KR102388144B1 - 방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법 - Google Patents
방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법에 관한 것으로, 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성 단백질을 코딩하는 유전자를 난노클로롭시스 살리나에 과발현시킴으로써, 포피라-334(Porphyra-334)와 같은 MAAs를 산업적으로 이용가능하도록 대량 생산할 수 있다.
Description
본 발명은 방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법에 관한 것이다.
마이코스포린 유사 아미노산(Mycosporine-like amino acids: MAAs)은 자연 생물체에 존재하는 물질로, UVA 및 UVB를 효과적으로 흡수하는 것으로 알려져 있다. MAAs는 자연계에 35종 이상이 존재한다고 알려져 있으며, 대표적으로 포피라-334(porphyra-334), 시노린(shinorine) 등이 있다. 최근에는 다양한 당이 붙은 형태의 MAAs가 미세조류에 존재하며, 항산화 기능이 탁월하다고 보고되었다. 또한, MAAs는 자외선 차단능뿐만 아니라, 산화, 삼투 및 열 스트레스에 대한 저항성 등을 부여한다고 알려져 있다.
이러한 MAAs를 대량생산하기 위하여, MAAs를 생산하는 생물을 사용할 경우에 대상 생물의 생장속도가 느리고, MAAs 함량이 낮아서 생산성이 높지 않으며, 배양환경에 따라 그 생산성이 일정하지 않고 크게 변하는 한계를 가지고 있다. 특히 포피라-334를 생산하는 대부분의 김 속(Pyropia sp.)은 늦가을부터 초봄까지만 생장하는 등의 한계를 가지고 있다. 따라서 고속 생장이 가능하며 생명공학기술 적용이 가능한 숙주에서 MAAs의 생산성을 높이려는 기술이 개발되고 있다. 지금까지 개발된 기술에 의한 최대 생산성은 세균인 스트렙토마이세스 아베르미틸리스(Streptomyces avermitilis) SUKA22에서 13.9mg MAAs/g DCW(dry cell weight)와, 진핵생물인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서 9.62 mg/g DCW의 시노린(shinorine)이다.
한편, 한국등록특허 제2003911호에는 '마이코스포린 유사 아미노산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 마이코스포린 유사 아미노산의 생산방법'에 대해 개시하고 있으며, 한국등록특허 제1606634호에는 'MAA 대량 생산 방법'에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 '방사무늬김 유래의 유전자를 이용한 마이크로스포린 유사 아미노산을 대량 생산하는 난노클로롭시스 형질전환체의 제조 방법'에 대해서는 아직까지 개시된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진, 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성 단백질을 코딩하는 유전자를 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)에서 과발현시킨 결과, 대조구인 야생형 방사무늬김에 비해 4~6배의 포피라-334(Porphyra-334)를 생산하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSCD 단백질을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 PySHSAB 또는 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 형질전환시켜 PySHSAB 단백질 코딩 유전자 및 PySHSCD 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체를 제공한다.
본 발명은 각각 서열번호 1 및 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성 단백질을 코딩하는 유전자를 난노클로롭시스 살리나에 과발현시킴으로써, 포피라-334(Porphyra-334)와 같은 MAAs를 산업적으로 이용가능하도록 대량 생산할 수 있다.
도 1은 방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 존재 여부를 서던 블롯(Southern blot)을 통해 확인한 결과(a)이며, PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 구조 모식도(b)와 UV-B 노출 시간에 따른 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 발현 변화(c)를 확인한 결과이다.
도 2는 방사무늬김 유래의 MAAs 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자가 도입된 난노클로롭시스 살리나의 형질전환용 벡터의 모식도이다.
도 3은 형질전환된 난노클로롭시스 살리나에서 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자 도입 여부를 서던 블롯(Southern blot) 및 노던 블롯(Northern blot)을 통해 확인한 결과이다. WT: 야생형 난노클로롭시스 살리나; 265, 286 및 287: 형질전환된 난노클로롭시스 살리나.
도 4는 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체에서 추출된 MAAs의 흡수 파장을 확인한 결과이다. P. yezoensis 및 N. salina: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 5는 방사무늬김 유래의 MAAs 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 이용하여 제조한 NsSHSABCD 과발현 형질전환체 추출물의 HPLC 결과이다. porphyra-334: 표준물질; P. yezoensis 및 N. salina: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 6은 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체의 추출물에서 포피라-334의 함량을 확인한 결과이다. Pyropia yezoensis: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286, NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 7은 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)에서 생산되는 포피라-334의 UV 차단 효과를 확인하기 위해, NsSHSABCD 과발현 형질전환체에 UV-B 처리 후 생장 정도를 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina.
도 8은 본 발명의 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)의 최대 광합성 효율(Fv/Fm; Maximum PSII quantum yield)을 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina. *은 UV-B 처리후 WT에 비해 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 값이 유의미하게 증가한다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 9는 본 발명의 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)의 항산화 수준을 확인하기 위해, UV-B 처리후 각 형질전환체의 ROS(reactive oxygen species) 생성량을 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina. WT: 야생형 N. salina. *은 UV-B 처리후 WT에 비해 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 값이 유의미하게 감소한다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 2는 방사무늬김 유래의 MAAs 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자가 도입된 난노클로롭시스 살리나의 형질전환용 벡터의 모식도이다.
도 3은 형질전환된 난노클로롭시스 살리나에서 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자 도입 여부를 서던 블롯(Southern blot) 및 노던 블롯(Northern blot)을 통해 확인한 결과이다. WT: 야생형 난노클로롭시스 살리나; 265, 286 및 287: 형질전환된 난노클로롭시스 살리나.
