KR20010073152A

KR20010073152A - 형질전환된 미세조류를 이용한 외래 단백질의 생합성

Info

Publication number: KR20010073152A
Application number: KR1020017003167A
Authority: KR
Inventors: 최태진; 김영태; 김대현
Original assignee: 곽병선; 주식회사 알진텍
Priority date: 1999-05-28
Filing date: 2000-03-17
Publication date: 2001-07-31
Also published as: AU3333900A; JP2003501031A; CN1354792A; CA2374402A1; WO2000073455A1; KR20000075076A; EP1180145A1; KR100443843B1

Abstract

본 발명은 형질전환된 미세조류를 이용하여 목적하는 외래 단백질을 경제적으로 생합성하기 위한 방법, 즉 목적하는 외래 단백질 유전자를 포함하는 DNA 벡터를클로렐라 엘립소이데아등의 원형질체에 형질전환시키고, 이를 대량 배양함으로써 외래 단백질을 경제적으로 생합성하기 위한 생물반응기로써 형질전환된 미세조류를 이용하는 방법에 관한 것이다. 더욱 자세하게는 본 발명은 플레오마이신(phleomycin)에 저항성을 부여하는Sh ble유전자를 선별표지(selection marker)로서 이용한다.

Description

형질전환된 미세조류를 이용한 외래 단백질의 생합성{Biosynthesis of foreign proteins using transformed microalgae}

대장균(Escherichia Coli)은 폭넓게 사용되는 이종 발현 시스템(heterogous expression system)이지만, i) 일정 단백질의 발현이 적거나 안되는 점; ii) 일부 재조합 단백질의 생물학적 활성이 낮아지는 점; iii) 일부 재조합 단백질은 대장균에 독성을 지닌 점; 및 iv) 일부 재조합 단백질은 비수용성 봉입체(inclusion body)를 형성하는 점 등의 문제점으로 인하여 그 사용이 제한되었다. 효모 발현시스템에서도 유사한 문제점이 나타날 수 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해서, 배양된 포유류 또는 곤충 세포들을 이용하기도 하지만, 이들 시스템들은 배양배지 및 많은 정제과정에 요구되는 장비들의 가격이 매우 비싼 문제점이 있다.

따라서, 상기한 문제점들을 해결하기 위해서, 본 발명자들은 대장균을 대체할 수 있는 새로운 이종 과발현 시스템(heterogous overexpression system)으로써클로렐라형질전환에 대해 연구하게 되었다.

그 결과로, 본 발명자들은, 미세조류가 동,식물에 비해 매우 단순한 물질대사경로(metabolic pathway)를 갖고 있고, 빛과 이산화탄소만이 존재하는 수조(aquarium)만으로도 대량 배양하는 것이 가능하기 때문에, 미세조류 발현시스템은 세포배양 또는 동,식물 발현시시템에 비해 매우 경제적일 수 있음을 발견하였다. 또한, 미세조류는 대중균과는 달리 번역후 변형과정(post-translation modification process)을 수행할 수 있기 때문에, 미세조류에서 발현된 외래 단백질의 생물학적 활성은 본래 단백질의 활성에까지 가까워질 수 있다. 이러한 발견으로, 본 발명자들은 외래 단백질을 생산하기 위한 미세조류 과발현 시스템을 발전시키고자 하였다.

종래에도 미세조류 중 하나인클로렐라종의 형질 전환에 대한 시도가 있었다. 즉, 자비스와 브라운은클로렐라 엘립소이데아(Chlorella ellipsoidea)의 원형질체에서 루시퍼라제(luciferase)의 일시적인 발현을 확인한 바 있고(Jarvis, E. E., and Brown, L. M. (1991). Transient expression of firefly luciferase in protoplasts of the green algaChlorella ellipsoidea. Current Genetics 19, 317-321), 도손 등은 질산염 환원효소(nitrate reductase)가 결핍된클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana)의 돌연변이체에,클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)로부터 분리된 질산염 환원효소 유전자를 형질전환시켰을 때, 돌연변이가 복구되는 것을 확인한 바 있다(Dawson, H. N., Burlingame, R., and Cannons, A. C. (1997). Stable transformation ofChlorella: Rescue of nitrate reductase-deficient mutants with the nitrate reductase gene. Current Microbiology 35, 356-362). 그러나, 상기한 발현들은 매우 일시적이거나, 동일 속인클로렐라로부터 유래한 단백질 유전자만이 발현되는 문제점이 있었다.

따라서, 본 발명자들은 미세조류와는 다른 생물체로부터 유래한 유전자를 포함하는 벡터 DNA를 미세조류의 원형질체에 형질전환시키고, 이를 대량 배양함으로써, 목적하는 외래단백질을 생합성하는 방법에 대해 연구하였다. 그 결과로, 본 발명자들은 상기한 방법에 의해 본 발명의 목적을 달성할 수 있음을 발견하였다.

