CN1325652C - 提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法 - Google Patents

Abstract

一种生物技术领域的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法。包括如下步骤：①用限制性内切酶酶切pCAMBIA2300和pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF基因，补平，去磷酸化，②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，③吸取适量农杆菌加入含有抗生素的YEP培养基中，28℃，250rpm培养36hr，④将这两种转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代；⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。本发明将这两种转基因植物后代杂交，外源蛋白的表达量比亲本提高50%以上。不改变其他的序列，仅在目的基因的末端加上的内质网和液泡导向信号，实现提高外源蛋白在植物中的积累。提高外源蛋白在转基因植物中的累积。达到提高外源蛋白在植物种子中积累的目标。

Description

提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法

技术领域

本发明涉及的是一种生物技术领域的方法，特别是一种提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法。

背景技术

提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，通常是寻找高表达的启动子和调节序列。现有大量资料表明，将菜豆球蛋白C端的AFVY(Ala-Phe-Val-Tyr)液泡导向信号连在绿色荧光蛋白的末端，可以实现绿色荧光蛋白在液泡中的积累。将绿色荧光蛋白的末端加上KDEL(Lys-Asp-Glu-Leu)短肽，绿色荧光蛋白能在细胞质的内质网中积累。

经对现有文献检索，尚未发现在不改变启动子和调节序列的前提下，仅仅在基因末端分别加上导向内质网和贮藏液泡的运输信号，再利用传统杂交育种的途径，提高外源蛋白在植物中累积的方法，也未发现与本发明相同技术主题的报导。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种提高外源蛋白在转基因植物种子中累积的方法。使其提高外源蛋白在转基因植物中的累积。构建两种含有内质网和液泡导向信号的组织特异性表达载体，分别转化植株，得到转基因后代，再将两种转基因植物后代杂交。将两种体系的优点整合到一起，从而达到提高外源蛋白在植物种子中积累的目标。

本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤：

①用限制性内切酶酶切pCAMBIA2300和pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，补平，用碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和酶切过的载体用T4连接酶连接，过夜。基因的末端有KDEL内质网导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除。

②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，其特点是hGM-CSF基因的末端有AFVY贮藏液泡导向信号，在成熟肽中该短肽能被正确切除。

③将这两种表达载体分别导入农杆菌GV3101和LBA4404中，吸取适量农杆菌加入含有抗生素的YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。当OD值达到0.8左右，开始用于转化拟南芥和大豆。拟南芥转化参考Clough和Bent文献(Clough S J and Bent A F，1998.Floral dip：a simplified method for Agrobacterium-mediatedtransformation of Arabidopsis thaliana.Plant J 16：735-743)。大豆的转化采用本实验室建立的大豆转化和培养程序，其专利公开号是ZL 02 150782.1(大豆转基因植株原位丛生芽再生培养方法)和ZL 02 50777.5(真空渗透辅助大豆原位丛生芽转化方法)。

④将这两种转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代。

⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。

a)参考Bradford法(Bradford，1976)对总可溶性蛋白定量。取2μl蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₈₅。

b)SDS-PAGE分离蛋白和膜上蛋白检测参照《分子克隆》(Sambrook等，1989)。蛋白在SDS-PAGE胶中电泳直到指示剂前沿达到凝胶的底部。

c)蛋白质向硝酸纤维素膜上转移在室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

d)膜上蛋白检测：加入第一抗体(抗人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体)，37℃温育30分钟；洗涤三次；在加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟，洗涤两次；加入底物显色观察蛋白带。

本发明分别构建含有内质网和液泡导向信号的植物表达载体，转化植株，得到转基因后代，再将这两种转基因植物后代杂交，外源蛋白的表达量比亲本提高50％以上。本发明不改变其他的序列，仅在目的基因的末端加上的内质网和液泡导向信号，再将转基因株系进行杂交，利用导向信号的不同，实现提高外源蛋白在植物中的积累。提高外源蛋白在转基因植物中的累积。构建两种含有内质网和液泡导向信号的组织特异性表达载体，分别转化植株，得到转基因后代，再将两种转基因植物后代杂交。将两种体系的优点整合到一起，从而达到提高外源蛋白在植物种子中积累的目标。

具体实施方式：

以下结合具体的实施例对本发明的技术方案作进一步描述。

实施例1人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在拟南芥种子中的表达

1.用XhoI限制性内切酶酶切pCAMBIA2300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，用T4 DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和pCAMBIA2300载体用T4连接酶连接，过夜。基因末端加上aaggatgagctt寡核苷酸导向信号。

2.用XhoI限制性内切酶酶切pCAMBIA2300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，用T4 DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和pCAMBIA2300载体用T4连接酶连接，过夜。基因末端加上gctttcgtttac寡核苷酸导向信号。

