KR101986770B1 - 사이토네마 유래 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사이토네마 유래 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 본 발명은 자외선, 황색 그리고 녹색을 흡수할 수 있는 새로운 피토크롬 광수용체를 발굴한 것으로서 녹색을 식물의 생장과 분화의 정보원으로 이용하지 못하는 조류와 고등식물 등의 광합성 식물에 도입함으로써 광형태형성과 열형태형성을 제어할 수 있는 방법을 제공함으로써 아파트형 식물공장과 온난화 환경에서 맞춤형 작물의 재배와 생산성 제고에 기여할 수 있는 있을 뿐만 아니라 광의학, 생체이미징, 세포학, 바이오에너지, 바이오매스 제고용 생명공학 분야 등 여러 응용 분야에서 유용하다.

Description

사이토네마 유래 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질 및 이의 용도{Near-UV/Yellow light photointerconvertible phytochrome Spr6432 protein from Scytonema and uses thereof}

본 발명은 사이토네마 유래 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 남세균 사이토네마 (Scytonnema) PCC 10023 유래의 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질과 상기 단백질 점돌연변이체 Spr6432 C257S에 관한 것이다.

빛은 광합성을 통해 식물체에 에너지를 제공할 뿐만 아니라 외부 자극원으로서 식물의 환경 적응 및 생존에 직접적인 영향을 준다. 산소발생형 광합성 생물은 변화하는 빛 환경 조건에서 최적의 광합성을 수행한다. 예를 들어 미세조류에서는 낮은 광 조건에서는 빛을 향해서 이동하는 양성 주광성을, 높은 광 조건에서는 빛으로부터 멀어지는 음성 주광성을 보인다(Song JY 등. 2011 Proc Natl Acad Sci 108:10780-10785). 엽록체를 갖는 육상식물에서는 빛의 세기에 따라 세포내 엽록체가 재배열됨으로써 광합성을 최적화함과 동시에 과다한 광으로부터 피해를 최소화한다(Banas 등 2013. J Exp Bot 63, 1559-1574).

식물에서 볼 수 있는 광수용체로서 적/원적외선을 감지하는 피토크롬(phytochrome), 청색을 감지하는 크립토크롬(cryptochrome)과 포토트로핀(phototropin), 자외선 B를 감지하는 자외선 수용체(UVR8)가 알려져 있다. 식물과 조류의 세포질에 존재하는 피토크롬은 빛의 질적인 면을 인지하여 분자적인 반응을 야기한다(Kami 등 2010. Current Topics in Developmental Biology 91, 29-66). 피토크롬은 약 120 kDa의 단백질이며 N-말단에 빛을 인지하는 부분으로서 발색단(chromophore)이 결합하는 부위를 포함하여 PAS-GAF-PHY 도메인을 갖고, C-말단 부위에 핵으로의 이동에 관여하는 시그널 도메인(nuclear localization signal)과 히스티딘 키나아제 도메인(histidine kinase domain)을 갖는다. 고등식물 피토크롬의 발색단은 선상 테트라피롤(open-chain tetrapyrrole)인 피토크로모빌린(phytochromobilin)이다(Matsushita 등 2003. Nature 424, 571-574). 피토크롬은 적색광과 원적색광을 흡수하여 발아, 하배축 길이신장, 광합성 기구 발달, 개화와 같은 광주기와 관련된 기작을 조절한다. 피토크롬 신호전달 경로는 피토크롬 상호작용인자(phytochrome interacting factors, PIFs)를 매개로 이루어진다. 다수의 PIFs 중에서 PIF4로 알려진 전사인자는 고온조건에서 하배축과 잎자루의 길이 생장을 촉진하며 잎의 하편생장을 유도함으로써 식물이 고온 조건에서도 적응할 수 있는 냉각효과(cooling effect)를 유도하기도 한다(Quint 등 2016. Nature Plants 2, 15190).

남세균 중 시네코시스티스 속(Synechocystis sp.) PCC6803에서 알려진 빌린 광수용체는 Cph1(cyanobacteria phytochrome 1; slr0473 위치) 및 Cph2(cyanobacteria phytochrome 2; sll0821 위치)이다. Cph1은 식물의 피토크롬과 유사한 구조를 갖는 반면 Cph2는 PAS 도메인이 없이 GAF-PHY 도메인으로 구성되어 있다.

피토크롬 이외에도 PAS나 PHY 도메인이 결핍되어도 GAF 도메인이 독립적으로 광수용체 역할을 하는 자외선, 청색, 녹색, 오렌지 및 적색을 흡수하는 광수용체 시아노박테리오크롬(cyanobacteriochrome, CBCR)이 다수 보고되었다(Rockwell NC 등. 2012. Biochemistry 51:1449-1463).

남세균 노스톡 펑티포르메(Nostoc punctiforme ATCC 29133)에서 적색/원적외선 피토크롬과는 다른 새로운 유형의 남세균 피토크롬이 보고되었다. TP1(trichromatic phytochrome 1; NpF1833 유전자 위치) 이라고 불리는 남세균 피토크롬은 전형적인 Cph1 또는 Cph2와는 달리 피코시아노빌린(phycocyanobilin) 발색단이 결합하는 Cys-His 모티프(motif) 대신에 Cys-Cys 잔기를 가지고 있는 이중 시스테인 피토크롬(dual-Cys phytochrome)으로, 자색/적색 광호변성 특성을 보인다. 또한 TP1은 자색 흡수형에서 적색 흡수형으로의 전환 과정에서 녹색 흡수형의 중간형이 생성된다는 점에서 기존의 알려진 피토크롬과 차별성을 보인다(Rockwell 등 2011. Proc Natl Acad Sci 108, 11854-11859). TP1과 유사한 그룹에 해당하는 Tpr0787 피토크롬이 남세균 톨리포스릭스에서 보고되었다(한국등록특허 제10-1669484). Tpr0787 피토크롬은 TP1과 달리 자색/황색 광호변성을 보이며 C258S 점돌연변이체는 녹색/적색 광호변성을 보인다.