본 발명은 형질전환된 미세조류를 이용하여 외래 단백질을 생합성하기 위한 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 목적하는 외래 단백질 유전자를 포함하는 벡터 DNA를 미세조류의 원형질체에 형질전환시킨 후, 이를 대량 배양함으로써 외래 단백질을 생합성하기 위한 방법에 관한 것이다.

도 1은 세포벽 분해 효소의 처리전(a) 및 처리후(b)의클로렐라 엘립소이데아를 칼코플루오르 화이트(calcofluor white)로 염색한 후, 현광현미경으로 관찰한 도면이다.

도 2는 형질전환된클로렐라 엘립소이데아에서 GFP 발현을 현광현미경으로 관찰한 도면이다.

도 3은 재조합벡터 pCTV의 모식도이다.

도 4는 플레오마이신(phleomycin)이 첨가되거나, 또는 첨가되지 않은 배지에서 배양된, 형질전환된클로렐라 엘립소데아및 형질전환되지 않은클로렐라 엘립소데아의 성장을 나타낸 도면이다.

도 5는 형질전환된클로렐라 엘립소이데아의 게놈 DNA에 삽입된 넙치 성장 호르몬 유전자(flounder growth hormone; 이하, 'fGH'라 함) 및 Sh ble 유전자의 PCR 증폭 및 서던 블럿 분석 결과를 나타내는 도면이다.

(도 5에서, A는 fGH 유전자에 대한 PCR 증폭 및 서던 블럿 분석 결과를,

B는 Sh ble 유전자에 대한 PCR 증폭 및 서던 블럿 분석 결과를 나타낸다.

상기 결과에서, Lane 1은 분자량 크기 마커를,

Lane 2는 형질전환된클로렐라 엘립소이데아를,

Lane 3는 형질전환되지 않은클로렐라 엘립소이데아를,

Lane 4는 각각 pBluescript SK+ 벡터로부터 절단된 fGH and Sh ble 유전자 단편을 나타낸다.)

도 6은 형질전환된클로렐라 엘립소이데아에서 발현된 fGH의 웨스턴 블럿 분석결과를 나타내는 도면이다.

(도 6에서, Lane 1은 분자량 크기 마커를,

Lane 2는 항체 생산을 위해 사용된 글루타치온-S-트랜스퍼라제(이하, 'GST-'라함)-fGH 융합 단백질을,

Lane 3: 형질전환되지 않은클로렐라 엘립소이데아에서 분리된 총 단백질을,

Lane 4: 형질전환된클로렐라 엘립소이데아에서 분리된 총 단백질을 나타낸다.)

도 7은 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아에서 fGH의 발현량을 검사하기 위한 웨스턴 블랏 분석결과를 나타낸 도면이다.

(도 7에서, lane M은 분자량 크기 마커를,

lane 1 & 2는 GST-fGH 융합단백질 10㎍을,

lane 3 & 4는 형질전환된클로렐라 엘립소이데아10㎖로부터 분리된 fGH를,

lane 5 & 6은 GST 단백질 10㎍을 나타낸다.)

도 8은 fGH로 형질전환시킨클로렐라 엘립소이데아를브라치오누스 플리카틸리스(Brachionus plicatilis) 및아르테미아 나우필러스(Artemia naupilus)를 동물 플라크톤에게 섭취시키고, 이들에서 축적된 fGH를 검사하기 위한 웨스턴 블랏분석 결과이다.

(도 8에서, lane 1∼4은브라치오누스 플리카틸리스에게 형질전환된클로렐라 엘리소이데아를 섭취시킨 후, 30, 60, 90 및 120분이 되었을 때를,

lane 6∼8은아르테미아 나우필러스에게 형질전환된클로렐라 엘리소이데아를 섭취시킨 후, 30, 60 및 90이 되었을 때를 나타낸다.)

도 9는 fGH를 형질전환시킨클로렐라 엘립소이데아에 의한 넙치의 성장촉진을 나타낸 도면이다.

(도 9에서, 흰 막대기는 형질전환된클로렐라 엘립소이데아에 의한 넙치의 성장촉진을,

검은 막대기는 형질전환시키지 않은클로렐라 엘립소이데아에 의한 넙치의 성장촉진을 나타내고,

수직경계선은 표준편차를 나타내고, 짧은 것은 유의적인 차이가 있음을 나타낸다.(p<0.05))

도 10은 fGH를 형질전환시킨클로렐라 엘립소이데아를 1시간 동안브라치오누스 플리카틸리스및아르테미아 나우필러스에게 먹이고, 이들 동물 플랑크톤을 30일동안 먹인 넙치의 성장촉진을 보여주는 도면이다.

발명의 요약

본 발명의 목적은 미세조류 과발현 시스템에서 외래 유전자를 안정적으로 발현시킬 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명의 방법은 (i) 미세조류의 원형질체를 얻는 단계; (ii) 목적하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제작하는 단계(여기에서, 상기 유전자는 미세조류와는 다른 생물체로부터 유래한 것임); (iii) 상기 원형질체에 상기 벡터를 도입하여 형질전환된 원형질체를 얻는 단계; 및 (iv) 목적하는 단백질을 생산하기 위해서, 상기 형질전환된 미세조류를 배양하는 단계를 포함함을 특징으로 한다.