3.将含有步骤1和步骤2pCAMBIA2300表达载体的农杆菌GV3101菌液，吸取适量加入YEP(每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl)/Gent(庆大霉素25mg/L)+Kan(卡那霉素50mg/L)培养基中，28℃，250rpm培养36hr。22℃，5500g离心20min，去上清，用转化介质(1/2×MS大量成分(Murashigeand Skoog，1962)，1/2×B5微量成分(Gamborg et al，1968)，5％sucrose，0.05％silwet-77，44nM benzylaminopurine)重悬，调整OD值达到0.8左右。将刚开花的拟南芥倒立在转化介质中，浸30秒中，并轻轻摇动。取出拟南芥，将叶、茎、花上多余的水珠抖落，平放在干净的塑料盆中，并用薄膜覆盖闭光保湿16hr。揭开薄膜，将拟南芥放置在日光灯下，光照强度80～110μmol.M^-2.s^-1，并浇Hogland营养液(KNO₃5×10^-3mol/L，KH₂PO₄5×10^-3mol/L，MgSO₄.7H₂O 4×10^-3mol/L，Ca(NO₃)₂ 4×10^-3mol/L，FeSO₄·7H₂O 5×10^-5mol/L，Na₂-EDTA  5×10^-5mol/L，MS微量成分(Murashige and Skoog，1962))，待其拟南芥角果完全枯黄、开裂时，收获种子。将消毒过的拟南芥种子移至含有Kan(50g/ml)的筛选平板上，均匀平铺，并吸去平板内多余的水。4′C春化2d，移至温室中，保证光照强度80～110μmol.m^-2.s^-1。约10d之后已转入质粒的植株具有Kan抗性，所以子叶为绿色，下胚轴较长，并已长出两片真叶。将转化子移至已用营养液浇透的蛭石中，用薄膜保湿过夜，第二天移至气候温室中，培养条件同上。收获T2代种子，分析。

4.对这两种转基因株系后代进行杂交。

5.对后代和亲本进行蛋白定量分析。

a)取50mg叶片，加入100μl 1×PBS(KH₂PO₄ 0.2g/l，Na₂HPO₄ 1.15g/l，KCl0.2g/l，NaCl 8g/1)于1.5ml离心管中研碎；130008，4℃离心10分钟；取上清，备用(以上过程于冰上进行)。

b)参考Bradford法(Bradford，1976)。取2μl蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₉₅。

c)SDS-PAGE分离蛋白：SDS-PAGE的制备参考《分子克隆》(Sambrook等，1989)：加样前，将样品置于含50mmol/LDTT的加样缓冲液(2×加样缓冲液：甘油2.4g，1M Tris-HCl 1ml(pH6.8)；溴酚兰0.01％，H₂O定容20ml)，煮沸10分钟；室温100V电压下聚丙烯酰胺凝胶电泳，直到指示剂(溴酚兰)前沿达到凝胶的底部。

d)蛋白质向硝酸纤维素膜上转移：转移之前，用缓冲液(39ml甘氨酸，48mmolTris-base，0.037％SDS，20％甲醇)平衡凝胶和硝酸纤维膜30分钟；室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸。

e)膜上蛋白检测：将硝酸纤维膜浸在封闭液中，37℃缓慢摇动，封闭60分钟(封闭液：取5克脱脂奶粉溶于100ml 1×PBS(含0.5g叠氮钠))；再将滤膜浸泡在洗涤缓冲液中，37℃洗涤两次，每次15分钟；加入第一抗体(抗人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体)，37℃温育30分钟；同步骤b)，洗涤三次；加入第二抗体(亲和素-碱性磷酸酶复合物)，37℃温育30分钟，洗涤两次；加入底物显色观察蛋白带。

杂交后代分别比亲本提高了63％和70％

实施例2人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰25种子中的表达

1用XhoI限制性内切酶酶切pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，用T4 DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和pCAMBIA3300载体用T4连接酶连接，过夜。基因末端加上aaggatgagctt寡核苷酸导向信号。

2.用XhoI限制性内切酶酶切pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(hGM-CSF)基因，用T4 DNA聚合酶补平，用Shrimp碱性磷酸酶去磷酸化。将hGM-CSF基因和pCAMBIA3300载体用T4连接酶连接，过夜。基因末端加上gctttcgtttac寡核苷酸导向信号。

