CN104292348B - 一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取多糖及蛋白的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取多糖及蛋白的方法，属于农产品精深加工领域。杏鲍菇加工副产物是指成熟杏鲍菇采收后加工成鲜售菇过程中，被切除的没有商业价值的粘连培养基的根蒂部分。将经预处理后制得的杏鲍菇加工副产物超微粉经85％乙醇室温浸泡，离心，沉淀加入磷酸缓冲液，室温盐溶提取蛋白，离心，上清液经100kDa超滤膜超滤，喷雾干燥制得蛋白，截留液备用；以盐溶过后离心沉淀为原料，热水浸提多糖，离心，上清液与上述备用截留液混合，浓缩液经乙醇沉淀12h离心，沉淀60℃烘干，加水溶解，100kDa超滤膜超滤，截留液冻干得粗多糖；采用热水浸提、超滤膜分离、喷雾干燥、冷冻干燥技术相结合的方法，多糖得率为10.69％，蛋白得率为11.23％。

Description

一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取多糖及蛋白的方法

一、技术领域

本发明涉及一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取提取蛋白及多糖的方法，属于农产品精深加工领域，产品可广泛应用于功能食品、生物医药等领域。其中杏鲍菇加工副产物是指在完整成熟杏鲍菇采收后加工成鲜售的产品过程中，被切除的没有商业价值的粘连培养基的根蒂部分。

二、背景技术

杏鲍菇(Pleurotus eryngii)又名刺芹侧耳，在食用菌界被誉为“菇中之王”，其子实体颜色雪白，质地脆嫩，又称雪茸、鲍鱼菇或干贝菇，为担子菌亚门、担子菌纲、层菌亚纲、无隔担子菌亚纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属食用菌。其菌肉肥厚，营养丰富，具有杏仁味和鲍鱼味，故称杏仁鲍鱼菇。杏鲍菇是近些年来开发栽培成功的集食疗、药用、食用于一体的珍贵食用菌新品种。杏鲍菇中含有较高的蛋白质、碳水化合物和膳食纤维，而脂肪含量较低，还含有V_E、V_B2等多种维生素，且富含钙、磷、铁等多种矿物质，是一种不可多得的高营养食品。

随着人类对保健食品以及杏鲍菇营养价值的认识逐渐加深，杏鲍菇将会有非常广阔的开发前景，与此同时，越来越多的杏鲍菇加工副产物在杏鲍菇的生产过程中被废弃，甚至连作牲畜的饲料都不甚理想，没有得到充分的利用。这样杏鲍菇加工副产物在生产流通环节的废弃，给企业增加了处理废弃物的成本。因此，杏鲍菇加工副产物的合理开发利用迫在眉睫，所以需要为杏鲍菇加工副产物的利用开辟一条途径。

在杏鲍菇多糖及蛋白的开发应用中，分离提取是关键的步骤之一，它不仅影响着产品的得率，直接关系经济效益，还与产品的活性价值密切相关。杏鲍菇多糖能溶于水，不溶于醇、醚、酮等有机溶剂，因而多糖传统提取方法主要有热水浸提法、酸碱浸提法、酶法等。而大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质。但是关于此两类活性物质的提取方法大都单独进行，在提取时间长、提取温度高、能耗大的前提下很难达到理想效果，这些都大大限制了活性物质的开发利用。利用超微粉碎、热水浸提、超滤膜分离与喷雾干燥技术、冷冻干燥技术相结合对多糖和蛋白进行有效的分离与纯化，可以相对快速的对这两种活性物质进行提取与富集。同时提取过程不涉及化学试剂，具有条件温和、不引入杂质、无污染、产品质量好等优点，这在一定程度上减少了对浸提物质生物活性的影响，并且可以使多糖与蛋白的损失率降低，有利于后续纯化。

利用超微粉碎、热水浸提、超滤膜分离与喷雾干燥技术、冷冻干燥技术相结合的方法，研究其适宜的提取条件，是提高杏鲍菇加工副产物利用率的重要途径，也是后续生物活性研究的基础。