또한, 본 발명의 방법은 단계 (iii) 및 단계 (iv) 사이에 항생제로 형질전환된 세포들을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 외의 다른 목적, 특징 및 적용들은 다음의 상세한 설명에 의해서 당업자에게 자명하게 인식될 것이다.

발명의 상세한 설명

명세서 및 청구범위에서, 용어 '외래 단백질'은 숙주인 미세조류의 숙주세포와는 다른 생물체로부터 유래한 임의 단백질을 의미하고, 본래의 생물학적 활성이 유지된다면, 그의 활성단편, 변이체 및 유사체도 포함된다. 용어 '외래 유전자'는 그 유래와는 무관하게(천연의 것 또는 합성된 것), 상기에서 정의한 외래 단백질을 코딩하는 핵산서열을 의미하고, DNA, RNA 또는 cDNA, 또는 코딩된 외래 단백질의 생물학적 활성이 유지되는 한도에서, 염기의 결실, 치환 또는 삽입에 의한 변이체도 포함된다.

클로렐라 엘립소이데아는 진핵생물의 특성을 갖고, 대량배양시 비용이 적게들기 때문에, 복합단백질의 생산을 위한 생물체로서 적당하다. 본 발명자들은클로렐라 엘립소이데아에서 외래단백질인 넙치성장 호르몬(fGH)의 기능발현 및 이 형질전환된클로렐라의 섭취에 의한 어류의 성장증진에 관하여 최초로 연구하였다. 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 한 fGH 유전자 및클라미도모나스(Chlamydomonase) RBCS2 유전자 프로모터에 의해 발현이 조절되도록 한 플로오마이신 저항성Sh ble유전자를 포함하는 벡터를클로렐라의 원형질체에 형질전환시켰다. 형질전환체로부터 분리된 크로모좀(chromosome) DNA에 대해 fGH 및sh ble유전자의 PCR 증폭 및 서던 블랏 분석을 수행한 결과, 도입된 유전자들이 크로모좀 DNA에 안정적으로 통합(integration)되었음을 확인하였다. 또한, fGH 단백질이 형질전환된클로렐라에서 발현됨을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다. 연속적인 7회의 배지(플레오마이신이 없는 배지임) 교체 후에도 DNA의 도입 및 fGH의 발현이 확인되었다. 우선, 형질전환된클로렐라세포를 동물플라크톤에게 섭취시켜서 셀룰로오즈 세포벽을 제거하고, 그런 다음 플랑크톤을 넙치 치어에 섭취시켰다. 섭취 30일 후에, 이들 어류들은 대조군에 비해 전체 길이 및 너비에서 약 25%의 증가가 관찰되었다. 이러한 결과들은 적은 비용으로 가치있는 단백질들을 생산하는데 있어,클로렐라 엘립소이데아가 이용될 수 있음을 보여준다.

본 발명에서, GFP(green fluorescent protein) 유전자를 형질전환시킨클로렐라의 녹색형광 및sh ble유전자를 형질전환시킨클로렐라의 플레오마이신 저항성을 통해, 이들 유전자의 기능발현을 확인하였다. 이를 넙치 치어에 섭취시키므올써, 재조합 fGH 단백질의 생물학적 활성도 확인하였다. 또한, 본 발명은 넙치 성장호르몬 유전자를 형질전환시킨 미세조류에서, 생물학적으로 활성화된 상태의 호르몬이 발현됨을 확인하였다. 따라서, 의약 및 산업적으로 가치있는 단백질들은 형질전환된 미세조류를 이용하여 생산될 수 있다. 특히, 미세조류는 간단한 장비 및 적은 비용으로도 생산될 수 있고, 이들에서 발현된 단백질의 분리정제 방법 또한 간단하기 때문에, 단백질 생산 비용은 현저하게 줄어든다.

또한, 본 발명에서는클로렐라 엘립소이데아의 형질전환체에 대한 선별 마커로서sh ble유전자가 성공적으로 사용될 수 있음을 확인하였고, 형질전환된클로렐라 엘로소이데아에서 생물학적 활성을 갖는 외래 단백질의 안정적인통합(integration) 및 발현에 대해서도 처음으로 확인하였다. 상기 결과들을 통해, 과학적 또는 약리학적 용도의 단백질들을 생산하는데 있어,클로렐라 엘립소이데아가 이용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 사용될 수 있는 미세조류는 그 종류가 특별히 한정되는 것은 아니지만, 본 기술은클로렐라 엘립소이데아(chlorella ellipsoidea),클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana) 및클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)와 같은 해수 및 담수에 사는클로렐라,클라미도모나스(Chlamydomonas),볼복스(Volvox),케아토세로스(Cheatoceros),패오닥틸룸(Phaeodactylum),스켈렉톤네마(Skelectonema),나비쿨라(Navicula),칼로네이세(Caloneise),니츠스키아(Nitzschia),탈라시오시라(Thalassiosira),암포라(Amphora),난노클로리스(Nannochloris),난노클로롭시스(Nannochloropsis),테트라셀미스(Tetraselmis),둔나리엘라(Dunaliella),스피루리나(Spirulina),마이크로사이스티스(Microcystis),오실라토리아(Oscillatoria),트리코데스미누스(Tricodesminus),이소크리오시스(Isochryosis),파블로바(Pavlova),디노피새에(Dinophyseae) 등을 포함하는 여러 조류(algae)등에도 적용할 수 있다.

