JPH11285382A - 神経変性疾患の細胞及び動物モデルを獲得するための方法及び手段 - Google Patents
神経変性疾患の細胞及び動物モデルを獲得するための方法及び手段Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 タンパク質の凝集に関連する細胞の調節不良
を再現することのできるモデルを提供すること。 【解決手段】 神経変性疾患に関与するタンパク質又は
ペプチドをコードする組換え型核酸であって、所定の細
胞区画内への前記タンパク質又はペプチドの集中を可能
にするように改変された組換え型核酸。
を再現することのできるモデルを提供すること。 【解決手段】 神経変性疾患に関与するタンパク質又は
ペプチドをコードする組換え型核酸であって、所定の細
胞区画内への前記タンパク質又はペプチドの集中を可能
にするように改変された組換え型核酸。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、バイオテクノロジ
ー、医学、生物学及び生化学の技術分野に関する。その
適用は、人間及び動物の健康の分野に関する。本発明
は、より具体的には、神経変性疾患の細胞及び動物モデ
ルを獲得するための方法、及びこれらの方法の実施のた
めに利用可能な手段（核酸又はベクターのような）に関
する。
ー、医学、生物学及び生化学の技術分野に関する。その
適用は、人間及び動物の健康の分野に関する。本発明
は、より具体的には、神経変性疾患の細胞及び動物モデ
ルを獲得するための方法、及びこれらの方法の実施のた
めに利用可能な手段（核酸又はベクターのような）に関
する。
【０００２】神経変性疾患は、主として工業国における
平均寿命の延長に関連した、増々増大する大きな保健行
政上の問題となっている。このように、アルツハイマー
痴呆及びパーキンソン病は、その結末が致命的であるこ
とのみならず、それが課する長く制約の大きい負担を理
由とし、経済的な重大な影響を有している。臨床的徴候
が記載され、いくつかの感受性遺伝子が同定されて、こ
れらの疾病についての知識は著しい進歩をとげることが
可能になったものの、これらの疾病の発生を支える分子
レベルの基礎はきわめて不明瞭である。これらの病理状
態において調節不良となったシグナリングカスケードを
解明することにより、恐らくは、治療的介入に好適な標
的を発見することができるだろう。これらの神経変性疾
患は、部分的には細胞生存因子と細胞死滅誘発因子間の
バランス不良により特徴づけられる確率がきわめて高
い。この点において、文献には、これらのプロセスに対
してアンタゴニストの役目を果たすタンパク質の生成に
おける選択的スプライシングの重要性を強調する例が数
多く存在する（Ｂｃｌ２ファミリー、カスパーゼ、Ｇｒ
ｂ２など）。これまでのところ良質で有効な治療が全く
存在しないことから、これらの分野における革新は、多
大な影響をもたらすことになろう。
平均寿命の延長に関連した、増々増大する大きな保健行
政上の問題となっている。このように、アルツハイマー
痴呆及びパーキンソン病は、その結末が致命的であるこ
とのみならず、それが課する長く制約の大きい負担を理
由とし、経済的な重大な影響を有している。臨床的徴候
が記載され、いくつかの感受性遺伝子が同定されて、こ
れらの疾病についての知識は著しい進歩をとげることが
可能になったものの、これらの疾病の発生を支える分子
レベルの基礎はきわめて不明瞭である。これらの病理状
態において調節不良となったシグナリングカスケードを
解明することにより、恐らくは、治療的介入に好適な標
的を発見することができるだろう。これらの神経変性疾
患は、部分的には細胞生存因子と細胞死滅誘発因子間の
バランス不良により特徴づけられる確率がきわめて高
い。この点において、文献には、これらのプロセスに対
してアンタゴニストの役目を果たすタンパク質の生成に
おける選択的スプライシングの重要性を強調する例が数
多く存在する（Ｂｃｌ２ファミリー、カスパーゼ、Ｇｒ
ｂ２など）。これまでのところ良質で有効な治療が全く
存在しないことから、これらの分野における革新は、多
大な影響をもたらすことになろう。
【０００３】特に、罹患した組織内及び健康な対照内で
の遺伝子発現の分析は、量質共に充分な生検を得ること
が困難であることが理由でほぼ不可能であるため、神経
変性疾患の性質上、これらの疾患の研究は難しいものと
なっている。したがって、動物及び細胞モデルの獲得
は、これらの神経系の疾患の病態生理学を理解する上で
明らかな進歩を示すものである。
の遺伝子発現の分析は、量質共に充分な生検を得ること
が困難であることが理由でほぼ不可能であるため、神経
変性疾患の性質上、これらの疾患の研究は難しいものと
なっている。したがって、動物及び細胞モデルの獲得
は、これらの神経系の疾患の病態生理学を理解する上で
明らかな進歩を示すものである。
【０００４】これらのモデルは： − 神経変性疾患の発生の異なる段階に関与する新たな
ｃＤＮＡを同定すること、 − 動物又は細胞の出発モデルに対するこれらのｃＤＮ
Ａ及びこれらのｃＤＮＡから誘導されたあらゆる構築物
の影響をテストすること、を可能にしてくれるだろう。
ｃＤＮＡを同定すること、 − 動物又は細胞の出発モデルに対するこれらのｃＤＮ
Ａ及びこれらのｃＤＮＡから誘導されたあらゆる構築物
の影響をテストすること、を可能にしてくれるだろう。
【０００５】しかしながら、人間の１つの疾病全体を反
映させることができる動物モデルは存在しない。したが
って、同じ病気のために複数のモデルを提供することが
実際上好都合であり、こうすることにより、複雑な人間
の病態生理学的状況においてそれらを評価する前に同定
可能な目的の遺伝子を増やすことが可能となる。
映させることができる動物モデルは存在しない。したが
って、同じ病気のために複数のモデルを提供することが
実際上好都合であり、こうすることにより、複雑な人間
の病態生理学的状況においてそれらを評価する前に同定
可能な目的の遺伝子を増やすことが可能となる。
【０００６】種々の神経変性疾患についてマウスのモデ
ルが、以下の方法により樹立されてきた： − アルツハイマー病（Johnson-Wood et al. 1997, PN