이와 같이 적색/원적외선(예, Cph1과 2) 및 자색/녹색/적색(예, TP1) 광호변성 피토크롬이 발견되었으나 그 외의 빛에 의해서 광호변되는 피토크롬에 대해서는 밝혀지지 않았다. 특히, 본 발명에서와 같이 TP1 오쏠로그로서 이중 시스테인을 가지면서 자외선/황색 광호변성을 갖는 피토크롬과 두 번째 시스테인이 세린으로 치환될 경우 광호변성 특성이 소실되는 피토크롬에 대해서는 밝혀진 바가 전혀 없다.

한편, 한국등록특허 제1669484호에는 '남세균 유래 자색/오렌지색 광호변성 피토크롬 TpR0787 단백질 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1523516호에는 '남세균 유래 자외선/녹색 광호변성 색소 단백질 및 이의 용도'가 개시되어 있으나, 본 발명의 '사이토네마 유래 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 남세균 사이토네마(Scytonema) PCC10023으로부터 3개의 피토크롬 광수용체 후보 중에서 유전자 위 Spr6432가 암호화하는 단백질이 N-말단으로부터 C-말단으로 PAS, GAF, PHY, 히스티딘 프로틴 키나제(HisKA)와 HATPase 도메인으로 구성되어 있으며, 아미노산 서열 상동성 기반 분자 계통도 분석 결과 노스톡 톨리포스릭스 Tpr078과 펑티포르메 유래 TP1 NpF1833과 시스터 그룹을 형성하는 것을 확인하였으며, Spr6432는 TP1과 같이 파이코시아노빌린(phycocyanobilin, PC) 발색단이 공유결합하는 GAF 도메인의 CH 모티프에 해당하는 256과 257번 아미노산 잔기에 두개의 시스테인(CysCys)를 가지고 있으며, 자외선(392 nm)과 황색(573 nm)에 의해서 광가역적 형태변환이 일어남을 확인하였다. 또한, 257번 시스테인을 세린으로 치환한 변이단백질 Spr6432 C257S은 자외선 대신에 녹색(545 nm)을 흡수하는 형으로 흡수 피크 전이가 일어났지만 자외선을 흡수하는 형태로의 광호변성이 일어나지 않음을 규명하였고, 이로써 본 발명에서 새롭게 분리한 Spr6432의 C257이 칼라튜닝에 관여함을 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 사이토네마(Scytonema) PCC10023 유래의 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Spr6432 단백질의 257번째 아미노산이 시스테인에서 세린으로 돌연변이된 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 자외선, 황색 또는 녹색을 흡수할 수 있는 광합성 독립영양성 형질전환 숙주세포를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 자외선, 황색 또는 녹색을 흡수할 수 있는 광합성 독립영양성 형질전환 숙주세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 Spr6432 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 Spr6432 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Spr6432 단백질을 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명은 자외선, 황색 그리고 녹색을 흡수할 수 있는 새로운 피토크롬 광수용체를 발굴한 것으로서, 녹색을 식물의 생장과 분화의 정보원으로 이용하지 못하는 조류와 고등식물 등의 광합성 식물에 도입함으로써 광형태형성과 열형태형성을 제어할 수 있는 방법을 제공함으로써 아파트형 식물공장과 온난화 환경에서 맞춤형 작물의 재배와 생산성 제고에 기여할 수 있는 있을 뿐만 아니라 광의학, 생체이미징, 세포학, 바이오에너지, 바이오매스 제고용 생명공학 분야 등 여러 응용 분야에서 유용하다.

도 1은 사이토네마 유래 Spr6432 단백질의 도메인 구조와 CH 모티프 해당 잔기에 두 개의 시스테인(C256C257)이 있음을 보여주는 것이다. A, Spr6432 단백질은 1개의 GAF 도메인을 갖는 전형적인 피토크롬이다. B, Spr6432와 TpR0787, 그리고 남세균(Cph1, CphP 및 NpF1183), 세균(DrBphP) 및 애기장대(AtPhyA) 피토크롬의 GAF 도메인 CH 모티프 주변 아미노산 서열을 보여주는 것으로 Spr6432, TpR0787과 NpF1183은 애기장대와 Cph1에서 볼 수 있는 CH 모티프에 두 개의 시스테인을 갖는 이중 CC를, 그리고 N-말단에 발색단이 결합하는 시스테인을 갖는 세균성 피토크롬 CphP, Agp1과 DrBphP는 C 대신 라이신, 발린, 메티오닌이 있다. C, Spr6432을 포함한 피토크롬 간의 유사성 계통도를 보여주는 것이다. Agp1, Agrobacterium tumefaciens F2 WP_010971984.1; AtPhyA, Arabidopsis thaliana AAC33219.1; DrBphP, Deinococcus radiodurans WP_010888498.1; Cph1, Synechocystis sp. PCC6803 BAK51092.1; CphP, Tolypothrix sp. PCC 7601 AAL76161.1; NpF1183, Nostoc punctiforme WP_012407929.
도 2는 빌리버딘(biliverdin, BV), 피코시아노빌린(phycocyanobilin, PCB), 피토크로모빌린(phytochromobilin, PΦB)를 생산하는 재조합 대장균에서 분리된 Spr6432 PAS-GAF-PHY 도메인을 포함하는 광센서 모듈(photosensory module, A)의 쿠마시 브릴리언트 블루(CBB) 염색과 아연(Zn²⁺)-의존적인 형광발광(B)을 보여 주는 것이다.
도 3는 재조합 사이토네마 Spr6432의 광센서모듈의 분광학적 특성을 보여주는 것이다. BV, PCB 그리고 PΦB를 생산하는 재조합 대장균으로부터 분리된 재조합 His₆ PAS-GAF-PHY의 흡수(A)와 이의 흡수 차이(B) 스펙트럼이다.
도 4는 재조합 사이토네마 Spr6432의 257번 아미노산 시스테인이 세린으로 치환된 단백질 변이체 Spr6432 C257S의 흡수 스펙트럼이다.
도 5는 과산화수소(H₂O₂, A)와 이오도아세트아미드(iodoacetamide, IAM, B)가 재조합 사이토네마 Spr6432의 광센서모듈의 분광학적 특성에 미치는 효과를 보여주는 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 사이토네마(Scytonema) PCC10023 유래의 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질을 제공한다.

