。在一个实施方式中，肽包括与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQID NO：8和SEQ ID NO：10的序列的氨基酸200-350的序列同一性为至少70％的连续氨基酸序列。

在另一具体实施方式中，本发明提供一种表现荧光素酶活性的分离的肽，其中荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应，该发光反应产生最大发射强度在小于或等于530nm的波长处的发射光谱，并且其中分离的肽具有如下氨基酸序列，当与Photinus荧光素酶(例如SEQ ID NO：4)比对时，与SEQ ID NO：4的差异在于选自R218缺失、H245N、G315S、L342S和T343S的至少一处氨基酸序列变化。在再另一个实施方式中，这样的肽具有如下氨基酸序列，当与SEQ ID NO：4比对时，与SEQ ID NO：4的差异在于选自A22Y、Y53A、L63T、E83D、F88Y、F89Y、P91I、A103C、Y109W、E113D、V139I、G160P、S198T、H212Q，R218缺失、D224S、P225缺失、G228D、P233K、P242Q、F243Y、H245N、L253M、Y255R、F273Y、Y280F、S298K、L300E、E311R、G315S、P318T、L319V、G339F、L342S、T343S、D375H、K380A、E389F、T408S、W417Y、L418V、D427N、L441I、I442V、K443M、Y444V、K445D、Q448A、A452T、L458I、V485L、V486T、G490R、V506L、R513K、V516C、T527A、和从K549开始且包括其至羧端的所有残基缺失的至少一处氨基酸序列变化。本发明的肽包括基于SEQ ID NO：4序列但包括一处或多处如上文列出或在表5中列出的氨基酸序列变化的肽，其在下文详细说明。

在其它的优选实施方式中，本发明的表现荧光素酶活性的分离的肽具有的氨基酸序列与选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列共享至少70％的同一性。

在具体的实施方式中，活性荧光素酶肽包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。在另一方面，本发明提供一种活性荧光素酶肽，其包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中该变体由以下核酸分子编码，该核酸分子在严格条件下与序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。

另一方面，本发明提供一种活性荧光素酶肽，其包括选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中该直向同源物由以下核酸分子编码，该核酸分子在严格条件下与序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。

再另一方面，本发明提供一种活性荧光素酶肽，其包括的氨基酸序列包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ IDNO：10的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列的片段。在具体的实施方式中，本发明包括活性荧光素酶肽，其具有的氨基酸序列与选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列共享至少70％、80％或90％的同一性。在一些优选的实施方式中，本发明的表现荧光素酶活性的活性肽的分子量大于36千道尔顿。

本发明的另一方面包括选择性地结合本发明的肽的抗体。在优选的实施方式中，这样的抗体可以用于检测选自如下的本发明的肽的存在：(a)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中该变体由在严格条件下与SEQID NO：1所示的核酸分子或其互补体杂交的核酸分子编码；(c)SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列的直向同源物的氨基酸序列，其中该直向同源物由在严格条件下与SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其互补体杂交的核酸分子编码；和(d)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的片段，其中该片段包括至少10个连续氨基酸。

本发明进一步包括一种分离的核酸分子，其包括的核苷酸序列编码选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。本发明同样包括一种核苷酸序列，其编码选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的变体，其中该核苷酸序列在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。而且，本发明包括一种核苷酸序列，其编码选自SEQ IDNO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的直向同源物，其中该核苷酸序列在严格条件下与选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。再进一步，本发明包括一种核苷酸序列，其编码选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的至少10个连续氨基酸的片段，还包括该核苷酸序列的互补体的核苷酸序列。

本发明包括的所述的核酸分子可以称为“本发明的核酸分子”。本发明包括其为本发明的核酸分子的互补体的核苷酸序列。

在其它各个实施方式中，本发明进一步包括在基因芯片、转基因细胞、核酸载体或宿主细胞内包括的本发明的核酸分子。

本发明的方法包括检测样品中本发明的核酸分子的存在的方法。因此，在具体的实施方式中，该方法包括使样品与寡核苷酸接触，该寡核苷酸与本发明的核酸分子在严格条件下杂交，以及检测寡核苷酸是否与样品中的核酸分子结合。

本发明的其它方法包括，例如，监控所关注基因或其一部分在宿主细胞中的表达的方法，该方法包括：(a)向宿主细胞内引入载体构建物，该载体构建物包括本发明的核酸分子，并进一步包括编码目的核苷酸序列或产物的核酸分子；其中本发明的核酸分子和目的序列或产物共表达；和(b)检测本发明的核酸分子的表达的存在，从而监控目的序列或产物的表达。

在本发明的具体方法中，本发明的核酸分子编码表现荧光素酶活性的肽。因此，在本发明的优选方法中，检测本发明的核酸分子表达的存在包括荧光素酶活性检验。在特别优选的方法中，荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应，该发光反应产生最大发射强度在小于或等于530±5nm的波长处的发射光谱。

在本发明范围内的其它实施方式中，表达载体包括与启动子操作(operative)连接的本发明的核苷酸序列。在具体的实施方式中，启动子在选自植物细胞、细菌细胞、动物细胞和昆虫细胞的细胞中有功能。在再一个实施方式中，载体进一步包括编码所关注的其它序列或产物的核苷酸序列。所关注的其它序列或产物可以是核酸、蛋白质、活性荧光素酶或其酶活性部分。当然，在其它的实施方式中，本发明包括含有本发明的载体的宿主细胞。宿主细胞可以是任何合适的细胞。在具体的实施方式中，宿主细胞选自植物细胞、昆虫细胞、真菌细胞、动物细胞和细菌细胞。

在再另一个方面，本发明的方法包括用目的核酸或其部分转化或转染宿主细胞的方法，该方法包括：(a)向宿主细胞中引入载体构建物，该载体构建物包括编码表现荧光素酶活性的肽的本发明的核酸分子，其中表现荧光素酶活性的肽被表达；和(b)检测荧光素酶活性，从而确认宿主细胞被转化或转染。

在另一个实施方式中，本发明的方法包括监控宿主细胞中控制器元件(controller element)的活性的方法，该方法包括：(a)向宿主细胞中引入载体构建物，该载体构建物包括本发明的核酸分子，其与控制器元件操作连接；和(b)检测荧光素酶的存在，从而监测控制器元件的活性。该实施方式中的控制器元件可以是启动子或增强子。本发明的核酸分子可以编码表现荧光素酶活性的肽。在肽表现荧光素酶活性的这样的实施方式中，检测荧光素酶的存在可以是荧光素酶活性的检验。

本发明的其它方法包括将化合物鉴别为功能性荧光素酶的推定底物的方法，该方法包括：(a)使本发明的核酸分子编码的功能性荧光素酶在适合于功能性荧光素酶活性的条件下与至少一种候选化合物接触；和(b)检验荧光素酶活性，其中荧光素酶活性的检测表明至少一种候选化合物是功能性荧光素酶的推定底物。通过本发明的方法的操作鉴别的新的化合物明显包括在本发明的范围之内。

本发明的特别优选的方法包括在等分试样中测量至少两种报道酶的活性的方法，该方法包括通过测量发光反应被第一报道酶催化产生的光信号来检验第一报道酶的活性，以及通过测量发光反应被至少第二报道酶催化产生的光信号来检验至少第二报道酶的活性。该方法包括那些检验在相同等分样品中进行的方法。在这些实施方式中，检验可以以任意顺序、分组、或所要的时间顺序或常规进行。在具体的实施方式中，多种检验同时进行。在另外的具体实施方式中，至少一种检验在至少第二检验之前进行，或者至少一种检验在所有其它检验之后进行，或者检验依次进行。在具体的实施方式中，第一报道酶包括本发明的活性荧光素酶。当然，在特别优选的实施方式中，报道酶中的至少一种是表现荧光素酶活性的肽，其中荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应，该发光反应产生最大发射强度在小于或等于530±5nm的波长处的发射光谱。

在再另一个实施方式中，至少两种报道酶是依赖ATP的荧光素酶。在特别优选的实施方式中，第一报道酶是菌蚋荧光素酶，第二报道酶是不同的荧光素酶。“不同的荧光素酶”是指任何其它荧光素酶，无论依赖或不依赖ATP。特别优选的不同的荧光素酶包括萤火虫、扣头虫或铁路虫(railroad worm)的荧光素酶。其它优选的荧光素酶催化的发光反应产生最大发射强度在大于530nm的波长处的发射光谱。

本发明的其它目标、特征和优势根据以下详细说明将是显而易见的。但应当理解到，尽管本发明说明了具体的实施方式，详细说明和具体实施例仅仅作为示例给出，因为根据该具体说明，各种本发明精神和范围内的变化和修改对于本领域技术人员来说将是显而易见的。

附图说明

以下附图形成本说明书的一部分，其被包括以进一步说明本发明的某些方面。参考这些附图中的一个或多个并结合本文给出的本发明的具体说明，可以更好地理解本发明。

图1A.Arachnocampa richardsae荧光素酶的共有核苷酸序列(SEQID NO：1)。

图1B.Arachnocampa richardsae荧光素酶的共有核苷酸序列(SEQID NO：1)，续自图1A。

图2A.Arachnocampa richardsae荧光素酶的核酸序列和对应的氨基酸序列。

图2B.Arachnocampa richardsae荧光素酶的核酸序列和对应的氨基酸序列，续自图2A。

图3.Arachnocampa richardsae荧光素酶的共有氨基酸序列(SEQID NO：2)。

图4.本发明的荧光素酶的核酸序列(SEQ ID NO：3)。

图5A.本发明的荧光素酶肽的核酸序列和对应的氨基酸序列。

图5B.本发明的荧光素酶肽的核酸序列和对应的氨基酸序列，续自图5A。

图5C.本发明的荧光素酶肽的核酸序列和对应的氨基酸序列，续自图5B。

图6A.来自18个物种的发光甲虫的荧光素酶氨基酸序列与Arachnocampa richardsae荧光素酶的比对。

图6B.来自18个物种的发光甲虫的荧光素酶氨基酸序列与Arachnocampa richardsae荧光素酶的比对，续自图6A。

图6C.来自18个物种的发光甲虫的荧光素酶氨基酸序列与Arachnocampa richardsae荧光素酶的比对，续自图6B。

图6D.来自18个物种的发光甲虫的荧光素酶氨基酸序列与Arachnocampa richardsae荧光素酶的比对，续自图6C。

图6E.来自18个物种的发光甲虫的荧光素酶氨基酸序列与Arachnocampa richardsae荧光素酶的比对，续自图6D。

图7.菌蚋荧光素酶在酰基-CoA连接酶超家族的其它荧光素酶的分子种系学中的位置。

图8.本发明的肽从GWLuc#1的表达。条带编号自左向右。第一个条带显示分子量标准，以千道尔顿(kD)标记。其它条带显示用pETDuet-1：FFLuc(条带3-5)和pETDuet-1：GWLuc#1(条带6-8)转化的大肠杆菌菌株BL21(DE3)。条带4和7显示在没有IPTG的情况下孵育48小时的培养物样品。条带3和6显示培养物的预感应样品。条带5和8显示在0.4mM IPTG的存在下孵育48小时并表达相关构建物的培养物样品。

图9.来自萤火虫Photinus pyralis的荧光素酶的天然氨基酸序列(FF荧光素酶；SEQ ID NO：4)。

图10.编码A.flava荧光素酶的核酸序列(SEQ ID NO：5)。

图11.A.flava荧光素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：6)。

图12.编码A.girraweenensis荧光素酶的核酸序列(SEQ ID NO：7)。

图13.A.girraweenensis荧光素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：8)。

图14.编码A.tasmaniensis荧光素酶的核酸序列(SEQ ID NO：9)。

图15.A.tasmaniensis荧光素酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：10)。

图16.生物发光被本发明的荧光素酶提高。

图17.生物发光通过增加本发明的荧光素酶的量而定量响应。

图18.校正曲线。

图19.加热变性消除生物发光活性。

图20.生物发光依赖于荧光素和ATP。

图21.生物发光活性特异于本发明的肽。

图22.本发明的肽不使用腔肠素(coelentarazine)作为底物。

图23.本发明的肽产生的最大生物发光发生在小于530±5nm波长处。

图24.本发明的生物发光活性在酵母中的表达。

图25A.四种菌蚋荧光素酶肽的多序列比对。

图25B.图25A的比对之续。

具体实施方式

以下的具体实施方式和实施例的详细说明是作为范例提供，而不加以限制。除非有相反指示或另外指出，在这些说明中以及本说明书全文中，术语“一个”和“一种”是指一或更多个(种)。类似地，术语“或”是指“和/或”。

“包括”是指包括但不限于，不论单词“包括”后是何物。因此，使用术语“包括”表明列出的元素是需要的或强制的，但其它元素是任选的，可以存在或不存在。“由……组成”是指包括并限于，不论短语“由……组成”中是何物。因此，短语“由……组成”表明列出的元素是需要的或强制的，并且不可以存在其它的元素。“基本由……组成”是指包括该短语中列出的任何元素，并限于其它不干扰或有助于本公开中所列元素的活性或作用的元素。因此，短语“基本由……组成”表明列出的元素是需要的或强制的，但其它元素是任选的，取决于其是否影响所列元素的活性或作用而可以存在或不存在。

在提供数值范围的情况下，应当理解成，每一个该范围上限和下限之间的中间数值，除非上下文明显另外指出，直至下限的十分之一单位，以及任何其它所述的或所述范围内的中间数值，均包括在本发明之内。这些较小范围的上限和下限可以独立地包括在较小范围中，也包括在本发明之内，进行所述范围中的任何具体排除限定。

肽分子

本发明提供编码肽分子的核苷酸序列，该肽分子已经被鉴别为蛋白质的荧光素酶家族的成员。提供的肽序列，以及本文所述的明显变体，特别是本文鉴别并使用本文提供的信息的同属变体，将被称为本发明的酶、酶肽、肽或蛋白质。

本发明一方面提供分离的肽和蛋白质分子，其由图2、3、5、11、13、15或SEQ ID NO：2、6、8和10中公开的酶肽的氨基酸序列组成或基本由上述序列组成或包括上述序列，或者由图1、2、4、5、10、12、14或SEQ ID NO：1、3、11、13和15所示的核酸分子编码，以及这些的所有本领域制造和应用的明显变体。这些变体中的一些在下文中详细描述。

如本文所用，当肽基本上不含细胞物质或不含化学前体或其它化合物时，称肽是“分离”或“提纯”的。本发明的肽可以提纯至同质或其它纯度。提纯的水平将基于既定的应用。(分离的核酸分子的特征下文讨论)。

在一些应用中，“基本不含细胞物质”包括具有少于大约30％(干重)的其它蛋白质(即污染蛋白质)、少于大约20％的其它蛋白质、少于大约10％的其它蛋白质、或少于大约5％的其它蛋白质的肽的制剂。当肽重组产生时，其也可以基本不含培养基，即，培养基占蛋白质制剂体积的小于大约20％。

文字“基本不含化学前体或其它化合物”包括肽的制剂，其中它从涉及其合成的化学前体或其它化合物中分离。在一个实施方式中，文字“基本不含化学前体或其它化合物”包括具有少于大约30％(干重)的化学前体或其它化合物、少于大约20％的化学前体或其它化合物、少于大约10％的化学前体或其它化合物、或少于大约5％的化学前体或其它化合物的酶肽的制剂。

分离的酶肽可以从天然表达其的细胞提纯，从已经改变成表达其(重组体)的细胞提纯，或使用已知的蛋白质合成法合成。例如，将编码酶肽的核酸分子克隆到表达载体中，将表达载体引入宿主细胞内，蛋白质在宿主细胞中表达。然后可以通过合适的提纯方案使用标准蛋白质提纯技术从细胞中分离蛋白质。许多这些技术在下文中详细说明。

一方面，本发明提供由所提供的氨基酸序列组成的蛋白质。当氨基酸序列是蛋白质的最终氨基酸序列时，蛋白质由氨基酸序列组成。

在其它方面，本发明进一步提供基本由所提供的氨基酸序列组成的蛋白质。蛋白质基本由氨基酸序列组成，是指这样的氨基酸序列仅与几个额外地氨基酸残基存在，例如，在最终的蛋白质中大约1至大约100个额外的残基，通常为1至大约20个额外的残基。

在再另一个方面，本发明提供包括所提供的氨基酸序列的蛋白质。蛋白质包括氨基酸序列，是指氨基酸序列是最终蛋白质氨基酸序列的至少一部分。在这种方式中，蛋白质可以仅是肽，或者具有额外的氨基酸分子，例如与其天然联合的氨基酸残基(连续编码的序列)，或异源氨基酸序列或肽序列。这样的蛋白质可以具有几个额外的氨基酸残基，或者可以包括数百个或更多的额外的氨基酸。下文提供了如何制造或分离各种类型的这些蛋白质的简要说明。

本发明的酶肽可以与异源序列连接，以形成嵌合或融合蛋白质。这种嵌合和融合蛋白质可以包括与异源蛋白质操作连接的酶肽，该异源蛋白质具有的氨基酸序列与酶肽基本不同源。“操作连接”是指酶肽和异源蛋白质的融合使得各自的操作性均不被破坏。异源蛋白质可以融合到酶肽的N-端或C-端。

在一些应用中，融合蛋白不会影响酶肽本身的活性。例如，融合蛋白可以包括但不限于，酶促融合蛋白，例如β-半乳糖苷酶融合、酵母双杂化GAL融合、聚-His融合、MYC-标记、HI-标记和Ig融合。这些融合蛋白，特别是聚-His融合可以促进重组酶肽的提纯。在某些宿主细胞(例如哺乳动物宿主细胞)中，蛋白质的表达或分泌可以通过使用异源信号序列得到提高。

在一些应用中，融合蛋白可以是蛋白质互补检验或PCA的组分，其中活性酶分成两个结构域，每一个与相互作用子(interactor)结构域融合或连接，其通过吸引与第三分子连接在一起，使得原始酶的活性得以恢复。例如，参见，美国专利第6,270,964号和第6,342,345号。

嵌合或融合蛋白可以通过标准的重组DNA技术产生。例如，根据传统技术将编码不同蛋白质序列的DNA片段在框内连接在一起。在另一实施方式中，融合基因可以通过传统技术，包括自动DNA合成仪来合成。或者，PCR扩增或基因片段的连接可以使用锚定引物进行，该锚定引物产生出两个相邻基因片段之间的互补突出端，其随后可以复性并再扩增，以产生嵌合基因序列(参见Ausubel等人，Current Protocolsin Molecular Biology，1998)。而且，许多表达载体是市售的，其已经编码融合部分(例如GST蛋白质)。编码酶肽的核酸可以克隆到这样的表达载体中，使得融合部分在框内与酶肽连接，这是在不破坏各组分操作性的情况下制造融合蛋白的一种方式。

如上文提及，本发明还提供并激活本发明蛋白质的氨基酸序列的明显变体，例如肽的天然成熟形式、肽的等位或序列变体、肽的非天然重组衍生的变体、以及肽的直向同源物和种内同源基因。本领域技术人员理解的可以自菌蚋属(双翅目)分离的本发明肽的直向同源物和类似物，是本发明的肽的优选实施方式。这样的变体可以很容易使用重组核酸技术和蛋白质生物化学领域公知的技术产生。但应当理解，变体排除本发明之前公开的任何完全氨基酸序列。

使用分子技术和本文公开的序列信息，可以很容易地鉴别或制造这样的变体。而且，基于与本发明的酶肽的序列或结构同源性，可以很容易地区分这样的变体与其它的肽。存在的同一性程度将主要基于肽是功能变体还是非功能变体、种内同源基因家族中存在的趋异量、以及直向同源物之间的进化距离。