三、发明内容

技术问题

本发明的目的是提供一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取提取蛋白及多糖的方法，该方法避免了传统提取技术提取时间长，提取率低、能耗高的弊端。同时该方法简便，易得，制得的多糖与蛋白无毒、安全，且得率与纯度较高，可广泛应用于保健品、功能食品、生物医药等领域。可以最大程度地提高废弃物的利用率，减少对环境的污染。

技术方案

一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取多糖及蛋白的方法，其特征在于收集新鲜的杏鲍菇加工副产物，进行除杂、清洗等预处理后利用超微粉碎技术制得杏鲍菇加工副产物超微粉，再利用盐溶蛋白技术、热水浸提多糖技术、超滤膜分离技术、冷冻干燥技术与喷雾干燥技术相结合得到杏鲍菇加工副产物多糖与蛋白。提取工艺包括：

1)杏鲍菇加工副产物超微粉的制备：新鲜杏鲍菇加工副产物经除杂、清洗、晾晒至半干后，放于烘箱中60℃鼓风烘干，然后经30B粉碎机粉碎，双辊破碎机破碎，80目筛分，气流粉碎机粉碎，300目筛分，制得杏鲍菇加工副产物超微粉，置于-4℃备用。

2)称取杏鲍菇加工副产物超微粉，按每1g超微粉加10～30mL 85％乙醇的比例室温下浸泡2h，以除去部分色素及杂质，离心取沉淀，按每1g沉淀加入10～20mL缓冲液(0.05MNa₂HP0₄，0.05M NaH₂PO₄，0.3M NaCl)室温搅拌1～3h，离心沉淀用于杏鲍菇加工副产物多糖的制备，上清液经Millipore公司超滤分离装置过孔径为100kDa的超滤膜进行超滤，截留液备用，透过液低温浓缩至适量，喷雾干燥制得杏鲍菇废弃物蛋白粗品；

3)向上述离心沉淀中加入去离子水，去离子水的用量为10～50mL/g，利用HH-4数显恒温水浴锅，以60～100℃水浴提取1～3h，4000r/min条件下离心10min取上清；

4)上清液与上述超滤截留液混合低温浓缩至原体积的1/4，浓缩液加4倍体积无水乙醇，4℃下沉淀12h，离心取沉淀，沉淀物置60℃烘箱烘干；

5)以干燥的沉淀为基准，按水料此200mL/g加去离子水溶解，经Millipore公司超滤分离装置过孔径为100kDa的超滤膜进行超滤，截留液经低温浓缩至原体积的1/4，冻干，即得到杏鲍菇加工副产物粗多糖。

有益效果

本发明与传统的分步提取多糖与蛋白相比，该方法具有提取时间短、操作方便、产品安全无毒、得率与纯度较高等特点，产品作为一种功能基料，可广泛应用于功能食品和医药等领域。在加工副产物的开发应用中，将其中的活性成分提取出来是关键的步骤之一，它不仅单纯地影响着产品的得率，直接关系经济效益，还与产品的生物活性有着密切的关系。由于传统分步提取多糖与蛋白的方法，提取时间长，多糖与蛋白得率低，很难最大程度的提高杏鲍菇加工副产物的利用率，为了改善这种情况，本发明采用超滤膜分离技术结合超微粉碎技术与盐溶技术制得杏鲍菇加工副产物蛋白；并利用热水浸提技术与冷冻干燥技术超滤膜分离与相结合的方法研究了浸提时间、水料此、浸提温度这3个单因素对多糖得率的影响，筛选各个因素的中心点，在此基础上，采用Design experts V6.0软件的BBD法，进行3因素3水平的提取参数优化试验，同时运用Design experts V6.0软件进行统计分析，确定3个因素不同水平的最优组合，最后优化出杏鲍菇加工副产物多糖提取的工艺参数为浸提时间140 min，浸提温度72℃，水料此为25mL/g，研究结果显示按照本发明的工艺参数，杏鲍菇加工副产物多糖的得率可达到10.69％，蛋白的得率可达到11.23％，与传统分步提取多糖与蛋白相比，多糖纯度提高了31.1％，蛋白纯度提高了19.58％，时间缩短了100min。