도 4는 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체에서 추출된 MAAs의 흡수 파장을 확인한 결과이다. P. yezoensis 및 N. salina: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 5는 방사무늬김 유래의 MAAs 생합성을 조절하는 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 이용하여 제조한 NsSHSABCD 과발현 형질전환체 추출물의 HPLC 결과이다. porphyra-334: 표준물질; P. yezoensis 및 N. salina: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 6은 방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체의 추출물에서 포피라-334의 함량을 확인한 결과이다. Pyropia yezoensis: 대조구(비형질전환체); NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286, NsSHSABCD 287: NsSHSABCD 과발현 난노클로롭시스 살리나 형질전환체.
도 7은 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)에서 생산되는 포피라-334의 UV 차단 효과를 확인하기 위해, NsSHSABCD 과발현 형질전환체에 UV-B 처리 후 생장 정도를 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina.
도 8은 본 발명의 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)의 최대 광합성 효율(Fv/Fm; Maximum PSII quantum yield)을 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina. *은 UV-B 처리후 WT에 비해 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 값이 유의미하게 증가한다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
도 9는 본 발명의 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287)의 항산화 수준을 확인하기 위해, UV-B 처리후 각 형질전환체의 ROS(reactive oxygen species) 생성량을 확인한 결과이다. WT: 야생형 N. salina. WT: 야생형 N. salina. *은 UV-B 처리후 WT에 비해 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 값이 유의미하게 감소한다는 것을 의미하며, p<0.05이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSCD 단백질을 제공한다.
본 발명에 따른 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질의 범위는 각각 서열번호 1 및 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1 또는 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1 및 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 단백질을 말한다.
본 발명은 또한, 상기 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질을 코딩하는 각각의 유전자를 제공한다.
본 발명에 따른 상기 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질을 코딩하는 각각의 유전자는 서열번호 3 및 4로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 유전자의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 3 또는 4의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 유전자에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 유전자 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 PySHSAB 및 PySHSCD 단백질을 코딩하는 각각의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예컨대, pLλ프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(E coli)이 이용되는 경우, E coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pLλ프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지(예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스(예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터(예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터(예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 75K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명은 또한, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli Rosetta, E. coli BL21, E. coli JM109, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주, 또는 미세조류 세포 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는, 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 난노클로롭시스 그라뉼라타(Nannochloropsis granulata), 난노클로롭시스 림네티카(Nannochloropsis limnetica), 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica), 난노클로롭시스 오큘라타(Nannochloropsis oculata) 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법, 하나한 방법(Hanahan, D, J Mol Biol, 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 유효성분으로 바람직하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자를 난노클로롭시스 속 미세조류에 형질전환시킴으로써 난노클로롭시스 속 미세조류에서 MAAs를 대량 생산할 수 있다.
본 발명의 조성물에서, 상기 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류는 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina), 난노클로롭시스 가디타나(Nannochloropsis gaditana), 난노클로롭시스 그라뉼라타(Nannochloropsis granulata), 난노클로롭시스 림네티카(Nannochloropsis limnetica), 난노클로롭시스 오세아니카(Nannochloropsis oceanica), 난노클로롭시스 오큘라타(Nannochloropsis oculata) 등일 수 있으며, 바람직하게는 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 MAAs는 포피라 334(Porphyra-334, mycosporine-glycine-threonine)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 숙주세포에서 MAAs를 생산하는 방법에서, 상기 숙주세포 및 MMAs는 전술한 바와 같다.
또한, PySHSAB 단백질 코딩 유전자와 PySHSCD 단백질 코딩 유전자는 하나의 벡터에 포함될 수도 있고, 각각 다른 벡터에 포함될 수도 있다.
또한, 본 발명의 생산 방법은, 상기 형질전환된 숙주세포를 배양한 후, 배양물로부터 MMAs를 분리·동정하는 단계를 포함한다. 상기 배양 및 분리·동정 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 특정 방법에 특별히 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 형질전환시켜 PySHSAB 단백질 코딩 유전자 및 PySHSCD 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체의 제조 방법 및 상기 방법에 의해 제조된 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체를 제공한다.
상기 MAAs 및 난노클로롭시스 속 미세조류는 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 방사무늬김의 Porphyra-334/shinorine 생합성 유전자 클로닝
방사무늬김(Pyropia yezoensis)에서 포피라-334(Porphyra-334), 시노린(shinorine) 등의 MAAs가 생산되는 것은 보고되어 있었으나 관련 유전자는 알려지지 않았다. 본 발명에서는 포피라 움빌리칼리스(P. umbilicalis, Pum0783s0002.1 및 Pum0783s0003.1)의 시노린 생합성 유전자의 단백질 서열을 이용하여 방사무늬김 전사체 정보를 대상으로 BLAST 수행하여 각각 87%, 83%의 높은 상동성(homology)을 가지는 2개의 전사체 정보를 확보하고 PySHSAB 및 PySHSCD로 명명하였다.
