JP2021508251A - アルツハイマー病をモデル化する新しいヒト誘発多能性幹細胞株およびその使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、ｈｉＰＳＣのβ−セクレターゼのレベルの増加および／またはＡβ−４２ペプチドの増加を誘発するように、ＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに組み込むことを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製する方法に関し、また、この方法で調製されたアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルにも関する。

Description

本発明は、生物医学分野、特にアルツハイマー病（ＡＤ）のために生理学的に関連する細胞モデルを作成することに関する。具体的には、本発明は、ヒト誘発多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を遺伝子修飾することによりＡＤ細胞モデルを調製する方法に関する。

アルツハイマー病（ＡＤ）は慢性神経変性疾患であり、認知症の最も一般的な原因である。双子と家族の研究に基づいたレビューによれば、アルツハイマー病の遺伝的遺伝率は、４９％から７９％の範囲にある¹‐²。症例の約０．１％は、家族性の常染色体（非性関連）優性遺伝であり、６５歳以前に発症する³。この形の疾患は、早期発症型家族性アルツハイマー病と呼ばれる。常染色体優性家族性ＡＤのほとんどは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）をコードする遺伝子と、プレセニリン１をコードする遺伝子と、プレセニリン２をコードする遺伝子との３つの遺伝子から選ばれる１つにおける変異に起因する可能性がある⁴。ＡＰＰとプレセニリン遺伝子のほとんどの変異は、老人斑の主成分であるＡβ４２と呼ばれる小さいタンパク質の生成を増加させる⁵。

アルツハイマー病のほとんどの症例は常染色体優性遺伝を示さず、孤発性ＡＤと呼ばれ、環境的および遺伝的差異が危険因子であるかもしれない。最も目立つ遺伝的危険因子は、アポリポタンパク質Ｅのε４対立遺伝子の遺伝である（ＡＰＯＥ）^6-7。ＡＤ患者の４０％〜８０％は少なくとも１つのＡＰＯＥε４対立遺伝子を持っている⁷。ＡＰＯＥε４対立遺伝子は、ヘテロ接合体では３倍、ホモ接合体では１５倍、疾患のリスクを増加させる³。

ＴＲＥＭ２遺伝子の変異は、アルツハイマー病を発症するリスクが３〜５倍高くなることに関連している^8-9。一般に認められている作用メカニズムは、ＴＲＥＭ２が変異すると、脳内の白血球が存在するβアミロイドの量を制御できなくなることである。

ＡＤには２つの異なる特徴がある。１つはアミロイドβ‐タンパク質（Ａβ）を含む細胞外プラークの存在であり、もう１つは細胞内神経原線維変化（ＮＦＴ）である。ＡＤの真の病理はまだ明確ではないが、何十年にわたる研究の積み重ねは、アミロイドカスケード仮説に強力な証拠を提供している。この仮説によると、ＡＤを引き起こす重要なイベントは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の処理中に特定のペプチドが形成されることのようであり、アミロイドβペプチド４２（Ａβ₄₂）は、容易に凝集してＡβ₄₂オリゴマーを形成し、その後にアミロイドプラークを形成する、粘着性ペプチドであり、これはＡＤの１つの特徴である。Ａβ₄₂凝集体とアミロイドプラークの存在は、ニューロンの炎症を引き起こし、カルシウム活性化キナーゼの発現を増加させることができ、これは却ってニューロンの細胞骨格微小管を安定化するｔａｕタンパク質の過剰なリン酸化を誘導する。ｔａｕタンパク質の過剰リン酸化は、ＡＤの２つ目の特徴であるニューロンでの神経原線維変化の形成を引き起こし、続いてニューロン死を引き起こす^10-14。

α−セクレターゼと、β−セクレターゼと、γ−セクレターゼとの３つの酵素は、ＡＰＰの切断に関与する。正常なプロセスでは、ＡＰＰはまずα−セクレターゼまたはβ−セクレターゼによって切断され、γ−セクレターゼは、さらに切断される生成物を異なる長さのペプチドの混合物に処理する。ＡＰＰがβ−セクレターゼによって切断される場合、生成物はγ−セクレターゼによってさらに切断されて可溶性の４０個のアミノ酸アミロイドペプチド（Ａβ₄₀）または４２個のアミノ酸のペプチド（Ａβ₄₂）を生成し、これら４２個のアミノ酸のペプチドは凝集して不溶性凝集体を形成し、これによってアミロイドプラークを形成する。アミロイドカスケード仮説の強力な証拠は、家族性ＡＤ（ＦＡＤ）の研究からであり、すべての家族性ＡＤ患者のＡＰＰまたはプレセニリン（ＰＳ）遺伝子に変異があることを示している。ＡＰＰ遺伝子の変異は異常なＡＰＰタンパク質を引き起こし、この異常なＡＰＰタンパク質はβ−セクレターゼによって優先的に切断されてより多くのＡβペプチドを生成する。一方、ＰＳ遺伝子の変異は、アミロイドプラークの成分であるＡβ₄₂ペプチドを優先的に生成する。もう一つの重要な観察結果は、β−セクレターゼの発現及び酵素活性が、ＡＤ患者、特にＡＤ人口の９０％以上を占める孤発性ＡＤ（ＳＡＤ）患者で有意に上昇していることである。アミロイド沈着の影響を受けた脳領域では、β−セクレターゼタンパク質と活性レベルが上昇し、この上昇が維持されているが、ＡＤにおけるニューロンとシナプスは明らかに失われている^15-17。

β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）は、β−サイトアミロイド前駆体タンパク質切断酵素１、β部位ＡＰＰ切断酵素１、膜関連アスパラギン酸プロテアーゼ２、メマプシン−２、アスパルチルプロテアーゼ２、およびＡＰＳ２とも呼ばれ、末梢神経細胞のミエリン鞘の形成時に重要なアスパラギン酸プロテアーゼである¹⁸。ヒトでは、ＢＡＣＥ１遺伝子によってコードされる。ＢＡＣＥ１によるＡＰＰの細胞外切断により、可溶性の細胞外フラグメントと、Ｃ９９と呼ばれる細胞膜結合フラグメントとが生成する。γ−セクレターゼによる膜貫通ドメイン内のＣ９９の切断により、ＡＰＰの細胞内ドメインが放出され、アミロイドβが生成する。γ−セクレターゼはＢＡＣＥ１よりも細胞膜に近い場所でＡＰＰを切断するため、γ−セクレターゼはアミロイド−βペプチドのフラグメントを除去する。ＢＡＣＥ１ではなくα−セクレターゼによってＡＰＰを初歩的に切断することは、アミロイドβの最終的な生成を防ぐことができる。

ＡＰＰおよびプレセニリン（ＰＳ）タンパク質とは異なり、ＢＡＣＥ１をコードする遺伝子には、まれな疾患である早期発症型家族性アルツハイマー病を引き起こす既知の変異はない。しかしながら、この酵素のレベルがより一般的な遅発性孤発性アルツハイマー病で増加することは示されている。ＢＡＣＥによるＡＰＰおよびその他の膜貫通タンパク質の切断の生理学的目的は不明である。ＢＡＣＥ２は、ＢＡＣＥ１に近接した相同体であり、生体内でのＡＰＰ切断は報告されていない。

Ａβ−４２ペプチドの生成はアミロイドプラークの形成において主要な役割を果たすので、過去２０年間のすべての創薬努力は、β−セクレターゼ活性を阻害するまたはＡβ−４２の凝集を阻害することによるＡβ−４２ペプチドの減少に集中している^19-26。しかし、ＡＤ薬剤開発の主要な問題の１つは、適切なＡＤモデルの欠如である。今まで最もよく知られているＡＤモデルは、変異ＡＰＰおよびＰＳ１遺伝子をマウスゲノムに挿入して高齢マウスにおいてＡＤ表現型を示す５×ＦＡＤトランスジェニックマウスである²⁷。５×ＦＡＤマウスモデルは広く使用されているが、薬剤開発においてその有用性に関して２つの主な欠点がある。第１に、ヒトの中枢神経系はマウスの中枢神経系とは非常に異なるため、５×ＦＡＤモデルでテストされた候補薬剤は通常、ヒトへの影響についての予測可能性が劣る。第２に、５×ＦＡＤマウスが表現型を示すには６〜８か月またはそれ以上かかるため、このモデルは明らかにＡＤ候補薬剤の早期スクリーニングには適していない。

多能性幹細胞は、無期限に増殖するだけではなく、ニューロン、心臓、膵臓細胞、肝細胞など、ヒト体内の他の細胞型を生成できるため、細胞モデルの調製において大きな発展の見込みがある。ヒト誘導多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）は、成体細胞から直接に生成できる多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣ技術は、日本の京都にある山中伸弥氏の研究室によって開拓された。転写因子をコードする４つの特定の遺伝子の導入により、成体細胞を多能性幹細胞に転換できることを、山中氏は２００６年に発表した。この画期的な技術は、体細胞のリプログラミング技術であり、これにより、研究者は、皮膚線維芽細胞などの最終分化細胞を胚性幹細胞段階に戻すことができる^28-29。