용어 '피토크롬(phytochrome)'은 식물의 적색광 광수용체로, 빛을 흡수하여 흡수 스펙트럼의 형태가 가역적으로 변하는 식물체 내의 색소 단백질로서 균류 이외의 모든 식물에 들어 있는 단백질이다. 피토크롬은 간혹 근적외선에 활성을 띠기도 하나 대부분의 경우 적색광에 의해 활성을 띠고 식물 유전자 발현 조절, 종자 발아 유도, 음지회피 반응 등을 매개하는 것으로 알려져 있다. 피토크롬은 2개의 뚜렷한 스펙트럼의 형태인 Pr 형태를 흡수하는 적색광(R, λmax = 660nm) 및 Pfr 형태를 흡수하는 원-적색광(FR, λmax = 730nm)의 형태가 있다. 식물 피토크롬의 적색광/원적색광 가역적 광변환에 비해, 남세균 피토크롬은 UV 근처로부터 적색광 부분까지 매우 다양한 흡광 특성을 나타낸다.

용어 '광호변성'은 조명(照明)되고 있는 동안에 한 물질의 빛깔이 가역적인 변화를 보이는 현상을 말한다.

본 발명에 따른 Spr6432 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 자외선/황색 광호변성 특성을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 상기 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Spr6432 단백질의 257번째 아미노산이 시스테인에서 세린으로 돌연변이된 Spr6432 C257S 변이체 단백질 및 상기 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명의 상기 Spr6432 C257S 변이체 단백질은 Spr6432 단백질의 광센서 모듈(도 2) 내 GAF(GTPase-activating protein) 도메인에 있는 두 개의 시스테인 잔기 중 두 번째 시스테인이 세린으로 치환된 점돌연변이체로, Spr6432 단백질과 달리 녹색을 흡수하는 분광학적 특성을 보여주었다.

본 발명은 또한, 상기 Spr6432 단백질 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 발명에서, 상기 Spr6432 단백질 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자 서열은 재조합 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 용어 "재조합 발현 벡터"는 세균 플라스미드, 파아지, 효모 플라스미드, 식물 세포 바이러스, 포유동물 세포 바이러스, 또는 다른 벡터를 의미한다. 대체로, 임의의 플라스미드 및 벡터는 숙주 내에서 복제 및 안정화할 수 있다면 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터의 중요한 특성은 복제 원점, 프로모터, 마커 유전자 및 번역 조절 요소(translation control element)를 가지는 것이다.

Spr6432 단백질 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자 서열 및 적당한 전사/번역 조절 신호를 포함하는 발현 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 발현 벡터는 번역 개시 부위로서 리보좀 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 자외선, 황색 또는 녹색을 흡수할 수 있는 광합성 독립영양성 형질전환 숙주세포를 제조하는 방법을 제공한다.

재조합 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 그 예로는 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinothricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), G418, 블레오마이신(bleomycin)과 같은 항생제 내성 유전자, aadA 유전자 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., J. Mol . Biol., 166:557-580(1983)) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 유전자총-매개 형질전환 방법(bombardment), 아그로박테리움-매개 형질전환법, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 DEAE-덱스트란 처리법 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 자외선, 황색 또는 녹색을 흡수할 수 있는 광합성 독립영양성 형질전환 숙주세포를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 숙주세포는 남세균 세포, 녹조류 세포 또는 식물 세포일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 Spr6432 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 Spr6432 단백질을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Spr6432 단백질을 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 자외선 차단용 화장료 조성물은 사이토네마(Scytonema) PCC10023 유래의 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질을 유효성분으로 포함하며, 상기 Spr6432 단백질은 자외선을 흡수하는 능력이 있으므로, 흡수형 자외선 차단제 제품의 원료로 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에는 상기 유효성분 이외에 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 크림,로션, 스프레이타입, 고형타입, 젤타입, 무스타입, 파운데이션, 또는 파우더타입의 화장품 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로 히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