본 발명에 사용된 외래 단백질 유전자는 넙치 성장호르몬 유전자이다. 그러나, 박테리아, 균류(fungi), 바이러스, 동물, 식물 또는 어류로부터 유래한 다른 유전자들도 본 발명을 사용함으로써 과발현시킬 수 있다.

또한, 벡터제작, 클로닝, 벡터에 의한 숙수의 형질전환, 형질전환체의 선별및 배양, 및 배양 후 목적하는 단백질의 회수 방법은 당업자에게 자명하게 알려져 있다.

다음의 실시예들을 본 발명을 설명하기 위한 것이지만, 본 발명의 범위가 여기에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 클로렐라 엘립소이데아 의 배양과 원형질체 형성

부경대학교 내 한국 해양 미세조류 은행으로부터클로렐라 엘립소이데아 (Chlorella ellipsoidea;Strain No. KMCC C-20)를 분양받았다. 초기농도 1×10⁶cells/㎖이 되도록클로렐라 엘립소이데아세포들을, 클로람페니콜과 스트렙토마이신이 각각 50㎍/㎖가 함유된 신선한 f/2 배지(Guillard, R. R. L., and Ryther, J. H. (1962). Studies on marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt and Detonula confervacea (Cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 3, 229-239)에 접종한 후, 25℃, 3,000lux 형광 램프하의 18:6(명:암) 광주기로 배양하였다. 세포수가 1~2×10⁸cells/㎖이 되었을 때(대략 접종후 약 8~9일), 원형질체를 형성시키기 위하여 세포를 회수하였다. 즉, 50㎖의 배양물을 1,500×g에서 5분동안 원심분리하고, 25mM 인산염 완충액(pH 6.0)으로 1회 세척한 후, 0.6M 소르비톨, 0.6M 만니톨과 4%(w/v) 셀룰라아제(Calbiochem, USA), 2%(w/v) 마세라아제(macerase; Calbiochem) 및 50 유닛(unit)의 펙티나아제(pectinase; Sigma)를 함유하는 인산염 완충액(pH 6.0) 5㎖로 현탁하였다. 세포 현탁액을 온화하게 교반하면서, 25℃, 암 조건에서 16시간동안 배양하였다.

클로렐라 엘립소이데아의 원형질체 형성은 두 가지 방법으로 확인하였다. 하나는 삼투-안정성 검사(Osmo-stability test)로, 세포벽 분해 효소로 처리한 세포들을 증류수에 부가한 후, 8시간이 지났을 때의 세포수 감소를 통해 확인하였다(현탁액을 처리한 경우 세포수는 1.7×10⁶에서 1.0×10⁵으로 감소, 반면 현탁액을 처리하지 않은 세포의 수는 변화하지 않음). 또 다른 방법은, 칼코플루오르 화이트 염색법(calcofluor white staining; Maeda, H., and Ishida, N. (1967). Specificity of binding of hexapyranosyl polysaccharides with fluorescent brightner. J. Biochem. 62, 276-278)으로 확인하였다. 현광현미경으로 관찰하였을 때, 세포벽 분해 효소로 처리한 세포들은 약 80%가 적색을 나타낸 반면, 처리되지 않은 세포들은 청색을 나타내었다(도 1 참조). 이러한 결과는 세포벽의 셀룰로오즈 성분이 완전히 분해되었기 때문에, 칼코플루오르가 결합되었음을 나타낸다.

[실시예 2] pMinGFP의 제작 및 GFP의 발현

클로렐라형질전환 시스템을 개발하기 위한 첫 단계로서, 식물 형질전환 벡터인 Bin19(Bevan, M. (1984). Binary Agrobacterium vectors for plant transformation. Nucleic Acids Res. 12, 8711-8721)로부터 약 5kb의 작은 바이너리 벡터(binary vector)를 제작하였다. 상기 제작된 새로운 벡터를 pMIN으로 명명하였다. 상기 pMIN벡터는E.Coli와아그로박테리움에서의 복제를 위한oriV오리진(replication origin), 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자인nptII, DNA 복제를 위한trfA및 DNA 통합(integration)을 위한 T-DNA의 왼쪽 및 오른쪽 부위(border)를 포함한다. 그런 다음, 직접적으로 녹색형광 단백질(GFP)를 발현시키기 위해, 콜리플라워 모자이크 바이러스 35S 프로모터를 포함한 DNA 단편들을 서브클로닝하여, 고등식물 및 조류의 형질전환용 pMinGFP 벡터를 제작하였다. 폴리에틸렌을 처리하여 pMinGFP 벡터를클로렐라원형질체에 형질전환시킨 후, GFP 발현을 측정하였다. 형질전환체 선별능력이 없는 f/2 배지로 7일동안 배양한 후, 형질전환된클로렐라의 일부 세포들에서는 GFP 형광을 나타냈지만, 형질전환되지 않은클로렐라세포들은 형광을 나타내지 않았다(도 2 참조).