또한, 서던(Southern) 분석을 통하여 각각의 유전자가 방사무늬김 게놈에 단일 카피(single copy)로 존재하는 것을 확인하였다(도 1a). PySHSAB 유전자(서열번호 3)는 878개의 아미노산(서열번호 1)을 코딩하고 있으며 DHQ-S(dehydroquinate synthase) 도메인과 O-MT(O-methyltransferase) 도메인으로 이루어져 있으며(도 1b), PySHSCD 유전자(서열번호 4)는 923개의 아미노산(서열번호 2)을 코딩하고 있고 ATPgrasp(adenosine triphosphate (ATP)-grasp ligase) 도메인과 Dala-Dala-lig (D-alanine-D-alanine ligase) 도메인으로 이루어져 있다(도 1b). 이러한 결과는 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 다른 진핵조류(Condrus 속, Dinoflagellate 등)에서처럼 시노린 생합성에 2개의 유전자가 필요하며, 이는 남세균과 같은 원핵생물의 시노린 생합성 유전자 4개 중 2개씩 융합(fusion)된 형태를 보여 주었다. PySHSAB와 PySHSCD 유전자는 UV(UV-B)에 노출된 엽체에서 발현이 증가되었으며, 특히 PySHSCD 유전자는 UV(UV-B) 노출 2시간 후에 8배 이상 크게 발현양이 증가하였다(도 1c).
실시예 2. PySHSAB 및 PySHSCD 과발현 형질전환체 생산
방사무늬김 유래의 PySHSAB 및 PySHSCD를 과발현하는 난노클로롭시스 형질전환체를 생산하기 위해, PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 하기 표 1에 개시된 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭하여 난노클로롭시스 살리나(Nannochloropsis salina) 형질전환용 벡터의 BamHI/EcoRV 자리에 도입하여 형질전환 벡터를 완성하였다(도 2). 그 후 난노클로롭시스 살리나에 전기천공법(electroporation)을 이용하여 형질전환용 벡터를 도입하여 3주 동안 2.5mg/L의 블레오마이신이 첨가된 F2/N 배지에 배양하여 블레오마이신 저항성을 가지는 콜로니를 선발하였다. 선발된 콜로니는 PySHSAB 및 PySHSCD 프로브를 사용하여 서던 블롯 및 노던 블롯으로 PySHSAB 및 PySHSCD 유전자의 형질전환 및 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, PySHSAB 및 PySHSCD 유전자를 안정적으로 발현하는 265, 286, 287 라인을 선발하였다(도 3). 상기 PySHSAB 및 PySHSCD를 과발현하는 난노클로롭시스 살리나 형질전환체를 이하 NsSHSABCD 과발현 형질전환체로 명명하였다.
유전자 | 프라이머 | 염기서열 정보 5'-3' |
PySHSAB | PySHSAB-F (BamHI) | AAGGATCCATGCATATTACTCTTGACAAGACGGT (서열번호 5) |
PySHSAB-R (EcoRV) | AAGATATCCTAAACGCGGCGCACAAGAAGGA (서열번호 6) |
|
PySHSAB-F3 (Probe) | CTTCTTCGTCGCTCATGGCGTCGA (서열번호 7) |
|
PySHSAB-R3 (Probe) | TAGCCCGTGAACGTGCCAATGTC (서열번호 8) |
|
PySHSCD | PySHSCD-F (BamHI) | AAGGATCCATGACGTCCCCTGCGTCGGCC (서열번호 9) |
PySHSCD-R (EcoRV) | AAGATATCCTACCGCCCGAGGGCCTTCAT (서열번호 10) |
|
PySHSCD-F (Probe) | AACTACGGGTGGCAGTGGTGGAGA (서열번호 11) |
|
PySHSCD-R (Probe) | TTCAGCCATGAGCACCAGCACGCT (서열번호 12) |
실시예 3. NsSHSABCD 과발현 형질전환체로부터 MAAs 추출 및 분석
MAAs를 추출하기 위해, 먼저 건조된 방사무늬김(P. yezoensis) 대조구 및 난노클로롭시스 살리나(N. salina) 대조구(WT)와 난노클로롭시스 살리나 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287) 100mg을 100% 메탄올(HPLC-grade)에 각각 녹여 4℃의 암 조건에서 하루 동안 보관하였다. 15분 동안 5,000 x g, 4℃에서 원심분리한 후, 깨끗한 상층액을 새로운 튜브에 옮겼다. 메탄올 추출물은 회전진공농축기(rotary vacuum evaporator)를 이용하여 40℃에서 건조시켜 농축하였다. 농축된 물질들을 15㎖의 물:클로로포름(2:1, v/v)에 녹인 후 수용액상(aqueous phase)을 0.2μm 시린지 필터를 통해 여과하였다.
먼저 대조구인 P. yezoensis 및 N. salina(WT)와 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)에서 각각 추출된 물질이 MAAs인지를 확인하고자 분광광도계를 이용하여 MAAs 흡수 파장인 300-360nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과, N. salina 대조구에서는 MAAs 흡수 파장인 330nm에서는 피크가 검출되지 않은 반면, 또 다른 대조구인 P. yezoensis에서는 흡광 피크가 확인되었으나 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)가 대조구인 P. yezoensis에 비해 4배 이상의 높은 흡광 피크를 보였다(도 4).
NsSHSABCD 과발현 형질전환체의 추출물에서 생산된 MAAs의 함량을 분석하고자 YMC Triart C18 column(5μm, 250mm x 4.6mm)이 장착된 HPLC system(Agilent 1200 series, USA)을 이용하였다. 추출된 샘플 10㎕를 주입하였고, 물:아세토니트릴(95:5, v/v)을 이동상으로 사용하였다. 35℃에서 0.5㎖/min의 유속으로 330nm 파장에서 분석하였다. 그 결과, 포피라-334 표준물질 및 P. yezoensis 대조구에서 머무름 시간(retention time) 5분에 피크가 나타났으며, NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서도 동일한 머무름 시간에 피크가 나타났다(도 5). 이는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 포피라-334가 생산됨을 보여준다.