게놈 DNA 분리 및 광센서모듈 클로닝

게놈 DNA 분리: 지수 생장기의 사이토네마 세포를 원심분리(3,500 rpm, 15분, 4℃)하여 수확한 후 200 ㎕ TEN 완충액(10 mM Tris-Cl, 150 mM NaCl, 100 mM EDTA)에 현탁시켰다. 여기에 10 ㎕ 리소자임(20 mg/ml)을 첨가하여 37℃에서 15분 반응시켜 세포를 파괴한 뒤, 10 % SDS 5 ㎕을 첨가하여 흔들어 주었다. 이 반응물질에 5 ㎕ 프로테아제 K(20 ug/ml)를 첨가하여 60℃에서 1시간 반응시킨 후 400 ㎕ 페놀을 첨가한 뒤, 원심분리(3,500 rpm, 3분, 상온)하여 상등액을 새 튜브에 옮겼다. 상등액과 동일량의 페놀:클로로포롬:아이소아밀 알코올을 첨가하여 상온에서 3-5분 흔들어 주었다. 다시 원심분리(3,500 rpm, 3분, 상온)한 후, 얻어진 상등액은 20 ㎕ 3M 소듐 아세테이트(pH 5.2), 400 ㎕ 에탄올과 혼합한 뒤, 원심분리(3,500 rpm, 3분, 상온)를 통해 DNA만 얻었다.

광센서모듈 클로닝 : N 말단, PAS, GAF, PHY 도메인의 단백질 서열이 보존된 야생종과 시스테인 257이 세린으로 치환할 수 있도록 프라이머(표 1)를 제작하였으며, 이때 양 말단에 어댑터로서 제한효소 인식부위를 삽입하였다. 사용된 제한효소는 클로닝하고자 하는 염기서열 내에 존재하지 않는 것으로 선택하였으며, 본 실험에는 XhoI과 PstI이 사용되었다. 제작된 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응을 통하여 다량의 염기서열 절편을 얻었다. 단백질 발현용 대장균에 형질전환에 앞서 DH5a 대장균에 서브클로닝을 하여 벡터 pBAD/mycHisC(Invitrogen, USA)와 중합효소 연쇄반응을 통해 얻어진 GAF 도메인의 염기서열을 라이게이션하고 형질전환하여 재조합된 플라스미드를 얻었다. 플라스미드를 추출하고 염기서열분석법을 통해 제작된 플라스미드내에 염기서열이 정확하게 삽입되었는지 확인하였다. 단백질 서열이 보존되었는지 최종 확인한 후, BV, PCB, PΦB 크로모포어를 형성하는 단백질 발현용 대장균(LMG-pPL-BV, -PCB, 그리고 PΦB)에 형질전환하였다(Cho SM et al. 2015. J Biol Chem 290, 28502-28514).

Primer	Direction	Sequence (3’ to 5’)(서열번호)
Spr6432 wild type	F	CAACTCGAGAATGAGCCAATCTGAAGTCAC(3)
	R	CAAGAATTCCTCTAACTCCAGATTCATTCT(4)
Spr6432 C257S	F	TCACCCCTGCTCTGTTGA(5)
	R	TCAACAGAGCAGGGGTGA(6)

BV, PCB, PΦB 생성 대장균에서 Spr6432 광센서모듈 발현 및 순수분리

형질전환된 단백질 발현용 대장균은 RM 액체배지(2% 카자미노산; 1X M9 염; MgCl₂ 1mM; 0.2% 글루코스; 티아민 0.1mM) 100ml에 항생제 앰피실린(200ug/L)와 카나마이신(50ug/L)을 첨가하고 OD₆₀₀=0.1이 되도록 접종하여 OD₆₀₀=0.4~0.6이 될 때까지 37℃에서 배양하였다. RM 배지 100mL에서 키운 단백질 발현용 대장균을 LB 배지 500mL에 섞어주고 FAC 25uM, ALA 25uM, IPTG 0.1mM, 앰피실린 200㎍/L, 카나마이신 50㎍/L를 첨가하여 28℃에서 1시간 배양하였다. 0.2% 아라비노스를 처리하여 28℃에서 5시간 배양한 뒤, 7000rpm, 4℃에서 원심분리하여 단백질 발현용 대장균을 수확하고 -70℃에 세포를 냉동보관하였다. 단백질을 추출하는 모든 과정은 4℃, 암조건에서 수행하도록 하였다. 세포용해버퍼(50mM Tris pH 7.85, 100mM NaCl, 10% 글리세롤, 0.1% NP40) 20mL에 Complete, EDTA-프리 프로테아제 저해제(Roche, Switzerland) 0.5 타블릿, 0.1mM DDT를 첨가하여 1시간 30분가량 초음파 세포 파쇄기로 단백질 발현용 대장균을 깨뜨린 후 15000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 새 튜브에 옮겼다. 상등액에 Ni-NTA Agarose(Quiagen, Germany) 비드 500㎕를 넣고 4℃ 암 조건에서 1시간 30분간 섞어주어 단백질과 결합시켰다. 3500rpm, 4℃에서 2분간 원심분리하여 단백질이 결합된 비드를 가라앉히고 상등액을 제거하였다. 결합한 비드를 Poly-Prep chromatography column(Bio-Rad, USA)에 옮겨 세척 버퍼(50mM 트리스 pH 7.85, 300mM NaCl, 10% 글리세롤, 20mM 이미다졸, 0.1% NP40) 10mL를 5번 통과시켜 결합한 단백질 이외의 용액을 제거하였다. 용출 버퍼(50mM 트리스 pH8.0, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸) 1.5mL을 통과시켜 단백질을 추출하고 Amicon Ultra centrifugal filter units 10K membrane(Millipore, USA)을 이용해 원심분리 함으로써 농축된 단백질을 얻어냈다. 분리된 순수한 단백질을 흡수 및 형광 스펙트럼을 측정하는데 사용하였다.