本发明采用超微粉碎、热水浸提、超滤膜分离、喷雾干燥技术、冷冻干燥技术相结合的方法，在制得具有较高纯度杏鲍菇加工副产物蛋白的同时制得了较高纯度的杏鲍菇加工副产物多糖，显著提高多糖与蛋白的得率和提取效率，且分离过程中无有毒有机试剂参与，所得产品无毒，安全；同时超滤膜分离技术具有设备简单，操作容易，适用范围广，生产效率高，能量损耗小等优点。因此，该技术为杏鲍菇加工副产物的充分利用，开辟了新的途径。

四、具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1是杏鲍菇加工副产物示意图。其中图1-A为成熟杏鲍菇；图1-B为市售杏鲍菇；图1-C为未经预处理的杏鲍菇加工副产物；图1-D为预处理过后的杏鲍菇加工副产物。

图2是杏鲍菇加工副产物蛋白与多糖示意图。其中图2-A是杏鲍菇加工副产物蛋白样品；图2-B是杏鲍菇加工副产物多糖样品。

1.多糖含量的测定方法：

采用硫酸苯酚法，精密称取杏鲍菇加工副产物粗多糖5g，溶与250mL去离子水，精密吸取样液0.5mL，置15mL试管中，并用蒸馏水补至2mL，分别加入1mL6％苯酚和5mL浓硫酸，摇匀，沸水中水浴20min，自然冷却后在490nm处测定吸光值A。以D-半乳糖为标准品，制作标准曲线。

蛋白含量的测定方法：微量凯氏定氮法(GB5009.5-2010)

粗多糖及蛋白得率的计算公式：

粗多糖得率(％)＝粗多糖质量(g)/超微粉重(g)×100％

粗蛋白得率(％)＝粗蛋白质量(g)/超微粉重(g)×100％

2.原料预处理

杏鲍菇加工副产物，由南京市高固食用菌科贸有限公司提供。

杏鲍菇加工副产物超微粉的制备：新鲜杏鲍菇加工副产物经除杂、清洗、晾晒至半干后，放于烘箱中60℃鼓风烘干，然后经30B粉碎机粉碎，双辊破碎机破碎，80目筛分，气流粉碎机粉碎，300目筛分，制得杏鲍菇加工副产物超微粉，置于-20℃备用。

称取杏鲍菇加工副产物超微粉，按每1g超微粉加15mL 85％乙醇的比例室温下浸泡2h，以除去部分色素及杂质，离心取沉淀，备用。

3.热水浸提杏鲍菇加工副产物粗多糖(对照)

1)取经过乙醇预处理的沉淀物，以原料为基准，按水料此28mL/g加入420mL去离子水充分混匀，在80℃水浴中浸提4h(浸提期间可以适时搅拌)；

2)浸提液5000r/min离心15min取上清，上清液采用Sevag试剂(正丁醇∶三氧甲烷＝1∶4)法去蛋白，8000r/min条件下离心10min取上清；

3)上清液置旋转蒸发仪(N-1100EYELA型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社)50℃减压浓缩至适量，浓缩液加4倍体积无水乙醇于4℃冰箱沉淀12h；

4)5000r/min离心15min取沉淀物，沉淀物置60℃烘箱烘干，即可得到热水浸提的杏鲍菇加工副产物粗多糖。粗多糖得率为8.26％，提取时间为240min。

采用传统热水浸提多糖的最优条件稍作修改，提取温度80℃，提取时间240min，水料比28mL/g时，多糖的得率为8.26％。

4.低温盐溶提取杏鲍菇加工副产物蛋白(对照)

1)取经过乙醇预处理的沉淀物，按每1g沉淀加入15mL缓冲液(0.05M Na₂HPO₄，0.05M NaH₂PO₄，0.03M NaCl)室温搅拌2h；

2)盐溶溶液5000r/min离心15min取上清；

3)上清液置旋转蒸发仪(N-1100EYELA型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社)50℃减压浓缩至适量；