또한, 포피라-334 표준물질을 이용하여 대조구인 P. yezoensis와 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)의 추출물에서 포피라-334 성분을 정량 분석하였다. 그 결과, 야생형 대조구인 P. yezoenesis는 4.11±0.31mg/g DW(dry weight)의 포피라-334를 생산하였으며, NsSHSABCD 과발현 형질전환체인 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서는 대조구(P. yezoensis)보다 4-6배 높은 25.58±3.29, 19.86±2.42 및 21.35 3.31 mg/g DW의 포피라-334를 생산하는 것으로 확인되었다(도 6). 즉, 포피라-334 생산성이 지금까지 보고 대비 가장 높다는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 재조합으로 생산된 MAAs의 성능 검정
본 발명의 재조합으로 생산된 MAAs가 천연생산 MAAs와 동등한 기능을 가지는 확인하고자 하였다. 형질전환된 난노클로롭시스 살리나(N. salina)에서 생산된 MAAs의 UV 차단 효과를 확인하기 위해, 형질전환 세포주에 UV-B를 처리한 후 spot growth test를 진행하였다. 그 결과, UV-B 처리 30분까지 NsSHSABCD 과발현 형질전환체(NsSHSABCD 265, 286, 287)는 WT(N. salina)와 유사한 성장속도를 보였으나, UV-B 처리 1시간 이후부터 WT보다 높은 성장률을 보여주었다(도 7). 이는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체들이 생산하는 MMAs, 즉 포피라-334가 자외선을 흡수하여 세포에 내성을 부여했음을 시사하였다.
또한, NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 PSII 활성을 나타내주는 지표인 최대 광합성 효율(Fv/Fm)을 확인하였다. Fv/Fm 측정은 1×107 세포/㎖를 Handy Plant Efficiency Analyzer(Hansatech, King’Lynn, United Kingdom)을 사용하여 측정하였다. 그 결과, WT(N. salina)의 경우, UV-B에 1시간 30분 노출시키면 UV-B 처리 전보다 Fv/Fm이 50% 감소된 반면, NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287의 경우, UV-B에 1시간 30분 노출 시 Fv/Fm이 UV-B 처리 전보다 각각 34%, 30%, 28% 감소되었음을 확인할 수 있었고(도 8), 이러한 결과는 UV 처리 후 NsSHSABCD 과발현 형질전환체들이 대조구(WT)에 비해 자외선에 대한 세포의 피해가 적어서 높은 광합성능을 유지하고 있음을 나타낸다.
UV에 노출 시 ROS 생산으로 인해 산화스트레스가 발생할 수 있다. MAAs는 UV 차단 효과뿐만 아니라 UV에 노출 시 생산된 ROS를 제거하는 항산화 효과가 있다고 알려져 있다. 따라서 NsSHSABCD 과발현 형질전환체인 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서 생산된 MAAs의 UV에 대한 항산화 효과를 확인하기 위해서 UV-B 처리 후 형질전환체에서 ROS 수준을 측정하였다.
ROS를 측정하기 위해 대조구인 WT(N. salina)와 NsSHSABCD 과발현 형질전환체 세포 배양액(1×107 cells/㎖) 2㎖에 UV-B를 각각 1시간 30분 처리하였고, 5μM의 DCF-DA(2',7'-dichlorofluorescein-diacetate)를 첨가하여 25℃의 암 조건에서 1시간 동안 교반하였다. 세포의 형광은 분광광도계(Model LS55; PerkinElmer, Norwalk, CT, United States)를 이용하여 상온에서 485nm의 excitation 파장과 500 and 600nm의 emission 파장을 측정하였다. 520nm(F520)의 형광 세기(fluorescence intensity)는 상대적인 ROS 생산을 결정하기 위해 사용되었다. UV-B 처리 전 WT 94.26±4.05, NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286 및 NsSHSABCD 287에서는 각각 140.76±20.4, 172.23±22.93 및 161.81±8.37의 ROS가 측정되었다. UV-B 처리 후 WT은 ROS 양이 3.8배(361.1±37.19) 증가하였지만, 형질전환체 NsSHSABCD 265, NsSHSABCD 286, NsSHSABCD 287에서는 각각 1.2배(168.36±15.23), 1.5배(255.12±33.35), 1.1배(178.37±4.29)로 WT에 비해 소폭 증가하였다(도 9). 이러한 결과는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 과량 생성된 MAAs가 ROS 수준을 명백히 감소시키고 ROS 제거제로서 기능함을 나타낸다.
상기와 같이, UV-B 처리 후 spot growth test에서의 높은 생장속도, Fv/Fm 분석에서의 높은 광합성능, 세포 내 ROS의 발생 감소 등의 결과는 NsSHSABCD 과발현 형질전환체에서 생산된 MAAs가 UV 손상으로부터 세포를 효과적으로 보호하는 효과가 있음을 보여주는 것으로 천연 MAAs와 동등한 기능을 가지는 것을 나타낸다.