ｈｉＰＳＣは様々な疾患の患者から入手でき、無期限に増殖できるため、無制限の細胞ソースを提供できる。さらに重要なことに、これらの患者由来のｈｉＰＳＣは、疾患関連の初代細胞に再分化し、細胞レベルで疾患の表現型を示すことができる^30-36。これは、ｈｉＰＳＣベースの細胞疾患モデルを作成するための１つの一般的なストラテジーである。このストラテジーは、疾患と明確に診断された患者からｈｉＰＳＣを生成し、患者由来のｈｉＰＳＣを標的細胞型に分化させてインビトロで疾患の表現型を示すことである。

患者由来のｈｉＰＳＣの他に、研究者らは細胞疾患モデルを確立ための別のストラテジーを実験している。研究者たちは、病気にかかっていないヒトからｈｉＰＳＣを生成し、ゲノム編集技術によって致病遺伝子をｈｉＰＳＣに導入する。

ｈｉＰＳＣから適切なＡＤ細胞モデルを生成するには、次のいくつかの基準を満たす必要がある。それは、生理学的にヒト機能性ニューロンと同等でなければならず、比較的に短い期間でインビトロでＡＤ表現型を示さなければならず、ＡＤ関連のヒトニューロンを一貫して大量に再現できる必要がある。何十年にもわたる研究にも関わらず、これまでこのような細胞モデルを調製するには真に成功していない。

本発明は、アルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製する方法を提供することにより、上述のニーズの少なくとも一部を満たし、この方法は、ｈｉＰＳＣを遺伝子編集して、細胞モデルが由来する同質遺伝子ｈｉＰＳＣと比較してより高いレベルのβ−セクレターゼとβ−４２ペプチドを生成することを含む。

本発明について、本発明者らはＡＤ関連遺伝子を非罹患ｈｉＰＳＣに導入して、同質遺伝子系、すなわち、同じ遺伝的背景を有する罹患細胞株と非罹患細胞株を得て、ゲノム編集技術によって導入されたＡＤ関連遺伝子のスタッキング効果により、罹患細胞株は比較的に短い期間においてインビトロで細胞レベルでＡＤ表現型を示す。

一態様では、本発明は、β−セクレターゼのレベルおよび／またはＡβ−４２ペプチドの増加を誘発するようにＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに組み込むことを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製する方法を提供する。一つの実施形態では、前記ＡＤ関連遺伝子はｈｉＰＳＣにおいて構成的に過剰発現される。一つの実施形態では、前記ＡＤ関連遺伝子は、ＡＤを引き起こす変異ＡＰＰまたは変異ＰＳ遺伝子、特にＰＳ１ｄＥ９遺伝子である。一つの実施形態では、前記ＡＤ関連遺伝子はＢＡＣＥ１遺伝子である。一つの実施形態では、前記ＡＤ関連遺伝子は、ＡＤを引き起こす変異ＡＰＰ、ＰＳ１ｄＥ９遺伝子、およびＢＡＣＥ１遺伝子から選択される一つ以上である。

ある実施形態では、前記ＡＤ関連遺伝子が部位特異的な方法によりｈｉＰＳＣに組み込まれる。好ましくは、前記ＡＤ関連遺伝子がＡＡＶＳ１部位でｈｉＰＳＣに組み込まれる。

一態様では、本発明は、上記方法により生成されたアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを提供する。

一態様では、本発明は、ＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに導入して構成的に過剰発現させることを含む、ｈｉＰＳＣを修飾する方法を含む。一つの実施形態では、前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによってｈｉＰＳＣに導入され、前記ヌクレオチド配列が、哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターに機能的に連結されている。一つの実施形態では、前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである。一つの実施形態では、哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子が、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む同一の発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターによって前記ｈｉＰＳＣにさらに導入される。一つの実施形態では、前記プロモーターがＰＧＡプロモーターまたはＣＡＧプロモーターである。一つの実施形態では、発現ベクターがさらに、部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列を含み、好ましくは、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同なヌクレオチド配列を含む。

一態様では、本発明は、哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターに機能的に連結され、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクターを提供する。一つの実施形態では、前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである。一つの実施形態では、前記ベクターは、哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。一つの実施形態では、前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである。一つの実施形態では、前記ベクターは、部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列をさらに含み、好ましくは、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同なヌクレオチド配列を含む。一つの実施形態では、薬剤選択遺伝子は抗生物質耐性遺伝子であり、好ましくは、ピューロマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン耐性遺伝子である。一つの実施形態では、レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。一つの実施形態では、ベクター内のすべてのエレメントが、前記ＡＤ関連遺伝子の発現に寄与する順序で排列している。好ましくは、ベクター内のすべてのエレメントがシス順で排列している。

一態様では、本発明は、第１のプロモーターと、前記第一のプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子と、第二のプロモーターと、前記第二のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子に連結されているＡＤ関連遺伝子と、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同な配列とのコード核酸配列を含む遺伝子構築体であって、前記エレメントがシス順で排列している、遺伝子構築体を提供する。一つの実施形態では、前記第１のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、前記第二のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記ＡＤ関連遺伝子が、ＢＡＣＥ１をコードする遺伝子であり、前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍色タンパク質をコードする遺伝子であり、好ましくは、緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である。一つの実施形態では、前記第１のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、前記第二のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記ＡＤ関連遺伝子がＰＳ１ｄＥ９であり、前記レポーター遺伝子がＧＦＰである。一つの実施形態では、抗生物質耐性遺伝子が、ピューロマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン耐性遺伝子である。

一態様では、本発明は、上記発現ベクターのいずれか一つまたは上記遺伝子構築体のいずれか一つによって転換されたｈｉＰＳＣ細胞株を提供する。一つの実施形態では、前記ｈｉＰＳＣ細胞株は、ＡＤ細胞モデルの生成に使用される。

一態様では、本発明は、ヒトＡＡＶＳ１部位でＢＡＣＥ１遺伝子を組み込み、前記組み込まれたＢＡＣＥ１遺伝子を構成的に過剰発現する、ＡＤ細胞モデルとして使用される遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣを提供する。一つの実施形態では、前記ＢＡＣＥ１遺伝子が組み込まれていない同質遺伝子ｈｉＰＳＣと比較して、修飾されたｈｉＰＳＣは、増加したβ−セクレターゼ、Ａβ４２／Ａβ−４０比、および／またはＡβ−４２ペプチドを示す。一つの実施形態では、修飾されたｈｉＰＳＣは、ヒトＡＡＶＳ１部位でＰＳ１ｄＥ９遺伝子を組み込み、前記組み込まれたＰＳ１ｄＥ９遺伝子を構成的に過剰発現する。

一態様では、本発明は、ＡＤ治療薬のハイスループットスクリーニングのための、遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣの使用を含む。

一態様では、本発明は、
ｉ）上記発現ベクターまたは上記遺伝子構築体をｈｉＰＳＣに導入することにより、ｈｉＰＳＣからアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製することと、
ｉｉ）細胞モデルで候補化合物を２日から２週間培養することと、
ｉｉｉ）前記候補化合物を添加する前後のβ−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比を測定することと、
ｉｖ）β−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比から選択される一つ以上の測定値の減少が、前記候補化合物がＡＤの治療のための潜在的な治療薬であることを示すこととを含む、
ＡＤ治療薬をハイスループットスクリーニングするための方法を提供する。

一つの実施形態では、前記ｈｉＰＳＣがヒトドナーに由来し、好ましくは、ＡＤを有さない正常なヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される。一つの実施形態では、前記方法は初期のＡＤ薬スクリーニング用である。

一態様では、本発明は、
ｉ）ＢＡＣＥ１遺伝子またはＰＳ１ｄＥ９遺伝子を構成的に過剰発現させることによりｈｉＰＳＣ細胞株を修飾することと、
ｉｉ）前記ｈｉＰＳＣ細胞株を機能性ニューロンに再分化することと、
ｉｉｉ）候補化合物の存在下で前記機能性ニューロンを培養することと、
ｉｖ）β−セクレターゼのレベル、Ａβ４２／Ａβ−４０比、及び／またはＡβ−４２濃度を測定し、β−セクレターゼのレベル、Ａβ４２／Ａβ−４０比、及び／またはＡβ−４２濃度を低減できる化合物を選択することとを含む、
β−セクレターゼまたはＡβ−４２阻害剤をスクリーニングするための薬剤スクリーニング方法を提供する。