为了确定两个氨基酸序列或两个核苷酸序列的百分比同一性，鉴于最优比较目的，将序列比对(例如，对于最优比对，可以在第一和第二氨基酸或核苷酸序列的一个或二者中引入缺口，对于比较目的，可以忽略非同源序列)。在优选的实施方式中，将参比序列长度的至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或更多进行比对，用于比较目的。然后比较相应氨基酸位置或核苷酸位置处的氨基酸残基或核苷酸。当第一序列中的位置被与第二序列中相应位置相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，则分子在该位置处是同一的(如本文所用，氨基酸或核酸“同一性”等同于氨基酸或核酸“同源性”)。两个序列之间的百分比同一性是序列共享的同一位置的数目的函数，并考虑到缺口的数目和每个缺口的长度，这需要引入以便用于两个序列的最优比对。

变体与图2、3或5或SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列的序列同一性优选为至少60％，更优选与图2、3或5或SEQ ID NO：2中所列的氨基酸序列的序列同一性为至少70％、80％、90％、95％、98％或99％。

或者，如上文提及，序列同一性可以针对肽的特定区域计算，例如荧光素结合袋(binding pocket)。SEQ ID NO：2中所列的菌蚋(Arachnocampa spp)荧光素酶的氨基酸序列与甲虫荧光素酶的代表性成员Photinus pyralis的序列比较表明，荧光素结合袋区域(位于SEQ IDNO：2的大约氨基酸201至350)的序列同一性为大约28％，而C-端区域(SEQ ID NO：2的氨基酸351至530)的序列同一性为大约41％(表6)。N-端氨基酸1至100上的序列同一性为大约29％。因此，本发明的肽优选包括与SEQ ID NO：2的氨基酸201至350的序列同一性至少为50％的连续氨基酸序列，更优选与SEQ ID NO：2的氨基酸201至350的序列同一性至少为60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的连续氨基酸序列。或者，或额外地，本发明的肽优选包括与SEQ ID NO：2的氨基酸351至530的序列同一性至少为50％的连续氨基酸序列，更优选与SEQ ID NO：2的氨基酸351至530的序列同一性至少为60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的连续氨基酸序列。本发明的肽还可以包括与SEQ ID NO：2的氨基酸1至201的序列同一性至少为50％的连续氨基酸序列，更优选与SEQ ID NO：2的氨基酸201至350的序列同一性至少为60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％的连续氨基酸序列。

对来自18种发光甲虫的荧光素酶氨基酸序列的比较确认了完全保守的128个残基。当比较菌蚋物种的对应残基时，这些残基中的55个是不同的(加3处缺失)。在A.richardsae中不同的55个残基列于表5中。优选的肽包括的氨基酸序列包括对应于表5中所列的55个氨基酸残基，即Y26、A54、T64、D84、Y89、Y90、I92、C104、W110、D114、1140、P161、T197、Q211、S219、D221、K226、Q235、Y236、N238、M246、R248、Y266、F273、K291、E293、R304、S308、T311、V312、F332、S335、S336、H367、A372、F381、S400、Y409、V410、N419、I433、V434、M435、V436、D437、A440、T444、I450、L477、T478、R481、L497、K504、C507、A518。其它优选的肽包括的氨基酸序列包括对应于表5中所列的氨基酸序列，其位于荧光素结合袋中在大约氨基酸201至350处，即Q211、S219、D221、K226、Q235、Y236、N238、M246、R248、Y266、F273、K291、E293、R304、S308、T311、V312、F332、S335、S336。

两个序列之间的序列比较和百分比同一性和相似性的确定可以使用数学算法进行。(Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，Oxford University Press，New York，1988；Biocomputing：Informatics andGenome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in MolecularBiology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence AnalysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991)。

在优选的实施方式中，多序列对比和种系树使用PROTML或PROTPARS程序得到：PROTML(Adachi，J.和Hasegawa，M.1996：Molphy Version 2.3.用于基于最大概率的分子种族发育学的程序。Computer Science monographs No.28.东京统计数学学院的出版物)；和PROTPARS(Felsenstein，J.1989.PHYLIP-Phylogeny Inference Package(Version 3.2).Cladistics 5：164-166)。

成对比对和序列同一性和同源性的水平使用GCG软件包中的BestFit程序确定。两个氨基酸序列之间的百分比同一性可以使用Needleman和Wunsch的算法确定(J.Mol.Biol.48：444-453(1970))，其已经结合到GCG软件包中的GAP程序中。该算法的采用使用Blossom62矩阵(matrix)或PAM250矩阵，缺口重量(gap weight)为16、14、12、10、8、6或4，长度重量(length weight)为1、2、3、4、5或6。两个核苷酸序列之间的百分比同一性使用GAP程序确定(Devereux，J.，等人，Nucleic Acids Res.12(1)：387(1984))，使用NSWgapdna.CMP矩阵，缺口重量为40、50、60、70或80，长度重量为1、2、3、4、5或6。

本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步用作“查询序列(querysequence)”，以针对序列数据库进行检索，例如，以鉴别其它家族成员或相关序列。这种检索可以使用Altschul等人的NBLAST和XBLAST程序(version 2.0)进行(J.Mol.Biol.215：403-10(1990))。BLAST核苷酸检索可以用NBLAST程序进行，记分＝100，字长＝12，以得到与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检索可以使用XBLAST程序进行，记分＝50，字长＝3，以得到与本发明的蛋白质同源的氨基酸序列。为了得到缺口比对用于比较目的，可以使用如Altschul等人所述的缺口BLAST(Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402(1997))。当使用BLAST和缺口BLAST程序时，可以使用各个程序(例如XBLAST和NBLAST)的缺省参数。

包括本发明的肽之一的、全长预加工形式以及成熟加工形式的蛋白质，可以容易地鉴别为与本发明的酶肽之一具有完全的序列同一性，而且被编码本文提供的酶肽的核酸分子编码。

酶肽的等位变体可以容易地鉴别为与本文公开的酶肽的至少一部分具有高度序列同一性的菌蚋荧光素酶肽。如本文所用，当氨基酸序列的同源性通常为至少大约70-80％、80-90％、最有利地至少大约90-95％或更高时，两种蛋白质(或蛋白质的区域)具有高度的序列同一性。根据本发明，显著同源的氨基酸序列将被在下文更充分描述的严格条件下与编码菌蚋荧光素酶肽的核酸分子杂交的核苷酸序列编码。

酶肽的直向同源物可以容易地鉴别为与酶肽的至少一部分具有一定程度的显著序列同一性，并且由来自另一有机体的基因编码。优选的直向同源物从分类为菌蚋属(双翅目)的成员的有机体分离。这样的直向同源物将由在下文更充分描述的、温和至严格条件下与本文所公开的新型核酸分子杂交的核苷酸序列编码，其取决于产生蛋白质的两种有机体的相关程度。

本发明的酶肽的非天然变体可以容易地使用重组技术产生。这样的变体包括但不限于，酶肽的氨基酸序列中的缺失、增加和置换。例如，一类置换是保守氨基酸置换。这种置换是将酶肽中的特定氨基酸用另一性质类似的氨基酸置换。通常认为是保守置换的是脂肪族氨基酸Ala、Val、Leu和Ile之间的互相代替；羟基残基Ser和Thr的互换；酸性残基Asp和Glu的交换；酰胺残基Asn和Gln之间的置换；碱性残基Lys和Arg的交换；以及芳香性残基Phe和Tyr的置换。关于可能表型沉默的氨基酸变化的指导可参见Bowie等人，Science247：1306-1310(1990)。

相比较于功能性肽，例如SEQ ID NO：2的肽，变体酶肽可以在所有功能上都不改变，或者可以由一种或多种活性中的改变的功能组成，或者甚至缺乏一种或多种活性中的功能，例如与底物结合的能力、或发射光谱的位移。功能变体可以仅含有保守变化或在非关键残基或非关键区域中的变化。图6、表3和5和其中的进一步细节可以用于识别关键结构域/区域。功能变体还可以含有不导致功能变化或变化不显著的类似氨基酸的置换。

在一个实施方式中，变体具有荧光素酶活性，该荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应，该发光反应产生最大发射强度在小于或等于530nm的波长处的发射光谱。优选地，变体具有至少25％的SEQ ID NO：2的荧光素酶的荧光素酶活性，更优选至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的SEQ ID NO：2的荧光素酶的荧光素酶活性。在特别优选的实施方式中，变体具有至少SEQ ID NO：2的荧光素酶的荧光素酶活性，或者活性更大。

或者，氨基酸置换可以在一定程度上改变功能。这样的变体通常在关键残基或关键区域中含有一个或多个非保守氨基酸的置换、缺失、插入、倒置或平截。类似地，图6、表3和5和其中的进一步细节可以用于识别关键结构域/区域中的这样的改变。功能改变的变体还可以含有不导致功能变化或变化不显著的类似氨基酸的置换。

功能所必要的氨基酸也可以通过本领域已知的方法识别，例如位点定向诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham等人，Science244：1081-1085(1989))。后一种方法在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后在检验中对产生的突变体分子进行生物活性测试，例如酶活性或发射光谱位移。结合配偶体/底物结合的关键位点也可以通过结构分析确定，例如结晶、核磁共振或光亲和力标记(Smith等人，J.Mol.Biol.224：899-904(1992)；de Vos等人，Science 255：306-312(1992))。Photinus荧光素酶的晶体结构是已知的(Conti等人Structure4：287-298(1996))，当进行功能关键氨基酸的识别时可以参考。参见，例如，Nakatsu等人(2006)。

书写肽或酶肽序列，氨基酸位置从编号为“1”的起始甲硫氨酸开始到羧端氨基酸进行编号。具体位置处的具体氨基酸用氨基酸的单字母名称表示，例如M是MET或甲硫氨酸，然后是相关氨基酸的位置编号，例如M1是起始甲硫氨酸。从上下文中明显看出，在本发明的肽氨基酸序列与其它例如Photinus荧光素酶的一些比较中，对比较进行描述的顺序表示了所参考的引用位置的相关氨基酸序列。因此，Arachnocampa richardsae荧光素酶中与Photinus pyralis荧光素酶不同的残基可以表示成，例如，A343I351，这表示菌蚋序列中343位置处的丙氨酸对应于P.pyralis中351位置处的异亮氨酸。类似地，DEL213-214 R218表示，如果存在精氨酸，P.pyralis的218位置处的精氨酸缺失落入菌蚋序列的残基213和214之间。参见，例如，图6A-6E提供的比对。

氨基酸序列或肽中的位置上的置换，由氨基酸单字母名称、然后是相关非置换序列或肽的位置编号、然后是取代氨基酸的一个或多个单字母名称来表示。因此，例如，天然Photinus pyralis荧光素酶342位置处的亮氨酸置换成丝氨酸表示成L342S。类似的名称从上下文和此处提供的进一步细节是很清楚的。例如，L342S的另外的名称可以表示成L342-＞S。类似地，其它荧光素酶序列中的相同变化可以参考任何一个这样的序列表示成“在与SEQ ID NO：4的Leu₃₄₂排比的位置处将Leu置换成Ser”。

本发明在包括这些片段和由其组成的蛋白质和肽之外，还进一步提供肽的片段，特别是包括图2、3、5和SEQ ID NO：2中确定的残基的片段。但本发明涉及的片段并不理解成要包括于本发明之前公开的片段。

包括分子N-端的本发明的肽片段可以通过编码区内的翻译停止位点的基因工程产生。或者，用称作蛋白酶的蛋白水解酶处理多肽可以产生多种N-端、C-端和中间片段。在某些实施方式中，肽可以通过已知方法合成。片段的例子可以包括长度为5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50、55、60、65、75、80、85、90、95、100、200、300、400、500或更多个氨基酸的连续残基。这些片段可以根据已知的方法提纯，例如沉淀(例如硫酸铵)、HPLC、离子交换色谱、亲和力色谱(包括免疫亲和力色谱)或各种范围的分离(沉降、凝胶电泳、凝胶过滤)。

这些片段可以基于保持一种或多种酶肽生物活性的能力选择，或者可以选择发挥功能的能力，例如与底物结合或充当免疫原。特别重要的片段是生物活性片段，例如，长度为大约10个或更多个氨基酸的肽。这样的片段通常包括酶肽的结构域或基序，例如，酶肽的活性位点、跨膜结构域、底物结合结构域或酶促活性部分。而且，可能的片段包括但不限于，含有结构域或基序的片段、可溶性肽片段和含有免疫原结构的片段。预测的结构域和功能位点可以很容易地通过本领域技术人员公知且容易获得的计算机程序识别(例如PROSITE分析)。

在一个实施方式中，片段具有荧光素酶活性，该荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应，该发光反应产生最大发射强度在小于或等于530nm的波长处的发射光谱。优选地，片段具有至少25％的SEQ ID NO：2的荧光素酶的荧光素酶活性，更优选至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的SEQ ID NO：2的荧光素酶的荧光素酶活性。在特别优选的实施方式中，片段具有至少SEQ ID NO：2的荧光素酶的荧光素酶活性，或者活性更大。

本发明的多肽可以含有通常称作20个天然氨基酸的20个氨基酸以外的氨基酸。而且，许多氨基酸，包括末端氨基酸，可以通过天然方法例如加工和其它翻译后修饰，或者通过本领域公知的化学修饰技术进行修饰。酶肽中天然发生的常见修饰描述于基础教科书、详细专题文章和科研文献，它们是本领域技术人员公知的。

已知的修饰包括但不限于，乙酰化、酰基化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、去甲基化、共价交联形成、胱氨酸形成、焦谷氨酸形成、甲酰化、γ-羧化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白水解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒基化(selenoylation)、硫酸化、转移-RNA介导的氨基酸向蛋白质的添加，例如精氨酰化和遍在蛋白化。

这些修饰是本领域技术人员公知的，已经在科学文献中得到详细描述。例如，几种特别常见的修饰——糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化，描述于最基本的教科书中，例如Proteins-Structure and Molecular Properties，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)。这一主题有许多详细的综述，例如Wold，F.，Posttranslational Covalent Modification ofProteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York 1-12(1983)；Seifter等人(Meth.Enzymol.182：626-646(1990))和Rattan等人(Ann.N.Y Acad.Sci.663：48-62(1992))。

因此，本发明的酶肽还包括衍生物或类似物，其中置换的氨基酸残基不是遗传密码编码的残基，其中包括取代基，其中成熟酶肽与其它化合物(例如增加酶肽半衰期的化合物(例如聚乙二醇))融合，或者其中额外的氨基酸与成熟酶肽融合，例如前导序列或分泌序列或用于提纯成熟酶肽的序列或前蛋白(pro-protein)序列。

蛋白质/肽的应用

本发明的肽的潜在应用主要基于蛋白质的来源、以及蛋白质的分类/作用。这些应用可以很容易地使用本文提供的信息(其为本领域公知的)和常规实验来确定。本发明的蛋白质(包括可能在本发明之前公开的变体和片段)可以用于涉及荧光素酶成员相关的酶的生物检验。这些检验通常涉及任何已知的酶功能或活性或荧光素酶性质。本发明的肽、片段或荧光素酶也可以用于本领域技术人员已知的和适合于荧光素酶肽或片段的任何方法或组合物。示范性应用的非穷举列表包括美国专利第6,927,037；6,690,461；6,602,658；6,602,657；6,586,196；6,503,723；6,297,018；6,171,809；6,143,502；和6,068,979号中公开的那些。而且，本发明的实施方式适合于例如在称作生物发光共振能量转移(BRET)的技术中的兴奋性配偶体(excitatory partner)的应用(参见，例如，WO/1999/066324)。.

本发明的蛋白质可以用于产生抗体，或者引起其它免疫反应；在设计成定量测定生物流体中的蛋白质(或其结合配偶体或配体)的水平的检验中用作试剂；以及用作其中相应蛋白质优先表达的组织的标记物。在蛋白结合或潜在地结合另一蛋白或配体(例如，在酶-效应器蛋白相互作用或酶-配体相互作用中)时，蛋白质可以用来鉴别结合配偶体/配体，以开发鉴别结合相互作用抑制剂的系统。任何或全部的这些应用能够开发成试剂级别或试剂盒形式，用于商品的商业化。

用于进行上述应用的方法是本领域技术人员公知的。公开这些方法的参考文献包括“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Sambrook，J.，E.F.Fritsch和T.Maniatis eds.，1989，和“Methods in Enzymology：Guide to MolecularCloning Techniques”，Academic Press，Berger，S.L.和A.R.Kimmel eds.，1987。

多肽可以用于鉴别以其天然状态或改变的形式调节蛋白质的酶活性的化合物。本发明的酶和适当的变体和片段都可以用于高通量筛选，以检验候选化合物与酶结合或参与发光反应的能力。这些化合物可以针对功能酶进一步筛选，以确定化合物对酶活性的影响。而且，这些化合物可以在动物或无脊椎动物系统中试验，以测定活性/效力。化合物还可以鉴别为将酶激活(激动剂)或灭活(拮抗剂)至所需程度。

而且，本发明的蛋白质可以用于筛选化合物刺激或抑制酶蛋白质和通常与酶蛋白质相互作用的分子(例如底物或酶蛋白质通常相互作用的信号途径的组分、或者发光反应涉及的辅因子)之间的相互作用的能力。这些检验通常包括以下步骤：在使酶蛋白质或片段与靶分子相互作用的条件下，将酶蛋白质与候选化合物合并，以检测蛋白质和靶之间的复合物的形成，或检测与酶蛋白质和靶之间的相互作用的生物化学结果，例如荧光素酶的发光反应或发光反应的单个反应步骤。

候选化合物包括，例如：(1)有机和无机小分子(例如从合成组合库或天然产物库得到的分子)；(2)抗体(例如多克隆、单克隆、人源化、抗-特应性、嵌合和单链抗体以及Fab、F(ab′).sub.2、Fab表达库片段、和抗体表位结合片段)；(3)磷酸肽(例如随机和部分简并的定向磷酸肽库的成员，参见，例如Songyang等人，Cell 72：767-778(1993))；和(4)肽，例如可溶性肽，包括Ig-尾的融合肽和随机肽库的成员(参见，例如，Lam等人，Nature 354：82-84(1991)；Houghten等人，Nature354：84-86(1991))和组合化学得到的由D-或L-构型氨基酸组成的分子库。

一种候选化合物是本发明的变体肽，其与例如SEQ ID NO：2的肽竞争底物结合。其它候选化合物包括突变体酶或含有突变的适当片段，其影响酶的功能并从而竞争底物。因此，本发明包括竞争底物的片段，例如以较高的亲和力，或者结合底物但不释放的片段。

本发明进一步包括识别调节(刺激或抑制)酶活性的化合物的其它终点检验。检验通常包括表明酶活性的发光途径中的活动的检验。酶介导的任何生物或生物化学功能都可以用作终点检验。具体地，可以检验表达酶的细胞或组织的生物功能。

本发明的蛋白质可以在设计成发现与酶相互作用的化合物(例如结合配偶体、配体或底物)的方法中用于竞争结合检验。因此，在使化合物结合多肽或与多肽相互作用的条件下，将化合物暴露于酶多肽。也可以向混合物中加入可溶性酶多肽。如果试验化合物与可溶性酶多肽相互作用，其可以增加或降低形成的复合物的量或来自酶靶的活性。这种类型的检验尤其可以用于寻求与酶的特定区域相互作用的化合物的情况。因此，与目标酶区域竞争的可溶性多肽设计成含有对应于所关注区域的肽序列。

为了进行目的化合物或蛋白质的无细胞筛选检验，有时需要固定酶蛋白或片段或其目标分子，以有助于将复合物从一种或两种的未复合形式中分离。

调节本发明的酶之一的试剂可以单独使用或结合使用一种或多种上述检验来识别。通常优选地，首先使用细胞基或无细胞系统，然后在可能想要的任何其它模型系统中证实活性。这些模型系统是本领域公知的，可以很容易地在该上下文中使用。本发明进一步包括通过上述筛选检验识别的新的试剂或底物。