전기영동 및 Zn ²⁺ 블러팅

12% SDS-PAGE 젤을 제작하여 분리 정제된 단백질 3㎕와 4X 샘플 버퍼 1㎕를 섞어 100℃에서 5분간 가열하였다. 하나의 레인 당 4㎕를 분주하여 120mV로 2시간 전기영동을 수행하였다. Zn^{2 +} 블러팅은 20mM Tris pH 7.35, 20mM Zinc 아세테이트 용액에 5분간 암조건에서 반응한 뒤 UV하에서 밴드를 확인하였다. 쿠마시 브릴리언트 블루용액(CBB)으로 1시간 염색한 뒤 탈염색 용액으로 12시간 이상 반응시켰다.

흡수스펙트럼 측정

UV-vis 스펙트로포토미터 S-3100(Scinco, Korea) 기계를 이용하고 LabPro 소프트웨어를 이용하여 190~1100nm 영역에서 흡수되는 스펙트럼을 측정하였다. 초기값은 Tris pH 8.0 용액으로 설정하였다. 750nm의 값으로 영점보정한 뒤 Origin 8.0으로 300~800nm 내의 흡수 스펙트럼을 얻었다.

실시예 1. Spr6432은 피코시아노빌린 혹은 피토크로모빌린과 결합하는 광수용체이다 .

사이토네마 남세균 피토크롬(cyanobacterial phytochrome) 중의 하나인 Spr6432은 N-말단에 PAS, GAF, 그리고 PHY 도메인을, C-말단에 히스티딘 키나제와 ATPase 도메인을 갖는다(도 1A). 아미노산 서열 정렬 결과 발색단이 결합하는 GAF 도메인에 두 개의 시스테인 잔기를 갖는 이중 시스테인 피토크롬(dual Cys phytochrome)임을 보여준다. 일반적으로 피토크롬 GAF는 1개의 시스테인 잔기를 갖고 있는데, 첫 번째 시스테인 잔기는 인접한 히스티딘과 함께 CH 모티프를 갖는 것으로 알려졌다(Rockwell, N.C., and Lagarias, J.C.(2010) ChemPhysChem 11, 1172-1180). Spr6432 GAF는 노스톡 유래 TP1, 톨리포스릭스 유래 Tpr0787과 같이 CH 모티프 대신에 시스테인을 갖는 두 개의 시스테인 CC을 갖는다(도 1B). 전장 아미노산을 이용하여 현재까지 알려진 대표적인 피토크롬 7종을 대상으로 계통 관계를 분석한 결과 노스톡 TP1인 NpF1183과 Tpr0787이 속한 그룹과 자매그룹을 형성함을 보임(도 1C)으로써 Spr6432이 TP1, Tpr0787과의 유연관계가 매우 가까움을 알 수 있었다.

광센서 모듈 PAS-GAF-PHY 도메인(도 2A)의 빌린계 발색단과의 결합 유무를 시험하기 위하여, 본 발명자는 BV, PCB 혹은 PΦB 생산 대장균 세포에서 상기 모듈을 발현시켰다. 각 재조합 대장균주에서 분리된 단백질을 12% SDS-PAGE 젤에 전기 영동하여 CBB 염색과 징크 블럿팅을 수행한 결과, PCB와 PΦB가 발색단으로 결합할 수 있음을 확인할 수 있었다(도 2B).

실시예 2, Spr6432은 자외선/황색 광가역적 피토크롬이다.

분리된 단백질을 고농도로 농축하여 광 수용체로서 어떠한 파장의 빛을 흡수하는지 확인하고자 UV-스펙트로포토미터를 이용하여 흡수 스펙트럼을 측정하였다. PCB를 발색단으로 갖는 바닥상태의 PAS-GAF-PHY-PCB(native 15Z)는 자외선(392 nm 피크)을 흡수하는 자외선 흡수형(Pu, naar-UV absorbing phytochrome)이었다. Pu에 380 nm의 자외선 A(near UV-A)을 조사하면 황색(573 nm)을 흡수하는 형(native 15E, Py, yellow absorbing phytochrome)으로 전환되었다(도 3). PΦB를 발색단으로 갖는 광센서 모듈은 청색(409 nm)/오렌지색(593 nm) 광호변성을 보였는데, PCB 광센서 모듈보다 15Z와 15E 상태에서 흡수 피크가 약 12 nm, 20 nm 적색편이(red shift) 되었다. 이러한 적색 편이는 D 피롤의 C18의 functional group의 차이에서 기인한다. 즉, PΦB는 비닐기를 갖는 반면 PCB는 에틸기를 갖고 있어서 공액사슬의 길이가 길기 때문에 장파장의 빛을 흡수할 수 있게 된다(Rockwell et al., 2012, Biochemistrym, 51, 1449-1463). 비록 BV는 광센서 모듈과 공유결합을 하지는 못하지만 비공유결합 형태로 청색광(411-414 nm)을 흡수하였다. 그러나 PCB나 PΦB와 같은 광호변적 특성은 보이지 않았다(도 3). 노스톡 Tp1은 자색(Pv)과 적색(Pr)을 흡수하는 형이며, Pv에서 Pr형으로의 전환에 빛 이외에 열에너지가 추가로 필요하다(Rockwell et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108, 11854-9). Tpr0787은 광전환에 열에너지가 필요하지 않다는 점에서 TP1과 차별성을 보인다. 본 발명의 Spr6432은 Tpr0787과 같이 열에 의존하지 않는 광전환 특성을 가지만 Pu와 Py 흡수 피크가 각각 10nm와 82 nm가 청색적이(blue-shifted) 되었다는 차별성을 보인다.