一つの実施形態では、前記方法は、候補薬剤化合物の存在下で前記機能性ニューロンを２日から２週間培養することを含む。一つの実施形態では、前記ｈｉＰＳＣがヒトドナーに由来し、好ましくは、ＡＤを有さない正常なヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される。一つの実施形態では、上記発現ベクターまたは上記遺伝子構築体をｈｉＰＳＣに導入することによって前記ｈｉＰＳＣを調製する。

具体的には、本発明は以下に係る。

１．ｈｉＰＳＣのβ−セクレターゼのレベルの増加および／またはＡβ−４２ペプチドの増加を誘発するようにＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに組み込むことを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製する方法。

２．前記ＡＤ関連遺伝子がｈｉＰＳＣにおいて構成的に過剰発現される、項１に記載の方法。

３．前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤを引き起こす変異ＡＰＰ遺伝子または変異ＰＳ遺伝子である、項１または２に記載の方法。

４．前記変異ＰＳ遺伝子がＰＳ１ｄＥ９遺伝子である、項３に記載の方法。

５．前記ＡＤ関連遺伝子がＢＡＣＥ１遺伝子である、項１または２に記載の方法。

６．前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤを引き起こす変異ＡＰＰ遺伝子、ＰＳ１ｄＥ９遺伝子、およびＢＡＣＥ１遺伝子から選択される、項１〜５のいずれか一項に記載の方法。

７．前記ＡＤ関連遺伝子が部位特異的な方法によりｈｉＰＳＣに組み込まれる、項１〜６のいずれか一項に記載の方法。

８．前記ＡＤ関連遺伝子がＡＡＶＳ１部位でｈｉＰＳＣに組み込まれる、項７に記載の方法。

９．項１〜８のいずれか一項に記載の方法により生成されたアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデル。

１０．ＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに導入して構成的に過剰発現させることを含む、ｈｉＰＳＣを修飾する方法。

１１．前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによってｈｉＰＳＣに導入され、前記ヌクレオチド配列が、哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターに機能的に連結されている、項１０に記載の方法。

１２．前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、項１１に記載の方法。

１３．哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子が、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む同一の発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターによって前記ｈｉＰＳＣにさらに導入される、項１１または１２に記載の方法。

１４．前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、項１３に記載の方法。

１５．前記発現ベクターがさらに、部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列を含む、項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。

１６．前記部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列が、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同なヌクレオチド配列である、項１５に記載の方法。

１７．哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターに機能的に連結され、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。

１８．前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、項１７に記載のベクター。

１９．哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、項１７または１８に記載のベクター。

２０．前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、項１９に記載のベクター。

２１．部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列をさらに含む、項１７〜２０のいずれか一項に記載のベクター。

２２．前記部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列が、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同なヌクレオチド配列である、項２１に記載のベクター。

２３．前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、項１７〜２２のいずれか一項に記載のベクター。

２４．前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、項１７〜２３のいずれか一項に記載のベクター。

２５．前記ベクター内のすべてのエレメントが、前記ＡＤ関連遺伝子の発現に寄与する順序で排列している、項１７〜２４のいずれか一項に記載のベクター。

２６．前記ベクター内のすべてのエレメントがシス順で排列している、項２５に記載のベクター。

２７．第１のプロモーターと、前記第一のプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子と、第二のプロモーターと、前記第二のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子に連結されているＡＤ関連遺伝子と、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同な配列とのコード核酸配列を含む遺伝子構築体であって、前記エレメントがシス順で排列している、遺伝子構築体。

２８．前記第１のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、前記第二のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記ＡＤ関連遺伝子が、ＢＡＣＥ１をコードする遺伝子であり、前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍色タンパク質をコードする遺伝子である、項２７に記載の遺伝子構築体。

２９．前記第１のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、前記第二のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記ＡＤ関連遺伝子が、ＰＳ１ｄＥ９をコードする遺伝子であり、前記レポーター遺伝子が、ＧＦＰをコードする遺伝子である、項２７に記載の遺伝子構築体。

３０．抗生物質耐性遺伝子が、ピューロマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン耐性遺伝子である、項２８または２９に記載の遺伝子構築体。

３１．項１６〜２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは項２７〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子構築体によって転換されたｈｉＰＳＣ細胞株。

３２．ＡＤ細胞モデルの生成のための、項３１のｈｉＰＳＣ細胞株の使用。

３３．ヒトＡＡＶＳ１部位でＢＡＣＥ１遺伝子が組み込まれ、前記組み込まれたＢＡＣＥ１遺伝子が構成的に過剰発現されている、ＡＤ細胞モデルとして使用される遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。

３４．前記ＢＡＣＥ１遺伝子が組み込まれていない同質遺伝子ｈｉＰＳＣと比較して、増加したβ−セクレターゼおよび／またはＡβ−４２ペプチドを示す、項３３に記載の遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。

３５．ヒトＡＡＶＳ１部位でＰＳ１ｄＥ９遺伝子が組み込まれ、前記組み込まれたＰＳ１ｄＥ９遺伝子が構成的に過剰発現されている、ＡＤ細胞モデルとして使用される遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。

３６．前記ＰＳ１ｄＥ９遺伝子が組み込まれていない同質遺伝子ｈｉＰＳＣと比較して、増加したβ−セクレターゼおよび／またはＡβ−４２ペプチドを示す、項３５に記載の遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。

３７．ＡＤ治療薬のハイスループットスクリーニングのための、項３３〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣの使用。

３８．ｉ）項１６〜２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは項２７〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子構築体をｈｉＰＳＣに導入することにより、ｈｉＰＳＣからアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製することと、
ｉｉ）上記細胞モデルで候補化合物を２日から２週間培養することと、
ｉｉｉ）前記候補化合物を添加する前後のβ−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比を測定することとを含み、
ここで、β−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比から選択される一つ以上の測定値の減少は、前記候補化合物がＡＤの治療のための潜在的な治療薬であることを示す、
ＡＤ治療薬をハイスループットスクリーニングするための方法。

３９．前記ｈｉＰＳＣがヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、項３８に記載の方法。

４０．前記ｈｉＰＳＣが、ＡＤを有さない正常なヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、項３９に記載の方法。

４１．初期のＡＤ薬スクリーニング用の、項３８〜４０のいずれか一項に記載のハイスループットスクリーニング方法。

４２．ｉ）ＢＡＣＥ１遺伝子またはＰＳ１ｄＥ９遺伝子を構成的に過剰発現させることによりｈｉＰＳＣ細胞株を修飾することと、
ｉｉ）前記ｈｉＰＳＣ細胞株を機能性ニューロンに再分化することと、
ｉｉｉ）候補化合物の存在下で前記機能性ニューロンを培養することと、
ｉｖ）β−セクレターゼのレベル、Ａβ４２／Ａβ−４０比、及び／またはＡβ−４２濃度を測定し、β−セクレターゼのレベル、Ａβ４２／Ａβ−４０比、及び／またはＡβ−４２濃度を低減できる化合物を選択することとを含む、
β−セクレターゼまたはＡβ−４２阻害剤をスクリーニングするための薬剤スクリーニング方法。

４３．候補薬剤化合物の存在下で前記機能性ニューロンを２日から２週間培養することを含む、項４２に記載の方法。

４４．前記ｈｉＰＳＣがヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、項４２または４３に記載の方法。

４５．前記ｈｉＰＳＣが、ＡＤを有さない正常なヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、項４４に記載の方法。

４６．項１６〜２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは項２７〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子構築体をｈｉＰＳＣに導入することによって前記ｈｉＰＳＣを調製する、項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。