本发明的肽还提供用于诊断活性蛋白质活性的标靶，特别是其它荧光素酶已知的活性和条件。因此，可以从生物样品中分离出肽，并检验导致畸变肽的基因突变的存在。这包括氨基酸置换、缺失、插入、重排、(由于畸变拼接现象)和不适当的翻译后修饰。分析方法包括变更的电泳流动性、变更的胰蛋白酶肽消化、细胞基或无细胞检验中变更的酶活性、底物或抗体结合模式变更、变更的等电点、直接氨基酸测序、和任何其它已知的可用于检测蛋白质突变的检验技术。这样的检测可以以单检测形式或多检测形式提供，例如抗体芯片阵列。用于肽检测的体外技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、蛋白质印迹、免疫沉淀和免疫荧光，其使用检测试剂，例如抗体或蛋白质结合试剂。

多报道基因检验

本发明的肽特别适合于在多报道基因检验中使用。常常使用多、双(或双重)报道基因来提高实验精确度。术语“多报道基因”是指在单一系统中同时表达并测量两种或更多种单独的报道酶。当一起使用时，这些单独的报道酶可以称作“共报道基因”。在遗传报道中，目前得益于双报道基因检测的例子包括在遗传上操纵成同时表达两种不同报道基因的单独的细胞或细胞群体(例如分散在培养物中的细胞、分离的组织或整个动物)。更常见地，一个基因的活性报道特定实验条件的影响，而第二报道基因的活性提供内部对照，从而可以对全套的实验值进行归一化。实验报道基因的活性相对于内部对照的活性的归一化，使得诸如细胞生活力或转染效率的差异造成的实验可变性最小化。其它可变性来源，例如移液体积的差异、细胞溶解效率和检验效率，可以有效地消除。因此，通过减少外部影响，双报道基因检验常常使实验数据的解释更为可靠。

目前得益于采用至少两种报道基因(即双报道基因检验)的例子包括在遗传上操纵成同时表达两种不同报道基因的单独的细胞或细胞群体(例如分散在培养物中的细胞、分离的组织或整个动物)。更常见地，一个基因的活性报道特定实验条件的影响，而第二报道基因的活性提供内部对照，从而可以对全套的实验值进行归一化。

可以得益于多报道基因技术的无细胞重构系统，是编码实验和对照报道酶的独立遗传材料的同时翻译、或偶联转录和翻译得到的细胞溶解产物。免疫检验可以类似地设计用于在单一样品内多重报道实验值和对照值。参见，例如Promega Dual-Luciferase^TM报道基因检测系统以及Promega pGL3荧光素酶报道基因载体(获自Promega Corporation，Madison，Wis.)以及美国专利第5,744,320号和第5,670,356号。

抗体

本发明还提供选择性地结合本发明的肽、包括这种肽的蛋白质、以及其变体和片段中的一种的抗体。如本文所用，抗体选择性地结合目标肽是指，其结合目标肽并且不会显著结合不相关的蛋白质。即使抗体也结合其它与目标肽基本不同源的蛋白质，也仍认为该抗体选择性地结合肽，只要这些蛋白质与抗体的肽标靶的片段或结构域享有同源性。在该情况下，尽管有一定程度的交叉反应性，也要理解成结合肽的抗体仍是选择性的。

许多产生或识别指定目标肽的抗体的方法是已知的。Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，(1989)描述了若干这样的方法。通常，为了产生抗体，将分离的肽用作免疫原，并给予哺乳动物有机体，例如大鼠、家兔或小鼠。可以使用全长蛋白质、抗原性肽片段或融合蛋白。特别重要的片段是涵盖结构域的片断，例如本文识别的结构域和序列同源性或家族间趋异的结构域，例如可以使用蛋白质比对方法很容易识别的片段，如表6所示。

抗体可以从本文所述的肽的任何区域制备。但优选的区域包括参与功能/活性或酶/结合配偶体相互作用的区域。图6A-6E以及表3和5的信息、以及本文通过实施例给出的其它指导都可以用于识别特别重要的区域，可以使用各种序列比对来识别保守和单一的序列片段。

抗原性片段通常包括至少8个连续氨基酸残基。但抗原性片段可以包括至少10、12、14、16或更多个氨基酸残基。这些片段可以基于物理性质选择，例如片段对应于位于蛋白质表面的区域，例如亲水区域，或者可以基于序列的唯一性选择。

本发明抗体的检测可以通过将抗体与可检测物质偶联(例如物理连接)而促进。可检测物质的例子包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料和放射性材料。合适的酶的例子包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶；合适的辅基复合物的例子包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸酯、若丹明、二氯三嗪基胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺(luminol)；生物发光材料的例子包括荧光素酶、荧光素和水母发光蛋白；合适的辐射性材料的例子包括¹²⁵I、¹³¹I、³⁵S或³H。

抗体可以用于通过标准技术，例如亲和力色谱或免疫沉淀，分离本发明的蛋白质之一。抗体可以促进天然蛋白质从细胞中的提纯，以及宿主细胞中表达的重组产生的蛋白质的提纯。此外，这些抗体可以用于检测本发明的蛋白质之一在细胞或组织中的存在，以确认蛋白质在有机体中不同组织之间或在发育进程上的正常或异常的表达模式。而且，这些抗体可以用于在原位、体外或在细胞溶解产物或上清液中检测蛋白质，以评价表达的丰度和模式。全长蛋白质的游离片段的抗体检测可以用于识别代谢回转。

抗体还可以用于抑制蛋白质功能，例如，阻断酶肽与结合配偶体(例如底物)的结合。这些用途还可以应用于分析的情况，其中分析涉及抑制蛋白质的功能。抗体可以用于，例如，阻断结合，从而调节(激动或拮抗)肽的活性。抗体可以针对含有功能所需位点的特定片段，或者针对与细胞或有机体有关的完整蛋白质而制备。

本发明还包括用于使用抗体检测生物样品中蛋白质的存在的试剂盒。试剂盒可以包括抗体，例如标记或可标记的抗体，和用于检测生物样品中的蛋白质的化合物或试剂；用于测定样品中蛋白质的量的装置；用于将样品中蛋白质的量与标准比较的装置；和使用说明书。这种试剂盒可以提供成检测单一蛋白质或表位，或者可以设置成检测众多表位中的一种，例如在抗体检测阵列中。用于核酸阵列的阵列在下文中详细描述，已经发展了用于抗体阵列的类似方法。

核酸分子

本发明提供图1、2、4、5和SEQ ID NO：1和3所示的分离的核酸分子以及其各种修饰或片段。在具体实施方式中，本发明提供编码本发明的酶肽或蛋白质的分离的核酸分子(cDNA、转录体和基因组序列)。这些核酸分子可以由编码本发明的酶肽之一的核苷酸序列、其等位变体、或其直向同源物或种内同源基因组成，或基本由其组成或包括其。

如本文所用，“分离的”核酸分子是与核酸天然来源中存在的其它核酸分离的核酸分子。优选地，“分离的”核酸不含在有机体(核酸从中得到)的基因组DNA中天然位于核酸侧翼的序列(即位于核酸5′和3′端的序列)。但是，可以有一些侧翼核苷酸序列，例如，至多大约5千碱基对(KB)、4KB、3KB、2KB或1KB或更小，特别是连续肽编码序列和基因组序列中在同一基因内但被内含子分隔的肽编码序列。重要之处在于将核酸与远端不重要的侧翼序列分离，使得其可以进行本文所述的特定操作，例如重组表达、探针和引物的制备、以及其它特异于核苷酸序列的应用。

而且，“分离的”核酸分子，例如转录体或cDNA分子，当通过重组技术产生时，可以基本上不含其它细胞材料或培养基，或者当通过化学合成时基本上不含化学前体或其它化合物。但是，核酸分子可以与其它编码或调节序列融合，仍视为是分离的。

例如，载体中含有的重组DNA分子被认为是分离的。分离的DNA分子的其它例子包括异源宿主细胞中保持的重组DNA分子或溶液中的(部分或基本上)提纯的DNA分子。分离的RNA分子包括本发明的分离的DNA分子的体外或体内RNA转录体以及其新的片段。根据本发明的分离的核酸分子进一步包括合成产生的这样的分子。

因此，本发明提供由本发明的核苷酸序列组成的核酸分子。核酸分子由核苷酸序列组成是指，核苷酸序列是核酸分子的完整核苷酸序列。本发明进一步提供基本由本发明的核苷酸序列组成的核酸分子。核酸分子基本由核苷酸序列组成是指，这样的核苷酸序列仅仅与很少的其它核酸残基一起存在于最终的核酸分子中。本发明进一步提供包括本发明的核苷酸序列的核酸分子。核酸分子包括核苷酸序列是指，核苷酸序列是核酸分子的最终核苷酸序列的至少一部分。以这种方式，核酸分子可以仅仅是核苷酸序列，或具有额外的核酸残基，例如与其天然结合的核酸残基或异源核苷酸序列。这样的核酸分子可以具有几个额外的核苷酸，或者可以包括数百或更多个额外的核苷酸。以下给出了如何容易地制造或分离各种类型的这些核酸分子的简要描述。

分离的核酸分子可以编码成熟蛋白质加额外的氨端或羧端氨基酸，或成熟肽内部的氨基酸(例如当成熟形式具有多于一个肽链时)。这些序列可以在从前体到成熟形式的蛋白质加工中发挥作用，促进蛋白质运输，延长或缩短蛋白质半衰期或者促进用于检验或产生蛋白质的操作，等等。通常在原位的情况下，额外的氨基酸可以通过细胞酶远离成熟蛋白质而加工。

如上文提及，分离的核酸分子包括但不限于，单独的编码酶肽的序列；编码成熟肽的序列和额外的编码序列，例如前导或分泌序列(例如前体-原(pre-pro)或前蛋白质序列)；带有或不带有额外的编码序列的编码成熟肽的序列，加额外的非编码序列，例如内含子或非编码5′和3′序列，例如转录但不翻译的序列，其在转录、mRNA加工(包括拼接和聚腺苷酰化信号)、核糖体结合和mRNA的稳定中发挥作用。此外，核酸分子可以与编码诸如有助于提纯的肽的标记序列融合。

分离的核酸分子可以是RNA的形式，例如mRNA，或者是DNA的形式，包括cDNA和基因组DNA，其通过克隆得到或通过化学合成技术或通过其组合产生。核酸，特别是DNA，可以是双链或单链的。单链核酸可以是编码链(有义链)或非编码链(反义链)。

本发明进一步提供编码本发明的肽的片段的核酸分子，以及编码上述的本发明的酶蛋白质的明显变体的核酸分子。这些核酸分子可以是天然的，例如等位变体(相同基因座)、种内同源基因(不同基因座)和直向同源物(不同有机体)，或者可以通过重组DNA方法或通过化学合成构建。这些非天然变体可以通过诱变技术产生，包括应用于核酸分子、细胞或有机体的诱变技术。因此，如上文讨论，变体可以含有核苷酸置换、缺失、倒置和插入。变化可以在编码区和/或非编码区发生。变化可以产生保守和非保守的氨基酸置换。

如本申请中所用，术语“编码荧光素酶的核酸分子”是指已经分离为不含全细胞核酸的核酸分子。本文所用的术语“功能相当密码子”是指编码相同氨基酸的密码子，例如精氨酸或丝氨酸的6个密码子(表2)，也指编码生物相当的氨基酸的密码子，如下文中讨论。

考虑到遗传密码的简并性，如果序列具有至少大约50％、通常至少大约60％、更通常大约70％、最通常大约80％、优选至少大约90％、最优选大约95％的与本发明的核苷酸序列相同的核苷酸，则认为该序列与所描述的序列基本相同。序列与所描述的序列基本相同也可以从功能上定义成能够在严格条件下与含有聚核苷酸的互补体的核酸片段杂交。术语密切相关的序列是指序列具有相当大的序列相似性，或者序列编码完成荧光素酶功能(即一种或多种导致发光的活性)或如本文所述引起类似抗原反应的蛋白质。本文使用术语密切相关的序列来命名与进行比较的聚核苷酸或多肽相比相似度最小为50％的序列。

本发明的DNA片段包括那些编码生物功能相当的荧光素酶蛋白质和肽的DNA片段，如上文所述。这样的序列可以是密码子丰余性和氨基酸功能相当的结果，这已知在核苷酸序列和由此编码的蛋白质中是天然发生的。或者，功能相当的蛋白质或肽可以经由应用重组DNA技术产生，其中蛋白质结构的变化可以根据对交换的氨基酸的性质的考虑而设计。变化可以通过应用位点定向诱变技术设计，或者可以随机引入并随后筛选所需的功能，如下文所述。

天然地，本发明还包括与编码菌蚋荧光素酶的聚核苷酸序列互补或基本互补的寡核苷酸。“互补”的核酸序列是能够根据标准Watson-Crick互补规则碱基配对的序列。如本文所用，术语“互补序列”是指核苷酸序列通过上述的相同核苷酸比较可以评价为基本互补，或者定义成能够与聚核苷酸的核酸片段在相对严格的条件下杂交，例如本文所述的那些。

或者，杂交片段可以是较短的寡核苷酸。17个碱基长的序列在复杂基因组中应该仅出现一次，因此足以指定单一的目标序列。尽管更短的寡聚体更容易制造并且更容易到达体内，确定杂交的特异性还涉及许多其它因素。寡核苷酸与其互补靶的结合亲和力和序列特异性均随着长度增加而增加。预计将使用8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100或更多个碱基对的示例性寡核苷酸，但预计也使用其它寡核苷酸。也预计编码250、500、1000、1212、1500、2000、2500、3000或3500个碱基和更长的较长聚核苷酸。这些寡核苷酸或聚核苷酸通常可以用于，例如，在DNA印迹和蛋白质印迹中用作探针，以及在扩增反应中用作引物，或者用于疫苗。

表2

天然地，本发明还包括与本发明的核苷酸的序列互补或基本互补的寡核苷酸。“互补”的核酸序列是能够根据标准Watson-Crick互补规则碱基配对的序列。如本文所用，术语“互补序列”是指核苷酸序列通过上述的相同核苷酸比较可以评价为基本互补，或者定义成能够与聚核苷酸的核酸片段在相对严格的条件下杂交，例如本文所述的那些。

片段的长度将决定于其既定用途。例如，片段可以编码肽的带有表位的区域，或者可以用作DNA探针和引物。这样的片段可以使用已知的核苷酸序列分离，以合成寡核苷酸探针。然后标记的探针可以用于筛选cDNA库、基因组DNA库或mRNA，以分离对应于编码区域的核酸。而且，引物可以用于PCR反应，以克隆特定的基因区域。探针/引物通常基本上包括提纯的寡核苷酸或寡核苷酸对。

直向同源物、同系物和等位变体可以使用本领域公知的方法识别。如肽部分所述，这些变体包括编码肽的核苷酸序列，该肽与图表中所示的核苷酸序列或该序列的片断的同源性通常为60-70％、70-80％、80-90％，更典型地为至少约90-95％。这些核酸分子可以很容易地识别为能够在温和至严格的条件下与图表中所示的核苷酸序列或该序列的片段杂交。等位变体可以很容易地通过编码基因的遗传基因座确定。

如本文所用，以及本领域技术人员所公知，用于核酸杂交的“高严格性条件”、“中严格性条件”和“低严格性条件”在Current Protocolsin Molecular Biology(Ausubel，F.M.等人，″Current Protocols inMolecular Biology″，John Wiley & Sons，(1998))中的第2.10.1-2.10.16页和第6.3.1-6页解释。确定杂交严格性的确切条件不仅取决于离子强度(例如0.2X SSC、0.1X SSC)、温度(例如室温、42摄氏度、68摄氏度)和去稳定剂(例如甲酰胺)或变性剂(例如SDS)的浓度，还取决于以下因素，例如核苷酸序列的长度、碱基组成、杂交序列之间的错配百分比和其它非相同序列内该序列亚型的出现频率。因此，高、中或低严格性条件可以根据经验确定。通过将杂交条件从不发生杂交的严格性水平到首次观察到杂交的水平而变化，可以确定使指定序列与样品中最相似的序列杂交(例如，选择性地)的条件。

示范性条件描述于Krause，M.H.和S.A.Aaronson，Methods inEnzymology，200：546-556(1991)。另外参见Ausubel等人，″CurrentProtocols in Molecular Biology″，John Wiley & Sons，(1998)，其描述了中或低严格性条件的洗涤条件的确定。洗涤步骤中条件通常设定成确定杂种互补性的最小水平。通常，以仅发生同源杂交的最低温度开始，每降低1摄氏度最终洗涤温度(SSC浓度保持恒定)，使杂交序列当中错配的最大程度增加1％。通常，SSC浓度加倍导致Tm增加大约17摄氏度。使用这些指导，用于高、中或低严格性的洗涤温度可以依据所寻求的错配水平根据经验确定。

例如，低严格性洗涤可以包括在室温下在含有0.2X SSC/0.1％SDS的溶液中洗涤10分钟；中严格性洗涤可以包括在42摄氏度下在含有0.2X SSC/0.1％SDS的预温溶液(42摄氏度)中洗涤15分钟；高严格性洗涤可以包括在68摄氏度下在含有0.1X SSC/0.1％SDS的预温溶液(68摄氏度)中洗涤15分钟。而且，洗涤可以重复进行或顺序进行，以得到所需的结果，这是本领域已知的。通过在保持目标核酸分子和所用引物或探针之间的同一性类似程度或类似性的同时，改变一个或多个参数(其例子是本领域已知的)，可以确定相当的条件。

核酸分子的应用

本发明的核酸分子可以用于探针、引物、化学中间体，并用于生物检验。核酸分子可以用作信使RNA、转录RNA或cDNA和基因组DNA的杂交探针，以分离编码所述肽的全长cDNA和基因组克隆，并分离对应于产生相同或相关肽的变体(等位基因、直向同源物等)的cDNA和基因组克隆。

探针可以对应于沿着所提供的核酸分子整个长度的任意序列。但是，如所讨论，片段应理解成不包括本发明之前公开的片段。

核酸分子也可以用作PCR引物，以扩增核酸分子的任何指定区域，并用于合成所需长度和序列的反义分子。如上文提及，反义分子明显包括通过RNA干扰有效地实现表达调节的RNA构建物。

核酸分子还可以用于构建重组载体。这些载体包括表达肽序列的一部分或全部的表达载体。载体还包括插入载体，用于整合到另一核酸分子序列中，例如整合到细胞基因组中，以原位改变基因或基因产物的表达。例如，内源编码序列可以经由同源重组被含有一个或多个特异性引入的突变的编码区的全部或部分取代。

核酸分子还可以用于表达蛋白质的抗原性部分。

核酸分子还可以用作探针，用于通过原位杂交方法确定核酸分子的染色体位置。

核酸分子还可以用于制造载体，该载体含有本发明的核酸分子的基因调节区域。

核酸分子还可以用于设计核酶，该核酶对应于由本文所述的核酸分子产生的mRNA的全部或部分。

核酸分子还可以用于制造表达肽的部分或全部的载体。

核酸分子还可以用于构建表达核酸分子和肽的部分或全部的宿主细胞。

核酸分子还可以用于构建表达核酸分子和肽的全部或部分的转基因有机体。

核酸分子还可以用作杂交探针，用于确定核酸表达的存在、水平、形式和分布。因此，探针可以用于检测细胞、组织和有机体中特定核酸分子的存在或测定其水平。测定水平的核酸可以是DNA或RNA。因此，对应于本文所述的肽的探针可以用于评价指定细胞、组织或有机体中的表达或基因拷贝数。

用于检测mRNA的体外技术包括RNA杂交和原位杂交。用于检测DNA的体外技术包括DNA杂交和原位杂交。

用于酶核酸表达的检验可包括核酸水平(例如mRNA水平)的直接检验，或者检验发光反应中涉及的附属(collateral)化合物。而且，还可以检验响应于信号或环境试剂或条件被增量或减量调节的基因的表达。在该实施方式中，这些基因的调节区域可以与编码本发明的一种或多种荧光素酶肽的报道基因可操作连接。