AS, 94, p1550〜1555）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬ
Ｓ）（Gurney et al, 1997, J, Neurol, 244, S15-S2
0）、ハンチントン舞踏病（Davies et al, 1997, Cell,
90, p537）ならびにプリオン病（Moore, R.C. and Mel
ton, D.W., 1997, Mol. Hum. Reprod., 3 p529〜544）
については、遺伝子導入による； − テイサックス病及びサンドホフ病（Sango, K. et a
l, 1996, Nat. Genet.,14, p348〜352）については相同
組換えによる； − 小児セロイド脂褐素症（Vance et al, Biochem. Bi
ophys. Acta, 1997, 1344 p286〜299）のモデルの場合
においては、代謝経路についての突然変異マウスの獲得
による。
ルが、以下の方法により樹立されてきた： − アルツハイマー病（Johnson-Wood et al. 1997, PN
AS, 94, p1550〜1555）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬ
Ｓ）（Gurney et al, 1997, J, Neurol, 244, S15-S2
0）、ハンチントン舞踏病（Davies et al, 1997, Cell,
90, p537）ならびにプリオン病（Moore, R.C. and Mel
ton, D.W., 1997, Mol. Hum. Reprod., 3 p529〜544）
については、遺伝子導入による； − テイサックス病及びサンドホフ病（Sango, K. et a
l, 1996, Nat. Genet.,14, p348〜352）については相同
組換えによる； − 小児セロイド脂褐素症（Vance et al, Biochem. Bi
ophys. Acta, 1997, 1344 p286〜299）のモデルの場合
においては、代謝経路についての突然変異マウスの獲得
による。
【０００７】これらのモデルは、疾病に特徴的な行動及
び組織学的徴候を多少の差こそあれ正しく再現する。
び組織学的徴候を多少の差こそあれ正しく再現する。
【０００８】その上、これらのモデルは、患者において
観察されたものをモデルにした優性突然変異により開始
された疾患を再現することを目的としているものの、同
定された感受性遺伝子のいかなる突然変異にも関連せ
ず、遺伝性の構成要素を持たない散発性の症例について
の情報は提供しない。
観察されたものをモデルにした優性突然変異により開始
された疾患を再現することを目的としているものの、同
定された感受性遺伝子のいかなる突然変異にも関連せ
ず、遺伝性の構成要素を持たない散発性の症例について
の情報は提供しない。
【０００９】本発明は、先行技術の欠点を克服し得るも
のである。本発明は、実際、神経変性疾患の細胞及び動
物モデルを獲得するための新しい方法及び手段について
記載する。
のである。本発明は、実際、神経変性疾患の細胞及び動
物モデルを獲得するための新しい方法及び手段について
記載する。
【００１０】本発明は、一部には、上述の神経変性疾患
が全て、明確な細胞区画内のタンパク質又はペプチドの
異常な蓄積、又は病理的細胞超微構造（レービー小体）
内のプロテオグリカンの蓄積に関連するものであるとい
う観察事実から結果としてもたらされたものである。
が全て、明確な細胞区画内のタンパク質又はペプチドの
異常な蓄積、又は病理的細胞超微構造（レービー小体）
内のプロテオグリカンの蓄積に関連するものであるとい
う観察事実から結果としてもたらされたものである。
【００１１】アルツハイマー病の場合、蓄積されたペプ
チドは、凝集形態である。これはＡＰＰタンパク質（ア
ミロイド前駆体タンパク質）のタンパク質分解に由来す
るベータアミロイド（１−４２）ペプチドである。アミ
ロイドシートの形に凝集したこのペプチドは、脳細胞間
空間内に存在するものの、その産生は、凝集に好適な条
件が存在する小胞体の中でＡＰＰの特異的分解の後に起
こる（Hartmann, T. et al, 1997, Nat. Med., p1016−
1020）。この細胞区画内でのこの蓄積は、恐らくアポト
ーシスカスケードの開始因子である細胞質内カルシウム
濃度の増大を開始させるものとして知られている小胞体
へのストレスを誘発する。
チドは、凝集形態である。これはＡＰＰタンパク質（ア
ミロイド前駆体タンパク質）のタンパク質分解に由来す
るベータアミロイド（１−４２）ペプチドである。アミ
ロイドシートの形に凝集したこのペプチドは、脳細胞間
空間内に存在するものの、その産生は、凝集に好適な条
件が存在する小胞体の中でＡＰＰの特異的分解の後に起
こる（Hartmann, T. et al, 1997, Nat. Med., p1016−
1020）。この細胞区画内でのこの蓄積は、恐らくアポト
ーシスカスケードの開始因子である細胞質内カルシウム
濃度の増大を開始させるものとして知られている小胞体
へのストレスを誘発する。
【００１２】プリオンタンパク質（Ｐｒｐ）は、海綿状
脳炎を患う脳組織内で異常な立体配座で存在する（ＢＳ
Ｅ, Kuru, クロイツフェルトヤコブ病）。この立体配座
は、プロテイナーゼＫによる消化に対する耐性をその特
徴とする。エンドソーム区画は、異常形態のＰｒｐの転
換及びそれに続く凝集が発生する場所として記載された
（Arnold, J.E. 1995, J. Pathol. 176, p403〜411）。
脳炎を患う脳組織内で異常な立体配座で存在する（ＢＳ
Ｅ, Kuru, クロイツフェルトヤコブ病）。この立体配座
は、プロテイナーゼＫによる消化に対する耐性をその特
徴とする。エンドソーム区画は、異常形態のＰｒｐの転
換及びそれに続く凝集が発生する場所として記載された
（Arnold, J.E. 1995, J. Pathol. 176, p403〜411）。
【００１３】ハンチントン舞踏病は、細胞タンパク質の
改変された一形態の凝集により特徴づけられる。これ
は、タンパク質のＮＨ2末端における可変的長さのグル