本発明の実施形態のこれらおよびその他の態様と利点は、以下の説明から、及び添付の図面を参照して、より容易に理解されるであろう。
親ｈｉＰＳＣ細胞株（ＵＣＩＳ３００７）の生成および表現型の同定実例を示す図である。健常な非罹患ドナーからの尿細胞が単離され、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用した標準リプログラミング法でｈｉＰＳＣ細胞に転換された。図１Ａは、形態学的変化とアルカリホスホターゼ（ＡＰ）染色を示す、尿細胞のリプログラミングのプロセスを示す図である。 親ｈｉＰＳＣ細胞株（ＵＣＩＳ３００７）の生成および表現型の同定実例を示す図である。健常な非罹患ドナーからの尿細胞が単離され、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用した標準リプログラミング法でｈｉＰＳＣ細胞に転換された。図１Ｂは、多能性幹細胞のバイオマーカーの免疫染色（Ｎａｎｏｇ、Ｔｒａ−１−６０、Ｔｒａ−１−８１、ＳＳＥＡ３、及びＳＳＥＡ４）を示す図である。 親ｈｉＰＳＣ細胞株（ＵＣＩＳ３００７）の生成および表現型の同定実例を示す図である。健常な非罹患ドナーからの尿細胞が単離され、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用した標準リプログラミング法でｈｉＰＳＣ細胞に転換された。図１Ｃは、その他の多能性試験（導入遺伝子サイレンシング、内因性多能性遺伝子の発現、表面マーカーのＦＡＣＳ分析、プロモーターの脱メチル化（ｄｅｍｙｔｈｅｌａｔｉｏｎ）、核型分析、胚様体形成および胚葉マーカーの発現）を示す図である。 親ｈｉＰＳＣ細胞株（ＵＣＩＳ３００７）の生成および表現型の同定実例を示す図である。健常な非罹患ドナーからの尿細胞が単離され、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用した標準リプログラミング法でｈｉＰＳＣ細胞に転換された。図１Ｄは、その他の多能性試験（導入遺伝子サイレンシング、内因性多能性遺伝子の発現、表面マーカーのＦＡＣＳ分析、プロモーターの脱メチル化（ｄｅｍｙｔｈｅｌａｔｉｏｎ）、核型分析、胚様体形成および胚葉マーカーの発現）を示す図である。 親ｈｉＰＳＣ細胞株（ＵＣＩＳ３００７）の生成および表現型の同定実例を示す図である。健常な非罹患ドナーからの尿細胞が単離され、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用した標準リプログラミング法でｈｉＰＳＣ細胞に転換された。図１Ｅは、その他の多能性試験（導入遺伝子サイレンシング、内因性多能性遺伝子の発現、表面マーカーのＦＡＣＳ分析、プロモーターの脱メチル化（ｄｅｍｙｔｈｅｌａｔｉｏｎ）、核型分析、胚様体形成および胚葉マーカーの発現）を示す図である。 親ｈｉＰＳＣ細胞株（ＵＣＩＳ３００７）の生成および表現型の同定実例を示す図である。健常な非罹患ドナーからの尿細胞が単離され、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用した標準リプログラミング法でｈｉＰＳＣ細胞に転換された。図１Ｆは、３つの胚葉が示されている、奇形腫の形成を示す図である。 親ｈｉＰＳＣ細胞株からの神経幹細胞と神経細胞（ＮＳＣ、混合ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、及び運動ニューロン）を示す図である。 ＡＡＶＳ１部位でのＡＤ関連遺伝子の異所性発現を伴うｈｉＰＳＣ細胞株の生成に使用されるドナーベクターを示す図である。標的組み込みに係る核酸配列は、ヒトＡＡＶＳ１部位（ＨＡ−ＬおよびＨＡ−Ｒ）に相同する配列、ＰＧＫ−１プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ＶＡＧプロモーター、ＡＤ関連遺伝子およびレポーター遺伝子を含み、これらはシス順で排列している。異なるＡＤ関連遺伝子は、Ｘｈｏ−ＩおよびＢｇｌＩＩを使用した制限酵素消化で簡単に置き換えることができる。図３Ａは、骨格ベクターＣＩＢ−ＰＣＢＥＢを示す図である。 ＡＡＶＳ１部位でのＡＤ関連遺伝子の異所性発現を伴うｈｉＰＳＣ細胞株の生成に使用されるドナーベクターを示す図である。標的組み込みに係る核酸配列は、ヒトＡＡＶＳ１部位（ＨＡ−ＬおよびＨＡ−Ｒ）に相同する配列、ＰＧＫ−１プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ＶＡＧプロモーター、ＡＤ関連遺伝子およびレポーター遺伝子を含み、これらはシス順で排列している。異なるＡＤ関連遺伝子は、Ｘｈｏ−ＩおよびＢｇｌＩＩを使用した制限酵素消化で簡単に置き換えることができる。図３Ｂは、ＢＡＣＥ１遺伝子の標的組み込みのためのドナーベクターを示す図である。 ＡＡＶＳ１部位でのＡＤ関連遺伝子の異所性発現を伴うｈｉＰＳＣ細胞株の生成に使用されるドナーベクターを示す図である。標的組み込みに係る核酸配列は、ヒトＡＡＶＳ１部位（ＨＡ−ＬおよびＨＡ−Ｒ）に相同する配列、ＰＧＫ−１プロモーター、薬剤選択マーカー遺伝子、ＶＡＧプロモーター、ＡＤ関連遺伝子およびレポーター遺伝子を含み、これらはシス順で排列している。異なるＡＤ関連遺伝子は、Ｘｈｏ−ＩおよびＢｇｌＩＩを使用した制限酵素消化で簡単に置き換えることができる。図３Ｃは、ＰＳ１ｄＥ９遺伝子の標的組み込みのためのドナーベクターを示す図である。 ＢＡＣＥ１遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図４Ａは、標的組み込みストラテジーを示す図である。 ＢＡＣＥ１遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図４Ｂは、ジャンクションＰＣＲによる単一細胞クローンのスクリーニング（上のパネル：Ｆ１＋Ｒ１プライマーを使用した５’末端ジャンクションＰＣＲ。クローン２１はインサート付きのＩＰＳＮ００４１−２１であり、クローン２４はインサートのないネガティブクローンである；下のパネル：３’末端ジャンクションＰＣＲ）を示す図である。 ＢＡＣＥ１遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図４Ｃは、ＩＰＳＮ００４１−２１のインサートの５’末端と３’末端配列を示す図である。 ＰＳ１ｄＥ９遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図５Ａは、標的組み込みストラテジーを示す図である。 ＰＳ１ｄＥ９遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図５Ｂは、ジャンクションＰＣＲによる単一細胞クローンのスクリーニング（上のパネル：Ｆ１＋Ｒ１プライマーを使用した５’末端ジャンクションＰＣＲ。７４は、更なるキャラクタライゼーションのために選択された、インサート付きのクローンであり、６７はインサートのないネガティブクローンである；下のパネル：３’末端ジャンクションＰＣＲ）を示す図である。 ＰＳ１ｄＥ９遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図５Ｃは、クローン７４のインサートの５’末端と３’末端配列を示す図である。 ＰＳ１ｄＥ９遺伝子のＡＡＶＳ１部位への標的組み込みを示す図である。ＡＡＶＳ１部位は、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ遺伝子座のエクソン１およびエクソン２のイントロン領域にある。Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３は、ジャンクションＰＣＲによる挿入の検証に使用されるプライマーである。図５Ｄは、ｉＰＳＣ（ＵＣＩ３００７−７４）におけるＰＳ１ｄＥ９遺伝子の過剰発現を示す図である。 ＨｉＰＳＣから大量の神経細胞を調製する調製方法を示す図である。中間段階としての神経幹細胞（ＮＳＣ）が測定プロセスを短縮し、変異を減らすための重要なステップであることは示されている。神経幹細胞は、ＮＳＣ特異的バイオマーカーｓоｘ−１（赤、核を染色する）とネスチン（緑、細胞質を染色する）で免疫染色される。機能性ニューロンは、ニューロン特異的バイオマーカーＴｕｊＩ（赤）とＤａｐｉ（青）で免疫染色される。 親細胞株ＩＰＳＮ００４１と比較して、ＩＰＳＮ００４１−２１におけるＢＡＣＥ１遺伝子が過剰発現し、また、親細胞株ＩＰＳＮ００４１と比較して、ＩＰＳＮ００４１−２１におけるＢＡＣＥ１遺伝子がＲＮＡおよびタンパク質での発現が有意に高いことを示す図である。Ａ．ｈｉＰＳＣおよびｈｉＰＳＣからのニューロンにおけるＩＰＳＮ００４１−２１とＩＰＳＮ００４１の間のｍＲＮＡ発現を示す図である。Ｂ．神経幹細胞およびｈｉＰＳＣ細胞株からのニューロンにおけるＢＡＣＥ１タンパク質の発現を示す図である。 ＩＰＳＮ００４１と比較して、ＩＰＳＮ００４１−２１におけるＡβ−４２ペプチドの過剰発現を示す図である。図８Ａは、ｈｉＰＳＣからのニューロンにおけるＡβ−４２濃度を示す図であり、ＩＰＳＮ００４１−２１からのニューロンは、ＩＰＳＮ００４１からのニューロンより高いＡβ−４２濃度を有することは示されている。 ＩＰＳＮ００４１と比較して、ＩＰＳＮ００４１−２１におけるＡβ−４２ペプチドの過剰発現を示す図である。図８Ｂは、異なる発現パターンを示す、ＩＰＳＮ００４１−２１とＩＰＳＮ００４１の間のＡβ−４２発現の経時的研究を示す図である。 ＩＰＳＮ００４１−２１を使用した薬剤スクリーニングの実施例を示す図である。以前に報告されていない２つの小分子化合物Ｂ３とＢ１６がｈｉＰＳＣからのニューロンにおけるＡβ−４０とＡβ−４２ペプチドの生成を減らすが、Ａβ−４２／４０比には影響しないことは示されている。既知のβ−セクレターゼ阻害剤（１０ｕＭ）を陽性対照として使用する。データは３つの生物学的反復からのものである。図９Ａは、Ｂ３とＢ１６がＡβ−４０の生成を減らすことを示す図である。 ＩＰＳＮ００４１−２１を使用した薬剤スクリーニングの実施例を示す図である。以前に報告されていない２つの小分子化合物Ｂ３とＢ１６がｈｉＰＳＣからのニューロンにおけるＡβ−４０とＡβ−４２ペプチドの生成を減らすが、Ａβ−４２／４０比には影響しないことは示されている。既知のβ−セクレターゼ阻害剤（１０ｕＭ）を陽性対照として使用する。データは３つの生物学的反復からのものである。図９Ｂは、Ｂ３とＢ１６がＡβ−４２の生成を減らすことを示す図である。 ＩＰＳＮ００４１−２１を使用した薬剤スクリーニングの実施例を示す図である。以前に報告されていない２つの小分子化合物Ｂ３とＢ１６がｈｉＰＳＣからのニューロンにおけるＡβ−４０とＡβ−４２ペプチドの生成を減らすが、Ａβ−４２／４０比には影響しないことは示されている。既知のβ−セクレターゼ阻害剤（１０ｕＭ）を陽性対照として使用する。データは３つの生物学的反復からのものである。図９Ｃは、Ａβ−４０に対するＡβ−４２の比率を示す図である。

