CN104710543A - 一种高分子量杏鲍菇多糖及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高分子量杏鲍菇多糖及其制备方法，本发明的一种高分子量杏鲍菇多糖是通过如下方法制备得到的：粗多糖提取、上清液超滤、低浓度醇沉、醇洗及干燥。本发明制备得到的杏鲍菇多糖分子量高，纯度高，活性强。

Description

一种高分子量杏鲍菇多糖及其制备方法

技术领域

本发明属于食用菌有效成分提取领域，具体的说涉及一种高分子量杏鲍菇多糖及其制备方法。

背景技术

现代药理学研究表明，杏鲍菇(Pleurotus Eryngii)中多糖是其主要的活性成分之一，在抗血栓、调血脂、调节免疫功能和抗肿瘤、抗放射方面都具有显著的药理作用。目前，杏鲍菇粗多糖的活性研究较多，而对于纯多糖的研究主要集中在分子量为1万-几十万道尔顿部分，如张化鹏等通过水提醇沉，经DEAE-52离子柱和Sepharose-G150凝胶柱层析分离纯化得到杏鲍菇多糖WPP1和WPP2，其平均分子量分别为2.871×10⁴Da和4.499×10⁵Da，活性研究结果显示分子量较大的组分WPP2具有一定的抗肿瘤活性。但对于分子量为上百万道尔顿的杏鲍菇多糖研究较少。

大量研究表明，真菌多糖的药理活性与其初级结构、高级结构、分子量、黏度有着密切的关系，一般认为多糖分支度较大、分子量大于一定的范围才表现出较好的生物学活性，因此研究高分子量多糖及其提取与制备工艺是非常必要的。

发明内容

本发明的目的首先提供一种高分子量杏鲍菇多糖的制备方法，其包括如下步骤：

(1)粗多糖提取：称取杏鲍菇下脚料碎块，加水，料液比为1:10-14(kg:L)，沸水浴1-2h，过滤取上清液；

(2)上清液超滤：卷式超滤膜100kDa，超滤压力0.15-0.2MPa，进行超滤；

(3)低浓度醇沉：超滤后的截留液离心后取上清液，进行醇沉，沉淀即为杏鲍菇下脚料粗多糖；

(4)醇洗及干燥：粗多糖经乙醇水溶液洗涤，冷冻干燥，得高分子量杏鲍菇多糖干品。

具体的说，本发明的一种高分子了杏鲍菇多糖的制备方法，包括如下步骤：

(1)粗多糖提取：称取杏鲍菇下脚料碎块，加水，料液比为1:10-14(kg:L)，沸水浴1-2h，过滤，滤液离心，残渣再重复提取一次，合并两次提取上清液；

(2)上清液超滤：卷式超滤膜100kDa，超滤压力0.15-0.2MPa，超滤温度常温，超滤时间2-3h，超滤期间加2-3倍体积的水稀释上清液，当透过超滤膜的液体最终电导率＜80μs/cm时超滤结束；

(3)低浓度醇沉：超滤后的截留液离心后取上清液，上清液加无水乙醇至乙醇最终浓度为20-25％(v/v)，室温静止8h，离心，沉淀即为杏鲍菇下脚料粗多糖；

(4)醇洗及干燥：粗多糖加入25-30％乙醇水溶液(v/v)，震荡洗涤，低温离心，洗涤2-3次，然后多糖冷冻干燥，得高分子量杏鲍菇多糖干品。

本发明还提供了由上述方法制备的高分子量杏鲍菇多糖，其中多糖含量为75％以上，β-葡聚糖含量超过45％，多糖重均分子量为3.90×10⁶Da左右，单糖分析显示主要由葡萄糖组成，且葡萄糖所占摩尔百分比为90-95％，该高分子量多糖体外刺激RAW264.7巨噬细胞活性高。

杏鲍菇下脚料是菌脚、菇片、菌柄基部等杏鲍菇加工副产物，在加工过程中因难以食用或商品价值低而被废弃。因而，利用杏鲍菇下脚料提取杏鲍菇多糖，不但原料来源丰富、生产成本低，而且节约资源、减少环境污染，达到杏鲍菇资源综合利用的目的。本发明提供的高分子量杏鲍菇多糖的制备方法，工艺简便、高效，不需要过离子柱及凝胶柱分离就可以得到多糖纯品，大大节省杏鲍菇多糖提取制备时间。

本发明采用超滤与醇沉相结合的方法制备高分子量多糖，多糖提取液经超滤后再低浓度醇沉，工艺简单，易于进行规模化生产。超滤处理，一方面起到浓缩作用，另一方面可以去除大部分小分子物质，方便后续的纯化分离，多糖只需简单的醇洗，就可得到高分子量杏鲍菇多糖纯品。而且制备得到的多糖分子量高，纯度高，活性好。

附图说明

图1杏鲍菇高分子量多糖的分子量分布

图2杏鲍菇高分子量多糖的单糖组成

图3杏鲍菇高分子量多糖促进RAW264.7巨噬细胞株释放的NO量

具体实施方式：

多糖和β-葡聚糖含量的检测：

多糖含量测定：用苯酚－硫酸法测定，精密称取样品2mg置2mL离心管中，加蒸馏水2mL，加热助溶后冷却至室温，离心。上清液稀释20倍，精密吸取样品1.0mL，置15mL试管中，分别加入苯酚、硫酸试剂，充分反应后在490nm处测定吸光度值，以葡聚糖为标准品计算样品的糖含量。