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<120> Method for producing Nannochloropsis transformant producing
mycosporine-like amino acids massively using gene from Pyropia
yezoensis
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<210> 1
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<212> PRT
<213> Pyropia yezoensis
<400> 1
Met His Ile Thr Leu Asp Lys Thr Val Gly Ala Gln Val Val Gln Pro
1 5 10 15
Lys His Phe Ala Ala Phe Val Ala Asp Val Gln Glu Ala Gly Val Thr
20 25 30
Val Pro Asp Gly Asp Val Thr Ala Ala Leu Glu Ala Val Leu Ala Ser
35 40 45
Pro Ala Leu Ser Thr Phe Leu Leu Arg Cys Ser Arg Ala Asp Val Phe
50 55 60
Asp Gly Ser Val Ala Ala Asp Phe Ser Gly Asn Ile Lys Asp Leu Arg
65 70 75 80
Met Leu Arg Ser Leu Lys Gln Leu Lys Tyr Phe Tyr Asn Leu Pro Ala
85 90 95
Gly Gln Leu Thr Gln Val Leu Ala Gly Val Val Ala Ser Gly Asp Ala
100 105 110
Val Ala Ala Lys Pro Trp Asn Ala Leu Ala Glu Arg Val Leu Ala Ser
115 120 125
Asp Glu Leu Cys Thr Gly Leu Ile Lys Asn Leu Ile Ile Gly Lys Thr
130 135 140
Ala Ser Ala Asp Leu Lys Ala Ile Tyr Glu Asp Asn Ala Glu Trp Leu
145 150 155 160
Leu His Asn Asp Pro His Ala Leu Tyr Pro Thr Ser Ile Tyr Arg Gln
165 170 175
Gly Ser Gly His Val Thr Ser Ser Glu Asp Ser Ser Arg Ile Glu Gly
180 185 190
Val Met Ser Thr Thr Ile Thr Thr Thr Ile Glu Ile Val Arg Asp Val
195 200 205
Leu Ser Pro Asp Asn His Gln Leu Arg Asp Met Tyr Lys Pro Leu Lys
210 215 220
Arg Cys Val Ala Val Val Asp Glu Arg Leu Asp Lys Leu Tyr Gly Thr
225 230 235 240
Thr Leu Ala Asn Tyr Phe Ala Ala His Asp Ile Glu Leu Val Gln Leu
245 250 255
Thr Tyr Arg Cys Met Glu Val Asp Lys Asp Ile Ser Thr Val Glu Lys
260 265 270
Met Leu Val Asp Leu Lys Gly Ser Arg Val Ser Arg Asn Glu Pro Val
275 280 285
Leu Ile Val Gly Gly Gly Val Met Ala Asp Val Gly Gly Phe Ala Cys
290 295 300
Ala Leu Tyr His Arg Asn Thr Pro Tyr Val Met Leu Cys Thr Ser Ile
305 310 315 320
Val Ser Gly Ile Asp Ala Gly Pro Ser Pro Arg Thr Cys Cys Asp Gly
325 330 335
Leu Gly Tyr Lys Asn Val Phe Gly Ala Tyr His Pro Pro Val Leu Thr
340 345 350
Leu Thr Asp Arg Gln Phe Phe Arg Thr Leu Glu Lys Gly Trp Ile Arg
355 360 365
His Gly Ile Ala Glu Ile Ile Lys Met Ala Val Thr Lys Asp Asn Thr
370 375 380
Leu Phe Glu Ala Leu Glu Glu Ala Gly Asp Lys Leu Val Thr Ser Lys
385 390 395 400
Phe Gly Ile Glu Gly Val Glu Ala Gly Ser His Phe Asp Thr Leu Ser
405 410 415
Glu Ser Ile Ile Ala Lys Ala Met Asp Gly Tyr Val Arg Ser Glu Tyr
420 425 430
Gly Asn Leu Trp Glu Thr His Gln Cys Arg Pro His Ala Tyr Gly His
435 440 445
Thr Trp Ser Pro Gly Phe Glu Leu Gln Ala Gly Leu Leu His Gly His
450 455 460
Ala Val Ala Ile Gly Met Gly Tyr Gly Ala Tyr Leu Ser Phe Leu Glu
465 470 475 480
Gly Trp Ile Ser Glu Val Asp Phe His Arg Ile Leu Lys Val Ile Ser
485 490 495
Thr Val Gly Leu Ser Leu Val His Pro Ile Leu Asp Asn Pro Asn Ser
500 505 510
Leu Trp Gln Ser Gln Val Lys Met Thr Glu Lys Arg Gly Gly Asn Leu
515 520 525
Cys Ala Pro Leu Pro Arg Gly Ser Ile Gly Lys Cys Gly Tyr Leu Asn
530 535 540
Asp Leu Thr Arg Glu Arg Leu Glu Ser Thr Leu Ile Asp Tyr Lys Glu
545 550 555 560
Leu Cys Lys Ala Tyr Pro Arg Glu Gly Ala Gly Ile Glu Pro His Cys
565 570 575
Arg Asp Val Gly Leu Glu Asp Pro Ser Thr Val Lys Gln His Ala Asp
580 585 590
Asn Ala Val His Ala Ser Ser Thr Glu Glu Pro Ser Ser Thr Glu Glu
595 600 605
Ala Pro Thr Ala Asn Gly Asn Gly Ala Ala Ala Asn Gly Asn Gly Glu
610 615 620
Val Tyr Asn Asp Trp Ile Ala Lys Gln Gln Val Ser Arg Asn Lys Gly
625 630 635 640
Ala Thr Ser Ser Ser Leu Met Ala Ser Met Val Asp Thr Thr Val Glu
645 650 655
Asp Thr Lys Thr Pro Pro Ala Phe Pro His Ala Thr Leu Phe His Glu
660 665 670
Gly Gly Glu Glu Tyr Ala Gln Ala Met Thr Thr Pro Ala Ser Ser Glu
675 680 685
Phe Val Lys Ile Ala Lys Asp Thr Val Ala Ala Glu Leu Phe Ala Pro
690 695 700
Cys Met Val Gly Ala Ile Glu Gly Gln Phe Leu Lys Met Val Ala Ser
705 710 715 720
Met Thr Lys Ala Lys Arg Val Leu Asp Ile Gly Thr Phe Thr Gly Tyr
725 730 735
Ser Ala Leu Ala Phe Ala Gly Gly Leu Pro Ser Asp Gly Gln Val Val