실시예 3. GAF 도메인의 두 번째 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 Spr6432 C257S는 자외선을 흡수하지 못하는 비광가역성이다.

GAF 도메인에는 PCB나 PΦB와 결합할 수 있는 시스테인 잔기가 256번째, 257번째에 존재한다. 첫 번째 시스테인은 남세균이나 고등식물 피토크롬에서 PCB나 PΦB와의 결합이 이루어지는 CH 모티프에 매우 잘 보존되어진 시스테인 잔기이다. 반면 두 번째 시스테인 Cys258은 노스톡 TP1와 톨리포스릭스에서 발견되는 258 시스테인과 상응하는 잔기로서 PCB와의 결합을 통해서 자색 빛 흡수를 가능하게 한다(Rockwell et al., 2011, Proc Natl Acad Sci USA, 108, 11854-9). TP1 및 Tpr0787과 같이 Spr6432에서 두 번째 시스테인 잔기 역시 PCB와 공유결합을 통해서 PCB의 공액사슬계를 2등분함으로써 자색을 흡수하게 함을 알 수 있었다. 즉, 시스테인을 세린 잔기로 치환한 Spr6432 C257S 변이체는 자외선을 흡수하는 대신에 녹색을 흡수하는 형이었다(도 4). Tpr6767 C258S 변이체는 녹색(549 nm)을 흡수하는 15Z 바닥상태가 형성되며, 녹색 조사에 의해서 적색을 흡수하는 Pr 형태(661 nm)로 전환된다(한국등록특허 제10-1669484). 반면 Spr6432 C257S 변이체는 광호변성을 보이지 않았다(도 4).

과산화수소(H₂O₂)는 티오이서 결합(thioether bond, R-S-R)을 설폭시드(R-S(=O)-R)와 술폰(sulfone, R-S(=O2)-R)으로 산화시킨다. 따라서 Spr6432가 과산화수소수에 노출되면 두 개의 티오이서 결합이 산화되며, 그 결과 자외선과 황색 피크 값이 감소될 것으로 예상된다. 예상과 같이 Pu와 Py가 과산화수소에 처리에 의해서 흡수 피크가 감소하였다(도 5A). 이오도아세트아미드(iodoacetamide, IAM)은 티올기(-SH)와 티오이서 결합을 형성할 수 있기 때문에 시스테인과 PCB 간의 티오이서 결합이 광호변 과정에서 안정성을 검증하는데 사용된다(Cho et al., 2017, Sci Rep, 7, 40576). IAM이 처리된 Pu와 Py형의 Spr6432는 광호변성에서 영향을 거의 받지 않았다. 이는 광호변성 과정에서 PCB 결합 포켓의 구조 변화가 크지 않음을 의미한다.

이상의 결과를 정리하여 보면, Spr6432은 GAF 도메인의 256번과 257번 시스테인 잔기를 통해서 이중으로 크로모포어 PCB와 결합하며, 257번 시스테인이 PCB 공액사슬계를 이등분함으로써 Pu형을 형성하게 하는 청색 전이(blue-shifted)에 관여하는 것으로 판단된다.

본 발명은 자외선, 황색 그리고 녹색을 흡수할 수 있는 새로운 피토크롬 광수용체를 발굴한 것으로서 황색과 녹색을 식물의 생장과 분화의 정보원으로 이용하지 못하는 조류와 고등식물 등의 광합성 식물에 도입함으로써 광형태형성과 열형태형성을 제어할 수 있는 방법을 제공함으로써 아파트형 식물공장과 온난화 환경에서 맞춤형 작물의 재배와 생산성 제고에 기여할 수 있는 있을 뿐만 아니라 광의학, 생체이미징, 세포학, 바이오에너지, 바이오매스 제고용 생명공학 분야 등 여러 응용 분야에서 유용하다.