[실시예 3] 넙치 성장 호르몬 유전자의 클로닝

일본 넙치 뇌하수체로부터 분리된 전체 mRNA(total mRNA)를 이용하여, Lambda ZAP-II cDNA synthesis kit(Stratagene, USA)로 넙치 cDNA 라이브러리를 제작하였다. 증폭된 라이브러리의 최종 역가는 3×10⁹pfu/㎖이고, 1㎕의 분액(aliquot)을 PCR 증폭에 사용하였다. 프라이머 fGH-AN (5'-CGG GAT CCC AGC CAA TCA CAG A-3')과 프라이머 fGH-AC (5'-CGG GCT ACA GAA TTC-3')를 이용하여 증폭된 DNA 단편을 pGEM-T 벡터(Promega, USA)에 삽입한 후 클로닝하여 서열을 확인하였다.BamHI/NdeI 단편을 pGEX-3X 벡터(Amersham Pharmacia Biotech, USA)에 삽입하여 서브클로닝한 후, 글루타치온-S-트랜스퍼라제-fGH 융합 단백질을 발현시키고, 생산된 융합 단백질은 폴리클로날 항체를 생산에 이용하였다.

[실시예 4] pMinfGH의 제작

성장 호르몬 유전자는 몇몇 어종에서 클로닝되었었고, 이들 유전자가 도입에 의한 성장 증진 효과가 트랜스지닉 어류(transgenic fish)에서 관찰되었다. 한국에서 주요 수중양식어류인 일본 넙치(학명:paralichthys olivaceus)로부터 분리한 성장 호르몬 유전자(fGH)를클로렐라의 형질전환에 사용하였다. 상기 fGH 유전자가 프라이머 fGH-N 5'-CGG GAT CCG GTC AGT CCC TTA TGC AGC CAA TCA CA-3'과 프라이머 fGH-C 5'-AAA AGC TCG AGC TCT TGG CGG AG-3'를 이용하여 PCR 증폭함으로써 넙치 뇌하수체 cDNA 라이브러리로부터 클로닝되었다(Watahiki, M., Yamamoto, M.,Yamakawa, M., Tanaka, M. & Nakashima, K. 1989. Cinserved and uniques amino acid residues in the domains of the growth hormone: flounder growth hormone deduced from the cDNA sequence has the minimal size in the growth hormone prolactin gene family. J. Biol. Chem. 264, 312∼316). pMinGFP 벡터에서 GFP 유전자를 사용하는 대신에, 560bp 크기의 PCR 생성물로 대체하여 pMinfGH 벡터를 제작하였다.

[실시예 5] pCTV 벡터의 제작

본 발명자는, 항생제에 결합하여 그의 DNA 분해 활성을 억제함으로써 탈리소마이신 (tallysomycin), 블레오마이신(bleomycin), 플레오마이신(phleomycin) 및 제오마이신(zeomycin)에 대한 저항성을 부여하는 13.7kDa의 작은 단백질을 코딩하는스트렙토알로테이추스 힌두스타무스(streptoalloteichus hindustamus) 유래의Sh ble유전자를 선별표지(selection marker)로서 이용하였다. 플레오마이신에 의해서클로렐라 엘립소이데아의 성장이 억제되는지를 알아보기 위해서, 다양한 농도의 플레오마이신이 함유된 f/2 배지에서 상기 미세조류를 배양하였다. 0.1 또는 0.5㎍/㎖의 플레오마이신이 함유된 배지에서 줄어든 성장이 관찰되었고, 1㎍/㎖ 이상의 플레오마이신이 함유된 배지에서는 상기 미세조류가 전혀 성장하지 못하였다. 따라서, 플레오마이신에 대한 저항성을 부여하는Sh ble유전자는 형질전환된클로렐라를 선별하는데 적합하게 이용될 수 있다. 프라이머 ble-N(5'-AAA CTC GAG GGC GCG CCA GAA GGA GC-3')과 프라이머 ble-C(5'-AAA CTC GAG AAT TCG AGG TCG GTA CC-3')를 사용하여, 플라스미드 pSP109(Lumbreras, V., Stevens, D.R., & Purton,S. 1998. Efficient foreign gene expression in Chlamydomonase reinhardtii mediated by an endogenous intron. Plant J. 14, 441∼447)로부터Sh ble유전자의 코딩영역 및 그의 상류에 위치하는클라미도모나스 레인하드티RBCS2 프로모터(Chlamydomonas reinhardtiiRBC2 promoter) 영역을 증폭하였다. 880bp의 PCR 생성물을XhoI으로 절단하고, pMinfGH 벡터에 서브클로닝하여클로렐라형질전환 벡터 pCTV를 제작하였다(도 3 참조).