タミン酸反復により改変されたハンチンティン（Huntin
gtin）である。凝集体は、ジストロフィー性神経突起内
ならびに核封入体の中で検出され、これら２つの位置
は、まだ解明されていないその機能に関連するハンチン
ティンの逆行性輸送を反映している（DiFiglia, M. et
al, 1997, Science, 277, p1990〜1993）。
改変された一形態の凝集により特徴づけられる。これ
は、タンパク質のＮＨ2末端における可変的長さのグル
タミン酸反復により改変されたハンチンティン（Huntin
gtin）である。凝集体は、ジストロフィー性神経突起内
ならびに核封入体の中で検出され、これら２つの位置
は、まだ解明されていないその機能に関連するハンチン
ティンの逆行性輸送を反映している（DiFiglia, M. et
al, 1997, Science, 277, p1990〜1993）。
【００１４】
【発明が解決しようとする課題】これら３つの例は、こ
れらの疾病の発生における細胞区画内のタンパク質又は
ペプチドの蓄積現象を表わしている。本発明の目的は、
タンパク質の凝集に関連する細胞の調節不良を再現する
ことができるモデルを提供することにある。これらのモ
デルは、遺伝子導入により得られる動物モデル又は細胞
モデルでありうる。これらの細胞モデルは、トランスフ
ェクションによって得ることができ、又ニューロン細胞
と同様に線維芽細胞のようなその他のタイプの細胞から
も誘導できる。
れらの疾病の発生における細胞区画内のタンパク質又は
ペプチドの蓄積現象を表わしている。本発明の目的は、
タンパク質の凝集に関連する細胞の調節不良を再現する
ことができるモデルを提供することにある。これらのモ
デルは、遺伝子導入により得られる動物モデル又は細胞
モデルでありうる。これらの細胞モデルは、トランスフ
ェクションによって得ることができ、又ニューロン細胞
と同様に線維芽細胞のようなその他のタイプの細胞から
も誘導できる。
【００１５】
【課題を解決するための手段】本発明の第１の局面は、
より具体的には、神経変性疾患に関与するタンパク質又
はペプチドをコードする組換え型核酸であって、所定の
細胞区画内への前記タンパク質又はペプチドの集中を可
能にするように改変された組換え型核酸に関する。
より具体的には、神経変性疾患に関与するタンパク質又
はペプチドをコードする組換え型核酸であって、所定の
細胞区画内への前記タンパク質又はペプチドの集中を可
能にするように改変された組換え型核酸に関する。
【００１６】本発明のより具体的な態様は、神経変性疾
患に関与するタンパク質又はペプチドをコードする組換
え型核酸であって、その凝集又は立体配座の変更をひき
起こす目的で、所定の細胞区画内への前記タンパク質又
はペプチドの集中を可能にするように改変された組換え
型核酸に関する。
患に関与するタンパク質又はペプチドをコードする組換
え型核酸であって、その凝集又は立体配座の変更をひき
起こす目的で、所定の細胞区画内への前記タンパク質又
はペプチドの集中を可能にするように改変された組換え
型核酸に関する。
【００１７】本発明のもう１つの態様は、上述の組換え
型核酸の発現の結果として得られるタンパク質又はペプ
チドに関する。本発明のもう１つの態様は、上述の組換
え型核酸の発現産物ならびにこのような組換え型核酸を
含むあらゆるベクターに関する。
型核酸の発現の結果として得られるタンパク質又はペプ
チドに関する。本発明のもう１つの態様は、上述の組換
え型核酸の発現産物ならびにこのような組換え型核酸を
含むあらゆるベクターに関する。
【００１８】本発明は同様に、上述のような組換え型核
酸又はベクターを含むあらゆる細胞にも関する。好都合
には、これは、所定の細胞区画内でこのタンパク質又は
ペプチドを産生するような形で前記組換え型核酸を発現
できる細胞である。
酸又はベクターを含むあらゆる細胞にも関する。好都合
には、これは、所定の細胞区画内でこのタンパク質又は
ペプチドを産生するような形で前記組換え型核酸を発現
できる細胞である。
【００１９】本発明はさらに、上述の１又は２以上の組
換え型核酸又は上述のベクターをその細胞の一部又は全
ての中に有するヒト以外の動物にも関する。
換え型核酸又は上述のベクターをその細胞の一部又は全
ての中に有するヒト以外の動物にも関する。
【００２０】本発明はさらに、神経変性疾患の発生に干
渉し得る分子を同定するための、これらの細胞又は動物
の用途に関する。
渉し得る分子を同定するための、これらの細胞又は動物
の用途に関する。
【００２１】同様に本発明は生成されたタンパク質又は
ペプチドの凝集を阻害する特性を持つ化合物又は組成物
をスクリーニング又は同定するための上記の細胞又は動
物の用途に関する。
ペプチドの凝集を阻害する特性を持つ化合物又は組成物
をスクリーニング又は同定するための上記の細胞又は動
物の用途に関する。
【００２２】同様に本発明は産生されたタンパク質又は
ペプチドの凝集により誘発されるアポトーシスを阻害す
ることのできる化合物又は組成物をスクリーニング又は
同定するための上記の細胞又は動物の用途に関する。
ペプチドの凝集により誘発されるアポトーシスを阻害す
ることのできる化合物又は組成物をスクリーニング又は
同定するための上記の細胞又は動物の用途に関する。
【００２３】同様に本発明はベータアミロイドペプチド
の凝集を阻害することのできる化合物又は組成物をスク
リーニングし同定するための上記の細胞又は動物の用途
に関する。
の凝集を阻害することのできる化合物又は組成物をスク
リーニングし同定するための上記の細胞又は動物の用途
に関する。
【００２４】同様に本発明はベータアミロイドペプチド
の凝集により誘発されるアポトーシスを阻害することの
できる化合物又は組成物のスクリーニング又は同定のた
めの上記の細胞又は動物の用途に関する。
の凝集により誘発されるアポトーシスを阻害することの
できる化合物又は組成物のスクリーニング又は同定のた
めの上記の細胞又は動物の用途に関する。
【００２５】明確な細胞区画の中へタンパク質又はペプ
チドを集中させることによりモデルを獲得する可能性
は、例えばアルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ
病及びハンチントン病について例示することができる。
チドを集中させることによりモデルを獲得する可能性
は、例えばアルツハイマー病、クロイツフェルトヤコブ
病及びハンチントン病について例示することができる。
【００２６】したがって、本発明による特定の組換え型
核酸は、その場所でのその凝集を目的として所定の細胞
区画内へベータデンプン形成（１−４２）ペプチドを集
中させるための、このペプチドをコードするｃＤＮＡの
あらゆる改変によって表わされる。より具体的には、こ
の改変は、最初に、小胞体の中での分泌を可能にし一続
きの疎水性アミノ酸をコードする分泌配列に対応する核
酸配列（当業者には周知の配列）をベータ（１−４２）
ペプチドをコードする配列の上流に付加すること、次
に、アミロイドペプチドの凝集形態の小胞体内保持を特
定するべくＫＤＥＬアミノ酸連鎖を下流に付加すること
（Griffiths, G. et al., 1994, J. CellBiol., 127, p
1557〜1574）により構成され得る。
核酸は、その場所でのその凝集を目的として所定の細胞
区画内へベータデンプン形成（１−４２）ペプチドを集
中させるための、このペプチドをコードするｃＤＮＡの
あらゆる改変によって表わされる。より具体的には、こ
の改変は、最初に、小胞体の中での分泌を可能にし一続
きの疎水性アミノ酸をコードする分泌配列に対応する核
酸配列（当業者には周知の配列）をベータ（１−４２）
ペプチドをコードする配列の上流に付加すること、次
に、アミロイドペプチドの凝集形態の小胞体内保持を特
定するべくＫＤＥＬアミノ酸連鎖を下流に付加すること
（Griffiths, G. et al., 1994, J. CellBiol., 127, p
1557〜1574）により構成され得る。
【００２７】本発明によるもう１つの特定の組換え型核
酸は、所定の細胞区画の中へプリオンタンパク質を集中
させて、そこでこの病理学的立体配座を誘発することを
目的としたこのプリオンタンパク質のｃＤＮＡのあらゆ
る改変によって表わされる。より具体的には、この改変
は、マンノース−６−リン酸のカチオン依存性レセプタ
ーの細胞質領域をコードするｃＤＮＡ配列を、タンパク
質Ｐｒｐをコードする配列の下流に付加することであり
得る（Rohrer, J. et al, 1995, J. Cell. Biol, 130,
p1297〜1306）。この改変は、エンドソームの中にこの
ように改変されたタンパク質Ｐｒｐを局在化し、そこに
おけるその病理学的トランス立体配座に有利に作用する
ことを可能にしなくてはならない。
酸は、所定の細胞区画の中へプリオンタンパク質を集中
させて、そこでこの病理学的立体配座を誘発することを
目的としたこのプリオンタンパク質のｃＤＮＡのあらゆ
る改変によって表わされる。より具体的には、この改変
は、マンノース−６−リン酸のカチオン依存性レセプタ
ーの細胞質領域をコードするｃＤＮＡ配列を、タンパク
質Ｐｒｐをコードする配列の下流に付加することであり
得る（Rohrer, J. et al, 1995, J. Cell. Biol, 130,
p1297〜1306）。この改変は、エンドソームの中にこの
ように改変されたタンパク質Ｐｒｐを局在化し、そこに
おけるその病理学的トランス立体配座に有利に作用する
ことを可能にしなくてはならない。
【００２８】本発明によるもう１つの特定の組換え型核
酸はさらに、所定の細胞区分内へハンチンティンタンパ
ク質を集中させてその凝集を誘発することを目的とした
このタンパク質のｃＤＮＡのあらゆる改変により表わさ
れる。厳密には、この改変は、ハンチンティンのｃＤＮ
Ａに、このタンパク質に凝集性を付与する１１５〜１５
６個のグルタミン酸の反復をコードする配列を５′にお
いて付加することにより行なわれる（Davies et al, 19
97, Cell 90, p537）。さらに具体的には、この改変
は、アミノ酸連鎖ＰＫＫＫＲＫＶによってその原型が表
わされる核局在化配列をこのタンパク質内に挿入するこ
とによって行なわれ得る（Efthymiadis, A. et al, 199
7, 272, p22134〜22139）。好都合には、この核局在化
配列をハンチンティンのＣ末端に付加することもでき、
したがって、このタンパク質のＮＨ2末端にある凝集性
の原因であるグルタミン酸反復に干渉することはない。
酸はさらに、所定の細胞区分内へハンチンティンタンパ
ク質を集中させてその凝集を誘発することを目的とした
このタンパク質のｃＤＮＡのあらゆる改変により表わさ
れる。厳密には、この改変は、ハンチンティンのｃＤＮ
Ａに、このタンパク質に凝集性を付与する１１５〜１５
６個のグルタミン酸の反復をコードする配列を５′にお
いて付加することにより行なわれる（Davies et al, 19
97, Cell 90, p537）。さらに具体的には、この改変
は、アミノ酸連鎖ＰＫＫＫＲＫＶによってその原型が表
わされる核局在化配列をこのタンパク質内に挿入するこ
とによって行なわれ得る（Efthymiadis, A. et al, 199
7, 272, p22134〜22139）。好都合には、この核局在化
配列をハンチンティンのＣ末端に付加することもでき、
したがって、このタンパク質のＮＨ2末端にある凝集性
の原因であるグルタミン酸反復に干渉することはない。
【００２９】本発明の組換え型核酸は、（相補的、ゲノ
ミック、合成、半合成などの）ＤＮＡであってもよいし
ＲＮＡであってもよい。さらに、これらの核酸は、転写
シグナル（プロモーター、ターミネーターなど）を有し
ていてもよい。
ミック、合成、半合成などの）ＤＮＡであってもよいし
ＲＮＡであってもよい。さらに、これらの核酸は、転写
シグナル（プロモーター、ターミネーターなど）を有し
ていてもよい。
【００３０】本発明の組換え型核酸は、上述の改変され
たタンパク質又はペプチドのうちの１つの、複数の細胞
の中での発現を可能にするウイルス性（レトロウイル
ス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス）及び
非ウイルス性ベクターのあらゆる構築物の中に挿入する
ことができる。好都合には、これは、ニューロンの一次