4)对浓缩液进行喷雾干燥即可得到低温盐溶提取的杏鲍菇加工副产物蛋白。蛋白得率为9.23％，提取时间为120min。

采用低温盐溶的提取方法的最优条件作修改，提取温度4℃，提取时间120min，液料比15mL/g时，蛋白的得率为9.23％。

5.热水浸提、超滤膜分离与盐溶技术结合法(本发明)

1)取经过乙醇预处理的沉淀物，按每1g沉淀加入15mL缓冲液(0.05M Na₂HPO₄，0.05M NaH₂PO₄，0.03M NaCl)室温搅拌2h，离心取上清，经Millipore公司超滤分离装置过孔径为100kDa的超滤膜进行超滤，透过液置旋转蒸发仪(N-1100EYELA型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社)50℃减压浓缩至原体积的1/4，喷雾干燥制得杏鲍菇加工副产物蛋白粗品；

2)向上述离心沉淀中加入去离子水，去离子水的用量为10～50mL/g，利用HH-4数显恒温水浴锅，以60～100℃水浴提取1～3h，4000r/min条件下离心10min取上清；

3)上清液与上述超滤截留液混合，置旋转蒸发仪(N-1100EYELA型旋转蒸发仪，日本东京理化器械株式会社)50℃减压浓缩至原体积的1/4，浓缩液加4倍体积无水乙醇，4℃下沉淀12h，离心取沉淀，沉淀物置60℃烘箱烘干；

4)以干燥的沉淀为基准，按水料此200mL/g加去离子水溶解，经Millipore公司超滤分离装置过孔径为100kDa的超滤膜进行超滤，截留液经旋转蒸发浓缩至原体积的1/4，冻干，即得到杏鲍菇加工副产物粗多糖；粗多糖得率为10.69％，粗蛋白得率为11.23％，所用时间为260min。

选择浸提温度、浸提时间和水料此做单因素试验，通过单因素试验初步确定3个变量的适宜范围，进行三因素三水平Box-Behnken试验设计，各因素的试验水平及编码列于表1，Box-Behnken试验设计及其响应值见表2。

表1 Box-Behnken试验设计各因素的试验水平及编码

表2 Box-Behnken试验设计及其响应值

Claims (1)

1.一种从杏鲍菇加工副产物中同步提取多糖及蛋白的方法，其特征在于收集新鲜的杏鲍菇加工副产物，进行除杂、清洗预处理后利用超微粉碎技术制得杏鲍菇加工副产物超微粉，再利用盐溶蛋白技术、热水浸提多糖技术、超滤膜分离技术、冷冻干燥技术与喷雾干燥技术相结合得到杏鲍菇加工副产物多糖与蛋白，

具体步骤为：

1)称取杏鲍菇加工副产物超微粉，按每1g超微粉加10～20mL 85％乙醇的比例室温下浸泡2h，以除去部分色素及杂质，离心取沉淀，按每1g沉淀加入10～30mL含有0.05MNa₂HPO₄，0.05M NaH₂PO₄及0.03M NaCl的缓冲液，室温搅拌1～3h，离心沉淀用于杏鲍菇加工副产物多糖的制备，上清液经孔径为100kDa的超滤膜超滤，截留液4℃备用，透过液低温浓缩，喷雾干燥得杏鲍菇加工副产物蛋白产品；

2)向上述备用离心沉淀中加入去离子水，去离子水的用量为10～50mL/g，以60～100℃热水提取1～3h，4000r/min条件下离心10min取上清；上清液与上述截留液混合，低温浓缩至原体积的1/4，浓缩液加4倍体积无水乙醇，沉淀12h，离心取沉淀，沉淀物置60℃烘干；以干燥的沉淀为基准，按水料比150～300mL/g加去离子水溶解，经孔径为100kDa的超滤膜进行超滤，截留液经低温浓缩至原体积的1/4，冻干得到杏鲍菇加工副产物多糖产品。