<110> The Industry ＆ Academic Cooperation in Chungnam National University (IAC) <120> Near-UV/Yellow light photointerconvertible phytochrome Spr6432 protein from Scytonema and uses thereof <130> PN17332 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2256 <212> DNA <213> Scytonema PCC10023 <400> 1 atgagccaat ctgaagtcac ccctacccaa attacaaatc tcattcagca cgaaccaatt 60 gaattttcca tctcgatcca gcctcatggc ttactaatgg cgctcaatcc ccagttagtc 120 atcttgcaag tgagcaacaa tactgaggac ttattgggca aaaagccaaa cgatttactc 180 ggtcaacccc ttagcgattt gcttaactca gaacaagtca aggctattga gcaatgctgg 240 caacaagaaa gaggtcgtgt caattccttt aagctgtcta tccagacttc aaaaggtaag 300 caatactttg acggtatagc tcatcgtaca gaaagtactc tgattcttga gctagaacca 360 actgactctg tcaacgaaat cagctttttg agcttccatg ctttggcggg tgaggcgatc 420 gccaaaatgc gaaaaacatc aaacctcaca gattttttgc aacttgttgc atccgaagta 480 caaaaaatta caggctttga cagagtgatg gtctatgaat ttgaccatgt gggagcgggt 540 tccgtagttg ccgaagtcaa acgtcatgat ttatcacctt atttagggct gcactatccc 600 gctacggatc tccctgagca agttagggag ttatacaagc gtaatttgct acgattcatt 660 cccaatttga atgcccaacc tgtcgaactc gtttcagttg aaaattccga aacgcattct 720 agacctgttg acttaagctt ttgcgtcctc aggagcgctc acccctgctg tgttgaatac 780 catcaaaaca tggatgtagc agccatgctg gtgatagcac tcattaaaga gcaaaagctt 840 tggggattaa tttcctgcca tcatcaaaca cataagcata ttccttacga agtgcgcaaa 900 atttgcgaat ttttggggca gattgtgtcg cgagaactag aacacaaagt caatcagtcg 960 caattggact atagggtaag gcttcagtcg ctacagtctg attttataga gtcgatttcc 1020 caagcagaca attttcgaga agcgcttgtc aatccccagc ctagcttgct agatgttgtc 1080 gatgctcaag gagcagcagt ttatctggat gatgagatta cgcttttggg agcaacacca 1140 aatattgagc aggttcgtct tctgattgat tgggcagatg cttcaaacgg ggacaattta 1200 ttttccactg attctctgcc caagctttac ccagaagctg ttgctttcaa aaatacggca 1260 agtggtttgc tgcttttgcg aatttctaaa gttcggcgtt attacatcct ctggtttcgt 1320 cccgaagtca tccaaacggt aagctgggca ggtaacccag atgaatcgat tcaggttgat 1380 gccaatggta atgttaaact ttgcccgcga gcatcgtttg aacgttggca acaaacggtt 1440 cgattgactt cgctgccttg gaaaccgtgt gaaatcgaca gcgctcttgc tcttcggaat 1500 gcgatcgtcg gcattgtact ttctaaggca gatgagttag ccagaatgaa tctggagtta 1560 gagcgcagca accgcgagct cgcttccttt gccttcgctg cttcccacga tttaaaggaa 1620 cctttgcgcg gcatccacaa ctactcaact gtgctgctgg aagactacgc ccaactgctg 1680 gatgaggatg gaattgagta cttacagaca gtggtttcct tgtctcaacg gatggaaact 1740 ctgatcaatt ccctgctgcg actctcccag ttagggcaag cgaaactgca gctacaagca 1800 actgacctca acgaattact tgatcaagtg attcatcttt tacgtgccag tcgtccgcaa 1860 ggtcagttca atattcgcat acccagacct ttgcctacaa ttgaatgtga cccagttctc 1920 gttagcgaag tgtttagtaa cctgattatc aatgctttaa aatacaatga caagccagaa 1980 aaatgcgttg aaattggtta cttgaatgct gaagagcaag gggaaacctc agtacccttt 2040 gtcttttata tacgagataa cggcattggt attccagaac atcaccacga gagtattttc 2100 cgactcttca agcggctaca ctctcaggaa aagtatggtg gaggtgccgg tgcggggctt 2160 gccatttcta agaagattgt tgagcgtcac ggtggtcgta tctgggttga gtcggtcgtg 2220 gatgttggct caacgtttta ttttacgctc gaatag 2256 <210> 2 <211> 751 <212> PRT <213> Scytonema PCC10023 <400> 2 Met Ser Gln Ser Glu Val Thr Pro Thr Gln Ile Thr Asn Leu Ile Gln 1 5 10 15 His Glu Pro Ile Glu Phe Ser Ile Ser Ile Gln Pro His Gly Leu Leu 20 25 30 Met Ala Leu Asn Pro Gln Leu Val Ile Leu Gln Val Ser Asn Asn Thr 35 40 45 Glu Asp Leu Leu Gly Lys Lys Pro Asn Asp Leu Leu Gly Gln Pro Leu 50 55 60 Ser Asp Leu Leu Asn Ser Glu Gln Val Lys Ala Ile Glu Gln Cys Trp 65 70 75 80 Gln Gln Glu Arg Gly Arg Val Asn Ser Phe Lys Leu Ser Ile Gln Thr 85 90 95 Ser Lys Gly Lys Gln Tyr Phe Asp Gly Ile Ala His Arg Thr Glu Ser 100 105 110 Thr Leu Ile Leu Glu Leu Glu Pro Thr Asp Ser Val Asn Glu Ile Ser 115 120 125 Phe Leu Ser Phe His Ala Leu Ala Gly Glu Ala Ile Ala Lys Met Arg 130 135 140 Lys Thr Ser Asn Leu Thr Asp Phe Leu Gln Leu Val Ala Ser Glu Val 145 150 155 160 Gln Lys Ile Thr Gly Phe Asp Arg Val Met Val Tyr Glu Phe Asp His 165 170 175 Val Gly Ala Gly Ser Val Val Ala Glu Val Lys Arg His Asp Leu Ser 180 185 190 Pro Tyr Leu Gly Leu His Tyr Pro Ala Thr Asp Leu Pro Glu Gln Val 195 200 205 Arg Glu Leu Tyr Lys Arg Asn Leu Leu Arg Phe Ile Pro Asn Leu Asn 210 215 220 Ala Gln Pro Val Glu Leu Val Ser Val Glu Asn Ser Glu Thr His Ser 225 230 235 240 Arg Pro Val Asp Leu Ser Phe Cys Val Leu Arg Ser Ala His Pro Cys 245 250 255 Cys Val Glu Tyr His Gln Asn Met Asp Val Ala Ala Met Leu Val Ile 260 265 270 Ala Leu Ile Lys Glu Gln Lys Leu Trp Gly Leu Ile Ser Cys His His 275 280 285 Gln Thr His Lys His Ile Pro Tyr Glu Val Arg Lys Ile Cys Glu Phe 290 295 300 Leu Gly Gln Ile Val Ser Arg Glu Leu Glu His Lys Val Asn Gln Ser 305 310 315 320 Gln Leu Asp Tyr Arg Val Arg Leu Gln Ser Leu Gln Ser Asp Phe Ile 325 330 335 Glu Ser Ile Ser Gln Ala Asp Asn Phe Arg Glu Ala Leu Val Asn Pro 340 345 350 Gln Pro Ser Leu Leu Asp Val Val Asp Ala Gln Gly Ala Ala Val Tyr 355 360 365 Leu Asp Asp Glu Ile Thr Leu Leu Gly Ala Thr Pro Asn Ile Glu Gln 370 375 380 Val Arg Leu Leu Ile Asp Trp Ala Asp Ala Ser Asn Gly Asp Asn Leu 385 390 395 400 Phe Ser Thr Asp Ser Leu Pro Lys Leu Tyr Pro Glu Ala Val Ala Phe 405 410 415 Lys Asn Thr Ala Ser Gly Leu Leu Leu Leu Arg Ile Ser Lys Val Arg 420 425 430 Arg Tyr Tyr Ile Leu Trp Phe Arg Pro Glu Val Ile Gln Thr Val Ser 435 440 445 Trp Ala Gly Asn Pro Asp Glu Ser Ile Gln Val Asp Ala Asn Gly Asn 450 455 460 Val Lys Leu Cys Pro Arg Ala Ser Phe Glu Arg Trp Gln Gln Thr Val 465 470 475 480 Arg Leu Thr Ser Leu Pro Trp Lys Pro Cys Glu Ile Asp Ser Ala Leu 485 490 495 Ala Leu Arg Asn Ala Ile Val Gly Ile Val Leu Ser Lys Ala Asp Glu 500 505 510 Leu Ala Arg Met Asn Leu Glu Leu Glu Arg Ser Asn Arg Glu Leu Ala 515 520 525 Ser Phe Ala Phe Ala Ala Ser His Asp Leu Lys Glu Pro Leu Arg Gly 530 535 540 Ile His Asn Tyr Ser Thr Val Leu Leu Glu Asp Tyr Ala Gln Leu Leu 545 550 555 560 Asp Glu Asp Gly Ile Glu Tyr Leu Gln Thr Val Val Ser Leu Ser Gln 565 570 575 Arg Met Glu Thr Leu Ile Asn Ser Leu Leu Arg Leu Ser Gln Leu Gly 580 585 590 Gln Ala Lys Leu Gln Leu Gln Ala Thr Asp Leu Asn Glu Leu Leu Asp 595 600 605 Gln Val Ile His Leu Leu Arg Ala Ser Arg Pro Gln Gly Gln Phe Asn 610 615 620 Ile Arg Ile Pro Arg Pro Leu Pro Thr Ile Glu Cys Asp Pro Val Leu 625 630 635 640 Val Ser Glu Val Phe Ser Asn Leu Ile Ile Asn Ala Leu Lys Tyr Asn 645 650 655 Asp Lys Pro Glu Lys Cys Val Glu Ile Gly Tyr Leu Asn Ala Glu Glu 660 665 670 Gln Gly Glu Thr Ser Val Pro Phe Val Phe Tyr Ile Arg Asp Asn Gly 675 680 685 Ile Gly Ile Pro Glu His His His Glu Ser Ile Phe Arg Leu Phe Lys 690 695 700 Arg Leu His Ser Gln Glu Lys Tyr Gly Gly Gly Ala Gly Ala Gly Leu 705 710 715 720 Ala Ile Ser Lys Lys Ile Val Glu Arg His Gly Gly Arg Ile Trp Val 725 730 735 Glu Ser Val Val Asp Val Gly Ser Thr Phe Tyr Phe Thr Leu Glu 740 745 750 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 caactcgaga atgagccaat ctgaagtcac 30 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 caagaattcc tctaactcca gattcattct 30 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcacccctgc tctgttga 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 tcaacagagc aggggtga 18