因此，酶基因表达的调节物可以在如下方法中识别，其中使细胞与候选化合物接触，并测定发光水平(即强度或光谱)。将存在候选化合物的情况下的发光特征(光谱、强度分布、绝对强度等)与不存在候选化合物的情况下的发光特征进行比较。然后基于这一比较，候选化合物可以识别成核酸表达的调节物，并用于，例如，治疗以畸变核酸表达为特征的疾病。

或者，酶核酸表达的调节物可以是使用本文所述的筛选检验识别的小分子或药物，只要药物或小分子抑制表达蛋白质的细胞和组织中的酶核酸表达。

核酸分子可以用作反义构建物，以控制细胞、组织和有机体中酶的基因表达。DNA反义核酸分子设计成与有关转录的基因的区域互补，防止转录并因而防止酶蛋白的产生。反义RNA或DNA核酸分子将与mRNA杂交，从而阻断mRNA翻译到酶蛋白质内。进行RNA干扰的技术和方法明显包括在这些技术中。

本发明还包括用于检测酶核酸在生物样品中的存在的试剂盒。例如，试剂盒可以包括试剂，例如标记或可标记的核酸，或能够检测生物样品中的酶核酸的试剂；用于测定样品中酶核酸的量的装置；和用于将样品中酶核酸的量与标准比较的装置。化合物或试剂可以包装在合适的容器中。试剂盒可以进一步包括使用试剂盒检测酶蛋白质mRNA或DNA的说明书。

核酸阵列

本发明进一步提供核酸检测试剂盒，例如基于所提供的序列信息的核酸分子的阵列或微阵列。

如本文所用，“阵列”或“微阵列”是指在底物，例如纸、尼龙或其它类型的膜、滤器、芯片、载玻片、或任何其它合适的固体载体上合成的不同聚核苷酸或寡核苷酸的阵列。在一个实施方式中，微阵列根据如下文献中所述的方法制备并使用：美国专利第5,837,832号，WO/1995/011995、Lockhart，D.J.等人(1996；Nat.Biotech.14：1675-1680)、和Schena，M.等人(1996；Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619)。在其它实施方式中，这样的阵列通过美国专利第5,807,522号中所述的方法制造。

微阵列或检测试剂盒优选由固定在固体载体上的大量唯一的、单链的核苷酸序列组成，上述核苷酸序列通常是合成的反义寡核苷酸或cDNA片段。寡核苷酸优选长度为大约6-60个核苷酸，更优选长度为15-30个核苷酸，最优选长度为大约20-25个核苷酸。对于某些类型的微阵列或检测试剂盒，可以优选使用长度仅7-20个核苷酸的寡核苷酸。微阵列或检测试剂盒可以含有覆盖已知5′或3′序列的寡核苷酸、覆盖全长序列的连续寡核苷酸；或者选自沿着序列长度的特定区域的唯一寡核苷酸。微阵列或检测试剂盒中使用的聚核苷酸可以是特异于所关注基因或多个基因的寡核苷酸。

在使用微阵列或检测试剂盒的样品分析的例子中，可以将来自生物样品的RNA或DNA制成杂交探针。分离mRNA，产生cDNA并将其用作制造反义RNA(aRNA)的模板。将aRNA在荧光核苷酸的存在下进行扩增，标记的探针与微阵列或检测试剂盒一起孵育，使得探针序列与微阵列或检测试剂盒的互补寡核苷酸杂交。孵育条件调节成杂化以精确的互补匹配或不同程度的较少互补性发生。除去非杂化的探针之后，使用扫描装置测定荧光的水平和模式。考察扫描的图像，以确定微阵列或检测试剂盒上每个寡核苷酸序列的互补性程度和相对丰度。生物样品可以获自任何所关注的合适来源。检测系统可以用于同时测量所有不同序列的杂交的缺乏、存在和量。该数据可以用于对样品、物种或环境样品之间的序列、表达模式、突变、变体或多态性进行大规模关联性研究。

本发明的测试样品包括细胞、细胞的蛋白质或膜提取物、甚至是粗的环境样品。用于上述方法的测试样品将基于检验形式、检测方法的性质和用作样品待检验的组织、细胞或提取物而变化。制备核酸提取物或细胞的方法是本领域公知的，可以很容易地使其适应以得到与所用系统相容的样品。

在本发明的另一实施方式中，提供含有进行本发明的检验必需的试剂的试剂盒。

载体/宿主细胞

本发明还提供含有本文所述核酸分子的载体。术语“载体”是指可以转运核酸分子的载剂，优选核酸分子。当载体是核酸分子时，核酸分子与载体核酸共价连接。在本发明的这一方面，载体包括质粒、单链或双链噬菌体、单链或双链RNA或DNA病毒载体、或人工人染色体，例如BAC、PAC、YAC或MAC。

载体可以作为外部染色体元件保持在宿主细胞中，并在此复制并产生额外的核酸分子拷贝。或者，载体可以整合到宿主细胞基因组中，当宿主细胞复制时产生额外的核酸分子拷贝。

本发明提供用于维持的载体(克隆载体)或用于表达核酸分子的载体(表达载体)。载体可以在原核细胞或真核细胞或两者中(往复载体)发挥作用。

表达载体含有与核酸分子在载体中可操作连接的顺式作用调节区，使得宿主细胞中可以进行核酸分子的转录。核酸分子可引入到宿主细胞中，单独的核酸分子能够影响转录。因此，第二核酸分子可以提供与顺式调节控制区相互作用的反式作用因子，使核酸分子从载体转录。或者，反式作用因子可以由宿主细胞提供。最后，反式作用因子可以由载体自身产生。但应当理解到，在一些实施方式中，核酸分子的转录或翻译可以在无细胞系统中发生。

本文所述的核酸分子可以可操作连接的调节序列包括用于指导mRNA转录的启动子。这些包括但不限于，来自细菌噬菌体X的左启动子、lac、TRP、和来自大肠杆菌的TAC启动子、来自SV40的早期和晚期启动子、CMV即时早期(immediate early)启动子、腺病毒早期和晚期启动子、和反转录病毒长端重复单元。

除启动转录的控制区之外，表达载体还可以包括调节转录的区域，例如阻抑物结合位点和增强子。例子包括SV40增强子、巨细胞病毒即时早期增强子、多瘤增强子、腺病毒增强子、和反转录病毒LTR增强子。

除含有转录起始和控制位点之外，表达载体还可以含有转录终止所需的序列以及转录区用于翻译的核糖体结合位点。其它用于表达的调节控制元件包括起始和终止密码子以及聚核苷酰化信号。本领域普通技术人员将会知道许多种可用于表达载体的调节序列。这些调节序列描述于，例如，Sambrook等人，Molecular Cloning：A LaboratoryManual.2nd.ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，N.Y.，(1989)。

可以使用多种表达载体来表达核酸分子。这些载体包括染色体的、附加型和源自病毒的载体，例如来自细菌质粒、来自细菌噬菌体、来自酵母附加体、来自酵母染色体元件(包括酵母人工染色体)、来自病毒(例如杆状病毒、乳多空病毒例如SV40、牛痘病毒、腺病毒、痘病毒、假狂犬病病毒和反转录病毒)的载体。载体还可以来自这些来源的组合，例如来自质粒和细菌噬菌体遗传元件，例如黏端质粒和噬菌粒。用于原核和真核宿主的合适的克隆和表达载体描述于：Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd.ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)。

调节序列可以在一种或多种宿主细胞中提供组成型表达(即组织特异性)，或者可以在一种或多种细胞类型中提供诱导型表达，例如，通过温度、营养添加剂、或外源因子(例如激素或其它配体)。许多种在原核和真核宿主中提供组成型和诱导型表达的载体是本领域普通技术人员公知的。

核酸分子可以通过公知的方法学插入到载体核酸中。通常，通过用一种或多种限制性内切酶对DNA序列和表达载体进行切割，然后将片段连接在一起，可以将最终被表达的DNA序列与表达载体连接。限制性内切酶消化和连接的方法是本领域普通技术人员公知的。

含有合适的核酸分子的载体可以使用公知技术引入到用于繁殖或表达的合适宿主细胞中。细菌细胞包括但不限于，大肠杆菌、链霉菌和鼠伤寒沙门氏菌。真核细胞包括但不限于，酵母、昆虫细胞例如果蝇、动物细胞例如COS和CHO细胞、以及植物细胞。

如本文所述，可以合意地将肽表达成融合蛋白。因此，本发明提供使肽产生的融合载体。融合载体可以增加重组蛋白的表达，增加重组蛋白的溶解性，并有助于蛋白质的提纯，例如发挥配体作用用于亲和力提纯。可以在融合部分的连接处引入蛋白水解切割位点，使得所需的肽最终可以从融合部分中分离出来。蛋白水解酶包括但不限于，Xa因子、凝血酶和肠酶(enteroenzyme)。典型的融合表达载体包括pGEX(Smith等人，Gene 67：31-40(1988))、pMAL(New England Biolabs，Beverly，Mass.)和pRIT5(Pharmacia，Piscataway，N.J.)，其分别将谷胱甘肽S-转移酶(GST)、麦芽糖E结合蛋白或蛋白A与目标重组蛋白融合。合适的诱导型非融合大肠杆菌表达载体的例子包括pTrc(Amann等人，Gene 69：301-315(1988))和pET 11d(Studier等人，Gene ExpressionTechnology：Methods in Enzymology 185：60-89(1990))。

重组蛋白质表达可以通过提供遗传背景在宿主细菌中最大化，其中宿主细胞具有削弱的蛋白水解切割重组蛋白质的能力。(Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，AcademicPress，San Diego，Calif.(1990)119-128)。或者，目的核酸分子的序列可以改变成提供用于特定宿主细胞(例如大肠杆菌)的优先密码子(Wada等人，Nucleic Acids Res.20：2111-2118(1992))。

核酸分子也可以由在酵母中操作的表达载体表达。用于在酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))中表达的载体的例子包括pYepSecl(Baldari，等人，EMBO J.6：229-234(1987))、pMFa(Kujan等人，Cell30：933-943(1982))、pJRY88(Schultz等人，Gene 54：113-123(1987))和pYES2(Invitrogen Corporation，San Diego，Calif.)。

核酸分子也可以在昆虫细胞中表达，例如，使用杆状病毒表达载体。可用于在培养的昆虫细胞(例如Sf 9细胞)中表达蛋白质的杆状病毒载体包括pAc系列(Smith等人，Mol.Cell Biol.3：2156-2165(1983))和pVL系列(Lucklow等人，Virology 170：31-39(1989))。

在本发明的某些实施方式中，本文所述的核酸分子使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达。哺乳动物表达载体的例子包括pCDM8(Seed，B.Nature 329：840(1987))和pMT2PC(Kaufinan等人，EMBO J.6：187-195(1987))。

本文所列的表达载体仅仅作为例子提供，本领域普通技术人员可以得到的公知载体均可以用于表达核酸分子。本领域普通技术人员将会知道，适合于本文所述的核酸分子的维持繁殖或表达的其它载体。这些载体可以参见，例如，Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989。

本发明还包括如下载体，其中本文所述的核苷酸序列以倒置方向克隆到载体中，但与允许反义RNA转录的调节序列可操作连接。因此，可以产生本文所述的核酸分子序列的全部或部分的反义转录体，包括编码区和非编码区。这种反义RNA的表达相对于有义RNA的表达受控于上述的每种参数(调节序列、组成型或诱导型表达、组织特异性表达)。

本发明还涉及含有本文所述的载体的重组宿主细胞。因此，宿主细胞包括原核细胞、低级真核细胞例如酵母、其它真核细胞例如昆虫细胞、以及高级真核细胞例如哺乳动物细胞。宿主细胞可以包括但不限于，蚕幼虫、CHO细胞、大肠杆菌和酵母。

通过本领域普通技术人员易于获得的技术，将本文所述的载体构建物引入细胞，可以制备重组宿主细胞。这些包括但不限于，磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖-介导的转染、阳离子脂质-介导的转染、电穿孔、转导、感染、脂质转染、和其它技术，例如，参见，Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989)。

宿主细胞可以含有一种以上的载体。因此，不同的核苷酸序列可以引入到相同细胞的不同载体上。类似地，核酸分子可以单独引入，或者与其它与该核酸分子无关的核酸分子(例如为表达载体提供反式作用因子的)一起引入。将一种以上的载体引入细胞时，载体可以独立引入、共同引入或者连接到核酸分子载体上。

在细菌噬菌体和病毒载体的情况下，这些可以通过感染和转导的标准方法作为包装或包封的病毒引入细胞。病毒载体可以是能够复制或复制缺陷的。在病毒复制有缺陷的情况下，复制会在提供补充缺陷的功能的宿主细胞中发生。

载体通常包括可选择标记，其能够选择含有重组载体构建物的细胞亚群。标记物可以包含在含有本文所述的核酸分子的相同载体中，或者可以在单独的载体中。标记物包括用于原核宿主细胞的四环素或氨苄青霉素抗性基因，以及用于真核宿主细胞的二氢叶酸还原酶或新霉素抗性。但是，任何为表型特征提供选择性的标记物都是有效的。

尽管成熟蛋白质可以在细菌、酵母、哺乳动物细胞和其它细胞中在合适的调节序列的控制下产生，无细胞转录和翻译系统也可以用于使用源自本文所述的DNA构建物的RNA来产生这些蛋白质。

在需要肽分泌的情况下，这用含有多跨膜结构域的蛋白质(例如酶)是很难实现的，可以将合适的分泌信号结合到载体中。信号序列可以是肽内源的，或者是与这些肽异源的。

在肽不分泌到培养基中的情况下，蛋白质可以通过标准破坏过程从宿主细胞中分离，例如冰冻融化、超声处理、机械破坏、使用细胞溶解剂和类似物。然后可以将肽回收，并使用公知的提纯技术提纯，包括硫酸铵沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水相互作用色谱、亲和力色谱、羟磷灰石色谱、凝集素色谱或高效液相色谱。

应当理解到，依赖本文所述的肽的重组产生中的宿主细胞，肽可以取决于细胞而具有各种糖基化形式，或者当在细菌中产生时是非糖基化的。此外，在一些情况下由于宿主介导的过程，肽可以包括初始的修饰甲硫氨酸。

载体和宿主细胞的应用

本文所述的表达肽的重组宿主细胞具有多种用途。首先，细胞可以用于产生酶蛋白质或肽，其可以进一步提纯，以产生所需量的酶蛋白质或片段。因此，含有表达载体的宿主细胞可以用于肽的产生。

宿主细胞还可以用于进行基于细胞的检验，该检验涉及酶蛋白质或酶蛋白质片段，例如上文所述的以及本领域已知的其它形式。因此，表达天然酶蛋白质的重组宿主细胞可以用于检验刺激或抑制酶蛋白质功能的化合物。

宿主细胞还可以用于识别其中这些功能受影响的酶蛋白质突变体。如果突变体天然存在并引起病理学，含有该突变的宿主细胞可以用于检验对突变的酶蛋白质具有所需作用(例如刺激或抑制功能)的化合物，其可能不通过其对天然酶蛋白质的作用而指示。

转基因学

菌蚋荧光素酶核酸可以用于在细胞系中产生转基因的、非人植物或动物或位点特异性的细胞修饰。本发明的转基因细胞包括一种或多种根据本发明的核酸作为转基因，转化成包括转基因的亲本细胞及其子代也包括在该定义内。

在许多实施方式中，转基因细胞是指并不正常地包埋或含有根据本发明的核酸分子的细胞。在这些实施方式中，转基因细胞并不天然地含有本发明核酸，核酸在细胞中在其天然位置以外的位置存在，即在非天然位置处整合到细胞的遗传物质中。

转基因动物可以通过同源重组制造，其中改变内源基因座。或者，核酸构建物随机整合到基因组中。用于稳定整合的载体包括质粒、反转录病毒或其它动物病毒、YAC和类似物。

本发明的转基因有机体包括作为内源基因敲除物的细胞和多细胞有机体，例如植物和动物，其中内源基因的表达即使没有消除也至少被降低。目的转基因有机体还包括细胞和多细胞有机体，例如植物和动物，其中蛋白质或其变体在细胞或组织中通常不表达的地方表达，或者以这些细胞或组织中通常不存在的水平表达。用于同源重组的DNA构建物包括本发明的基因的至少一部分，其中该基因具有所需的遗传修饰并包括与目标基因座具有同源性的区域。用于随机整合的DNA构建物不需要包括与中间重组具有同源性的区域。方便地，可以包括用于正选择和负选择的标记物。

通过同源重组产生具有目标基因修饰的细胞的方法是本领域已知的。对于各种转染哺乳动物细胞的技术，参见Keown等人(1990)，Meth.Enzymol.185：527-537。对于胚胎干(ES)细胞，可以使用ES细胞系，或者可以从宿主(例如小鼠、大鼠、豚鼠等)新鲜获得胚胎细胞10。这些细胞在合适的成纤维细胞-饲养层上生长，或者在白血病抑制因子(LIF)的存在下生长。当ES或胚胎细胞已经被转化时，它们可以用于产生转基因动物。转化之后，将细胞在合适的培养基中平板接种在饲养层上。含有构建物的细胞可以通过使用15种选择性培养基检测。充分长时间使菌落生长后，将其挑取，并分析同源重组的发生或构建物的整合。然后可以将阳性的克隆用于胚胎操作和胚泡注射。胚泡可以自4-6周龄的超排卵雌性获得。将ES细胞胰蛋白酶化，然后将修饰过的细胞注射到20个胚泡的囊胚腔中。注射之后，将胚泡返回假孕雌性的每个子宫角。然后使雌性妊娠结束(go to term)，产生的后代进行构建物筛选。通过提供不同显型的胚泡和遗传修饰细胞，可以很容易检测出嵌合子代。对嵌合动物在修饰基因存在的情况下进行筛选，使具有修饰的雄性和雌性交配，产生纯合子代。如果基因改变在发育中在某一点导致致死性，可以将组织或器官维持成异源或异系同基因的移植物或移植体，或者保持在体外培养物中。转基因动物可以是任何非人哺乳动物，例如实验动物、家畜等。转基因动物可以用于功能研究或调节物筛选，或本领域技术人员提供或已知的其它用途。

转基因植物可以以类似方式产生并使用。制备转基因植物细胞和植物的方法描述于美国专利第5,767,367；5,750,870；5,739,409；5,689,049；5,689,045；5,674,731；5,656,466；5,633,155；5,629,470；5,595,896；5,576,198；5,538,879；5,484,956号中。产生转基因植物的方法也综述于Plant Biochemistry and Molecular Biology(eds.Lea &Leegood，John Wiley & Sons)(1993)第275-295页。

简言之，根据植物物种的性质，收获合适的植物细胞或组织。因此，在某些实例中，分离原生质体，其中这些原生质体可以从许多种不同植物组织分离，例如叶、下胚轴(hypoctyl)、根等。对于原生质体的分离，将收获的细胞在纤维素酶的存在下孵育，以除去细胞壁，其中精确的孵育条件根据由其得到细胞的植物或组织的类型而变化。然后通过筛分和离心将产生的原生质体与产生的细胞碎片分离。也可以使用包括体细胞的胚胎发生外植体来代替原生质体的使用，以制备转基因宿主。细胞或组织收获之后，将关注的外源DNA引入植物细胞。多种不同的技术可用于这种引入。对于分离的原生质体，引入机会通过DNA-介导的基因转移方案升高，该方案包括：将原生质体与包括目的外源编码序列的裸DNA(例如质粒)一起在多价阳离子(例如PEG或PLO)的存在下一起孵育；和将原生质体在包括目的外源序列的裸DNA的存在下进行电穿孔。

然后选择已经成功吸收外源DNA的原生质体，通过与合适量和比例的刺激因子(例如生长素和细胞分裂素)接触，将其生长成胼胝体，并最终生长成转基因植物。对于胚胎发生外植体，在目标体细胞中引入外源DNA的方便的方法是通过使用粒子加速或“基因枪”方案。然后使产生的外植体生长成嵌合植物，得到交叉配种的转基因子代。