本願で使用されるすべての技術および科学用語は、別段の定義がない限り、当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。例えば、本願で提供される生物学分野の用語について、研究者は特にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第二版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （１９８９）；およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参考にした。これらの用語は、当業者によって理解される範囲より狭い範囲を有すると解釈されるべきではない。

「含む」という用語は、本明細書および請求の範囲で使用されており、他の要素またはステップを除外するものではない。特に説明しない限り、単数名詞を言及する時に不定冠詞または定冠詞である「一つ」、「一種」、「これ」、「この」を使用する場合、当該名詞の複数をも含む。

「ＡＤ関連遺伝子」は、アルツハイマー病（ＡＤ）の発症に関連するいずれの遺伝子を表す。アルツハイマー病の原因はよくわかっていないが、リスクの約７０％は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）およびプレセニリン（ＰＳ）１及び２をコードする変異遺伝子のような通常の遺伝子に遺伝的な関係がある。ＡＰＰ遺伝子変異により、β−セクレターゼによって優先的に切断されてより多くのＡβペプチドを生成する異常なＡＰＰタンパク質が生成する。ＰＳ遺伝子変異により、アミロイドプラークの構成成分であるＡβ４２ペプチドが優先的に生成する。ＦＡＤまたはＳＡＤ患者にはβ−セクレターゼをコードする遺伝子の変異が見つかっていないが、ＢＡＣＥ１発現の上昇により、Ａβペプチドの発現が上昇し、ＡＤ患者におけるＡβ−４２ペプチドのレベルを増加させることが明らかである。これらの遺伝子は、ＡＤの発症に密接に関連することが見出されたまたは見出される他の遺伝子とともに、本発明ではまとめてＡＤ関連遺伝子と呼ばれる。

本願における変異アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）またはプレセニリン（ＰＳ）１および２遺伝子は、ＡＤの発症を引き起こす変異のＡＰＰまたはＰＳ１またはＰＳ２遺伝子を表す。これらの遺伝子の変異は、ＡＤ患者で自然に発生するか、インビトロで遺伝的に生成し得る。本発明で「ＢＡＣＥ１遺伝子」という用語が使われる場合、自然に存在する遺伝子だけではなく、その機能的変異体も含む。機能的変異体は、アミノ酸配列に自然に存在する遺伝子とわずかに異なり得る。例えば、自然に存在するＢＡＣＥ１タンパク質のアミノ酸配列とは、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を有するが、自然のＢＡＣＥ１タンパク質と同じ機能を持っている。

「構成的発現」とは、必要に応じてのみ転写される通性遺伝子と比較して、継続的に転写される遺伝子発現のことである。「過剰発現」とは、顕著な遺伝子関連の発現型を生成する過度に高いまたは過量のレベルの遺伝子発現をいう。本発明について言えば、ｈｉＰＳＣに組み込まれる前記ＡＤ関連遺伝子は、ｈｉＰＳＣでは構成的に過剰発現され、アミロイド前駆体タンパク質の処理過程においてＡＤ発現型の出現をもたらす。

本発明の「ＡＤ発現型」は、アミロイド前駆体タンパク質の処理過程での発現型に関係し、前記発現型は、ＡＤ関連遺伝子の組み込み、および組み込まれたＡＤ関連遺伝子の構成的過剰発現によって誘導されて生成し、前記ＡＤ発現型は、β−セクレターゼのレベルの増加、アミロイドタンパク質βペプチドの増加、Ａβ−４２濃度の増加、および／またはＡβ−４２／Ａβ−４０の増加を含むが、これらに限られていない。

本発明では、前記ＡＤ関連遺伝子は、ＡＤ関連遺伝子を構成的に過剰発現してＡＤ発現型を生成するためにｈｉＰＳＣに組み込まれる。好ましくは部位特異的な方法で組み込まれ、もっとも好ましくは、セーフハーバー部位、すなわちヒトＡＡＶＳ１部位、に相同な配列を使用して組み込まれる。相同組換えを達成するには遺伝子が「相同」であることが必要であり、これによって外来遺伝子を標的部位に組み込む。公知常識に基づいて、当業者は、相同組換えの目的を達成するために標的組み込み部位での核酸配列に相同な核酸配列を設計する方法を知っている。したがって、本発明は相同な配列を言及する場合、実施例で使用されている相同な配列を含むが、これらに限られず、さらに、当業者が通常の技術を通してヒトＡＡＶＳ１部位での組み込みを実現するために設計したいずれの相同な配列を含む。

ベクター
本発明のＡＤ細胞モデルは、遺伝的組換え法を用いて生成して、ＡＤ関連遺伝子を非患者のｈｉＰＳＣに導入することができる。組換えられて生成したＡＤ細胞モデルについて、ＡＤ関連タンパク質、例えば、変異ＡＰＰまたはＰＳタンパク質、またはＢＡＣＥ１酵素をコードする核酸を単離し、さらにクローニングする（ＤＮＡの増幅）または発現するために複製可能なベクターに挿入する。前記タンパク質をコードするＤＮＡについて、本分野の従来の方法を使用して容易に単離およびシーケンシングすることができる。

本発明の目的のために、多くのベクターが、更なる改変に用いることができる。ベクターの成分は一般に、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、１つ以上のレポーター遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写終結配列から選択される１つ以上を含むが、これらに限られていない。

複製起点
発現ベクターとクローニングベクターはどちらも、ベクターが選択した宿主細胞内で複製できるようにする核酸配列を含む。

一般に、クローニングベクターにおいて、この配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能にするものであり、複製起点または自己複製配列を含む。この配列は、さまざまな細菌、酵母、及びウイルスでよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２の複製起点はほとんどのグラム陰性菌に適しており、２μプラスミド起点は酵母に適しており、さまざまなウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオ―マ、アデノウイルス、ＶＳＶ、またはＢＰＶ）は哺乳動物細胞でのクローニングベクターに使用可能である。一般に、哺乳動物発現ベクターは複製成分起点を必要としない（初期プロモーターを含むためＳＶ４０起点を一般に使用可能である）。

選択遺伝子成分
発現ベクターとクローニングベクターは、選択性マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含み得る。典型的な選択遺伝子は、次のタンパク質、すなわち、（ａ）アンピシリン、ネオアイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリン、ウロマイシン、カナマイシン、及びジェネティシンなど、抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質、（ｂ）栄養要求性欠乏を補うタンパク質、または（ｃ）バチルスのＤ−アラニンラセマーゼをコードする遺伝子のような、複合培地から得られない重要な栄養素を提供するタンパク質、をコードする。

選択スキームの一例は、宿主細胞の増殖を阻止する為に薬剤を利用する。異種遺伝子での形質転換に成功した細胞は、薬剤耐性を付与するタンパク質を生成し、選択スキームで生き残る。このような優性選択の例では、ネオマイシン、ウロマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ハイグロマイシンという薬物を使用する。

哺乳動物細胞に適した選択性マーカーの別の例は、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ（ＧＳ）、チミジンキナーゼ、メタロチオネイン−Ｉおよび−ＩＩ、好ましくは霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシン２０デアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど、コーディング核酸の抗体を吸収する能力のある細胞の同定を可能にするものである。

例えば、ＤＨＦＲ遺伝子で形質転換された細胞は、メトトレキセート（Ｍｔｘ）、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストを含む培地で形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下で、ＤＨＦＲ遺伝子は他の同時形質転換された核酸とともに増幅される。