培養物のような非増殖性細胞の感染を可能にするアデノ
ウイルスベクターであり得る。本発明によるもう１つの
特定のベクターは、上記のような改変されたタンパク質
の１つをそのニューロン内で発現するトランスジェニッ
ク動物を獲得できるようにするベクター構築物である。
たタンパク質又はペプチドのうちの１つの、複数の細胞
の中での発現を可能にするウイルス性（レトロウイル
ス、アデノウイルス、ＡＡＶ、ヘルペスウイルス）及び
非ウイルス性ベクターのあらゆる構築物の中に挿入する
ことができる。好都合には、これは、ニューロンの一次
培養物のような非増殖性細胞の感染を可能にするアデノ
ウイルスベクターであり得る。本発明によるもう１つの
特定のベクターは、上記のような改変されたタンパク質
の１つをそのニューロン内で発現するトランスジェニッ
ク動物を獲得できるようにするベクター構築物である。
【００３１】本発明はまた、上述のような改変されたタ
ンパク質の１つを構成的に又は誘発可能な形で発現する
細胞クローンを樹立することをも目的としている。好都
合には、これらのクローンは、細胞ＰＣ１２のような或
る種のニューロン分化特性を呈する細胞から誘導され得
る。
ンパク質の１つを構成的に又は誘発可能な形で発現する
細胞クローンを樹立することをも目的としている。好都
合には、これらのクローンは、細胞ＰＣ１２のような或
る種のニューロン分化特性を呈する細胞から誘導され得
る。
【００３２】本発明は同様に、上記の動物及び前記のよ
うな改変されたタンパク質の１つを発現するニューロン
の一次培養物の調製のためのこのようなトランスジェニ
ック動物のあらゆる用途をも目的とする。
うな改変されたタンパク質の１つを発現するニューロン
の一次培養物の調製のためのこのようなトランスジェニ
ック動物のあらゆる用途をも目的とする。
【００３３】本発明はまた、目的のタンパク質の凝集を
阻害する物性を持つ化合物又は組成物、特に化学的組成
物のスクリーニング又は同定のための、無細胞性、細胞
性又は動物のモデルの中で発現された上記の通りの改変
されたタンパク質の１つのあらゆる用途をも目的とす
る。
阻害する物性を持つ化合物又は組成物、特に化学的組成
物のスクリーニング又は同定のための、無細胞性、細胞
性又は動物のモデルの中で発現された上記の通りの改変
されたタンパク質の１つのあらゆる用途をも目的とす
る。
【００３４】本発明はさらに、細胞又は動物モデルの中
で発現された上記のとおりの改変されたタンパク質を、
このようなタンパク質の凝集により誘発されるアポトー
シスを阻害するその能力について、化合物又は組成物、
特に化学的組成物をスクリーニング又は同定する目的で
利用することをもその目的としている。
で発現された上記のとおりの改変されたタンパク質を、
このようなタンパク質の凝集により誘発されるアポトー
シスを阻害するその能力について、化合物又は組成物、
特に化学的組成物をスクリーニング又は同定する目的で
利用することをもその目的としている。
【００３５】本発明はまた、神経変性疾患に関与するタ
ンパク質の凝集を阻害する特性又はこのようなタンパク
質の凝集により誘発されるアポトーシスを阻害する能力
を持つ化合物のスクリーニング又は同定の方法にも関す
る。これらの方法は特に、上記のとおりの細胞又は動物
を、テスト化合物又は組成物の存在下におく工程、及び
凝集又はアポトーシスに対する効果を観察する工程を含
む。
ンパク質の凝集を阻害する特性又はこのようなタンパク
質の凝集により誘発されるアポトーシスを阻害する能力
を持つ化合物のスクリーニング又は同定の方法にも関す
る。これらの方法は特に、上記のとおりの細胞又は動物
を、テスト化合物又は組成物の存在下におく工程、及び
凝集又はアポトーシスに対する効果を観察する工程を含
む。
【００３６】以下、本発明を、制限的な意味のない一例
としてみなされるべき実施例を用いて、さらに詳細に説
明する。
としてみなされるべき実施例を用いて、さらに詳細に説
明する。
【００３７】
【実施例】１．小胞体内のアミロイドペプチド蓄積によ
って誘発される細胞ストレスモデル例 小胞体内の分泌配列及び保持配列すなわちＫＤＥＬアミ
ノ酸連鎖のベータアミロイド（１−４２）ペプチドへの
添加は、当業者にとって既知の分子生物学上の従来の技
術にしたがって実現される。
って誘発される細胞ストレスモデル例 小胞体内の分泌配列及び保持配列すなわちＫＤＥＬアミ
ノ酸連鎖のベータアミロイド（１−４２）ペプチドへの
添加は、当業者にとって既知の分子生物学上の従来の技
術にしたがって実現される。
【００３８】この構築物の目的は、互いに凝集しその後
アポトーシスを誘発する能力を持つタンパク質を発現す
ることにあることから、誘発可能な発現ベクターの中に
改変されたアミロイドペプチドをコードするｃＤＮＡ配
列を導入するのが好都合である。好都合には、特にテト
ラサイクリンの存在下で、誘発されていない条件の下で
の導入遺伝子の厳密な抑制を確実に行ない、この抗生物
質を除去した時点で強い誘発を可能にするように、誘発
可能なベクターが選択される。
アポトーシスを誘発する能力を持つタンパク質を発現す
ることにあることから、誘発可能な発現ベクターの中に
改変されたアミロイドペプチドをコードするｃＤＮＡ配
列を導入するのが好都合である。好都合には、特にテト
ラサイクリンの存在下で、誘発されていない条件の下で
の導入遺伝子の厳密な抑制を確実に行ない、この抗生物
質を除去した時点で強い誘発を可能にするように、誘発
可能なベクターが選択される。
【００３９】このモデルの目的は、ベータアミロイドペ
プチドの凝集を阻害するか又は細胞の生存度を改善する
ための化学的組成物又は戦略を同定することにあるた
め、選択された導入遺伝子の誘発可能な発現システムが
中で樹立される細胞モデルとして、ヒト由来のＨｅｌａ
系が検討された。非ニューロン系であるこの系統は、優
れたトランスフェクション効率を有し、テトラサイクリ
ンの存在下での基礎レベルの発現が存在しない。
プチドの凝集を阻害するか又は細胞の生存度を改善する
ための化学的組成物又は戦略を同定することにあるた
め、選択された導入遺伝子の誘発可能な発現システムが
中で樹立される細胞モデルとして、ヒト由来のＨｅｌａ
系が検討された。非ニューロン系であるこの系統は、優