代替上述裸DNA方法的另一种产生转基因植物的方便方法是土壤杆菌(Agrobacterium)介导的转化。对于土壤杆菌介导的转化，制备包括外源DNA的共整合的或二元的载体，然后将其引入合适的土壤杆菌菌株，例如A.tumefaciens。然后将生成的细菌与制备的原生质体或组织外植体(例如叶盘(leaf disk))一起孵育，产生胼胝体。然后将胼胝体在选择性条件下生长，选择，并经受生长培养基，以诱导根和芽的生长，最终产生转基因植物。

可用于表达载体的任何调节或其它序列可以形成转基因序列的一部分。这包括内含序列和如果已包括的聚腺苷酰化信号。组织特异性调节序列可以与转基因可操作连接，以引导酶蛋白表达至特定细胞。

实施例

包括以下实施例，以说明本发明的优选实施方式。本领域技术人员应当认识到，以下的实施例中公开的技术代表发明人发现的在本发明实施中发挥良好作用的技术，因此可以视为是构成实施其的优选方式。但是，本领域技术人员根据本公开内容应当认识到，可以对公开的具体实施方式进行许多种变化，仍能在不偏离本发明精神和范围的情况下得到类似或相似的结果。

实施例中使用的各种材料和方法学

昆虫

在NSW National Parks和Wildlife Service的知会同意下从野外收集Arachnocampa richardsae的个体。从Newnes Railway Tunnel，map no.8931，grid reference E414 N187，New South Wales，Australia收集100只幼虫A.richardsae。将幼虫转移至实验室，在显微镜下从胴体剩余部分解剖光器官。

菌蚋物种可以通过本领域已知的方法培养。参见：Takaie，H.(1989)Breeding and display of the glow-worms，Arachnocampa spp.Insectarium，vol.26 July：214-219；Takaie，H.(1997)Ten years of the glow-worm(Arachnocampa richardsae)rearing at Tama Zoo-Fascination of a livingmilky way.Insectarium，vol 34 November：336-342.Sakurai，Y.，R.Komatani，K.Tabata和H.Takaie On the glow-worm breeding at TamaZoo。

RNA分离：使用RNAqueous^TM-Micro试剂盒(Ambion)根据制造商的说明书(除了组织在300μl溶解溶液中磨碎)，从一个胴体或大约10个光器官分离全RNA。

cDNA库：代表胴体和光器官的cDNA库使用具有改良的Creator^TMSMART^TM cDNA库构建试剂盒(Clontech)构建。第一条cDNA通过所述的长程(LD)PCR方法合成，使用1微克使用20周期扩增的全RNA和cDNA。如制造商所述，将2克扩增的ds cDNA进行蛋白酶K和SfiI消化，并根据制造商的说明书将其在cDNA尺寸分离柱(Invitrogen)上分开。将单独的部分(至多100ng ds cDNA)与100ngSfiI-消化的pDNR-LIB连接，随后电穿孔到ElectroMAX^TM DH10β^TMT1Phage抗性大肠杆菌(Invitrogen)中。通过将未扩增的库用50％(v/v)甘油-LB以1∶2稀释，制备每个cDNA库的甘油储液(stock)。此外，通过将100μl10％(v/v)甘油-LB用单克隆接种并在37℃下孵育过夜，在具有低蒸发盖的96孔聚苯乙烯平底板(Becton Dickinson)中制备来自每个光器官cDNA库的1056个单独挑取的克隆的甘油储液。将这些在-80℃下冷冻保存。

质粒分离：对于两个光器官cDNA库(部分10库和部分9库)的每一个，质粒DNA从96个随机挑取的克隆制备。

96-孔质粒DNA制备：质粒DNA根据自Millipore Corporation提供的信息(Beckman Coulter-Biomek 2000 Workstation ^TM-MilliporeProtocols，August 2002)改良的方法制备。单个菌落接种于在无菌96深孔板中的含有30μg/mL氯霉素的1.1ml 2x Luria Broth中。将板覆以AeraSeal^TM(Excel Scientific，Wrightswood CA)，在设定在320rpm的轨道式振荡器中在37℃下孵育24小时。将板在室温下以1500g离心5分钟，倾倒出上清液，通过将板在棉纸上稳固地轻拍从粒状沉淀上除去过量流体。

使用BioMek2000^TM自动工作站(Beckman Coulter)，将150μl溶液1(30mM葡萄糖，15mM Tris-HCl(pH 8.0)，30mM Na₂EDTA，60μg/mlRNaseA)加入到每孔中并混合。将板手动涡旋3分钟。加入150μl溶液2(0.2N NaOH，1％(w/v)SDS)，然后加入150μl溶液3(3.6M钾；6M乙酸盐)。将孔的内容物彻底混合。将300μl粗的溶解产物转移至Multiscreen^TM澄清板(Millipore)，将其置于真空歧管上的Plasmid^TM板(Millipore)之上。将溶解产物在真空下过滤(7分钟，203mm Hg)。弃去澄清板，将溶解产物在质粒板上真空过滤(8分钟；508mm Hg)。将质粒板在相同真空下用每孔200μl水洗涤6分钟。释放真空，向质粒板的每孔中加入35μl 10mM Tris(pH 8.0)，该板在600rpm下震摇15分钟。将含有质粒DNA的孔内容物用多道移液器收集。

测序：使用CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing^TM用QuickStart Kit^TM(Beckman Coulter)和100fmol质粒DNA对克隆进行测序。

来自A.richardsae光器官cDNA库的克隆的筛选的点印迹：使用96-孔复制因子(V & P Scientific，Inc.)将来自萤火虫光器官cDNA库(部分9)甘油储液的克隆点在Hybond-XL^TM膜(Amersham)上。然后根据制造商的说明书将膜变性、中和并固定。

将点印迹用使用以下引物制备的796bp的α³²P-dATP-标记PCR探针进行探测：

正向引物GWLucScreenU 5′-GATGATAATGCACCAGAAAAG-3′导向克隆1E1的核苷酸142-162(SEQ ID NO：11)

反向引物GWLucScreenL 5′-TTATAATATCCAGCATCACCA-3′导向克隆1E1的核苷酸938-918(SEQ ID NO：12)。

使用cDNA克隆1E1作为模版，遵照Millican和Bird的方法(Millican和Bird 1997)产生具有Taq DNA聚合酶(Invitrogen)的PCR探针。印迹根据膜制造商的说明书杂交并洗涤，然后暴露于X-射线膜。从与1E1杂交的克隆中提纯质粒DNA，对插入物进行测序。

构建编码A.richardsae荧光素酶的全长cDNA：制备Arachnocamparichardsae荧光素酶cDNA的两个模型。GWLuc#1(序列4)含有共有区编码序列，而GWLuc#2含有单一、沉默的自1308位的共有区的偏离。GWLuc#1和GWLuc#2在3′UTR中的单一碱基处也不同。

GWLuc#1使用克隆8F5的5′区和克隆4F12的3′区构建。克隆8F5是自部分9萤火虫光器官cDNA库(8号板；F5位)分离的全长cDNA。它与唯一的BamHI位点(1030)的3’区中的共有区含有3处不同。克隆4F12是部分cDNA，长度为1.5kb，3’为相同的BamH1位点，严格符合共有区编码序列。因此，在pDNR-LIB的MCS中在BamHI位点与XhoI位点之间的克隆8F5的3′端被移除，来自克隆4F12的相应片段拼接至克隆8F5。

GWLuc#2使用上述相同的8F5克隆构建，在该情况下，唯一的BamHI位点的3’区被相应的来自克隆1B6插入的片段代替(将T用C代替)。

将构建物通过PCR使用Platinum Pfx^TM DNA聚合酶(Invitrogen)根据制造商的说明书进行扩增。

荧光素提取物的制备：根据Viviani(Viviani，Hastings等人2002)从菌蚋的光器官制备含有部分(fraction)的菌蚋荧光素(下文称为“GW荧光素”)。将来自A.richardsae的90个光器官在热的0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5中均化。将悬液在95℃下孵育5分钟，用0.1M HCl酸化至pH 2.5-3.0。将提取物用等体积乙酸乙酯萃取，在氮气下干燥。残余物溶解在水中。

多序列比对：多序列比对和种系树使用如下程序产生：PROTML或PROTPARS程序：PROTML(Adachi，J.和Hasegawa，M.1996：MolphyVersion 2.3.Programs for molecular Phylogenetics based on maximumlikelihod.Computer Science monographs No.28.东京统计数学学院的出版物))；PROTPARS(Felsenstein，J.1989.PHYLIP-Phylogeny InferencePackage(Version 3.2)Cladistics 5：164-166)。成对比对和序列同一性和同源性水平使用BestFit(GCG)确定。序列比对程序通过AustralianNational Genomic Information Service提供的BioManager界面使用(http://www.angis.org.au)。

实施例1：分离编码菌蚋荧光素酶的核酸

分别地，胴体cDNA库自分成部分的胴体ds cDNA的部分8-10构建，光器官cDNA库自分成部分的ds cDNA的部分9和10构建。

在自每个光器官cDNA库分离的96个克隆中，分别有92和95个克隆成功进行了测序。使用tBLASTx程序对每个序列针对NCBI数据库进行询问。来自部分10光器官cDNA库的克隆没有鉴别出与任何荧光素酶具有同源性，但来自部分9光器官cDNA库的5个克隆与发光甲虫的荧光素酶具有同源性。克隆1E1(1275bp)；1B6(1163bp)；1F7(948bp)；1G12(768bp)；和1C5(494bp)进行完全测序，而且均显示出代表相同开放阅读框的独立得到的5′-截断的部分cDNA，在tBLASTx搜索中，所有5个克隆均显示与来自Phrixothrix vivianii和Phrixothrix hirtus的荧光素酶具有同源性。这些甲虫物种(鞘翅目：光荧科)具有发光幼虫，称作“铁路虫”。所有5个cDNA序列都在5’端被截断至不同程度。5个克隆的序列分析识别出3’端的11个碱基置换，其中3个是沉默的。

尽管cDNA扩增使用了校正DNA聚合酶(Advantage 2 PolymeraseMix，Clontech)，在每一个扩增步骤后得到高水平的推定的序列变异。这就有必要对多个独立的扩增子进行测序，以确定可靠的序列，并分离具有该序列的扩增子。当用另一种校正DNA聚合酶(Pfx，Invitrogen)扩增P.pyralis荧光素酶时观察到类似现象。萤火虫和菌蚋的荧光素酶共享的特殊特征在于，存在高比例的核苷酸二分体，这可能可以解释以这些序列作为目标进行PCR的相对较差的保真性。

使用96-孔复制因子(V & P Scientific，Inc.)将来自萤火虫发光器官cDNA库(部分9)甘油储液的克隆点在Hybond-XL膜(Amersham)上。根据制造商的说明书将膜变性、中和并固定。

用源自1E1的探针对960个含有光器官cDNA的菌落进行筛选，其中29个(大约3％)给出阳性信号。由于膜与复制因子接触的效率并不完全，这可能对阳性的总数有所低估。在用1E1探针筛选的大约1000个来自部分9胴体cDNA库的菌落中，无一发现呈阳性。

通过PCR对21个给出的杂交信号最强的克隆进行筛选，使用导向5’载体序列的pDONRLIBM13F作为正向引物，使用导向1E1核苷酸804-788的GWLuc484作为反向引物。从10个目标克隆中获得扩增子，证实其与1E1的5’端重叠。4个扩增子显示出比1E1要长。其中之一获自克隆4F12，长度为1.1千碱基对，表明全克隆长度为1.5千碱基对。获自克隆11B11、8F5和6B6的三个其它扩增子的长度均为1.3千碱基对，表明每个克隆的长度为1.7千碱基对。

A.richardsae荧光素酶的完全开放阅读框的序列通过对克隆1E1、1B6、1F7、1C5、1G12和11B11、8F5和6B6的测序而推导。来自至少3个独立克隆的序列在全部核苷酸位置上进行比较。共有区核苷酸序列显示于图1A至图1B或SEQ ID NO：1。在少数情况中，三个或更多个测序的克隆中单独的一个具有不同于共有区的序列。这些变异列于表3中。

表3.测序的Arachnocampa richardsae部分或全长克隆中的唯一的核苷酸变异

cDNA中的核苷酸位置	共有区	变体
			190	G	C
215	T	C
			613	T	C
654	T	C
			702	T	C
920	A	T
			1122	A	G
1159	A	C
			1245	T	C
1291	A	G
			1308	T	C
1310	T	C
			1346	T	C
1491	A	C
			1493	A	T

进行PCR筛选，以鉴别与克隆11B11、8F5和6B6相同的5’端上游任何额外的未翻译的序列。使用菌蚋光器官cDNA作为模板，通过半锚PCR得到代表荧光素酶基因5’端的cDNA克隆。在菌蚋光器官cDNA的构建中(Creator SMART cDNA库构建试剂盒(Clontech)，LD-PCR合成)，已经将SMART IV Oligo引物添加到所有扩增的cDNA上。因此使用SMART IV Oligo引物的一部分锚定PCR反应的5′端：5′-CAACGCAGAGTGGCCATTA-3′(SEQ ID NO：13)。使用导向荧光素酶cDNA的核苷酸514-494的荧光素酶基因特异性引物作为反向引物：5′-TGGCTTTTCTGGTGCATTATC-3′(SEQ ID NO：14)。使用如之前所述制备但在消化和尺寸分级(fractionation)之前的菌蚋光器官cDNA库的等分试样作为模板。将DNA用HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen)进行扩增。将扩增子(大约500bp)克隆到pGEMTeasy(Promega)中。对识别为加工荧光素酶cDNA的13个克隆进行测序。其中，8个具有与推定的全长荧光素酶cDNA克隆11B11、8F5和6B6完全相同的5′UTR序列。

cDNA在一个翻译框内显示出单个长的开放阅读框。该序列对应于SEQ ID NO：2的序列。ORF在用于核糖体启动的校正AXXAUGG菌肉(context)中以AUG开始(Kozak 1986；Kozak 1987)，并在核苷酸1621位以UAA终止密码子终止。蛋白质长度为530个氨基酸，该长度与其它昆虫荧光素酶和类荧光素酶(luciferase-like)蛋白质类似。

荧光素酶计算的分子量为58,955，计算的等电点为7.36。因此，其或多或少小于Photinus pyralis荧光素酶(de Wet等人1987)和若干其它萤火虫荧光素酶。计算的菌蚋荧光素酶的分子量与通过凝胶过滤测定的值大为不同。Viviani，Hastings等人(2002)教导分子量为36kDa。

实施例2：菌蚋荧光素酶序列与其它昆虫荧光素酶的序列的比较

用回收的菌蚋荧光素酶序列在NCBI数据库中进行tBLASTX搜索，发现来自D.melanogaster和Anopheles gambiae的类荧光素酶蛋白质以及来自Phrixothrix viviani、萤火虫和其它发光甲虫的荧光素酶。菌蚋荧光素酶与甲虫之间的氨基酸同源性在菌蚋序列的Asn 9处开始，其对应于发现于甲虫荧光素酶中5位和9位之间的保守天冬酰胺(图6)。

在核苷酸水平上，与P.viviani荧光素酶的同一性水平最高(58.1％)，但与Photinus pyralis的同一性水平几乎一样高(57.1％)。

表4.A.richardsae荧光素酶、两种代表性发光甲虫的荧光素酶和两种非发光蝇的类荧光素酶蛋白质之间的成对序列比较的小结。Phrixothrix viviani是使用A.richardsae查询在NCBI序列数据库的tBLASTx搜索中产生的得分最高的荧光素酶。

Photinus pyralis荧光素酶(550个氨基酸)	57.1	45.7	33.0
				Drosophila melanogaster类荧光素酶蛋白质(DroCG6178)(544个氨基酸)	55.6	51.2	38.8
Anopheles gambiae类荧光素酶蛋白质(AgCP8896)(493个氨基酸的部分序列)	54.5	48.8	36.8

Drosophila和Anopheles的类荧光素酶蛋白质多少具有水平较低的核苷酸同一性。在氨基酸水平上，与D.melanogaster的类荧光素酶蛋白质的同一性(38.8％)和同源性(51.2％)水平最高。与功能性荧光素酶的同一性(34.9％)和同源性(48.3％)水平最高的是来自Phrixothrixviviani的酶(表4)。很明显，菌蚋物种的荧光素酶与萤火虫和其它甲虫的荧光素酶属于同一基因超家族。另外显然菌蚋荧光素酶是该家族的新的成员，仅与甲虫荧光素酶具有很远的关系。这通过以下观察结果得到强调：在氨基酸水平上，与体内或体外都没有发光活性的类荧光素酶蛋白质的序列相似度更大。

基于来自18个物种的发光甲虫的荧光素酶序列的比对，这18个物种代表来自叩甲科的一个属、来自光荧科的一个属和来自荧科的8个属，甲虫荧光素酶共享128个完全保守的氨基酸残基(图6)。萤火虫荧光素酶的长度一贯为大约550个氨基酸残基。因此，迄今测序的所有甲虫荧光素酶成员之间大约23％的残基是完全保守的。相反，荧光素酶—酰基-CoA连接酶和肽合成酶超家族的所有成员之间仅有7个残基是完全保守的(Conti等人1996)。A.richardsae荧光素酶的序列在128个当中的58个位置处与甲虫荧光素酶共有区的序列不同(表3)。因此，A.richardsae荧光素酶序列代表着萤火虫所表现发光的问题的完全不同的解决方案。

表5.所有甲虫荧光素酶之间完全保守但A.richardsae序列偏离的58个残基的列表。

表5的注解：

A：P.pyralis(M15055)荧光素酶，长度550个氨基酸。

B：A.richardsae荧光素酶，长度530个氨基酸。

#57个变化中，我们得到按蚊类荧光素酶基因的序列：

1.A.richardsae残基与两个双翅目类荧光素酶序列之一相同，但彼此不同。

2.A.richardsae、D.melanogaster和A.gambiae残基相同，但其不同于甲虫共有区。

3.A.richardsae残基与甲虫共有区不同，但D.melanogaster和A.gambiae类荧光素酶蛋白质均具有与甲虫共有区相同的残基。

4.所有三个双翅目基因在该位置处具有不同的残基。

5.A.richardsae残基与甲虫共有区不同，D.melanogaster和A.gambiae类荧光素酶蛋白质二者具有相同的不是甲虫共有区的残基。

实施例3：关键氨基酸和位置的识别

所有迄今测试的甲虫荧光素酶都使用相同的D-荧光素。诱变研究已经揭示了数个残基在甲虫荧光素酶的底物结合或催化机制中的重要性。A.richardsae的荧光素酶在这些关键残基的亚型处序列不同。已经显示萤火虫荧光素酶的精氨酸218是必要的荧光素结合位点残基(Branchini，Magyar等人2001)。R218用谷氨酰胺、赖氨酸或丙氨酸取代，导致荧光素的K_M值增加15-20倍。闪光高度(强度)分别降低至野生型的值的33％、5％和3.6％，并且k_cat数值降低。所有三个突变体中的发射最大值波长也均有降低。R218代表了上述在所有考察的18种甲虫荧光素酶中完全保守的残基中的一个。但是，在菌蚋荧光素酶的对应区域中，缺失了4个氨基残基。A.richardsae的N213和L214之间的缺失(表3)包括预计出现精氨酸的位置，相当于P.pyralis的R218(图6)。跨越缺失的A.richardsae残基K205、G206、V207和H216在菌蚋和所有18种甲虫荧光素酶之间是完全保守的(图6)。直接相邻于缺失的残基N213、L214和I215分别与10、2和2个其它甲虫荧光素酶相同。因此，菌蚋荧光素酶的底物结合特性在这一区域中大大偏离于甲虫荧光素酶的性质。