あるいは、ＧＳ遺伝子で形質転換された細胞は、Ｌ−メチオニンスルホキシミン（Ｍｓｘ）、ＧＳ阻害剤を含む培地で形質転換体を培養することにより同定される。これらの条件下で、ＧＳ遺伝子は他の同時形質転換された核酸とともに増幅される。ＧＳ選択／増幅システムは、上記ＤＨＦＲ選択／増幅システムと組み合わせて使用することができる。

レポーター遺伝子成分
レポーター遺伝子（通常は単にレポーターと略称）は、研究者が生物体に関心のある別の遺伝子の調節配列に設けられた遺伝子である。一部の遺伝子をレポーターとして選択するのは、これらの遺伝子によりこれらを発現する生物体に与える特徴が容易に同定および測定でき、あるいは、これらの遺伝子が選択性マーカーであるからである。レポーター遺伝子は、ある遺伝子が細胞または生物集団に取り込まれたか、または発現されたかの指標としてよく使用される。

レポーター遺伝子を生物体に導入するために、科学者は、レポーター遺伝子と目的遺伝子を同じＤＮＡ構築体に置いて細胞または生物体に挿入する。視覚同定特徴を誘発する一般的に使用されるレポーター遺伝子は、通常、蛍光および発光タンパク質に係る。その例として、クラゲの緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子、および遺伝子ｄｓＲｅｄからの赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含み、前記クラゲの緑色蛍光タンパク質遺伝子によって、この遺伝子を発現する細胞が青色光の下で緑色に光る。

プロモーター成分
発現ベクターおよびクローニングベクターは一般に、宿主細胞によって認識し、目的のタンパク質をコードする核酸に機能的に連結されるプロ―モーターを含む。

プロモーター配列は真核生物では知られている。ほぼすべての真核生物遺伝子には、ＡＴが豊富な領域があり、この領域は、転写開始部位のほぼ上流の塩基に位置している。多くの遺伝子の転写開始点から上流の７０〜８０塩基にある別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、Ｎは任意のヌクレオチド配列であってもよい。ほとんどの真核遺伝子の３’末端にはＡＡＴＡＡＡ配列があり、これは、コード配列の３’末端にポリＡテールを付加するシグナルであってもよい。これらの配列は全て、真核の発現ベクターに適切に挿入される。

ｈｉＰＳＣのベクターからのＡＤ致病タンパク質の転写は、次のプロモーターを介して制御することができる。すなわち、ポリオ―マウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肺炎ウイルス、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスのゲノムから取得したプロモーター、またはアクチンプロモーターや免疫グロブリンプロモーターのような、異種哺乳動物プロモーターから取得したプロモーター、宿主細胞系と相容する、熱ショックプロモーターから取得したプロモーターを介して制御することができる。

ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を含むＳＶ４０制限フラグメントとして便利に取得できる。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ Ｅ制限フラグメントとして便利に取得される。米国特許第４，４１９，４４６号には、ベクターとしてウシパピローマウイルスを使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現するシステムが開示されている。このシステムの改善は米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、Ｒｅｙｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ２９７：５９８−６０１（１９８２）、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ５プロモーターの制御下のマウス細胞におけるヒトｐ−インターフェロンｃＤＮＡの発現を参照できる。あるいは、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルスの長い末端反復をプロモーターとして使用することができる。

ＣＡＧプロモーターは、哺乳動物発現ベクターで高いレベルの遺伝子発現を駆動するためによく使用される強力な合成プロモーターである^37-38。次の配列から構築される：
（Ｃ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント、
（Ａ）プロモーター、第１のエクソンおよびニワトリβ−アクチン遺伝子の最初のイントロン、
（Ｇ）ウサギβ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプター。

得られた合成エレメントはｐＣＡＧＧＳ発現ベクターに使用される。

構築体全体は一般に「ＣＡＧプロモーター」と呼ばれるが、転写配列とイントロンの一部を含むため、厳格な意味でのプロモーターではない。ＣＭＶ即時初期エンハンサーの他に、ニワトリβアクチン遺伝子のイントロンには、脊椎動物では高度に保存的なエンハンサーエレメントがさらに含まれる。プロモーターの３’部分はＧＣ含有量が高いため、ＰＣＲ増幅には適しない。

ＰＧＫ−１遺伝子は、ハウスキーピング酵素、３−ホスホグリセリン酸キナーゼをコードし、広く発現している。この遺伝子は哺乳動物のＸ染色体上に存在し、メス体細胞またはオス生殖細胞の不活性Ｘ染色体上のほとんどの他の遺伝子と一緒にサイレンシングされる場合を除き、常に発現される。Ｐｇｋ（ＰＧＫ）−１プロモーターは、ヌクレオチドＧおよびＣが豊富な領域にある。このプロモーターは、大腸菌ｌａｃやｎｅоなどのレポーター遺伝子の高いレベルの発現を効率的に駆動できる。転写開始部位の上流の１２０ｂｐはコアプロモーターとされる。その上流は３２０ｂｐの領域であり、コアプロモーターの転写を方向と位置に依存しない方法で増強する。この３２０ｂｐの領域は、ＳＶ４０初期領域のコアプロモーターの転写を増強しない。核タンパク質はこの３２０ｂｐのフラグメントに結合するが、ゲル移動度シフト法によって結合された制限領域を証明することができ、これによって、エンハンサーの活性が複数の部位に結合している因子によって媒介できることが示され、各部位は低い親和性を有する³⁹。

エンハンサーエレメント成分
エンハンサー配列をベクターに挿入することによって、高等真核生物における、目的タンパク質をコードするＤＮＡ転写はしばしば増加する。現在、哺乳動物の遺伝子（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）から多くのエンハンサー配列が知られている。しかし、一般に真核細胞のウイルスからのエンハンサーが使用される。例として、複製起点の後側（１００〜２７０ｂｐ）のＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後側のポリオ―マエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。また、Ｙａｎｉｖ，Ｎａｔｕｒｅ２９７：１７−１８（１９８２）の、真核プロモーターの活性化のための強化エレメントも参照できる。エンハンサーは、抗体コード配列の５’または３’位、好ましくはプロモーターの５’部位で、ベクターにスプライシングされ結合され得る。

転写終止成分
ヒト細胞のような真核宿主細胞で使用される発現ベクターはまた、転写の終止およびｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は一般に、真核またはウイルスＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’、時には３’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域には、目的タンパク質をコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化フラグメントとして転写されたヌクレオチドセグメントが含まれる。

一つの実施形態では、本発明のベクターは、アルツハイマー病（ＡＤ）関連遺伝子に関連する遺伝子をヒト多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）に高効率で標的組み込むために設計される。そのため、ベクターはまた、部位特異的組み込みのための配列を含むように設計される。

標的認識能力を持つ酵素による既知の位置への遺伝子の挿入は、ゲノム指向編集技術であり、この技術により、研究者は高効率かつ正確にゲノムレベルの任意の遺伝子またはＤＮＡ片段を削除、挿入、または修飾することができる^40-42。このような技術はまた、例えば、ＵＳ８６９７３５９、ＵＳ８７７１９４５、ＵＳ８７９５９６５に開示された最近広く使用されているＣＲＩＳＰＲｃａｓ９遺伝子編集技術を含む。本発明の一部の実施形態では、ＡＤ関連遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲｃａｓ９遺伝子編集技術により、セーフハーバー部位、すなわち、ＡＡＶＳ１部位に特異的に組み込まれる。

ＡＡＶＳ１部位は、ヒト１９番染色体上の自然なＡＡＶ組み込み部位である。この領域（ＡＡＶＳ１）には、導入遺伝子の理想的な標的となる特徴がある。

本発明の一つの具体的な実施形態では、ベクターは、第１のプロモーターによって制御される薬剤選択マーカー遺伝子、第２のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子と連結されるＡＤ関連遺伝子、及びヒトＡＡＶＳ１部位の配列に相同な配列を含む。

本発明の一つの具体的な実施形態では、ドナーベクターの主鎖は、シス順で排列している標的組み込みのための左腕（ＨＡ−Ｌ）、ＰＧＫ−１プロモーター、ピューロマイシン遺伝子、ＣＡＧプロモーター、ＧＦＰレポーター遺伝子、および標的組み込みのための右腕（ＨＡ−ＲＬ）を含む（図４Ａ）。

