CN106591186A - 一种螺旋藻原生质体的制备方法 - Google Patents

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任迪峰
马珺
韩小雨
廖梦梦
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor

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Abstract

本发明涉及一种将螺旋藻去壁获得螺旋藻原生质体的方法。取培养至对数中期OD560＝0.800‑1.000的螺旋藻培养液20ml，放入约30‑60个玻璃珠3‑10mm，在转速为100‑180rpm、温度为28℃的螺旋藻恒温光照培养箱中摇转18h，分装进入离心管，4000rpm/min、4℃离心10min，收集藻段，用15ml 1.5mol/L NaCl洗涤5min，离心，用Zarrouk液体培养基冲洗，离心，反复3‑4遍。加入酶溶液，在黑暗条件下进行酶解，酶解温度为28℃，时间为1h。酶解结束后，离心收集沉淀，即获得螺旋藻原生质体。得到的螺旋藻原生质体达25％‑50％。本发明提供一种高得率、操作方法简单，用时较短的制备螺旋藻FACHB904原生质体的方法。

Description

一种螺旋藻原生质体的制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备螺旋藻原生质体的方法，属于生物技术领域。
背景技术
螺旋藻(Spirulina platensis)属蓝藻类，螺旋藻又名蓝藻，呈墨绿色，现代营养学家称之为“人类营养的微型宝库”，螺旋藻含有多种营养成分，具有极大营养及医疗保健功能，被世界粮农组织(FAO)誉为21世纪人类最理想的食品。螺旋藻中蛋白质质量分数高达55％-70％，富含多达18种氨基酸，具有提高机体免疫力、抑制癌细胞等作用，而且易被人体所吸收。
近些年螺旋藻的开发引起了广大科研工作者的注意，螺旋藻含有大量的蛋白质，但是现阶段国内外研究螺旋藻方向的多为啤酒、饮料、酱油、酸奶、果冻、巧克力、面条等食品。天然螺旋藻蛋白和花生蛋白、大豆蛋白功能性质有很大差距，这限制了螺旋藻在食品中的应用。
在过去的30年中，原生质体已被广泛用于植物生理学、植物细胞生物学、植物组织和细胞培养的许多研究领域。因此，制备高质量且具有再生能力的螺旋藻原生质体，对开展螺旋藻的分子遗传学和育种研究都是至关重要的。
1892年，Klercker用机械方法从藻类中首次得到原生质体。1952年，Chnyen的一个用果胶酶分离获得高等植物的单细胞。1957年，Eddy和Wiliamson利用蜗牛的汁液得到了酵母菌的原生质体。1960年，Cocking首次用纤维素酶从番茄幼苗根尖中分离出原生质体。同时，开创了酶法大规模分离原生质体的新时代。1982年，Robinson首先提出了酶解制备钝顶螺旋藻原生质体的方法。1994年，P.Sethe等以甘露醇为渗透稳定剂溶菌酶酶解获得了原生质体。1996年，彭国宏等首先采用机械法研磨破碎藻丝体。秦松等用超声波处理钝顶螺旋藻制得原生质体并再生成功。2000年，郭厚良等将钝顶螺旋藻经多步处理后得到了大量密集的原生质体。分离原生质体所用的酶，常有纤维素酶、果胶酶、半纤维素酶、几丁质酶、蛋白酶。此外，还必须在酶液中加入稳压剂，常用的稳压剂有甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖。酶液中加入Ca2+、Mg2+、K+等离子对原生质膜有稳定作用，加入葡萄糖硫酸钾则可以保护细胞内核酸不受破坏，增强细胞分裂能力。
上述方法，或是未报道得率，或是操作方法较为繁琐，延时较长。总之，国内外在钝顶螺旋藻原生质体的制备虽然做了一些工作，但到目前为止，尚不能可靠地制备出质量高且得率高的螺旋藻原生质体。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种高得率、操作方法简单，用时较短的制备螺旋藻FACHB904原生质体的方法。
为实现上述目的，本发明由以下步骤组成：
(1)选取培养至对数中期OD560＝0.800-1.000的螺旋藻培养液，每20ml放入约30-60个玻璃珠3-10mm，在转速为100-180rpm/min、温度为28℃的螺旋藻恒温光照培养箱中摇转18h，得到一定长度的藻段。
(2)离心收集藻段，用1.5mol/L NaCl洗涤5min(去除角质鞘)，离心后用Zarrouk液体培养基反复冲洗3-4遍。
(3)向步骤2中获得的螺旋藻段中加入酶溶液，在黑暗条件下进行酶解，酶解温度为28℃，时间为1h。所述的酶溶液含有0.5％溶菌酶，1％牛血清白蛋白，1％Hepes。
(4)酶解结束后，用自制过滤器过滤，离心收集沉淀，即获得螺旋藻原生质体。螺旋藻原生质体的得率为25％-50％。
进一步地，所述的酶解液按照如下步骤配置而成：将溶菌酶，牛血清白蛋白、Hepes加入到Zarrouk培养基中溶解混匀，并过0.22μm滤膜过滤除菌。
进一步地，在酶解过程中，以60rpm/min的转速搅拌酶解溶液。
进一步地，自制过滤器为无底试管，塞入一定厚度的棉花，过滤时，原生质体可透过过滤器，其他杂菌则留在上层。
本发明涉及一种利用玻璃珠法与酶解相结合的方法制备螺旋藻原生质体，与现有技术相比，提供了一种操作更简单，用时较短的制备螺旋藻FACHB904原生质体的方法。
附图说明
图1制取钝顶螺旋藻原生质体的工艺流程图
图2玻璃珠打断后藻段
图3去除角质鞘后藻段
图4原生质体图
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但并不限制本发明的范围。
实施例1：
取培养至对数中期OD560＝0.800-1.000的螺旋藻培养液(Zarrouk培养基)20ml，放入约50个玻璃珠，在转速为120rpm/min、温度为28℃的螺旋藻恒温光照培养箱中摇转18h，分装进入两个离心管，4000rpm/min、4℃离心10min，收集藻段，用15ml 1.5mol/L NaCl洗涤5min，离心，用Zarrouk液体培养基冲洗，离心，反复3-4遍。将溶菌酶，牛血清白蛋白、Hepes加入到Zarrouk培养基中溶解混匀，并过0.22μm滤膜过滤除菌。加入酶溶液，在黑暗条件下进行酶解，酶解温度为28℃，时间为1h。酶解结束后，用自制过滤器过滤酶解液，离心收集沉淀，即获得螺旋藻原生质体。经过依文思蓝染色，可测得螺旋藻原生质体活性，最终可获得35％的螺旋藻原生质体。
计数公式:原生质体得率＝原生质体总数/原细胞总数×100％
Zarrouk培养基配方：
。