在更广泛的研究中(Branchini，Southworth等人2003)，据信位于P.pyralis荧光素酶活性位点5内的15个残基(R218、H245、G246、F247、F250、T251、G315、G316、G341、L342、T343、S347、A348、I351、K529)进行了突变。黑体的11个残基显示出4倍或更大的D-荧光素K_M的变化。A.richardsae荧光素酶中相应位置处的残基在由Branchini鉴别的15种情况中的10个中不同(op.cit；DEL 213-214 R218、N238H245、A239G246、T243F250、A244T251、S308G315、S335L342、S336T343、L339S347、A343I351；也参见图6)。菌蚋中在这10个位置各处的氨基酸置换或缺失的性质不同于Branchini等人测试的实验操作，其仅限于如下：R218-＞K、Q、A(Branchini，Magyar等人2001；Branchini，Southworth等人2003)；H245-＞F、D、A(Branchini，Magyar等人1998；Branchini，Magyar等人2001；Branchini，Southworth等人2003)；G246-＞A；F247-＞Y、L、A；F250-＞S、G；T251-＞A；G315-＞A；G316-＞A；G341-＞A；L342-＞A；T343-＞A；S347＞A；A348-＞V；1351-＞A；K529-＞A(Branchini，Southworth等人2003)。

因此没有这些残基的菌蚋形式的先例，即使是单独的置换。而且，Branchini等人测试的8个结合位点残基(R218、H245、F247、G315、G341、L342、T343和K529)在所有18个用于比对的甲虫荧光素酶之间是完全保守的。在A.richardsae中的相应位置处(图6)，这些残基中的5个是排列甲虫荧光素酶中底物结合袋的不变残基的亚型，相应的菌蚋残基在60％以上的情况下是不同的，这由菌蚋(Arachnocampaspp)荧光素酶特定片段和Photinus pyralis序列之间的百分比相似性/同一性反映：

结果使用GAP(GCG/ANGIS)得到。注意BESTFIT得到的结果基本相同。

实施例4：菌蚋荧光素酶与其它双翅目的类荧光素酶蛋白质的相似性及进化起源

本发明的荧光素酶与甲虫荧光素酶共有序列不同的58个氨基酸残基中的57个落入序列可用于D.melanogaster和A.gambiae的“类荧光素酶”蛋白质的区域。在这57个残基的33个上，类荧光素酶蛋白质符合甲虫荧光素酶的序列(表5)，即使这些有机体并不发光。基于这些共有残基，似乎A.richardsae的荧光素酶已经经历从祖先的科分歧出的进化压力。基于我们的序列数据，不能推论发光甲虫和蝇的荧光素酶是否是从共同的发光祖先进化而来，或者鞘翅目和双翅目中的发光是否是从酰基-CoA连接酶家族的类荧光素酶蛋白质独立进化的。

实施例5：菌蚋荧光素酶在酰基-CoA连接酶超家族的其它荧光素酶的分子种系学中的位置

使用来自发光鞘翅目昆虫的18种唯一荧光素酶序列、D.melanogaster和A.gambiae的类荧光素酶蛋白质、来自小鼠的酰基-CoA连接酶和来自A.richardsae的新的荧光素酶的PROTML程序(图7)的未锚定种系分析将萤火虫(荧科：例如Hotaria、Photinus、Lampyris、Luciola和Pyrocoelia)与铁道虫(光荧科：即Phrixothrix物种)和叩头虫(叩甲科：即Pyrophorus物种)分开。A.richardsae的荧光素酶明显与所有三个发光甲虫科分开，尽管与甲虫荧光素酶的关系比与双翅目类荧光素酶蛋白质的关系密切。但是，在相同序列的分子种系学中，使用PROTPARS程序用小鼠酰基-Co连接酶锚定(未显示)，菌蚋荧光素酶的位置是作为双翅昆虫类荧光素酶蛋白质的外组(outgroup)。所有其它荧光素酶之间的关系不变。

实施例6：菌蚋荧光素酶的表达

构建pETDuet-l：GWLuc#l

使用Platinum Pfx DNA聚合酶(Invitrogen)，遵照制造商的推荐，使用每反应10pmol的pETGWLucF和pETGWLucR PCR引物对GWLuc#1的全长cDNA进行扩增：

pETGWLucF：GACACACCATGGCTTGTACTTCAGT(SEQ ID NO：15)

pETGWLucR：GACGACCCTAGGTTACAATGTTCCTCTTAAA(SEQ ID NO：16)

这些引物引入全长菌蚋荧光素酶cDNA的NcoI和AvrII限制酶切位点5′和3′。提纯的PCR产物是A尾的(A-tailed)，如pGEM T-easy载体系统I手册(Promega)中所述，将其与pGEM T-easy连接。将构建物电穿孔到大肠杆菌DH5α菌株中，使用CEQ 2000 Dye TerminatorCycle Sequencing用Quick Start试剂盒(Beckman Coulter)和50fmol质粒DNA进行测序。将含有无错菌蚋荧光素酶cDNA序列的构建物用NcoI和AvrII切除，并使用MCS1的NcoI位点和MCS2的AvrII位点插入到Novagen pET-Duetl载体(EMD/Merck Biosciences，San Diego/Darmstadt)中。产生的质粒称为pETDuet-1：GWLuc#1。将质粒电穿孔到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，并再次进行测序。

甲虫荧光素酶(Photinus pyralis)对照

将P.pyralis luc基因的全长构建物(1653核苷酸)插入到pETDuet-1载体中，得到pETDuet-1：FFLuc，随后将其电穿孔到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，如对于pETDuet-1：GWLuc#1所描述。

对照表达载体

通过切除MCS1 5’的NcoI位点至MCS2的AvrII位点，其分别从MCS1和MCS2上除去His和S标记，由pETDuet-1制备对照表达载体pETDuet-1：对照。产生的5′突出端使用DNA聚合酶I(Klenow，NEB)用25mM每种dNTP进行端填充(end-filled)。反应在25℃下孵育15分钟，并通过加入10mM EDTA和在75℃下孵育20分钟终止。提纯载体，并根据Fermentas对于钝尾连接(blunt ended ligation)的推荐，使用T4 DNA连接酶(Fermentas)在5％(w/v)PEG8000的存在下进行自连接。随后将对照载体电穿孔到大肠杆菌菌株BL21(DE3)中，如对于pETDuet-1：GWLuc#1所描述。

先期诱导

将2毫升(mL)空对照载体pETDuet-1：对照载体(在BL21(DE3)中)；pETDuet-1：FFLuc(萤火虫(firefly)荧光素酶)构建物(在BL21(DE3)中)；pETDuet-1：GWLuc(萤火虫(glow-worm)荧光素酶)#1构建物(在BL21(DE3)中)和未转化的BL21(DE3)细胞的培养物，在含有1M葡萄糖的LB培养基中在37℃、200rpm下孵育过夜。次日，将培养物在室温下以1,500rpm离心3次，粒状沉淀重悬浮在2mL LB中。将50mL LB用每个培养物的1∶50稀释液接种，然后加入50μL 1000x氨苄青霉素。诱导开始之前将这些接种的溶液在37℃下孵育1小时。在600nm下测量培养物的吸收(Abs600nm)，当达到Abs600nm≥0.6时，取出4个1mL的等分试样，在室温下以10,000g离心5分钟，细胞粒在-80℃下存储。

诱导

从剩余的培养物体积中，将2个9mL等分试样转移至50mL锥形离心管中。一个等分试样通过加入IPTG(0.4mM最终浓度)诱导，第二个不进行诱导(取而代之加入等量的水)。未转化的BL21(DE3)培养物不进行诱导，将20mL转移至250mL锥形烧瓶中。随后，所有培养物在20℃、150rpm下孵育48小时，这时测量Abs600nm。从每个培养物中取出3个250μL的等分试样，在室温下以10,000g离心5分钟，粒状沉淀在-80℃下存贮用于蛋白质分析。将5mL pETDuet-1：对照载体；pETDuet-1：FFLuc和pETDuet-1：GWLuc#1和15mL BL21(DE3)培养物转移至洁净的离心管中，在4℃下以3,000rpm离心10分钟。倾倒出上清液，各丸粒重新悬浮在各个起始体积的冰冷磷酸盐缓冲盐水(pH 7.4)(137mM NaCl，2.7mM KCl，4.3mM Na₂HPO₄)中，在4℃下以3,000rpm再离心10分钟。倾倒出PBS，将丸粒重新悬浮在冰冷PBS中，调节成与最浓的样品给出相同的Abs 600nm。

蛋白质分析

蛋白质分析使用Invitrogen的NuPAGE^TM Novex Bis-Tris凝胶系统，使用制造商的说明书进行。将冷冻的细菌丸粒通过加入含有50mMDTT的1x NUPAGE^TM月桂基十二烷基硫酸酯(LDS)样品缓冲液并在70℃下加热10分钟而溶解。通过使细菌溶解产物穿过30G针若干次，对染色体DNA进行剪切。将蛋白质浓度大致相等的细菌样品(通过测量细菌密度(Abs600×稀释因子)而推测)和SeeBlue^TM预染色标准物(Invitrogen)装到NUPAGE^TM 12％Bis-Tris凝胶上，并在恒定的200V下使用NUPAGE^TM MOPS SDS流动缓冲液(pH 7.7，50mM MOPS，50mM Tris，0.1％(w/v)SDS，1mM EDTA)电泳大约50分钟，在仅具有XCeIl SureLock^TM Mini-cell(Invitrogen)的上室中加入1x NUP AGE^TM抗氧化剂。

将凝胶从盒子中取出，在室温下在45％(v/v)甲醇-10％(v/v)乙酸中轻轻搅动10分钟洗涤3次。最终洗涤之后，将凝胶浸没在Faststain(16％(v/v)Fast Stain储液(Fisher Biotec)、9％(v/v)甲醇、2％(v/v)乙酸)中，在室温下轻轻搅动染色过夜。倾倒出染色溶液，将凝胶最初于室温下在10％(v/v)乙酸中漂洗10分钟，然后保存在10％(v/v)乙酸中。使用视频图像捕获系统以透见荧光照明对凝胶进行拍照。图8显示了用pETDuet1：FFLuc(第5道)或pETDuet1：GWLuc#1(第8道)构建物转化的诱导丸粒的LDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，表现出类似的蛋白质表达模式。用IPTG诱导的转化细菌(用pETDuet1：FFLuc载体)表现出新的特征是萤火虫荧光素酶的51和64kDa之间的谱带(第5道)。类似地IPTG诱导的用pETDuet1：GWLuc#1载体转化的细菌表现出新的谱带(第8道)，表明了菌蚋荧光素酶的成功表达。

制备溶解产物

将40μL BL21(DE3)未转化细胞与50μL pETDuet-1：对照、pETDuet-1：FFLuc或pETDuet-1：GELuc#1培养物混合，加入10μL 1MH₂HPO₄(pH 7.8)和20mM EDTA。将细胞混合物的等分试样在干冰上快速冷冻，并保存在-80℃下。冷冻细胞通过置于室温水浴中的试管中而解冻。将细胞等分试样与300μL现制的溶解混合物(1×荧光素酶细胞培养物溶解试剂(CCLR，Promega)、1.25mg/mL溶菌酶(Sigma)、2.5mg/mL牛血清白蛋白(BSA)(Sigma))混合。在室温下孵育10分钟后，将溶解产物等分，在-80℃下保存或立即使用。

荧光素检验

该荧光素检验使用含有源自菌蚋的荧光素酶(“萤火虫荧光素酶”或“GW荧光素酶”)的细胞溶解产物(如上)。将10μL的细胞溶解产物等分试样(除非另外指出)加入到OptiPlate^TM-96板的孔中。将90μL(或使最终体积为100μL的合适体积)含有Tris-乙酸盐缓冲液(pH7.75)、ATP、乙酸镁和D-荧光素(Sigma)的缓冲混合物加入到溶解产物中，使最终浓度分别为25mM、2mM、4mM和0.4mM。或者，将100μL通过将10mL荧光素酶检验缓冲液混合到含有冻干的荧光素酶检验底物的小瓶中而制备的市售荧光素酶检验试剂(Promega)，加入到20μL指定的细胞溶解产物中。使用Wallacl420 Victor 2光度计(Perkin-Elmer)快速动力学模式测量总的光输出。积分时间设为0.5秒，重复次数设为100。

实施例7：菌蚋荧光素酶活性

与对照细胞溶解产物相比，向10μL源自菌蚋的荧光素酶(“萤火虫荧光素酶”或“GW荧光素酶”)的细胞溶解产物加入D-荧光素导致生物发光活性提高(图16)。已经有报道，甲虫生物发光系统和菌蚋生物发光系统之间完全没有交叉反应性。不同和增加量的GW荧光素酶加入到D-荧光素中，表明该反应是定量的(图17)。在所有情况下，通过使所用的孔间隔开，小心地保证孔之间没有交谈(cross-talk)。溶解产物混合物中存在的GW荧光素酶可以使用甲虫D-荧光素进行定量(灵敏度为18.52CPS/μL加入的GW荧光素酶溶解产物)(图18)。检验灵敏度足以对以上述方式制备的萤火虫荧光素酶进行定量。

对照

为了保证观察到的生物发光增强是因为GW荧光素酶与D-荧光素的相互作用，进行了数项对照实验。第一项对照实验简单地涉及在与D-荧光素混合之前将GW荧光素酶细胞溶解产物在95℃下加热5分钟。在加入D-荧光素之前加热含有细胞溶解产物的GW荧光素酶完全消除了生物发光的增强(图19)。

第二项对照是看GW荧光素酶对ATP/Mg(浓度分别为2mM和4mM)的响应。图20显示了在同时加入或不加入D-荧光素的情况下，50μL GW荧光素酶溶解产物对加入ATP/Mg的响应。ATP或Mg不会导致生物发光增强，但存在D-荧光素则会导致。

进一步对照使用不同荧光素酶与D-荧光素以及不同底物与GW荧光素酶进行。与非诱导的细胞溶解产物相比，将GW荧光素酶用IPTG诱导的类果蝇(drosophilia-like)荧光素酶替代不会导致在加入D-荧光素时生物发光的任何提高(图21)。与对照细胞溶解产物相比，将D-荧光素用生物发光最有效的腔肠素(coelentarazine)底物(CLZN-hcp(1μ/100μl))代替不会导致在加入GW荧光素酶时生物发光的任何提高(图22)。

将GW荧光素酶和D-荧光素混合时观察到生物发光提高的反应是由于在ATP的存在下涉及这两种组分的特定相互作用。

实施例8：Arachnocampa Richardsae生物发光系统

粗提取物的制备：方法1

该方法自Viviani等人(2002)所述的方法改造。通过将5个发光器官在0.5mL冷提取缓冲液(27mM Tricine、7mM MgSO₄、0.2mMEDTA、10％甘油和1％ Triton X-100，pH 7.4)中均化，制备菌蚋的粗提取物。均化之后将提取物在4℃下以15,000g离心15分钟。通过在98℃下将上清液加热5分钟，并加入1mM ATP(最终浓度)，制备热的提取物。通过将10μL热的提取物与90μL含有0.84mL Tris-HCl缓冲液(pH 8)的反应缓冲溶液、0.11mL萤火虫(glow-worm或firefly)荧光素酶和0.05mL ATP/Mg(40/80mM)混合，测定荧光素酶活性。

粗提取物的制备：方法2

在第二种方法中，通过在艾本德(eppendorf)管中向5个冷冻的光器官中加入100μL乙酸乙酯，然后在均化后将提取物在15,000g下离心5分钟，制备粗提取物。将含有光器官的艾本德保持在干冰上，同时进行均化处理。通过将20μL粗提取物与含有tris-乙酸盐缓冲液(25mM)、乙酸镁(4mM)和ATP(2mM)(均为最终浓度)的反应缓冲溶液混合，得到100μL的最终体积，进行体外生物发光检验。

GW荧光素酶检验

将含有tris-乙酸盐缓冲液(25mM)、乙酸镁(4mM)和ATP(2mM)(均为最终浓度)、和GW荧光素酶细胞溶解产物的反应缓冲溶液给出的最终体积为100μL，将其加入到20μL粗提取物中。

粗提取物活性

最初试图用GW荧光素酶重复Viviani等人(2002)所述的热-冷提取物实验的考察是不成功的。向上述制备的粗提取物样品中加入GW荧光素酶，不同时加入ATP，导致生物发光活性闪光。该作用在进一步加入GW荧光素酶以及同时加入ATP时是可重复的。这种类型的闪光是向D-荧光素中加入过量荧光素酶和ATP时通常观察到的闪光类型的特征。

发光光谱

在D-荧光素的存在下GW荧光素酶活性的阳性证明之后，记录加入D-荧光素时GW和FF荧光素酶的荧光和生物发光光谱。

溶液的制备。通过将450μL检测缓冲溶液或商业检测试剂(Promega)与50μL所说明的相应荧光素酶混合，制备0.5mL溶液。混合在1mL的荧光计池中进行，通过Cary Eclipse荧光荧光计使用波长扫描模式记录光谱。生物发光光谱在溶液混合之后立即记录，荧光光谱在加入所示的各个荧光素酶之前和之后记录。

生物发光光谱

加入D-荧光素时GW(菌蚋)和FF(萤火虫，Photinus)荧光素酶的归一化生物发光光谱显示在图23中。加入GW荧光素酶诱导的最大生物发光在440和480nm之间。使用GW荧光素酶代替FF荧光素酶导致发射光谱从555nm蓝移至低于530nm。报道的FF荧光素酶的最大值在pH 7.6下为562nm。光谱的最大强度变化很大，FF和GW荧光素酶分别为90.98任意单位(a.u.)和3.12a.u.。

实施例9：从其它菌蚋物种中分离同源荧光素酶

如Baker(2004)中所综述，数年来，认识了发光菌蚋的4个澳大拉西亚物种。这些物种是新西兰特有的Arachnocampa flava、Arachnocampa richardsae、Arachnocampa tasmaniensis和Arachnocampaluminosa。第一对物种识别为Campara亚属，后一对识别为菌蚋亚属。Baker(前面引用的)在她的博士研究中取得了澳大拉西亚发光双翅目由至少9个生物物种代表的有力证据。除已经提到的4个物种之外，Baker(前面引用的)还描述了5个新的澳大利亚物种，即Arachnocampabuffaloensis、Arachnnocampa tropicus、Arachnocampa girraweenensis、Arachnocampa gippslandensis和Arachnocampa otwayensis。除Arachnocampa spp.和北美Orfelia fultoni(Fulton，1941；Viviani，2002)之外，还有其它双翅目发光物种的零星报道，通常是Keroplatus spp.(例如Sivinski，1998；Baker，2004中所总结)。这些报道通常证据不足，并涉及通常不发现于当地丰产的群聚中(以澳大拉西亚动物群为特征)。我们开始论证使用A.richardsae的序列从其它生物发光双翅目和一些容易得到的例如菌蚋的澳大利亚物种分离编码荧光素酶的序列的可行性，以设计PCR引物。

方法和结果

对来自三种其它的菌蚋物种的A.richardsae荧光素酶基因的同源物进行分离、克隆和测序。这三个物种为Campara亚属的Arachnocampaflava和Arachnocampa girraweenensis，以及Arachnocampa亚属的Arachnocampa tasmaniensis。对于这些物种的每一个，从其自然栖息地收集2至5个幼虫样品，将其在24小时内活着转移至实验室。将每个物种的样品在磷酸盐-或tris-缓冲的盐水下解剖。将切下的连有一些周围组织的光器官集中并在-80℃下快速冷冻。

A.RNA提取

对于三种样品的每一个，使用RNAqueous-Micro试剂盒(Ambion，cat.no.1931)遵照制造商的说明书提取两种或三种光器官的全RNA。

B.cDNA合成

1.第一条cDNA的合成：使用来自Creator SMART cDNA库构建试剂盒(Clontech/BD Biosciences，cat.no.K1053-1)的引物合成单链cDNA。反应遵照制造商的说明书进行。该试剂盒中提供的逆转录酶直接用新鲜的PowerScript逆转录酶(BD Biosciences，cat.no.639500)替换。