Claims (12)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진, 사이토네마(Scytonema) PCC10023 유래의 자외선/황색 광호변성 피토크롬 Spr6432 단백질.
2. 제1항의 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자.
3. 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 Spr6432 단백질의 257번째 아미노산이 시스테인에서 세린으로 돌연변이된 Spr6432 C257S 변이체 단백질.
4. 제3항에 있어서, 상기 Spr6432 C257S 변이체 단백질은 녹색을 흡수하는 피토크롬인 것을 특징으로 하는 변이체 단백질.
5. 제3항의 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자.
6. 제2항 또는 제5항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
7. 제6항의 재조합 벡터로 숙주세포를 형질전환시켜 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자 또는 Spr6432 C257S 변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 자외선, 황색 또는 녹색을 흡수할 수 있는 광합성 독립영양성 형질전환 숙주세포를 제조하는 방법.
8. 제7항의 방법에 의해 제조된 자외선, 황색 또는 녹색을 흡수할 수 있는 광합성 독립영양성 형질전환 숙주세포.
9. 제8항에 있어서, 상기 숙주세포는 남세균 세포, 녹조류 세포 또는 식물 세포인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
10. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 숙주세포에 형질전환시켜 Spr6432 단백질을 코딩하는 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 Spr6432 단백질을 생산하는 방법.
11. 제10항의 방법에 의해 생산된 Spr6432 단백질.
12. 제11항의 Spr6432 단백질을 유효성분으로 포함하는 자외선 차단용 화장료 조성물.

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