Claims (9)

1.一种螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于所述方法包括如下步骤：
(1)选取培养至对数中期OD560＝0.800-1.000的螺旋藻培养液，放入约有30-60个玻璃珠3-10mm的三角瓶中，培养条件为：转速100-180rpm/min、温度28℃、时间18h。
(2)离心收集藻段，用1.5mol/L NaCl含有的Zarrouk培养基洗涤5min，离心后用Zarrouk液体培养基反复冲洗3-4遍。
(3)向步骤2中获得的螺旋藻段中加入酶溶液，在黑暗条件下进行酶解，酶解温度为28℃，时间为1h。所述的酶溶液含有0.5％溶菌酶，1％牛血清白蛋白，1％Hepes。
(4)酶解结束后，用自制的过滤装置过滤酶解液，收集滤液，离心，收集沉淀，即获得螺旋藻原生质体。
2.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：用酶解液处理螺旋藻之前，先用玻璃珠处理螺旋藻使其变为藻段，避免了超声波破碎藻段对螺旋藻细胞产生的机械损害和其它未知损害。
3.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：用高浓度盐洗掉螺旋藻外层角质鞘，便于下一步酶解。
4.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：所述的酶解液中，含有0.5％溶菌酶，1％牛血清白蛋白，1％Hepes。
5.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：所述的酶解液按照如下步骤配置而成：将溶菌酶，牛血清白蛋白、Hepes加入到Zarrouk培养基中溶解混匀，并过0.22μm滤膜过滤除菌。
6.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：在酶解过程中，以60rpm/min的转速搅拌酶解溶液。
7.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：步骤1中所述的螺旋藻培养液，其OD560值为0.800-1.000。
8.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：步骤1中螺旋藻培养液为Zarrouk培养液。
9.根据权利要求1所述的螺旋藻原生质体的制备方法，其特征在于：步骤4中自制的过滤器为无底试管，塞入一定厚度的棉花，过滤时，原生质体可透过过滤器，其他杂菌则留在上层。
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