2.第二条cDNA的合成：双链(ds)cDNA通过长程PCR使用Creator SMART cDNA库构建试剂盒中提供的引物进行。使用2μL如之前小节中所述合成的第一条cDNA，遵照试剂盒说明书进行25个扩增热周期。将试剂盒中的DNA聚合酶直接用新鲜的Advantage cDNA聚合酶混合物(BD Biosciences，cat.no.50595)替换。

C.通过PCR克隆荧光素酶cDNA

1.A.flava和A.girraweenensis

将A.flava和A.girraweenensis荧光素酶cDNA的部分从其各自的ds cDNA库进行扩增。PCR反应使用HotStarTaq DNA聚合酶(Qiagen，cat.no.203203)进行，PCR引物设计成与A.richardsae荧光素酶基因互补(表6)。

表6：正文和表7中提到的A.richardsae荧光素酶cDNA引物的序列。

	引物名称	引物序列	SEQ ID NO：
				F1F2F3F4F5R5R6R7R8R9R10R11R12R13	GWLO8F5F250GWLucScreenUGWLO91E1F250GWLO91B6F12GWLO91F7F228GWLucRS873GWLucRS757GWLucRS601GWLucRS484GWLucScreenLGWLucRS326GWLucRS182GWLucRS90GWLucRS42	5’-AGAAAGGGCGATCGTGTTG-3’5’-GATGATAATGCACCAGAAAAG-3’5′-ACCATTGCCACTGTTTTATTGA-3′5′-CATTTAATGGCACCAGGGTACT-3′5′-ACCCGAAATTGCGAACTATGA-3′5′-AGTAAAACCAAACGCATTAG-3′5′-AAGGGAGGGTGAACACTGA-3′5′-CCATAAAATTGACGTACGACC-3′5′-CCAAGAAGGGCACCAGTTT-3′5′-TTATAATATCCAGCATCACCA-3′5′-CAACGAACCATTCAAATCT-3′5′-AATGCAAATAATACTTCACCACC-3′5′-GCCACCTTTAAGATGCTTG-3′5′-AACATTTTGCCAGCTGGATTC-3′	1718192021222324252627282930

对于A.flava，测试了30种引物对的组合(表7)，遵照制造商的说明书进行40个扩增热周期。30种引物对组合中的29个扩增了预计大小的唯一产物。将两种PCR产物(表7)用microCLEAN DNA Cleanup试剂(Astral，cat.no.2MCL-5)提纯，并用特异于A.richardsae荧光素酶cDNA序列的引物进行测序。BESTFIT比较显示，A.flava核苷酸序列与之前测定的A.richardsae荧光素酶的cDNA序列的同一性为96％。这证实了A.flava序列作为A.richardsae荧光素酶同源物的身份。

对于A.girraweenensis，仅仅测试了4种A.richardsae荧光素酶基因特异性引物的组合(表7)，使用与上述小节相同的PCR条件。所有4种引物对的组合均扩增了预计大小的唯一产物。将两种PCR产物(表7)提纯，并用A.richardsae荧光素酶cDNA序列特异性引物进行测序。BESTFIT比较显示，A.girraweenensis核苷酸序列与之前测定的A.richardsae荧光素酶的cDNA序列的同一性为96.5％。这证实了A.girraweenensis序列作为A.richardsae荧光素酶同源物的身份。

将A.flava和A.girraweenensis荧光素酶cDNA的5′和3′端单独地通过半锚定PCR扩增：每个引物对包括A.richardsae荧光素酶cDNA序列特异性引物，以及与A.flava和A.girraweenensis ds cDNA的cDNA合成中使用的SMART引物部分互补的第二引物(表8)。使用双链cDNA作为模版，遵照制造商的指示，以Pfx50 DNA聚合酶和40个扩增热周期进行递降(touchdown)PCR反应。

对于5′端扩增，对两种物种测试了2种引物对的组合(表9)。对于A.flava和A.girraweenensis，两个引物对均扩增了预计大小的唯一产物(表9)。

对于3′端扩增，对两种物种测试了2种引物对的组合(表10)。对于A.flava和A.girraweenensis，两个引物对均扩增了预计大小的唯一产物(表10)。对于两个物种，对来自每个3′和5′端扩增的一种产物进行测序，揭示了荧光素酶cDNA的5′端和3′端的序列。对于A.flava和A.girraweenensis的荧光素酶基因，ORF的前40个核苷酸和后40个核苷酸与A.richardsae荧光素酶cDNA ORF是相同的。A.flava和A.girraweenensis荧光素酶基因的完整ORF用Virginia的表达小节中所述的两个引物pETGWLucF和pETGWLucR通过递降PCR而扩增。反应用单链cDNA作为模版和Pfx50 DNA聚合酶(Invitrogen，cat.no.12355-012)进行，遵照制造商的说明书进行扩增。对1.6kb的扩增子在其整个长度上测序。发现A.flava和A.girraweenensis荧光素酶肽序列与来自A.richardsae的荧光素酶基因的同一性分别是99.6％和99.8％。

2.A.tasmaniensis

A.tasmaniensis荧光素酶cDNA的5′和3′端均通过半锚定PCR直接扩增。对于每一端测试了数种引物对(表11；表12)。使用双链cDNA作为模版，遵照制造商的说明书以Pfx50 DNA聚合酶和40个扩增热周期进行递降PCR反应。

对于5′端的扩增，测试了6个引物对的组合。这些扩增的唯一产物中的两个具有预计的大小。将一种产物(表11)根据制造商的说明书直接克隆到pJET1/blunt克隆载体(Fermentas，cat.no.K1221)中。

为了扩增3′端，测试了2个引物对组合。一对(表12)扩增了预计大小的单一产物，将其直接克隆到pJET1/blunt克隆载体中。将来自两种克隆产物中的每一种的4个克隆用pJET1测序引物进行测序。与A.richardsae荧光素酶cDNA的BESTFIT DNA序列比较显示，5’端处的同一性为83％，3’端处的同一性为88％。与A.richardsae荧光素酶基因的BESTFIT肽序列比较显示，5’端的同一性和3’端的同一性分别为89％和93％。这些数据证实了两种PCR扩增子都源自A.richardsae荧光素酶cDNA的相似同源物。ORF的开始和末端都已经得到鉴别。设计与A.tasmaniensis荧光素酶ORF的开始和末端互补的引物，以扩增完整的ORF：

A.tasLucORF-F：5′-ATGACTTCTACATCTGTGGA-3′；(SEQ ID NO：31)

A.tasLucORF-R：5-TTACAATGTTGATCTTAAAATAC-3′；(SEQ IDNO：32)

表7：以A.flava ds cDNA测试的A.richardsae cDNA引物的组合

Y：预计大小扩增的唯一产物

N：没有预计大小扩增的产物

-：引物组合未测试

^*g：引物组合另外用A.girraweenensis测试，预计大小扩增的唯一产物

#^*f，g：测序的A.flava和A.girraweenensis产物

表8：用于扩增荧光素酶cDNA的5′和3′端的引物序列

#：来自SMART的引物

^*：A.richardsae荧光素酶cDNA序列引物

表9：A.flava和A.girraweenensis的5′端荧光素酶扩增测试的引物组合

	SMART-nF1	SMART-nF2
			GWLucRS1120	-	Y，0.5kb*f，g
GWLucRS1000	Y	-

Y：预计大小扩增的唯一产物

-：引物组合未测试

^*f，g：对于A.flava和A.girraweenensis，产物进行测序

表10：A.flava和A.girraweenensis的3′端荧光素酶扩增测试的引物组合

	CDSIII-R
		GWLO91C5F84	Y，0.5kb*f，g
GWLO91G12F236	Y

Y：预计大小扩增的唯一产物

^*f，g：对于A.flava和A.girraweenensis，产物进行测序

表11：A.tasmaniensis荧光素酶的5′端扩增测试的引物组合

	SMART-nF1	SMART-nF2
			GWLucRS1120	-	N
GWLucRS1000	N	-
			GWLuc1E1R10	Y，0.4kb*	Y
GWLucRS757	N	N

Y：预计大小扩增的唯一产物

N：没有预计大小扩增的产物

-：引物组合未测试

^*：单一产物克隆并测序

表12：A.tasmaniensis荧光素酶的3′端扩增测试的引物组合

	CDSIII-R
		GWLO91C5F84	N
GWLO91G12F236	Y，0.6kb*

Y：预计大小扩增的单一产物

N：没有预计大小扩增的产物

^*：单一产物克隆并测序

表13：四个菌蚋物种的氨基酸同一性/相似性的成对比较

	A.richardsae	A.flava	A.girraweenensis	A.tasmaniensis
					A.richardsae	100	99.6	96.8	91.5
A.flava	99.8	100	99.8	91.7
					A.girraweenensis	100	99.8	100	91.7
A.tasmaniensis	94.7	94.9	94.7	100

使用在先小节所述的PCR方法，不仅从A.flava和A.girraweenensis，而且从A.tasmaniensis直接地分离荧光素酶cDNA。由于我们在Campara亚属的物种之间观察到的高水平序列同源性，使用本文所述的技术也会直接地从菌蚋(Campara)gippslandensis、菌蚋(Campara)otwayensis、菌蚋(Campara)tropicus和事实上任何将来可能描述的菌蚋属Campara亚属的其它物种来分离荧光素酶。而且我们已经论证，使用特异于A.richardsae的PCR引物，可以无需过度的实验而从A.tasmaniensis分离荧光素酶。因此，我们推论将会直接地从归类为菌蚋亚属的其它物种中发现同源荧光素酶，这些物种包括菌蚋luminosa和菌蚋buffaloensis以及事实上任何将来可能描述的菌蚋属的其它物种。当然，将会更直接地使用特异于A.tasmaniensis荧光素酶序列的引物，使用前述的策略和方法从菌蚋亚属的其它物种中发现同源荧光素酶。没有必要为了分离A flava、A.girraweenenis或A tasmaniensis的荧光素酶而诉诸于筛选cDNA库。但是，前述的文库筛选方法将是不仅从菌蚋属其它成员而且从其它关系更远的发蓝光的双翅目(例如Orfelia fultoni或Keroplatus spp.)中发现同源荧光素酶的可行方式。

由于我们能够容易地从少到两个Arachnocampa spp.的光器官中分离编码同源荧光素酶的序列，我们也确信可以使用所公开的方法，从发蓝光的双翅目的甚至单一样品中扩增并分离同源荧光素酶，例如从Sivinski(1998)所提到的那些物种中，其中仅仅遇到单个样品。

实施例10：萤火虫荧光素酶的细菌表达：表达载体、宿主细胞、诱导方式和融合标记

用于GWLuc#1的细菌表达的交替诱导方式和表达构建物

在对细菌表达的GWLuc#1的表达和亚细胞分配进行优化的尝试中，如以下小节所述对诱导方式的如下变量进行操纵：(i)诱导时间，(ii)诱导温度，(iii)IPTG浓度和(iv)大肠杆菌菌株(Derewenda，2004的综述)。使用的第二个策略是在GWLuc#1与标记，硫氧还原蛋白(Trx；例如pET48b(+)表达载体)和NusA(例如pET50b(+)表达载体)之间产生N-端融合。已经证明这些标记对蛋白质表达和溶解性都具有正面影响(

Hellgren，van den Berg，Berglund和

2002的综述)。另外产生具有GWLuc#1的N-端6His融合构建物，以进一步论证产生GWLuc#1融合蛋白的能力。选择His标记是因为它可以修改成使用金属离子螯合色谱进行提纯。

细菌表达的GWLuc#1和FFLuc的分配的分析

将冷冻的细菌丸粒用100μl现制的溶解混合物(1x荧光素酶细胞培养物溶解试剂(CCLR)、1.25mg ml-1溶菌酶)溶解。在室温下孵育10分钟后，将溶解产物在室温下以16,000g离心20分钟。取出上清液，向其中加入含有50mM DTT的1X NuPAGE

月桂基十二烷基硫酸酯样品缓冲液。丸粒通过加入含有50mM DTT的1X NuPAGE

月桂基十二烷基硫酸酯样品缓冲液溶解，通过使细菌溶解产物穿过30G针若干次，对染色体DNA进行剪切。上清液和丸粒样品使用Invitrogen的NuPAGE

Novex Bis-Tris凝胶系统如上所述进行分析。

用于天然GWLuc#1的细菌表达的交替诱导方式

对在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达的天然P.pyralis和A.richardsae荧光素酶的pETDuet-1构建物进行交替诱导方式。从如上所述制备的预诱导培养物中，将每个5ml的等分试样转移至50ml锥形离心管。等分试样或者不进行诱导(添水至0.4mM IPTG的相同体积)，或者通过加入IPTG至最终浓度为0.1mM、0.2mM或0.4mM进行诱导。将这些培养物在10℃或20℃、150rpm下孵育24、48小时(10℃和20℃)或120小时(仅10℃)，其间测量每个培养物的Abs600nm。从每个培养物中取出3或4个0.25-0.5ml整分试样，在室温下以10,000g离心5分钟。丸粒在-80℃下存储用于蛋白质分析。

如之前对于DH5α和BL21(DE3)大肠杆菌菌株所述，将天然P.pyralis和A.richardsae的荧光素酶的pETDuet-1构建物电穿孔到大肠杆菌的Rosetta-gami^TM B(DE3)(Novagen)菌株中。如上文对于BL21(DE3)中的pETDuet-1：GWLuc#1所述，将培养物预诱导。达到0.6-1.0的Abs600nm时，将5ml的各等分试样转移至50ml的锥形离心管。等分试样或者不进行诱导(添水至0.4mM IPTG的相同体积)，或者通过加入IPTG至最终浓度为0.2mM或0.4mM进行诱导。将这些培养物在10℃或20℃、150rpm下孵育4小时(仅20℃)、24、48小时(10℃和20℃)或120小时(仅10℃)，其间测量每个培养物的Abs600nm。从每个培养物中取出3或4个0.25-0.5ml整分试样，在室温下以10,000g离心5分钟。丸粒在80℃下存储用于蛋白质分析。

pETDuet-1中N-端6His GWLuc#1融合蛋白的构建

使用Plainum Pfx DNA聚合酶，遵照制造商的推荐使用2ng模板和10pmol的引物NHis-GWLuc#1(5′-GAgaattcGATTGAGGGACGCATGGCTTGTACTTCAGT-3′；SEQ ID NO：42)和pETGWLucR(5′-GACGACcctaggTTACAATGTTCCTCTTAAA-3′；SEQ ID NO：16)，对GWLuc#1的全长cDNA扩增20个周期。这些引物在全长A.richardsae荧光素酶cDNA的5′和3′引入EcoRI和AvrII限制性内切位点(小写字母)。提纯的产物如上所述是A尾的，连接到pGEM T-easy中。将构建物电穿孔到大肠杆菌DH5α菌株中，并使用CEQ 2000 Dye TerminatorCycle Sequencing用Quick Start试剂盒和50fmol质粒DNA进行测序。将全长无错构建物用EcoRI(Fermentas)和AvrII切除，并插入到EcoRI/AvrII线性化的pETDuet-1中，产生的质粒称为pETDuet：NHis-GWLuc#1。将这些质粒如上所述电穿孔到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中并进行测序。

构建pET-48b(+)AmpR：GWLuc#1和pET-50b(+)AmpR：GWLuc#1.

通过将来自pTAL-Luc的氨苄青霉素抗性基因插入到每个载体中存在的SphI限制性内切酶位点，使表达载体pET-48b(+)(Trx N-端标记)和pET-50b(+)(NusA N-端标记)(Novagen，EMD Bioscience)具有氨苄青霉素抗性。使用Platinum Pfx DNA聚合酶遵照制造商的推荐，使用2ng模版和10pmol引物AmpRCasSphIF(5′-TAGCGAAgcatgcGGTCTGACAGTTACCAA-3′；SEQ ID NO：43)和AmpRCasSphIR(5′-CGTAAGCgcatgcTCTAAATACATTCAAATATG-3′；SEQ ID NO：44)，将来自pTAL-Luc的氨苄青霉素抗性基因(负链上bp4148-3218+紧随基因5′和3′的10bp)扩增20个周期。各个引物在氨苄青霉素抗性基因的5′和3′端引入SphI限制性内切酶位点(小写字母)。PCR产物使用microCLEAN提纯，用SphI(New England Biolabs)消化，并再次使用microCLEAN提纯。将SphI消化的氨苄青霉素抗性基因PCR产物连接到去磷酸化、SphI线性化的pET-48b(+)或pET-50b(+)中，电穿孔到大肠杆菌DH5α菌株中，并使用CEQ 2000 Dye Terminator CycleSequencing用Quick Start试剂盒和25fmol质粒DNA进行测序。产生的质粒分别称为ρET-48b(+)AmpR和pET-50b(+)AmpR。

使用Platinum Pfx DNA聚合酶遵照制造商的推荐，使用2ng模版和10pmol引物GWLuc1FHRV3C(5′-gggacccATGGCTTGTACTTCAG-3′；SEQ ID NO：45)和pETGWLucR(5′-GACGACcctaggTTACAATGTTCCTCTTAAA-3′；SEQ ID NO：16)，将GWLuc#1的全长cDNA扩增20个周期。这些引物在全长A.richardsae荧光素酶cDNA的5′和3′引入SanDI和AvrII限制性内切位点(小写字母)。提纯的产物如上所述是A尾的，连接到pGEM T-easy中。将构建物电穿孔到大肠杆菌DH5α菌株中，并使用CEQ 2000 Dye Terminator Cycle Sequencing用QuickStart试剂盒和50fmol质粒DNA进行测序。将全长无错构建物用SanDI(Stratagene，La Jolla CA)和AvrII切除，并插入到SanDI/AvrII线性化的pET-48b(+)AmpR或pET-50b(+)AmpR中，产生的质粒分别称为pET-48b(+)AmpR：GWLuc#1和pET-50b(+)AmpR：GWLuc#1。将这些质粒如上所述电穿孔到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中并进行测序。将每个表达载体的无错构建物pET-48b(+)AmpR、pET 48b(+)AmpR：GWLuc#1、pET-50b(+)AmpR和pET-50b(+)AmpR：GWLuc#1电穿孔到大肠杆菌Rosetta-gami^TM B(DE3)菌株中。

pETDuet：NHis-GWLuc#1、pET-48b(+)AmpR：GWLuc#1和pET-50b(+)AmpR：GWLuc#1的诱导方式

BL21(DE3)中的pETDuet-1：NHis-GWLuc#1的预诱导培养物如上文对于BL21(DE3)中的pETDuet-1：GWLuc#1所述。等分试样(10ml)或者不进行诱导(添水至0.4mM IPTG的相同体积)，或者通过加入IPTG至最终浓度为0.4mM进行诱导。将这些培养物在20℃或37℃、150rpm下孵育，在37℃下孵育1、2、3、5和24小时，或者在20℃下孵育2、5、24、30和48小时，其间测量每个培养物的Abs600nm。从每个培养物中取出5个0.5ml和3个1.5ml的整分试样，在室温下以10,000g离心5分钟。丸粒在80℃下存储用于蛋白质分析。

Rosetta-gami^TM B(DE3)中的pET-48b(+)AmpR、pET-48b(+)AmpR：GWLuc#1、pET-50b(+)AmpR和pET-50b(+)AmpR：GWLuc#1的预诱导培养物如上文对于BL21(DE3)中的pETDuet-1：GWLuc#1所述。达到0.6-1.0的Abs600nm时，将来自每个预诱导培养物的5ml等分试样转移至50ml的锥形离心管中。等分试样或者不进行诱导(添水至0.4mM IPTG的相同体积)，或者通过加入IPTG至最终浓度为0.1mM、0.2mM或0.4mM进行诱导。将这些培养物在10℃或20℃、150rpm下孵育24或48小时，其间测量每个培养物的Abs600nm。从每个培养物中取出4或5个0.20-1.0ml的整分试样，在室温下以10,000g离心5分钟。丸粒在80℃下存储用于蛋白质分析。