れたトランスフェクション効率を有し、テトラサイクリ
ンの存在下での基礎レベルの発現が存在しない。
【００４０】リプレッサーｔｅｔを構成的に発現するＨ
ｅｌａ系は、市販されている（Clontech）。
ｅｌａ系は、市販されている（Clontech）。
【００４１】上記の改変されたベータアミロイド（１−
４２）ペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するベクタ
ーは、当業者に公知の技術を用いてトランスフェクショ
ンにより導入される。この遺伝子構築物を組込んだＨｅ
ｌａクローンの選定は、選定用物質に対する耐性を生じ
させる第２のプラスミドの同時トランスフェクションに
より行なわれる。好都合には、選ばれた物質はヒグロマ
イシンである。
４２）ペプチドをコードするｃＤＮＡを含有するベクタ
ーは、当業者に公知の技術を用いてトランスフェクショ
ンにより導入される。この遺伝子構築物を組込んだＨｅ
ｌａクローンの選定は、選定用物質に対する耐性を生じ
させる第２のプラスミドの同時トランスフェクションに
より行なわれる。好都合には、選ばれた物質はヒグロマ
イシンである。
【００４２】ヒグロマイシン耐性を持つＨｅｌａクロー
ンは、テトラマイシンの除去による発現の誘発の際の改
変されたペプチドの発現の特徴づけにより選択された。
ンは、テトラマイシンの除去による発現の誘発の際の改
変されたペプチドの発現の特徴づけにより選択された。
【００４３】標準的には、最も強い発現を可能にする５
つのクローンが、その後の研究用に選択された。
つのクローンが、その後の研究用に選択された。
【００４４】これら５つのクローンのうちテトラサイク
リンの存在下で最高の生存度を示し、この抗生物質の不
在下で最高のアポトーシスを示す（ゲノムＤＮＡの分解
により明らかになる）クローン１５．０９をその後形態
学的に特徴づけした。
リンの存在下で最高の生存度を示し、この抗生物質の不
在下で最高のアポトーシスを示す（ゲノムＤＮＡの分解
により明らかになる）クローン１５．０９をその後形態
学的に特徴づけした。
【００４５】細胞生物学及び免疫組織化学的技術によ
り、特にテトラサイクリンの不在下での小胞体内の改変
されたペプチドの蓄積が明らかになった。その上、改変
されたペプチドの発現の抑制解除に続く３時間以内に、
この細胞器官の著しい拡大が目に見えた。
り、特にテトラサイクリンの不在下での小胞体内の改変
されたペプチドの蓄積が明らかになった。その上、改変
されたペプチドの発現の抑制解除に続く３時間以内に、
この細胞器官の著しい拡大が目に見えた。
【００４６】電気泳動により明らかにされるゲノムＤＮ
Ａの分解パターンの他に、Ｈｅｌａ細胞の中で誘発され
るアポトーシスは、ストレスキナーゼＪＮＫ１及びＪＮ
Ｋ２の高い活性化とも相関関係を持つ。
Ａの分解パターンの他に、Ｈｅｌａ細胞の中で誘発され
るアポトーシスは、ストレスキナーゼＪＮＫ１及びＪＮ
Ｋ２の高い活性化とも相関関係を持つ。
【００４７】ＫＤＥＬではなく対照として用いられたＥ
ＬＫＤ配列に融合されたベータアミロイドペプチドを発
現するクローンの中にも、又出発Ｈｅｌａ系統の中に
も、これらのアポトーシスマーカーは全く観察されなか
った。同様に、ベータアミロイドペプチドと同じアミノ
酸に対応するが順序が異なっている４２アミノ酸のペプ
チドがＫＤＥＬ配列に融合された場合、細胞超微構造の
変性も、ゲノムＤＮＡの改変も、また、ストレスキナー
ゼ構成性活性化も全く見られなかった。
ＬＫＤ配列に融合されたベータアミロイドペプチドを発
現するクローンの中にも、又出発Ｈｅｌａ系統の中に
も、これらのアポトーシスマーカーは全く観察されなか
った。同様に、ベータアミロイドペプチドと同じアミノ
酸に対応するが順序が異なっている４２アミノ酸のペプ
チドがＫＤＥＬ配列に融合された場合、細胞超微構造の
変性も、ゲノムＤＮＡの改変も、また、ストレスキナー
ゼ構成性活性化も全く見られなかった。
【００４８】これらの結果は、アルツハイマー病に最も
関連する凝集性ペプチドの小胞体内での保持によるアポ
トーシスモデルの獲得を裏づけている。
関連する凝集性ペプチドの小胞体内での保持によるアポ
トーシスモデルの獲得を裏づけている。
【００４９】このモデルの利用分野は以下の通りであ
る： − ベータアミロイドペプチドの凝集を阻害する能力を
持つ化学的化合物を同定することを目的とした上述の戦
略に基づく細胞モデルの利用。 − ベータアミロイドペプチドの凝集により誘発される
アポトーシスを阻害する能力を持つ化学的化合物を同定
することを目的とした上述の戦略に基づく細胞モデルの
利用。
る： − ベータアミロイドペプチドの凝集を阻害する能力を
持つ化学的化合物を同定することを目的とした上述の戦
略に基づく細胞モデルの利用。 − ベータアミロイドペプチドの凝集により誘発される
アポトーシスを阻害する能力を持つ化学的化合物を同定
することを目的とした上述の戦略に基づく細胞モデルの
利用。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 45/00 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ
Claims (10)
- 【請求項１】 神経変性疾患に関与するタンパク質又は
ペプチドをコードする組換え型核酸であって、所定の細
胞区画内への前記タンパク質又はペプチドの集中を可能
にするように改変された組換え型核酸。 - 【請求項２】 請求項１に記載の組換え型核酸の発現の
結果として得られるタンパク質又はペプチド。 - 【請求項３】 請求項１に記載の組換え型核酸を含むベ
クター。 - 【請求項４】 請求項１に記載の組換え型核酸又は請求
項３に記載のベクターを含む細胞。 - 【請求項５】 請求項１に記載の組換え型核酸又は請求
項３に記載のベクターをその細胞の一部又は全ての中に
有するヒト以外の動物。 - 【請求項６】 神経変性疾患の発生に干渉し得る分子を
同定するための請求項４又は５に記載の細胞又は動物の
用途。 - 【請求項７】 生成されたタンパク質又はペプチドの凝
集を阻害する特性を持つ化合物又は組成物をスクリーニ
ング又は同定するための、請求項４又は５に記載の細胞