[실시예 6] pCTV 벡터에 의한 클로렐라 클립소이데아 의 형질전환

클로렐라 엘립소이데아의 원형질체(1×10⁸)를 400×g에서 5분동안 원심분리하고, 0.6M 소르비톨/만니톨이 함유된 f/2 배양액으로 침전물을 재현탁시켰다. 그런 다음, 다시 400×g에서 5분동안 원심분리하고, 0.05M CaCl₂이 함유된 0.6M 소르비톨/만니톨 용액 1㎖으로 침전물을 재현탁시켰다. 그런 다음, 1×10⁸세포수의원형질체 0.4㎖를 신선한 미세원심분리 튜브에 옮기고, 상기 튜브에 5㎍의 pCTV 벡터 과 담체로써 송아지 흉선세포 DNA(Sigma Chemicals) 25㎍을 첨가하였다. 이를 상온에서 15분 동안 배양한 후, 200㎕의 PNC[0.8M NaCl, 0.05M CaCl₂, 40% PEG 4000(Sigma)]을 첨가하고, 상온에서 30분동안 온화하게 혼합하였다. 그런 다음, 0.6M 소르비톨/만니톨, 1% 효모추출액 및 1% 글루코오즈가 함유된 f/2 배양액 0.6㎖를 첨가하고, 25℃의 암조건하에서 12시간동안 배양하여, 세포벽을 재형성시켰다. 세포들을 플레오마이신(1㎍/㎖)이 함유된 신선한 f/2 배지에 옮기고, 상기에서와 같은 조건으로 배양하였다.

5일경에 검출가능한 성장(detectable growth)이 나타났고, 15일경에 세포성장은 정지기(stationary phase)에 도달하였다. 반대로, 형질전환되지 않은 원형질체에서는 검출가능한 성장이 관찰되지 않았다(도 4 참조). 형질전환된 세포의 느린 성장은 pMinGFP에 의한 예비형질전환실험 결과(녹색형광을 나타내는 세포는 단지 2%에 불과했음)와 일치하였다. 정지기 상태의 형질전환된클로렐라세포들을 신선한 f/2 배지 또는 플레오마이신이 함유된 f/2 배지로 옮겨 배양했을 때, 두 배지의 검출가능한 성장에서는 차이가 없었다. 또한, 두 배지의 성장속도도 플레오마이신이 없는 f/2배지에서의 형질전환되지 않은클로렐라의 성장과 비슷하였다(도 4 참조). 이러한 결과들은 도입된 DNA가클로렐라의 성장에 어떠한 영향도 미치지 않고, 형질전환된 세포들의 형태학적인 변형도 일으키지 않음을 나타낸다.

[실시예 7] 도입된 DNA의 안정적인 통합(integration)

클로렐라를 발현시스템으로서 사용하기 위해서는, 도입된 DNA의 크로모좀 DNA로의 안정적인 통합이 필수적으로 필요하다. PCR 및 서던 분석들을 수행하여, 도입된 DNA가클로렐라의 크로모좀 DNA에 통합되었는지를 확인하였다.

(A) DNA 분리

배양액 3㎖ 내의 약 3×10⁸의 형질전환세포들을 원심분리하여 펠렛으로 형성하고, CTAB 완충액[250 ㎖: hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) 5g, 1M Tris (pH 8.0) 25 ㎖, NaCl 20.45g, EDTA 1.68g, β-mercaptoethanol (2%)] 500㎕으로 형성된 펠렛을 재현탁한 후, 65℃에서 1시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배양액을 동량의 페놀/클로로포름 용액으로 추출한 다음, 추출액을 3,000×g에서 5분 동안 여러번 원심분리한 후, 상등액을 수집하였다. 그런 다음, 상등액에 에탄올을 처리하여 크로모좀 DNA를 침전시키고, 침전물을 30㎕의 TE 완충액으로 재현탁하였다.

(B) PCR과 서던 블럿 분석(Southern blot analysis)

프라이머 fgh-N/fgh-C 및 ble-N/ble-C를 이용하여 분리된 크로모좀 DNA로부터 fGH 유전자와 Sh ble 유전자 각각을 증폭하였다. 크로모좀 DNA 200ng 및 각각의 프라미어 100 pmole을 50㎕의 PCR 반응액에 부가하고, 94℃에서 1분 변형, 54℃ 또는 57℃에서 30초간 fGH 및sh ble유전자 각각에 대한 어닐링(anealing), 72℃에서 1분간 중합반응의 사이클을 30번 반복한 후, 마지막으로 72℃에서 5분간 중합반응을 더 수행하였다. 서던 블랏에 사용된 프로브는 DIG-DNA labeling kit(Boehringer mannheim, Germany)를 이용하여 합성하였다.