以交替诱导方式和表达构建物细菌表达的GWLuc#1的生物发光检验

通过向20μL细胞溶解产物中加入100μL Promega试剂缓冲液或者向细胞溶解产物样品中加入自制的缓冲液，如上所述进行生物发光检验。生物发光用使用快速动力学模式(积分时间＝0.5秒，重复次数＝100)的Wallacl420 Victor 2光度计(Perkin-Elmer)记录，或者用以生物发光模式(间隔时间＝0.2秒，PMT增益＝4095，间隔次数＝200，归一化时间＝0.5秒)工作的POLARstar OPTIMA(BMG)记录。

结果

两种天然荧光素酶在一系列诱导方式下进行细菌表达。早在37℃下的1小时和20℃下的2小时，Trx和NusA N-端GWLuc#1融合构建物在Rosetta-gami^TM B(DE3)大肠杆菌菌株中成功表达，6His N-端GWLuc#1融合构建物在BL21(DE3)中成功表达。

Rosetta-gami^TM B(DE3)大肠杆菌菌株中的表达的A.richardsae荧光素酶与在交替方式下诱导的pETDuet-1构建物进行检验，以测定加入自制缓冲液时的生物发光活性。当与从在10℃或20℃下孵育24小时的培养物制备的样品比较时，通过将培养物在20℃下孵育48小时产生活性最高的细胞溶解产物。如果将在Rosetta-gami^TM B(DE3)大肠杆菌菌株中表达的A.richardsae荧光素酶的生物发光活性与在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中表达的相比，存在大约2个因子的增强。必须注意的是，A.richardsae荧光素酶在大肠杆菌BL21(DE3)中以比在Rosetta-gami^TM B中高得多的水平表达，这说明表达的荧光素酶蛋白的特异活性比在Rosetta-gami^TM B系统中高得多。与在本文所述的任何诱导方式下的对照载体样品相比较，Rosetta-gami^TM B(DE3)大肠杆菌菌株中表达的硫氧还原蛋白和NusA.标记的A.richardsae荧光素酶没有产生任何明显的生物发光活性(P＝0.05)。

对细菌表达的天然P.pyralis(FFLuc)和A.richardsae(GWLuc#1)荧光素酶的亚细胞分配进行测定。基于凝胶的蛋白质染色，FFLuc主要分配在上清液中，仅有少量保持在粒状沉淀部分。GWLuc#1的分配大为不同，主要部分分配至粒状沉淀。基于凝胶的蛋白质染色，没有在上清液中观察到其存在。在无诱导的方式下，基于蛋白质染色，观察到天然A.richardsae荧光素酶的分配从粒状沉淀迁移至上清液部分。这一观察结果将会解释为何在加入D-荧光素时FFLuc(‘萤火虫荧光素酶’)的生物发光测量灵敏度要远大于GWLuc#1。

实施例11：A.richardsae荧光素酶在真核酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中的表达

构建用于酿酒酵母中诱导型表达的pYES2：GWLuc#1

将来自“pET-48b(+)AmpR：GWLuc#1和pET-50b(+)AmpR：GWLuc#1的构建”小节中使用并描述的含有全长、无错GWLuc#1的cDNA构建物的pGEM T-easy克隆的EcoRI片段切除，并插入到去磷酸化、EcoRI线性化的pYES2(Invitrogen)中。该质粒称为pYES2：GWLuc#1，将其电穿孔到大肠杆菌DH5α菌株中。使用引物T7(5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′)和pETGWLucR进行标准PCR筛选，从而鉴别出方向正确的含有GWLuc#1的转化体。使用QIAprep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)从pYES2和pYES2：GWLuc#1分离质粒DNA，使用1μg质粒使用酵母转化试剂盒(Sigma)来转化酿酒酵母菌株S288C(Invitrogen)。通过在30℃下在补充有2％(w/v)葡萄糖(Sigma)的无尿嘧啶的酵母合成漏失(Drop-Out)培养基补充物(SCCM-U)(Sigma)上选择48小时，选择用于尿嘧啶原养(prototrophy)的酵母转化体。通过使用Y-DER^TM提取试剂盒(Pierce，Rockford IL)提取质粒DNA并使用T7和pETGWLucR重复上述PCR筛选，再次证实pYES2：GWLuc#1的存在。

pYES2：GWLuc#1的诱导

将15ml S288C中的pYES2和S288C中的pYES2：GWLuc#1的培养物在含有2％(w/v)葡萄糖的SCCM-U中在28℃下以恒定搅动生长过夜。测定每个过夜培养物的Abs600nm，以计算得到5ml中0.5的Abs₆₀₀nm所需的培养物体积。取出所需体积的每种培养物，在1500g下离心5分钟，以使细胞成粒。将成粒的酵母细胞再次悬浮在5ml非诱导培养基(含有2％(w/v)棉子糖(Sigma)的SCCM-U)或诱导培养基(含有2％(w/v)半乳糖(Sigma)和2％(w/v)棉子糖的SCCM-U)中。将培养物在28℃下以恒定搅动孵育24、48和72小时，孵育结束时测量每个培养物的Abs600nm。从每个培养物中取出等分试样(0.1-0.5ml)，在室温下以10,000g离心5分钟。粒状沉淀在80℃下保存用于蛋白质分析。

酿酒酵母表达的GWLuc#1的蛋白质分析如所述进行，并具有以下修改。由于酵母细胞壁的存在，将溶解的样品在100℃下加热5分钟。

制备用于荧光素酶检验的细胞溶解产物

向细胞丸粒中加入1X被动溶解缓冲液(Promega)，以产生1.446X 10⁷的酵母细胞数，计算基于Abs₆₀₀nm 1＝3X10⁷细胞/ml。在检验之前即刻加入被动溶解缓冲液，混合时间为大约15-20秒。

酿酒酵母中的A.richardsae荧光素酶的生物发光检验

加入溶解缓冲液之后，将25μL细胞溶解产物混合物与75μL自制的检验缓冲液混合，如上所述用Wallacl420 Victor 2光度计(Perkin-Elmer)监控光输出随时间的变化情况。

结果

凝胶的蛋白质染色显示载有和不载有GWLuc#1构建物的酵母菌株之间没有任何差异。但是，pYES2表达系统不同于pET-大肠杆菌表达系统，它不是过表达系统。没有进行进一步实验以鉴别A.richardsae荧光素酶蛋白质。相反，进行荧光素酶检验，以比较载有GWLuc#1的菌株和不载有的对照菌株。这是比SDS-PAGE和蛋白质染色灵敏得多得筛选活性荧光素酶的存在的方法。

生物发光似乎是短脉冲的活性，如同如果以远远过量的D-荧光素/ATP检验低浓度的任何荧光素酶预计的那样。图24显示了在开始记录后1.12秒测量的从在28℃下孵育24、48或72小时的培养物制备的GWLuc#1或对照载体的生物发光强度(CPS 0.5s)。从孵育72小时的培养物制备的细胞溶解产物达到的生物发光活性最大，并且GWLuc#1的活性显著高于对照样品(P＝0.05)。这表明GWLuc#1在酿酒酵母中成功表达，并且也显示出相当大的活性。尽管A.richardsae荧光素酶在大肠杆菌菌株BL21(DE3)或酿酒酵母中表达时生物发光强度(CPS)为类似的量级(图24)，在前者中的表达水平远高于后者，表明表达的荧光素酶的特异活性在酿酒酵母中远大于在BL21(DE3)细菌菌株中。

上述说明书中提到的所有出版物和专利均在此并入作为参考。在不偏离本发明范围和精神的情况下，本发明所述的方法和系统的各种修改和变化是本领域技术人员显而易见的。尽管本发明通过具体的优选实施方式进行说明，但应当理解到，所要求保护的本发明并不应该局限于这些具体实施方式。事实上，分子生物学或相关领域技术人员显而易见地对实施本发明的上述方式的各种修改均在所附权利要求的范围之内。

参考文献

将以下参考文献，以为本文所述内容提供示范性方法或其它细节补充的程度，具体结合到本文中作为参考。

美国专利5,484,956

美国专利5,538,879

美国专利5,576,198

美国专利5,595,896

美国专利5,629,470

美国专利5,633,155

美国专利5,656,466

美国专利5,670,356

美国专利5,670,356

美国专利5,674,731

美国专利5,689,045

美国专利5,689,049

美国专利5,739,409

美国专利5,744,320

美国专利5,744,320

美国专利5,750,870

美国专利5,767,367

美国专利5,807,522

美国专利5,837,832

美国专利6,068,979

美国专利6,143,502

美国专利6,171,809

美国专利6,270,964

美国专利6,297,018

美国专利6,342,345

美国专利6,503,723

美国专利6,586,196

美国专利6,602,657

美国专利6,602,658

美国专利6,690,461

美国专利6,927,037

美国专利申请20030166905(2003)

Adachi，J.Hasegawa，M.MOLPHY：programs for molecular phylogenetics，ver 2.3.Institute of Statistical Mathematics，Tokyo(1996).

Altschul等人J.Mol.Biol.215：403-10(1990)

Amann等人，Gene 69：301-315(1988)

Angers，S.，A.Salahpour等人Proc Natl Acad Sci U S A 97(7)：3684-9(2000).

Ausubel等人，″Current Protocols in Molecular Biology″，John Wiley &Sons，(1998).

Baker，C.(2004).Australian glow-worms(Diptera：Keroplatidae：Arachnocampa spp.)：distribution，diversity，identity and management.Ph.D.Thesis，Department of Zoology and Entomology，University ofQueensland，Brisbane：186pp.

Baldari等人，EMBO J.6：229-234(1987).

Berger，S.L.和A.R.Kimmel eds.，1987″Methods in Enzymology：Guideto Molecular Cloning Techniques″，Academic Press.

Bowie等人，Science 247：1306-1310(1990).

Branchini，B.R.，R.A.Magyar等人Biochemistry 37(44)：15311-9(1998).

Branchini，B.R.，R.A.Magyar等人Biochemistry 40(8)：2410-8(2001).

Branchini，B.R.，T.L.Southworth等人Biochemistry 42(35)：10429-36(2003).

Conti等人Acta Crystallogr D Biol Crystallogr.1996 Jul 1；52(Pt 4)：876-8.

Conti，E.，N.P.Franks等人Structure 4(3)：287-298(1996).

Creighton，T.E.，Proteins-Structure and Molecular Properties，2nd Ed.，W.

H.Freeman and Company，New York(1993).

Cunningham等人，Science 244：1081-1085(1989)

Day，J.C，L.C.Tisi等人，Luminescence 19(1)：8-20(2004).

de Vos等人Science 255：306-312(1992).

de Wet，J.R.，K.V.Wood等人Molecular and Cellular Biology 7(2)：725-37(1987).

Derewenda，Z.S.(2004)Methods 34：354-363.

Devereux，J.等人，Nucleic Acids Res.12(1)：387(1984)

Elion E.A.(2003)Unit 3.17-Constructing recombinant DNA molecules bythe polymerase chain reaction.In Ausubel F.M.，Brent R.，Kingston R.E.，

Moore D.D.，Seidman J.G.，Smith J.A.and Struhl K.(Eds)CurrentProtocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons，Inc.，USA.

Felsenstein，J.Cladistics 5：164-166，1989

Flanagan，W.M.等人(1991)J.Virology：65，769-786

Fulton，B.B.Annals of the Entomological Society of America 34：289-302(1941).

Gottesman，S.，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，

Academic Press，San Diego，Calif.(1990)119-128).

Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，Sequence Analysis Primer，M StocktonPress，New York，1991

Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，eds.，Computer Analysis of Sequence Data，Part 1，Humana Press，New Jersey，1994

M.等人.(2002)Protein Science 11：313-321.

Harlow，Antibodies，Cold Spring Harbor Press，(1989)

Harrison，R.A.Pacific Insects 8(4)：877-833(1966).

Houghten等人，Nature 354：84-86(1991)

Jain，V.K.和Magrath，I.T.，Bio Techniques：12，681-683(1992)

Kaufman等人，EMBO J.6：187-195(1987)

Keown等人(1990)，Meth.Enzymol.185：527-537.

Kozak，M.，Cell 44(2)：283-92(1986).

Kozak，M.，Nucleic Acids Res 15(20)：8125-48(1987).

Krause，M.H.和S.A.Aaronson，Methods in Enzymology，200：546-556(1991)

Kujan等人，Cell 30：933-943(1982)

Lam等人，Nature 354：82-84(1991)

Leckie，F.等人.Bio Techniques：17，52-57(1994)

Lee，J.Photochemistry and Photobiology 24：279-285(1976).

Lesk，A.M.，ed.，Computational Molecular Biology，Oxford University

Press，New York，1988

Lockhart，D.J.等人Nat.Biotech.14：1675-1680，1996.

Lucklow等人，Virology 170：31-39(1989)

Lundin，A.Methods Enzymol 305：346-70(2000).

Masuda等人，Gene 77，265-270(1989)和

Millican，D.S.和I.M.Bird，Anal Biochem 249(1)：114-7(1997).

Nakatsu，T.等人Nature 440：372-376(2006).

Needleman和Wunsch(J.MoI.Biol.48：444-453(1970)

Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402(1997)

Plant Biochemistry and Molecular Biology(eds.Lea & Leegood，JohnWiley & Sons)(1993)pp 275-295.

Promega：Instructions for use of Products E2920，E2940，and E2980，revised 1/06，Part Number TM058.and Promega pGL3 Luciferase ReporterVectors(得自Promega Corporation，Madison，Wis.)

Pugsley，C.W.，New Zealand Entomologist 7(4)：419-424(1983).

Rattan等人(Ann.N.Y Acad.Sci.663：48-62(1992)

Sakurai，Y.，R.Komatani，K.Tabata和H.Takaie On the glow-wormbreeding at Tama Zoo

Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd.ed.，Cold

Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，(1989)

Schena，M.等人(1996 Proc.Natl.Acad.Sci.93：10614-10619)

Schultz等人，Gene 54：113-123(1987)

Seed，B.Nature 329：840(1987)

Seifter等人(Meth.Enzymol.182：626-646(1990))和

Seliger，H.H.和W.D.McElroy，Arch Biochem Biophys 88：136-41(1960).

Shimomura，Johnson等人1966

Shimomura，O.，F.H.Johnson等人，Observations on the biochemistry ofluminescence in the New Zealand glowworm，Arachnocampa luminosa.Bioluminescence in Progress.F.H.Johnson和Y.Haneda.Princeton，Princeton University Press：487-494(1966).

Smith等人，Gene 67：31-40(1988)

Smith等人，L MoI.Biol.224：899-904(1992)

Smith等人，MoI.Cell Biol.3：2156-2165(1983)

Smith，D.W.，ed.，Biocomputing：Informatics and Genome Projects，Academic Press，New York，1993

Songyang等人，Cell 72：767-778(1993)

Studier等人，Gene Expression Technology：Methods in Enzymology185：60-89(1990)

Sivinski，J.M.(1998).Florida Entomologist 81(3)：282-292.

Takaie，H.(1989)Breeding and display of the glow-worms，Arachnocampaspp.Insectarium，vol.26 July：214-219

Takaie，H.(1997)Ten years of the glow-worm(Arachnocampa richardsae)rearing at Tama Zoo-Fascination of a living milky way.Insectarium，vol34 November：336-342.

Viviani，Hastings等人.Photochem Photobiol.75(1)：22-7(2002)

Viviani，V.R.，Cell.Mol.Life Sci.59：1833-1850(2002)

von Heinje，G.，Sequence Analysis in Molecular Biology，Academic Press，(1987)

Wada等人，Nucleic Acids Res.20：2111-2118(1992)

WO/1995/011995

WO/1999/066324

WO/2000/024878

WO1999/049019

Wold，F.，Posttranslational Covalent Modification of Proteins，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York 1-12(1983)

Wood，K.V.，(1998)The Chemistry of Bioluminescent Reporter Assays，Promega Notes 65，第14页.

Wood等人，Science 244，700-702(1989)

Wood，K.V.，Evolution of bioluminescence in insects.VII InternationalSymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence，Wiley，Chichester，UK(1983).

Xu，Y.，D.W.Piston等人，Proc Natl Acad Sci U S A 96(1)：151-6(1999).

Claims (20)

1.一种显示荧光素酶活性的分离的肽，其中

a.所述荧光素酶活性包括催化ATP依赖性的发光反应；和

b.所述发光反应产生最大发射强度在小于或等于530±5nm的波长处的发射光谱；和

c.所述的肽具有如下氨基酸序列，当与SEQ ID NO：4比对时，与SEQ ID NO：4的差异在于选自R218缺失、H245N、G315S、L342S和T343S的至少一处氨基酸序列变化。

2.根据权利要求1所述的分离的肽，其包括如下氨基酸序列，当与SEQ ID NO：4比对时，与SEQ ID NO：4的进一步差异在于选自A22Y、Y53A、L63T、E83D、F88Y、F89Y、P91I、A103C、Y109W、E113D、V139I、G160P、S198T、H212Q，R218缺失、D224S、P225缺失、G228D、P233K、P242Q、F243Y、H245N、L253M、Y255R、F273Y、Y280F、S298K、L300E、E311R、G315S、P318T、L319V、G339F、L342S、T343S、D375H、K380A、E389F、T408S、W417Y、L418V、D427N、L441I、I442V、K443M、Y444V、K445D、Q448A、A452T、L458I、V485L、V486T、G490R、V506L、R513K、V516C、T527A、和从K549开始并包括其至羧端的所有残基缺失的至少一处另外的氨基酸序列变化。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的肽，其包括选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的至少10个连续氨基酸的氨基酸序列的片段。

4.根据权利要求1或权利要求2所述的分离的肽，其包括选自SEQID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列的变体的氨基酸序列，其中所述变体由以下核酸分子编码，所述核酸分子在严格条件下与序列选自SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：5、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：9的核酸分子或其互补体杂交。

5.根据权利要求1所述的分离的肽，其包括选自SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：10的氨基酸序列。

6.一种分离的肽，其具有的氨基酸序列与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列共享至少70％的同一性。

7.一种抗体，其选择性地结合根据权利要求1-6中任意一项所述的肽。

8.一种分离的核酸分子，其包括编码根据权利要求1-6中任意一项所述的肽的核苷酸序列。

9.一种基因芯片，其包括根据权利要求8所述的核酸分子。

10.一种转基因细胞，其包括根据权利要求8所述的核酸分子。

11.一种核酸载体，其包括根据权利要求8所述的核酸分子。

12.一种宿主细胞，其含有根据权利要求11所述的载体。

13.一种监控目的基因或其部分在宿主细胞中的表达的方法，所述方法包括：(a)向宿主细胞内引入载体构建物，所述载体构建物包括根据权利要求8所述的核酸分子，并进一步包括编码目的核苷酸序列或产物的核酸分子；其中根据权利要求8所述的核酸分子和目的序列或产物共表达；和(b)检测根据权利要求8所述的核酸分子的表达的存在，从而监控目的序列或产物的表达。

14.一种在样品的等分试样中测量至少两种报道酶的活性的方法，所述方法包括通过测量发光反应被第一报道酶催化产生的光信号来测定第一报道酶的活性，以及通过测量发光反应被至少第二报道酶催化产生的光信号来测定至少第二报道酶的活性，其中所述第一或第二报道酶的至少一种表现出荧光素酶活性，所述荧光素酶活性包括催化依赖ATP的发光反应，所述发光反应产生最大发射强度在小于或等于530±5nm的波长处的发射光谱。

15.根据权利要求14所述的方法，其中至少两种报道酶的两种都是ATP依赖性的荧光素酶。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一报道酶包括根据权利要求1所述的肽。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述第一报道酶包括根据权利要求5所述的肽。

18.根据权利要求14所述的方法，其中所述第二报道酶催化发光反应，所述发光反应产生最大发射强度在大于530nm的波长处的发射光谱。

19.根据权利要求14所述的方法，其中所述测定在同一样品等分试样上进行。

20.根据权利要求14所述的方法，其中多项测定同时进行。

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