本明細書で使用されているように、標的組み込みのための左腕（ＨＡ−Ｌ）は、次の配列を含む：
TGCTTTCTCTGACCAGCATTCTCTCCCCTGGGCCTGTGCCGCTTTCTGTCTGCAGCTTGTGGCCTGGGTCACCTCTACGGCTGGCCCAGATCCTTCCCTGCCGCCTCCTTCAGGTTCCGTCTTCCTCCACTCCCTCTTCCCCTTGCTCTCTGCTGTGTTGCTGCCCAAGGATGCTCTTTCCGGAGCACTTCCTTCTCGGCGCTGCACCACGTGATGTCCTCTGAGCGGATCCTCCCCGTGTCTGGGTCCTCTCCGGGCATCTCTCCTCCCTCACCCAACCCCATGCCGTCTTCACTCGCTGGGTTCCCTTTTCCTTCTCCTTCTGGGGCCTGTGCCATCTCTCGTTTCTTAGGATGGCCTTCTCCGACGGATGTCTCCCTTGCGTCCCGCCTCCCCTTCTTGTAGGCCTGCATCATCACCGTTTTTCTGGACAACCCCAAAGTACCCCGTCTCCCTGGCTTTAGCCACCTCTCCATCCTCTTGCTTTCTTTGCCTGGACACCCCGTTCTCCTGTGGATTCGGGTCACCTCTCACTCCTTTCATTTGGGCAGCTCCCCTACCCCCCTTACCTCTCTAGTCTGTGCTAGCTCTTCCAGCCCCCTGTCATGGCATCTTCCAGGGGTCCGAGAGCTCAGCTAGTCTTCTTCCTCCAACCCGGGCCCCTATGTCCACTTCAGGACAGCATGTTTGCTGCCTCCAGGGATCCTGTGTCCCCGAGCTGGGACCACCTTATATTCCCAGGGCCGGTTAATGTGGCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGC。

ＰＧＫ−ピューロマイシンカセットは、次の配列を含む：
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCCCCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT。

ＣＡＧプロモーターは次の配列を含む：
ATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGTCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGTGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGGCGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGACCTCGAG。

ＧＦＰレポーター遺伝子は、次の配列を含む：
AGATCTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGTTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA。

標的組み込みのための右腕（ＨＡ−ＲＬ）は、次の配列を含む：
TACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACACCCCCATTTCCTGGAGCCATCTCTCTCCTTGCCAGAACCTCTAAGGTTTGCTTACGATGGAGCCAGAGAGGATCCTGGGAGGGAGAGCTTGGCAGGGGGTGGGAGGGAAGGGGGGGATGCGTGACCTGCCCGGTTCTCAGTGGCCACCCTGCGCTACCCTCTCCCAGAACCTGAGCTGCTCTGACGCGGCTGTCTGGTGCGTTTCACTGATCCTGGTGCTGCAGCTTCCTTACACTTCCCAAGAGGAGAAGCAGTTTGGAAAAACAAAATCAGAATAAGTTGGTCCTGAGTTCTAACTTTGGCTCTTCACCTTTCTAGTCCCCAATTTATATTGTTCCTCCGTGCGTCAGTTTTACCTGTGAGATAAGGCCAGTAGCCAGCCCCGTCCTGGCAGGGCTGTGGTGAGGAGGGGGGTGTCCGTGTGGAAAACTCCCTTTGTGAGAATGGTGCGTCCTAGGTGTTCACCAGGTCGTGGCCGCCTCTACTCCCTTTCTCTTTCTCCATCCTTCTTTCCTTAAAGAGTCCCCAGTGCTATCTGGGACATATTCCTCCGCCCAGAGCAGGGTCCCGCTTCCCTAAGGCCCTGCTCTGGGCTTCTGGGTTTGAGTCCTTGGCAAGCCCAGGAGAGGCGCTCAGGCTTCCCTGTCCCCCTTCCTCGTCCACCATCTCATGCCCCTGGCTCTCCTGCCCCTTCCCTACAGGGGTTCCTGGCTCTGCTCT。

別の具体的な実施形態では、ドナーベクターは、ＢｇＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位でベクター骨格に挿入されるＢＡＣＥ１遺伝子を含む（図４Ｂ）。ＢＡＣＥ１遺伝子のｃＤＮＡ配列は、遺伝子座ＮＭ＿１３８９７３．３（Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓβ−セクレターゼ１、転写変異体ｄ、ｍＲＮＡ）としてＧｅｎｂａｎｋに開示されている。本明細書で使用されているように、「ＢＡＣＥ１」は、ＢＡＣＥ１遺伝子によってコードされる膜貫通プロテアーゼを表す。ＢＡＣＥ１は、アミロイド前駆体タンパク質からのアミロイドβペプチドの形成における最初のステップを触媒する。アミロイドβペプチドは、アミロイドβプラークの主成分であり、ヒトアルツハイマー病患者の脳に蓄積している。

ドナーベクターにおけるＢＡＣＥ１遺伝子のＤＮＡ配列は下記通りである：
ATGGCCCAAGCCCTGCCCTGGCTCCTGCTGTGGATGGGCGCGGGAGTGCTGCCTGCCCACGGCACCCAGCACGGCATCCGGCTGCCCCTGCGCAGCGGCCTGGGGGGCGCCCCCCTGGGGCTGCGGCTGCCCCGGGAGACCGACGAAGAGCCCGAGGAGCCCGGCCGGAGGGGCAGCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTGAGGGGCAAGTCGGGGCAGGGCTACTACGTGGAGATGACCGTGGGCAGCCCCCCGCAGACGCTCAACATCCTGGTGGATACAGGCAGCAGTAACTTTGCAGTGGGTGCTGCCCCCCACCCCTTCCTGCATCGCTACTACCAGAGGCAGCTGTCCAGCACATACCGGGACCTCCGGAAGGGTGTGTATGTGCCCTACACCCAGGGCAAGTGGGAAGGGGAGCTGGGCACCGACCTGCTTTGTGGTGCTGGCTTCCCCCTCAACCAGTCTGAAGTGCTGGCCTCTGTCGGAGGGAGCATGATCATTGGAGGTATCGACCACTCGCTGTACACAGGCAGTCTCTGGTATACACCCATCCGGCGGGAGTGGTATTATGAGGTGATCATTGTGCGGGTGGAGATCAATGGACAGGATCTGAAAATGGACTGCAAGGAGTACAACTATGACAAGAGCATTGTGGACAGTGGCACCACCAACCTTCGTTTGCCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGCAGTCAAATCCATCAAGGCAGCCTCCTCCACGGAGAAGTTCCCTGATGGTTTCTGGCTAGGAGAGCAGCTGGTGTGCTGGCAAGCAGGCACCACCCCTTGGAACATTTTCCCAGTCATCTCACTCTACCTAATGGGTGAGGTTACCAACCAGTCCTTCCGCATCACCATCCTTCCGCAGCAATACCTGCGGCCAGTGGAAGATGTGGCCACGTCCCAAGACGACTGTTACAAGTTTGCCATCTCACAGTCATCCACGGGCACTGTTATGGGAGCTGTTATCATGGAGGGCTTCTACGTTGTCTTTGATCGGGCCCGAAAACGAATTGGCTTTGCTGTCAGCGCTTGCCATGTGCACGATGAGTTCAGGACGGCAGCGGTGGAAGGCCCTTTTGTCACCTTGGACATGGAAGACTGTGGCTACAACATTCCACAGACAGATGAGTCAACCCTCATGACCATAGCCTATGTCATGGCTGCCATCTGCGCCCTCTTCATGCTGCCACTCTGCCTCATGGTGTGTCAGTGGCGCTGCCTCCGCTGCCTGCGCCAGCAGCATGATGACTTTGCTGATGACATCTCCCTGCTGA。

ＢＡＣＥ１のタンパク質配列は下記通りである：
MAQALPWLLLWMGAGVLPAHGTQHGIRLPLRSGLGGAPLGLRLPRETDEEPEEPGRRGSFVEMVDNLRGKSGQGYYVEMTVGSPPQTLNILVDTGSSNFAVGAAPHPFLHRYYQRQLSSTYRDLRKGVYVPYTQGKWEGELGTDLLCGAGFPLNQSEVLASVGGSMIIGGIDHSLYTGSLWYTPIRREWYYEVIIVRVEINGQDLKMDCKEYNYDKSIVDSGTTNLRLPKKVFEAAVKSIKAASSTEKFPDGFWLGEQLVCWQAGTTPWNIFPVISLYLMGEVTNQSFRITILPQQYLRPVEDVATSQDDCYKFAISQSSTGTVMGAVIMEGFYVVFDRARKRIGFAVSACHVHDEFRTAVEGPFVTLDMEDCGYNIPQTDESTLMTIAYVMAAICALFMLPLCLMVCQWRCLRCLRQQHDDFADDISLLK。