740 745 750
Ser Ile Glu Phe Asp Glu Lys Cys Ala Asp Val Ala Gln Lys Cys Phe
755 760 765
Asp Ala Ser Ala Asp Gly Ser Lys Ile Lys Leu Val Arg Gly Asp Ala
770 775 780
Met Lys Val Val Thr Glu Met Ala Asp Ala Gly Glu Gln Phe Asp Ile
785 790 795 800
Val Phe Leu Asp Ala Asp Lys Val Asn Tyr Ala His Tyr Tyr Glu Ala
805 810 815
Gly Leu Lys Met Leu Ala Pro Gly Gly Thr Ile Leu Ala Asp Asn Ala
820 825 830
Leu Cys Ser Leu Val Tyr Ala Asp Asp Asp Pro Val Arg Leu Ala Leu
835 840 845
His Ala Phe Ala Gln Lys Val Arg Ala Asp Thr Arg Val Glu Gln Val
850 855 860
Met Leu Thr Val Arg Glu Gly Ile Leu Leu Val Arg Arg Val
865 870 875
<210> 2
<211> 923
<212> PRT
<213> Pyropia yezoensis
<400> 2
Met Thr Ser Pro Ala Ser Ala Arg Ala Asn Arg Asn Leu Val Gln Thr
1 5 10 15
Val Leu Arg Leu Leu Asp Ala Leu Phe Trp Ser Leu Leu Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Gly Val Leu Leu Leu Ala Ser Arg Pro Val Ala Arg Thr Pro Thr
35 40 45
Gly Ile Ala Ala Gly Lys Thr Val Leu Val Thr Thr Gly Arg Gln Ala
50 55 60
Lys Thr Val His Val Ile Arg Ala Leu Lys Ala Val Gly Ala Thr Val
65 70 75 80
Ile Val Thr Asp Tyr Asp His Val Ser Ala Ser Ala Val Ser Thr Ala
85 90 95
Cys Asp His Phe Val Val Leu Pro Ala Leu Asp Val Gly Ala Leu Asp
100 105 110
Ala Trp Val Asp Ala Phe Gly Ala Leu Leu Val Glu His Lys Val Asp
115 120 125
Met Val Val Pro Val Ser Thr Ile Asn Glu Ala Leu Phe Leu Gly Val
130 135 140
Ala Arg Asp Arg Leu Ala Pro Lys Leu Pro His Val Glu Trp Leu Cys
145 150 155 160
Thr Gly Leu Asp Asn Val Leu Arg Leu Asp Asp Arg Glu Arg Phe Ser
165 170 175
Ala Thr Cys Arg Gln Tyr Gly Val Pro Ala Pro Ala Ser Gly Leu Val
180 185 190
Thr Ala Arg Glu Gln Val Pro Pro Ser Ser Ser Gln Pro His Gly Ile
195 200 205
Ile Val Lys Arg Met Glu Ser Ser Val Asn Arg Asp Glu Glu Ile Val
210 215 220
Pro Val Ala Pro Gly Ala Pro Leu Pro Glu Val Val Lys Pro Ser Pro
225 230 235 240
Thr Asp Ala Trp Gln Trp Gln Gln Met Ile Arg Gly Ala Glu Tyr Ser
245 250 255
Val Trp Tyr Val Cys Val Asn Gly Ala Val Thr Phe Ser Ala Cys Tyr
260 265 270
Val Ser Gln Pro Asp Leu Val His Phe Asp Ala Val Pro Thr Pro Ala
275 280 285
Asp Val Asp Thr Pro Leu Arg Ala Leu Ile Arg Gly Met His Leu Ser
290 295 300
Gly Gln Tyr Ala Phe Asp Phe Ile Arg Asp Asp Glu Ser Gly Val Pro
305 310 315 320
Tyr Val Ile Glu Cys Asn Pro Arg Ala Ser Ser Ile Leu Glu Thr Val
325 330 335
Ser Cys Thr Pro Leu Trp Gly Glu Ala Phe Phe Gly Val Asp Val Ser
340 345 350
Ala Arg Arg Thr Thr Gln Asp Val Gly Phe Val Tyr His Ala Asn Cys
355 360 365
Trp Pro Trp Thr Ala Arg Thr Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Ala Asp Pro
370 375 380
Leu Pro Phe Phe Ala Ala Glu Ile Ala Trp Pro Leu His Ala Ile Gln
385 390 395 400
Thr Ala Gly Leu Gly Asp Ala Gly Tyr Arg Lys Ile Asp Val Asn Ile
405 410 415
Cys Lys Ile Ile Ile Asp Gly Pro Ser Ala Pro Arg Asn Ile Gly Ala
420 425 430
Phe Glu Asp Ala Ser Gln Ala Ala Lys Leu Thr Val Leu Gly Arg Ala
435 440 445
Leu Glu Phe Val Asp Thr Val Tyr Ile Asp Ala Ala Val Pro Asn Val
450 455 460
Ala Ala Val Val Ala Val Ala Thr Lys Ala Ser Cys Thr Pro Leu Leu
465 470 475 480
Phe Gln Leu Gly Gly Val Pro Ser Arg Ala Ala Val Thr Ala Ala Leu
485 490 495
Pro Pro Ile Gln Tyr Val Ala Thr Pro Glu Asp Leu Gly Ala Leu Val
500 505 510
Ala Thr Ser Glu Leu Val Ala Pro Thr Arg Val Leu Leu Ser Asp Ala
515 520 525
Ala Ser Val Val Leu Gly Phe Asp Ala Glu Leu Thr Phe Leu Ala Pro
530 535 540
Arg Ser Pro Val Ala Pro Tyr Thr Tyr Tyr Arg Ile Pro Leu Arg Arg
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Leu Lys Val Leu His Val Met Gly Ser Cys Thr Ser Lys Tyr Tyr Glu
565 570 575
Thr Val Ser Ala Tyr Tyr Gly Phe Asp Cys Ile Ala Ser Thr Thr Asp
580 585 590
Asp Val Arg Tyr Glu His Val Val Gly Tyr Val His Leu Thr Gly Glu
595 600 605
Trp Ser Val Ala Val Gly Lys Asp Ala Gln Tyr Met Arg Glu Lys Ala
610 615 620
Pro Arg Leu Ser Leu Ala Gln Ala Leu Ala Thr Phe Glu Ser Leu Ser
625 630 635 640
Leu Asp Leu Met Ile Pro His Met Phe Asp Tyr Ala Gly Leu Thr Ala
645 650 655
Tyr Arg Ser Val Phe Thr Met Leu Asp Leu Pro Thr Val Gly Cys Ser