β-葡聚糖含量测定：参照Megazyme公司的酵母和蘑菇β-葡聚糖检测试剂盒中的方法对多糖样品中β-葡聚糖含量进行测定。

实施例一:

1粗多糖提取：称取500g杏鲍菇下脚料碎块(上海贝安菌业专业合作社)，加水6.5L，沸水浴2h，过滤，滤液10000r/min离心15min，残渣再加水6L，沸水浴1h，过滤，滤液10000r/min离心15min，合并两次提取上清液。

2上清液超滤：超滤设备为纳滤超滤反渗透一体机(BH-UF-NF-RO-3-2012，上海贝鸿生物科技有限公司)，使用卷式超滤膜100kDa(型号PSI1，安得膜分离技术工程有限公司)，超滤压力0.15-0.2MPa，超滤温度为室温，超滤时间2h，超滤期间加2倍体积的蒸馏水稀释，使透过超滤膜的液体最终电导率＜80μs/cm时结束超滤，收集超滤后的截留液浓缩至终体积为1.8L。

3低浓度醇沉：将超滤后的截留液离心取上清液，上清液加无水乙醇至乙醇浓度为20％(v/v)，室温静置8h，离心，沉淀为杏鲍菇粗多糖。

4醇洗及干燥：粗多糖加100mL的25％乙醇水溶液(v/v)，震荡洗涤，低温离心收集沉淀，重复洗涤2次(至无颜色为止)。沉淀加水溶解后水浴加热挥干乙醇，冷冻干燥得高分子量多糖纯品。

制备所得杏鲍菇高分子量多糖的多糖含量为76.25％(±0.89)，β-葡聚糖含量为47.35％(±2.94)。

实施例二:

1粗多糖提取：称取500g杏鲍菇下脚料碎块(上海贝安菌业专业合作社)，加水7L，沸水浴2h，过滤，滤液10000r/min离心15min，残渣再加水6L，沸水浴1h，过滤，滤液10000r/min离心15min，合并两次提取上清液。

2上清液超滤：超滤设备为纳滤超滤反渗透一体机(BH-UF-NF-RO-3-2012，上海贝鸿生物科技有限公司)，使用卷式超滤膜100kDa，超滤压力0.15-0.2MPa，超滤温度为室温，超滤时间2h，期间加3倍体积蒸馏水稀释上清液，使透过超滤膜的液体最终电导率＜80μs/cm时结束超滤，收集超滤后的截留液浓缩至终体积为2L。

3低浓度醇沉：超滤后的截留液离心，上清液加无水乙醇至乙醇浓度为25％(v/v)，室温静止8h，离心，沉淀为杏鲍菇多糖。

4醇洗及干燥：粗多糖加100mL 30％乙醇水溶液(v/v)，震荡洗涤，低温离心收集沉淀，重复洗涤3次(至无颜色为止)，沉淀加水溶解后水浴加热挥干乙醇，冷冻干燥得高分子量多糖纯品。

制备所得杏鲍菇高分子量多糖的多糖含量为78.21％(±1.55)，β-葡聚糖含量为49.2％(±1.44)。

实施例三：

1、样品配制：称取2mg实施例一中制备的高分子量杏鲍菇多糖，加入1mL流动相(含0.05mol/L的NaH₂PO₄和0.15mol/L的NaNO₃溶液)，充分溶解，13000r/min离心10min，上清液经0.45μm的水相微孔滤膜(上海安谱科学仪器有限公司)过滤后进行HPSEC-MALLS-RI分析。

2、色谱分析条件：高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散色仪-示差折光检测仪联用分析法(HPSEC-MALLS-RI System)：由Waters2695型高效液相色谱仪，氦－氖激光光源的八角度激光光散射检测器(MALLS，Wyatt公司)和Waters 2414示差检测器(RI)等组成。分析柱选TSK PWXL 6000和TSK PWXL 4000凝胶色谱柱(TOSOH公司)串联后分析，流动相为含0.05mol/L的NaH₂PO₄和0.15mol/L的NaNO₃溶液(pH＝7，0.02％叠氮钠)，流速为0.5mL/min，色谱柱温用柱温箱恒定在35℃；八角度激光光散射检测器光源波长选用623.8nm。多糖在溶液中的折光指数增量(dn/dc)按照0.146mL/g计算。

3、分子量计算：使用Astra(version 6.1.1,Wyatt Technology,Santa Barbara,CA)数据分析软件对光散射数据进行采集和分析，计算分子量和多糖分子特性参数。

HPSEC-MALLS-RI分析图谱如图1所示。实施例一中制备得到的杏鲍菇高分子量多糖其液相图谱为单一峰(27min左右)，其重均分子量为3.938×10⁶Da，数均分子量为3.669×10⁶Da，特性粘度为1289.70mL/g。

实施例四:

1、样品制备：称取实施例一制备的杏鲍菇高分子量多糖2mg加入带盖玻璃瓶，加入3mL 2mol/L的三氟乙酸(TFA)，110℃油浴2h，冷却至室温，氮吹仪吹干，再加甲醇并吹干，重复加甲醇3次至TFA完全除去，用超纯水冲洗玻璃瓶并将酸解液转移至50mL容量瓶中，定容。

2、色谱条件：色谱柱CarboPac^TM PA20(3×150nm)；流动相0.8％NaOH溶液(pH＝12)；时间30min；柱温30℃；流速0.45mL/min；进样量25μL。

经戴安公司离子色谱仪(型号：ICS2500)检测分析单糖组成如图2所示。实施例一的杏鲍菇高分子量多糖组分由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖五种单糖组成，其中葡萄糖所占比例最高，百分摩尔比为94.89％，其次是甘露糖，百分摩尔比为2.5％。

实施例五：体外刺激巨噬细胞释放NO的活性测定：

1、样品准备：精确称取实施例一制备的杏鲍菇高分子量多糖样品于灭过菌的eppendorf管中，用无菌的PBS配制成浓度5mg/mL的样品液。充分溶解后以15000r/min离心40min，无菌条件下将上清转移至新的无菌eppendorf管中，将样品稀释成2mg/mL、0.5mg/mL待用。

2、细胞培养：取对数生长期的RAW264.7巨噬细胞株(购自中科院细胞所)，用DMEM完全培养基(Gibco公司)在37℃、含5％CO₂条件下传代培养，用0.05％胰酶(Gibco公司)消化，混悬液1000rpm/min离心3min后收集细胞，计数备用。

3、试剂配制及标准曲线绘制

Griess试剂制备：在烧杯中加入6.25mL H₃PO₃，加入蒸馏水250mL，分别加入2.5g磺胺(sulfanilamide，Sigma公司)和0.25g萘基乙二胺二盐酸盐(naphthyl ethyylenediaminedihydrochloride，Sigma公司)，用磁力搅拌器至全部溶解，棕色试剂瓶4℃冰箱保存。

标准曲线绘制：配成不同浓度的亚硝酸钠溶液，浓度梯度为0、5、10、15、20、25、30、35、40μM共九个；取100μL于96孔板孔，加入50μL Griess试剂,测定543nm吸光值，标准曲线每个浓度3个重复，根据吸光值绘制标准曲线。

4、样品刺激巨噬细胞释放NO量的测定：收集RAW264.7细胞，用无色RPMI1640(10％胎牛血清+1％抗生素液体，Gibco公司)培养基将细胞稀释至5×10⁵个/mL，加入96孔板，每孔加入180μL，然后再加入20μL待测样品，阳性对照为LPS(终浓度为1μg/mL，Sigma公司)，37℃培养48h。取100μL上清于96孔板孔，加入50μL Griess试剂，室温孵浴10min，测定543nm吸光值。根据标准曲线计算细胞NO的释放量。

结果见附图3，由此结果可以看出，实施例一所得的杏鲍菇高分子量多糖对RAW264.7巨噬细胞株释放NO有明显的促进作用，可明显增强巨噬细胞的吞噬杀伤能力，且高分子量多糖对巨噬细胞的免疫活性表现出很好的浓度依赖性。

Claims (3)

1.一种高分子量杏鲍菇多糖的制备方法，其特征在于其包括如下步骤：

(1)粗多糖提取：称取杏鲍菇下脚料碎块，加水，料液比为1:10-14(kg:L)，沸水浴1-2h，过滤取上清液；

(2)上清液超滤：卷式超滤膜100kDa，超滤压力0.15-0.2MPa，进行超滤；

(3)低浓度醇沉：超滤后的截留液离心后取上清液，进行醇沉，沉淀即为杏鲍菇下脚料粗多糖；

(4)醇洗及干燥：粗多糖经乙醇水溶液洗涤，冷冻干燥，得高分子量杏鲍菇多糖干品。

2.根据权利要求1所述的高分子量杏鲍菇多糖的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)粗多糖提取：称取杏鲍菇下脚料碎块，加水，料液比为1:10-14(kg:L)，沸水浴1-2h，过滤，滤液离心，残渣再重复提取一次，合并两次提取上清液；

(2)上清液超滤：卷式超滤膜100kDa，超滤压力0.15-0.2MPa，超滤温度常温，超滤时间2-3h，超滤期间加2-3倍体积的水稀释上清液，当透过超滤膜的液体最终电导率＜80μs/cm时超滤结束；收集超滤后的截留液；

(3)低浓度醇沉：超滤后的截留液离心后取上清液，上清液加无水乙醇至乙醇最终浓度为20-25％(v/v)，室温静止8h，离心，沉淀即为杏鲍菇下脚料粗多糖；

(4)醇洗及干燥：粗多糖加入25-30％乙醇水溶液(v/v)，震荡洗涤，低温离心，洗涤2-3次，然后多糖冷冻干燥，得高分子量杏鲍菇多糖干品。

3.一种由权利要求1或2任一项所述方法制备得到的高分子量杏鲍菇多糖。