又は動物の用途。 - 【請求項８】 産生されたタンパク質又はペプチドの凝
集により誘発されるアポトーシスを阻害することのでき
る化合物又は組成物をスクリーニング又は同定するため
の、請求項４又は５に記載の細胞又は動物の用途。 - 【請求項９】 ベータアミロイドペプチドの凝集を阻害
することのできる化合物又は組成物をスクリーニングし
同定するための請求項７に記載の用途。 - 【請求項１０】 ベータアミロイドペプチドの凝集によ
り誘発されるアポトーシスを阻害することのできる化合
物又は組成物のスクリーニング又は同定のための請求項
８に記載の用途。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9802145 | 1998-02-23 | ||
| FR9802145A FR2777015B3 (fr) | 1998-02-23 | 1998-02-23 | Procede et moyens pour l'obtention de modeles cellulaires et animaux de maladies neurodegeneratives |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11285382A true JPH11285382A (ja) | 1999-10-19 |
Family
ID=9523246
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP11038522A Pending JPH11285382A (ja) | 1998-02-23 | 1999-02-17 | 神経変性疾患の細胞及び動物モデルを獲得するための方法及び手段 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH11285382A (ja) |
| DE (1) | DE19907493A1 (ja) |
| FR (1) | FR2777015B3 (ja) |
| GB (1) | GB2335192A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1325652C (zh) * | 2005-10-13 | 2007-07-11 | 上海交通大学 | 提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法 |
| US8715643B2 (en) | 2008-04-09 | 2014-05-06 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | TDP-43-storing cell model |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| TWI239847B (en) | 1997-12-02 | 2005-09-21 | Elan Pharm Inc | N-terminal fragment of Abeta peptide and an adjuvant for preventing and treating amyloidogenic disease |
| US6923964B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-08-02 | Neuralab Limited | Active immunization of AScr for prion disorders |
| US7964192B1 (en) | 1997-12-02 | 2011-06-21 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Prevention and treatment of amyloidgenic disease |
| US6787523B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US6913745B1 (en) | 1997-12-02 | 2005-07-05 | Neuralab Limited | Passive immunization of Alzheimer's disease |
| US6743427B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-06-01 | Neuralab Limited | Prevention and treatment of amyloidogenic disease |
| US20080050367A1 (en) | 1998-04-07 | 2008-02-28 | Guriq Basi | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US6761888B1 (en) | 2000-05-26 | 2004-07-13 | Neuralab Limited | Passive immunization treatment of Alzheimer's disease |
| US7790856B2 (en) | 1998-04-07 | 2010-09-07 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| US6710226B1 (en) | 1997-12-02 | 2004-03-23 | Neuralab Limited | Transgenic mouse assay to determine the effect of Aβ antibodies and Aβ Fragments on alzheimer's disease characteristics |
| US20030147882A1 (en) | 1998-05-21 | 2003-08-07 | Alan Solomon | Methods for amyloid removal using anti-amyloid antibodies |