660 665 670
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675 680 685
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Gly Asp Lys Pro Thr Met Pro Leu Pro Phe Val Ile Lys Pro Thr Glu
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725 730 735
Pro Ala Ala Leu Glu Ala Ala Phe Arg Phe Gly Asp Glu Val Met Val
740 745 750
Glu Gln Phe Ile Pro Leu Gly Arg Glu Leu Arg Val Ala Val Val Glu
755 760 765
Thr Pro Ala Gly Gly Phe Glu Leu Leu Pro Met Val Glu Tyr Phe Leu
770 775 780
Pro Ala Asp Lys Pro Ile Arg Leu Ser Ala Asn Lys Leu Thr Thr Asp
785 790 795 800
Ser Thr Gly Gln Pro Ser Gly Phe Ala Lys Thr Asp Arg Gln Val Pro
805 810 815
Ala Asp Val Asp Pro Val Leu Lys Glu Lys Leu Tyr Lys Met Ala Met
820 825 830
Val Ala His Arg Ala Thr Asp Cys Ala Asp Tyr Ser Ile Tyr Asp Val
835 840 845
Arg Val Asp Pro Ala Gly Glu Pro Tyr Met Leu Glu Ser Cys Leu Tyr
850 855 860
Cys Ser Phe Ser Phe Arg Ser Val Leu Val Leu Met Ala Glu Ala Ala
865 870 875 880
Gly Lys Lys His Pro Gln Leu Phe Val Glu Phe Ser Glu Arg Ala Val
885 890 895
Gly Arg Lys Ser Ala Ala Val Ala Ala Arg Ala Arg Gly Gly Ala Ala
900 905 910
Pro Gln Glu Phe Gly Met Lys Ala Leu Gly Arg
915 920
<210> 3
<211> 2637
<212> DNA
<213> Pyropia yezoensis
<400> 3
atgcatatta ctcttgacaa gacggtaggt gcgcaggtgg tgcaacccaa gcacttcgcc 60
gcgtttgtgg ccgacgtcca ggaggctggc gtgactgtgc ctgatggtga cgtgacggcc 120
gccctggagg cggtgctggc ctcgcccgcc ctttcaacct ttctgctgcg ctgctcccgg 180
gcggatgtct ttgacggctc ggtcgctgcc gacttttcgg gcaacatcaa ggacctacgc 240
atgctgcggt cgctcaagca gctgaagtac ttttacaacc tgcctgctgg gcagctgact 300
caggtgctgg cgggtgtggt ggcgtctggg gatgcagtgg cggccaagcc gtggaatgcc 360
ctggccgagc gggtgctcgc cagcgacgag ctgtgcactg ggctgatcaa gaacctgatc 420
attggcaaga cggccagcgc cgacctcaag gccatctatg aggacaatgc tgagtggctg 480
ctgcacaatg accctcacgc gctgtatccg acgtctatct accgccaggg cagcggccac 540
gtgacgtcgt cggaagactc atctcgcatt gagggcgtca tgtccactac catcaccacc 600
actattgaga ttgttcggga cgtgctcagc cccgacaacc accaactccg ggatatgtac 660
aagcctctca agcgctgcgt ggcggttgtt gatgagcgcc tggacaagct gtacgggacg 720
acgctggcca actactttgc cgcgcacgac attgagcttg tgcaactgac ctaccggtgc 780
atggaggtgg acaaggacat ctctacagtg gagaagatgc tggtggacct gaagggcagc 840
cgcgtctctc gcaatgagcc cgtccttatt gtgggcggcg gtgtcatggc cgacgttggt 900
ggctttgctt gcgcccttta ccaccgcaac actccctatg tcatgttgtg cacgtctatt 960
gtgtcgggta ttgacgctgg gccgtccccg cggacttgct gtgatgggct tggctacaag 1020
aatgtgtttg gcgcttacca ccccccggtg ctgaccctga cggaccgcca gttcttccgt 1080
actttggaga agggctggat tcgccacggc attgctgaga ttatcaagat ggccgtcacc 1140
aaggacaaca ccctctttga ggctttggag gaggcgggtg acaagctcgt aacgtccaag 1200
tttgggattg agggggtgga ggccggctcc cactttgaca ccctgtcgga gagcatcatt 1260
gccaaggcca tggacggcta cgtgcggtcc gagtatggta acctatggga gacccaccag 1320
tgccgaccgc acgcctacgg tcacacttgg tccccaggct ttgagcttca ggcggggctc 1380
ctgcacggcc acgccgtcgc cattggcatg ggctacggcg cctacctctc cttcctggag 1440
ggttggatct ctgaggtgga ctttcaccgc attctcaagg tcatctctac cgtgggtctg 1500
tcgctggttc accccattct ggacaacccg aacagcctgt ggcagtcgca ggtgaagatg 1560
acggagaagc gcggtggcaa cctgtgcgcc cctctgccgc gtgggtccat tggcaagtgc 1620
ggatacctga acgacctcac tcgggagcgg ctggagtcga cgctcatcga ctacaaggag 1680
ctgtgcaagg cttacccgcg ggagggtgcc gggattgagc cacactgccg cgatgtgggg 1740
ctggaggacc catccacggt gaagcagcat gctgacaatg cagtgcacgc ttcttccacc 1800
gaggagccct cttcgactga ggaggcccca accgccaatg gcaatggtgc cgctgccaac 1860
ggcaatggcg aggtgtacaa tgactggatt gcgaagcagc aggtgtcgcg caacaagggc 1920
gccacttctt cgtcgctcat ggcgtcgatg gtggacacta cggttgagga cacgaagaca 1980
ccaccggcct ttccccacgc caccctgttc cacgagggcg gcgaggagta cgcccaggcc 2040
atgaccacac ccgcctcatc cgagtttgtc aagattgcta aggacacggt cgcagcggag 2100
ctctttgctc cttgcatggt cggggcgatt gaaggccagt tcctgaagat ggtggcgtcc 2160
atgaccaagg ccaagcgcgt gctcgacatt ggcacgttca cgggctactc ggcgctggcc 2220
tttgccggcg ggcttccctc tgatggccag gtggtttcca tcgagtttga cgaaaagtgc 2280