3.将这两种表达载体转入农杆菌LBA4404中，转化大豆合丰25 。

a)大豆种子经过消毒，放在MSB(MS大量成分(Murashige and Skoog，1962)+B5微量成分(Gamborg et al，1968))+6-BA(6-苄氨基嘌呤，6-benzylaminopurine)0.4mg/L(PH5.8)培养基上萌发5天，去顶芽并制造伤口，得到外植体，放在MSB(+6-BA10mg/L+IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基预培养一天。

b)真空条件下在104Pa负压条件下，实施列4中构建pCAMBIA3300表达载体农杆菌LBA4404感染10～20分钟(OD600nm≈0.5)，放在MSB+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.2mg/L(PH5.8)培养基上共培养3天，取出放在MSB+6-BA0.5mg/L+IBA0.1mg/L+头孢霉素300mg/L+羧苄青霉素300mg/L(PH＝5.8)培养基上除菌2周。

c)除菌后的外植体放在MSB+卡那霉素80mg/L(PH＝5.8)培养基上，每2周转接一次，进行筛选至出现不定芽。伸长到1～2cm时切除子叶，至伸长到3～4cm。

d)切下外植体上的不定芽并放在1/2MSB+卡那霉素50mg/L(PH＝5.8)培养基上，进行转化芽诱导生根15～20天，移栽到大盆直至获得转化植株产生的种子。

e)收获T2代种子，进行分析。

4.将这两种转基因株系后代进行杂交。

5.测定转基因株系种子中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子累积量，并分别与未杂交前的亲本相比较。蛋白的定量分析同实施例1中的步骤5。

杂交后代分别比亲本提高了68％和76％。

实施例3人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆品种合丰42种子中的表达

1.转化载体的构建同实施例2中步骤1和步骤2。

2.将含有pCAMBIA3300表达载体农杆菌LBA4404，转化大豆品种合丰42。具体步骤见实施例2的步骤3。

4.将这两种转基因株系后代进行杂交。

5.测定转基因株系种子中人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子累积量，并分别与未杂交前的亲本相比较。测定方法见实施例1的步骤5。

杂交后代分别比亲本提高了52％和87％。

Claims (6)

1、一种提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①用限制性内切酶酶切pCAMBIA2300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF基因，补平，去磷酸化，将hGM-CSF基因和上述酶切过的pCAMBIA2300质粒用T4连接酶连接，过夜，在所述的基因的末端加上KDEL内质网导向信号，在成熟肽中该导向信号能被正确切除；

②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，其特点是hGM-CSF基因的末端加上AFVY贮藏液泡导向信号，在成熟肽中该导向信号能被正确切除；

③将①和②构建的载体分别导入农杆菌GV3101中，吸取适量农杆菌加入含有抗生素的YEP培养基中，28℃，250rpm培养36hr，当OD值达到0.8左右，开始用于转化拟南芥和大豆；

④将分别用步骤①和步骤②的载体转化的转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代；

⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。

2、一种提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征在于，包括如下步骤：

①用限制性内切酶酶切pCAMBIA3300质粒和人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子hGM-CSF基因，补平，去磷酸化，将hGM-CSF基因和上述酶切过的pCAMBIA3300质粒用T4连接酶连接，过夜，在所述的基因的末端加上KDEL内质网导向信号，在成熟肽中该导向信号能被正确切除；

②用上述同样的方法构建另一种系列的表达载体，其特点是hGM-CSF基因的末端加上AFVY贮藏液泡导向信号，在成熟肽中该导向信号能被正确切除；

③将①和②构建的载体分别导入农杆菌LBA4404中，吸取适量农杆菌加入含有抗生素的YEP培养基中，28℃，250rpm培养36hr，当0D值达到0.8左右，开始用于转化拟南芥和大豆；

④将分别用步骤①和步骤②的载体转化的转基因植株的后代进行杂交，得到杂交的后代；

⑤对后代和亲本进行蛋白定量分析。

3、根据权利要求1或者2所述的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征是，在步骤①中，所述的去磷酸化，是指用碱性磷酸酶。

4、根据权利要求1或者2所述的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征是，在步骤③中，所述的含有抗生素的YEP培养基，是指：每升含10g胰蛋白胨，10g酵母抽提物，5gNaCl。

5、根据权利要求1或者2所述的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征是，在步骤⑤中，所述的对后代和亲本进行蛋白定量分析，按照如下方法实施：

a)对总可溶性蛋白定量，取2μl蛋白样品，加入1mlBradford试剂，混匀后，分光光度计测OD₅₉₅；

b)SDS-PAGE分离蛋白和膜上蛋白检测，蛋白在SDS-PAGE胶中电泳直到指示剂前沿达到凝胶的底部；

c)蛋白质向硝酸纤维素膜上转移，在室温下用半干式电转仪转移1h，凝胶两侧各垫3层Whatman滤纸；

d)膜上蛋白检测：加入第一抗体，37℃温育30分钟；洗涤三次；再加入第二抗体，37℃温育30分钟，洗涤两次；加入底物显色观察蛋白带。

6、根据权利要求5所述的提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法，其特征是，所述的第一抗体，是指：抗人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子的抗体。