| US6787637B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-09-07 | Neuralab Limited | N-Terminal amyloid-β antibodies |
| UA81216C2 (en) | 1999-06-01 | 2007-12-25 | Prevention and treatment of amyloid disease | |
| JP2005231998A (ja) * | 2000-02-01 | 2005-09-02 | Zeria Pharmaceut Co Ltd | 透析アミロイド線維重合核の製造方法及び透析アミロイド−シス治療剤のスクリーニング方法並びに透析アミロイドーシス治療剤 |
| US7700751B2 (en) | 2000-12-06 | 2010-04-20 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Humanized antibodies that recognize β-amyloid peptide |
| MY139983A (en) | 2002-03-12 | 2009-11-30 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Humanized antibodies that recognize beta amyloid peptide |
| PE20050627A1 (es) | 2003-05-30 | 2005-08-10 | Wyeth Corp | Anticuerpos humanizados que reconocen el peptido beta amiloideo |
| PE20061329A1 (es) | 2004-12-15 | 2006-12-08 | Neuralab Ltd | Anticuerpos ab humanizados para mejorar la cognicion |
| US8784810B2 (en) | 2006-04-18 | 2014-07-22 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of amyloidogenic diseases |
| US8003097B2 (en) | 2007-04-18 | 2011-08-23 | Janssen Alzheimer Immunotherapy | Treatment of cerebral amyloid angiopathy |
| PL2182983T3 (pl) | 2007-07-27 | 2014-10-31 | Janssen Alzheimer Immunotherap | Leczenie chorób amyloidowych z wykorzystaniem humanizowanych przeciwciał specyficznych względem Abeta |
| JO3076B1 (ar) | 2007-10-17 | 2017-03-15 | Janssen Alzheimer Immunotherap | نظم العلاج المناعي المعتمد على حالة apoe |
| US9067981B1 (en) | 2008-10-30 | 2015-06-30 | Janssen Sciences Ireland Uc | Hybrid amyloid-beta antibodies |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9316727D0 (en) * | 1993-08-12 | 1993-09-29 | Inst Of Psychiatry | Models of alzheimers's disease |
-
1998
- 1998-02-23 FR FR9802145A patent/FR2777015B3/fr not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-02-17 JP JP11038522A patent/JPH11285382A/ja active Pending
- 1999-02-22 DE DE19907493A patent/DE19907493A1/de not_active Withdrawn
- 1999-02-23 GB GB9903955A patent/GB2335192A/en not_active Withdrawn
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1325652C (zh) * | 2005-10-13 | 2007-07-11 | 上海交通大学 | 提高外源蛋白在转基因植物中累积的方法 |
| US8715643B2 (en) | 2008-04-09 | 2014-05-06 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | TDP-43-storing cell model |
| JP5667872B2 (ja) * | 2008-04-09 | 2015-02-12 | 公益財団法人東京都医学総合研究所 | Ｔｄｐ−４３蓄積細胞モデル |
| US9128081B2 (en) | 2008-04-09 | 2015-09-08 | Tokyo Metropolitan Institute Of Medical Science | TDP-43-storing cell model |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| GB2335192A (en) | 1999-09-15 |
| FR2777015A1 (fr) | 1999-10-08 |
| GB9903955D0 (en) | 1999-04-14 |
| FR2777015B3 (fr) | 2000-09-15 |
| DE19907493A1 (de) | 1999-08-26 |
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