gcggatgtgg cgcagaagtg ctttgacgcc tcggccgacg ggagcaagat caagctcgtc 2340
cgcggtgacg ccatgaaggt ggtgacagag atggctgacg caggagagca gtttgacatt 2400
gtcttcctgg acgcggacaa ggtcaactac gcacactact acgaggcggg tcttaagatg 2460
ctggcgccag gcggcacgat tcttgccgac aacgcgctgt gctcgctggt gtacgctgac 2520
gatgacccgg tgcggctagc gctccacgca tttgcccaga aggtgcgggc agacacaagg 2580
gtagagcagg tgatgctcac cgtccgcgag ggtatccttc ttgtgcgccg cgtttag 2637
<210> 4
<211> 2772
<212> DNA
<213> Pyropia yezoensis
<400> 4
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attgtcacgg actatgacca cgtcagcgcg tcggcggtga gcaccgcgtg cgaccacttt 300
gtggtgctgc ccgccctgga tgtgggcgcc ctcgacgcct gggttgacgc gtttggcgcc 360
ctcctcgtgg agcacaaggt ggacatggtg gtgcccgtca gcaccatcaa tgaggccctc 420
ttcctgggag tggcgcggga ccggctggct cccaagttgc cccacgttga gtggttgtgc 480
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tcgtcgtcgc agccgcacgg catcattgtc aagcgcatgg agtcgtcggt caaccgggat 660
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tacgtcattg agtgcaaccc gcgggcgtcg tccatcctcg agacggtgtc gtgcacgccg 1020
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<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 5
aaggatccat gcatattact cttgacaaga cggt 34
<210> 6
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 6
aagatatcct aaacgcggcg cacaagaagg a 31
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<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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cttcttcgtc gctcatggcg tcga 24
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 8
tagcccgtga acgtgccaat gtc 23
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 9
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
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<212> DNA
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<220>
<223> primer
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aactacgggt ggcagtggtg gaga 24
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 12
ttcagccatg agcaccagca cgct 24
Claims (10)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSAB 단백질.
- 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 MAAs(Mycosporine-like amino acids) 생합성을 조절하는 PySHSCD 단백질.
- 제1항 또는 제2항의 단백질을 코딩하는 유전자.
- 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
- 제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 숙주세포.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는, 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하기 위한 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 MAAs는 포피라-334(Porphyra-334, mycosporine-glycine-threonine)인 것을 특징으로 하는 조성물.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시키는 단계를 포함하는, 숙주세포에서 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 방법.
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김(Pyropia yezoensis) 유래의 PySHSAB 단백질을 코딩하는 유전자 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 방사무늬김 유래의 PySHSCD 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 난노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 형질전환시켜 PySHSAB 단백질 코딩 유전자 및 PySHSCD 단백질 코딩 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는, MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체의 제조 방법.
- 제9항의 방법에 의해 제조된 MAAs(Mycosporine-like amino acids)를 생산하는 난노클로롭시스 속 미세조류 형질전환체.
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ID=80325420
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WO2019094447A2 (en) | 2017-11-07 | 2019-05-16 | Algenol Biotech LLC | Production of mycosporine-like amino acids in cyanobacteria |
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2020
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Title |
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ACS SYNTH. BIOL. 2019, 8, 346-357 [DOI: 10.1021/ACSSYNBIO.8B00388] |
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GENBANK: OSX70339.1 |
PNAS, JULY 17, 2017, 114 (31), E6361-E6370 [DOI/10.1073/PNAS.1703088114] |
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