예측된 크기의 PCR 생성물은 형질전환된클로렐라로부터 분리된 DNA에서만 생산되었다. fGH 또는sh ble유전자에 특이적인 프로브를 이용한 서던 분석에 의해, 상기 DNA 단편들이 동정되었다. 플레오마이신이 없는 배지를 7회 연속으로 교체한 후,클로렐라로부터 분리된 크로모좀 DNA에 대한 이들 두 유전자의 PCR증폭에 의해, 통합된 DNA의 안정성이 확인되었다.

[실시예 8] 형질전환된 클로렐라 엘립소이데아 에서 fGH의 발현

fGH의 발현은 상기 언급한 바와 같이 웨스턴 블랏에 의해서 수행하였다.10⁸~10⁹의 세포들을 함유하는 배양액 3㎖을 17,000×g에서 5분 동안 원심분리하여 형질전환된클로렐라 엘립소이데아를 회수하였다. 회수된 형질전환클로렐라를 액체질소로 분쇄한 후, 시료 로딩 완충액(sample loading buffer; 1mM EDTA, 250mM Tris-Cl (pH 6.8), 4% SDS, 2% β-머캅토에탄올, 0.2% 브모로페닐블루, 50% 글리세롤) 20㎕로 재현탁시키고, 10분동안 끓였다. 그런 다음, 시료를 12,000×g에서 10분 동안 원심분리하고, 그 상청액을 15% SDS-PAGE 겔에서 전기영동하여 분리하였다. 또한, 형질전환되지 않은클로렐라에서도 단백질 추출물을 제조하였다. 웨스턴 블랏 분석은 일반적인 방법에 의해서 수행하였다. SDS-PAGE를 통해 형질전환된클로렐라또는 형질전환되지 않은클로렐라로부터 단백질 추출물을 분리하고, 니트로셀룰로오스막으로 트랜스퍼(transfer)하였다. fGH에 대한 폴리클로날 항체의 최종 희석농도는 1:3,000으로 하고, 2차항체로서 알카린성 포스파타아제-컨쥬게이트 항-마우스 IgG를 사용하였다.

형질전환된클로렐라에서는 20kDa 크기의 fGH가 확인되었지만, 형질전환되지 않은 세포들에서는 확인되지 않았다(도 6 참조).

우수한 발현 시스템이 되기 위해서는, 많은 양의 외래 단백질이 생산할 수 있어야 한다. 형질전환된클로렐라에서 fGH의 발현양은, GST-fGH 융합 단백질에 대한 폴리클로날 항체, 정제된 GST, GST-fGH 융합단백질 및 형질전환된클로렐라추출물을 이용하여 엘리사(Enzyme Linked Immunosorbent Assay; ELISA) 및 웨스턴 블랏에 의해 측정되었다(도 7 참조). 1×10⁸의 정지기 세포들에서 약 400ng의 fGH가얻어졌다(1㎖ 배양액에 400㎍의 총단백질 함유). 수율은 최종 세포수가 1×10⁸㎖이라고 가정할 때, 배양된클로렐라1리터 당 400㎍의 단백질의 농도와 동등하다. 미세조류에 대한 배양액의 가격이 낮기 때문에, 이들 시스템은 진핵세포 단백질들, 특히 약제학적 가치가 있는 단백질들을 생산하는데 유용하다.

[실시예 8] 생물학적 활성 검사

클로렐라는 그의 세포벽에 셀룰로오스 함량으로 높기 때문에, 어류 및 갑각류의 유생(crustacean larvae)에 직접적으로 섭취시킬 수 없다. 따라서, 셀룰라아제를 함유한 동물플랑크톤에클로렐라를 섭취시키고, 이를 대량배양하는 것으로 이용되었다. 또한, 어류는 피노시토시스(pinocytosis)에 의해 먹이내의 단백질을 수용하고, 포유동물 및 어류의 재조합 성장 호르몬을 경구투여함으로써 어류의 성장을 증진시킬 수 있다는 것도 보고되었다.

따라서, 200리터의 해수를 채운 300리터 수조에, 4일생 넙치 유생을 1,000마리씩 그룹지었다. 윤충(rotifers;Brachionus plicatilis) 및 작은 바다새우(brine shrimp;Artemia nauplius)는 성장호르몬의 축적, 및클로렐라세포벽의 셀룰로오스의 제거에 사용되었다. 부화(hatching)한 후의 동물플랑크톤을 하루동안 굶기고, 3×10⁸/㎖의 형질전환된클로렐라또는 형질전환되지 않은클로렐라를 1시간동안 섭취시켰다. 웨스턴 블랏을 통해, 먹이섭취 후 1시간 정도까지는 동물플랑크톤 체내에 미세조류의 fGH가 축적되고; 1시간 이후에는 fGH가 분해되며; 섭취 2시간 후에는 없어진다는 것을 확인하였다(도 8 참조). 10일동안 하루에 한번씩 윤충을, 그다음 5일동안 윤충 및 작은 바다새우의 혼합물을, 그 다음 15일 동안은 작은 바다새우를 넙치유생에게 섭취시켰다. 윤충 및 작은 바다새우의 최종 세포수는 각각 10 및 5개체/㎖이었다. 형질전환된클로렐라또는 형질전환되지 않은클로렐라를 1시간 동안 섭취시킨 동물플랑크톤을 섭취시키면서 4일생 넙치 치어를 30일동안 배양하였다. 먹이섭취 10일 후에 어류 유생의 길이를 측정하고, 섭치 30일 후에 유생의 길이 및 너비를 모두 측정하였다. 1,000마리의 물고기를 포함하는 세 개의 실험수조로부터 50마리의 물고기를 임의로 선택하여 측정하였다. 도 9에서 보는 바와 같이, 10일 후에 물고기의 길이는 유의적인 차이를 나타냈으며, 30일 후에는 길이 및 너비 증가가 약 25%증가된 것이 관찰되었다(도 10 참조).

본 발명의 바람직한 실시예들은 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 발명의 기본적인 개념의 다양한 변화 및 변형은 당업자에게 자명하고, 다음의 특허청구범위에서 명시한 본 발명의 개념 및 범위내에 해당하는 것이다.

본 발명의 형질전환된 미세조류를 이용한 이종 과발현 시스템은, 목적하는 외래 단백질 유전자를 포함하는 벡터 DNA를 미세조류의 원형질체에 형질전환시키고 이를 대량 배양함으로써, 산업 및 약학적으로 가치있는 외래 단백질을 값싸게 대량으로 생산할 수 있다.

Claims

(i) 미세조류 원형질체를 얻는 단계;

(ii) 상기 미세조류와는 다른 생물체로부터 유래한, 목적하는 외래 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터를 제작하는 단계;

(iii) 상기 벡터를 상기 원형질체에 도입하여, 형질전환된 원형질체를 생산하는 단계; 및

(iv) 목적하는 단백질을 생산하기 위해서, 상기 형질전환된 미세조류를 배양하는 단계

를 포함하는 미세조류에서 목적하는 외래 단백질을 생합성하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 배양단계의 다음단계로 미세조류로부터 단백질을 회수하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (iii) 및 (iv) 사이에 항생제로 형질전환된 세포들을 선별하는 단계를 더 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 단계 (iii) 및 (iv) 사이에 형질전환된 원형질체에 세포벽을 재형성시키는 단계를 더 포함하는 방법.
제 3항에 있어서, 상기 벡터는 형질전환체를 선별하기 위한 선별 표지(selection marker)로서sh ble유전자를 포함하고, 상기 항생제는 플레오마이신(phleomycin), 탈리소마이신(tallysomycin), 블레오마이신(bleomycin) 및 제오마이신(zeomycin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 벡터는 콜리플라워 모자이크 바이러스(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터 및클라미도모나스RBCS2(ChlamydomonasRBCS2) 유전자 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터를 포함하는 방법.
제 1항에 있어서, 상기 미세조류는 해수 및 담수에 사는클로렐라,클라미도모나스(Chlamydomonas),볼복스(Volvox),케아토세로스(Cheatoceros),패오닥틸룸(Phaeodactylum),스켈렉톤네마(Skelectonema),나비쿨라(Navicula),칼로네이세(Caloneise),니츠스키아(Nitzschia),탈라시오시라(Thalassiosira),암포라(Amphora),난노클로리스(Nannochloris),난노클로롭시스(Nannochloropsis),테트라셀미스(Tetraselmis),둔나리엘라(Dunaliella),스피루리나(Spirulina),마이크로사이스티스(Microcystis),오실라토리아(Oscillatoria),트리코데스미누스(Tricodesminus),이소크리오시스(Isochryosis),파블로바(Pavlova),디노피새에(Dinophyseae) 중 하나인 방법.
제 1항에 있어서, 상기 목적하는 외래 단백질이 박테리아, 균류(fungi), 동물, 식물 또는 어류로부터 유래함을 특징으로 하는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 목적하는 외래 단백질은 넙치 성장 호르몬인 방법.
목적하는 외래 단백질을 코딩하는 유전자 및 형질전환체를 선별하기 위한 선별표지로서Sh ble유전자를 포함하는, 미세조류에서 목적하는 외래 단백질을 생합성하기 위한 재조합 DNA 벡터.
목적하는 외래 유전자 및Sh ble유전자가 미세조류의 게놈에 통합(integration)된, 목적하는 외래 단백질을 생합성하기 위한 형질전환된 미세조류.
제 11항에 있어서, 상기 미세조류가 목적하는 외래 단백질 및Sh ble유전자를 발현시킬 수 있는 형질전환된 미세조류.
제 11항 또는 제 12항의 형질전환된 미세조류에서 목적하는 외래 유전자를 발현킴시켜 생산하는 목적하는 외래 단백질.
제 11항의 미세조류 또는 제 13항의 단백질로 동물을 사육하는 방법.