別の一つの具体的な実施形態では、ドナーベクターは、ベクター骨格に挿入されるＢｇＩＩＩおよびＸｈｏＩ部位でのＰＳ１ｄＥ９遺伝子を含む（図５Ｂ）。ＰＳ１ｄＥ９遺伝子は、ＰＳ１遺伝子のエクソン９が欠失しているＰＳ１遺伝子の変異体である。本明細書で使用されているように、用語「ＰＳ１」は、プレセニリン１遺伝子によってコードされるタンパク質を表す。ＰＳ１遺伝子のｃＤＮＡ配列は、遺伝子座ＮＭ＿００００２１．３（Ｈｏｍｏｓａｐｉｅｎｓ、プレセニリン１、転写変異体１、ｍＲＮＡ）としてＧｅｎｂａｎｋに開示されている。プレセニリン１は、プレセニリン複合体の４つのコアタンパク質の１つであり、細胞内のγセクレターゼを含むいくつかのタンパク質のタンパク質加水分解イベントを導く。用語の「ＰＳ１ｄＥ９遺伝子」は、ＰＳ１の変異遺伝子を表し、これは、異常なγ−セクレターゼの分解を引き起こし、Ａβ−４２ペプチドの生成に寄与し、これによってアルツハイマー病の早期発症を引き起こす。

ドナーベクターのＰＳ１ｄＥ９のＤＮＡ配列は下記の通りである（強調表示されているのは欠失している配列である）：

ＰＳ１ｄＥ９のタンパク質配列は以下の通りである（強調表示されているのは、エクソン９が欠失していることによる翻訳ミスのある部分である）：

本明細書の別の実施形態では、本発明のドナーベクターは、ＢＡＣＥ１の任意の変異体および／またはＰＳ１の任意の変異体を含んでもよい。変異体は、例えば、異なる個体の対立遺伝子変異体（多型など）、選択的スプライシング形態などによって引き起こされる自然に存在する変異体を含む。変異体は好ましくは、本発明による配列と実質的に相同であり、すなわち、本発明の配列とは一般に、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド配列同一性を示す。本発明の遺伝子の変異体はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記で定義された配列（またはその相補鎖）にハイブリダイズする核酸配列を含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃を超える温度、２００ｍＭ以下の塩分を含む。

ｈｉＰＳＣ細胞株
一つの実施形態では、本発明は、本発明の方法によってセーフハーバー部位（ＡＡＶＳ１部位）でＡＤ関連遺伝子を組み込むことでｈｉＰＳＣ細胞株を生成することに係る。本発明によって作製されたｈｉＰＳＣ細胞株は、組み込まれた遺伝子を構成的に過剰発現し、同質遺伝子対照のｈｉＰＳＣ細胞株と比較して増加したβ−セクレターゼ及び／またはＡβ−４２ペプチドを示す。

一つの具体的な実施形態では、本発明の方法によって調製されたｈｉＰＳＣ細胞株は、ＡＡＶＳ１部位に組み込まれた外因性核酸配列を有する。核酸配列は、ＰＧＫ−１プロモーター、ピューロマイシン、ＣＡＧプロモーター、ＢＡＣＥ１遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、および異なるセグメントをリンクする配列を含む。挿入された核酸配列は下記の通りである（下線部はＢＡＣＥ１遺伝子である）：
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCCCCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGGCCGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGTCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGTGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGGCGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGACCTCGAGATGGCCCAAGCCCTGCCCTGGCTCCTGCTGTGGATGGGCGCGGGAGTGCTGCCTGCCCACGGCACCCAGCACGGCATCCGGCTGCCCCTGCGCAGCGGCCTGGGGGGCGCCCCCCTGGGGCTGCGGCTGCCCCGGGAGACCGACGAAGAGCCCGAGGAGCCCGGCCGGAGGGGCAGCTTTGTGGAGATGGTGGACAACCTGAGGGGCAAGTCGGGGCAGGGCTACTACGTGGAGATGACCGTGGGCAGCCCCCCGCAGACGCTCAACATCCTGGTGGATACAGGCAGCAGTAACTTTGCAGTGGGTGCTGCCCCCCACCCCTTCCTGCATCGCTACTACCAGAGGCAGCTGTCCAGCACATACCGGGACCTCCGGAAGGGTGTGTATGTGCCCTACACCCAGGGCAAGTGGGAAGGGGAGCTGGGCACCGACCTGCTTTGTGGTGCTGGCTTCCCCCTCAACCAGTCTGAAGTGCTGGCCTCTGTCGGAGGGAGCATGATCATTGGAGGTATCGACCACTCGCTGTACACAGGCAGTCTCTGGTATACACCCATCCGGCGGGAGTGGTATTATGAGGTGATCATTGTGCGGGTGGAGATCAATGGACAGGATCTGAAAATGGACTGCAAGGAGTACAACTATGACAAGAGCATTGTGGACAGTGGCACCACCAACCTTCGTTTGCCCAAGAAAGTGTTTGAAGCTGCAGTCAAATCCATCAAGGCAGCCTCCTCCACGGAGAAGTTCCCTGATGGTTTCTGGCTAGGAGAGCAGCTGGTGTGCTGGCAAGCAGGCACCACCCCTTGGAACATTTTCCCAGTCATCTCACTCTACCTAATGGGTGAGGTTACCAACCAGTCCTTCCGCATCACCATCCTTCCGCAGCAATACCTGCGGCCAGTGGAAGATGTGGCCACGTCCCAAGACGACTGTTACAAGTTTGCCATCTCACAGTCATCCACGGGCACTGTTATGGGAGCTGTTATCATGGAGGGCTTCTACGTTGTCTTTGATCGGGCCCGAAAACGAATTGGCTTTGCTGTCAGCGCTTGCCATGTGCACGATGAGTTCAGGACGGCAGCGGTGGAAGGCCCTTTTGTCACCTTGGACATGGAAGACTGTGGCTACAACATTCCACAGACAGATGAGTCAACCCTCATGACCATAGCCTATGTCATGGCTGCCATCTGCGCCCTCTTCATGCTGCCACTCTGCCTCATGGTGTGTCAGTGGCGCTGCCTCCGCTGCCTGCGCCAGCAGCATGATGACTTTGCTGATGACATCTCCCTGCTGAAGGTCGACAGATCTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGTTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGAGCTCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCGATCG。

インサートセグメントと宿主ゲノム間の５’末端ジャンクションでの配列は、次のように表される：
ACCCCACAGTGGGGCAAGCTTGGATCCTC及びその相補的な配列。

インサートセグメントと宿主ゲノム間の３’末端ジャンクションでの配列は、次のように表される：
CGATCGGCGGCCGCTACTAGGGACAGGATT及びその相補的な配列。

一つの具体的な実施形態では、本発明の方法によって調製されたｈｉＰＳＣ細胞株は、ＡＡＶＳ１部位に組み込まれた外因性核酸配列を有する。核酸配列は、ＰＧＫ−１プロモーター、ピューロマイシン、ＣＡＧプロモーター、変異体ＰＳ１遺伝子（ＰＳ１ｄＥ９）、ＧＦＰ遺伝子、および異なるセグメントをリンクする配列を含む。挿入された核酸配列は下記の通りである（下線部はＰＳ１ｄＥ９遺伝子である）：
ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTACCGGGTAGGGGAGGCGCTTTTCCCAAGGCAGTCTGGAGCATGCGCTTTAGCAGCCCCGCTGGGCACTTGGCGCTACACAAGTGGCCTCTGGCCTCGCACACATTCCACATCCCCCGGTAGGCGCCAACCGGCTCCGTTCTTTGGTGGCCCCTTCGCGCCACCTTCTACTCCTCCCCTAGTCAGGAAGTTCCCCCCCGCCCCGCAGCTCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATGGAAGTAGCACGTCTCACTAGTCTCGTGCAGATGGACAGCACCGCTGAGCAATGGAAGCGGGTAGGCCTTTGGGGCAGCGGCCAATAGCAGCTTTGCTCCTTCGCTTTCTGGGCTCAGAGGCTGGGAAGGGGTGGGTCCGGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGCTCAGGGGCGGGGCGGGCGCCCGAAGGTCCTCCGGAGGCCCGGCATTCTGCACGCTTCAAAAGCGCACGTCTGCCGCGCTGTTCTCCTCTTCCTCATCTCCGGGCCTTTCGGAATTCATGACCGAGTACAAGCCCACGGTGCGCCTCGCCACCCGCGACGACGTCCCCCGGGCCGTACGCACCCTCGCCGCCGCGTTCGCCGACTACCCCGCCACGCGCCACACCGTCGACCCGGACCGCCACATCGAGCGGGTCACCGAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGCGCGTCGGGCTCGACATCGGCAAGGTGTGGGTCGCGGACGACGGCGCCGCGGTGGCGGTCTGGACCACGCCGGAGAGCGTCGAAGCGGGGGCGGTGTTCGCCGAGATCGGCCCGCGCATGGCCGAGTTGAGCGGTTCCCGGCTGGCCGCGCAGCAACAGATGGAAGGCCTCCTGGCGCCGCACCGGCCCAAGGAGCCCGCGTGGTTCCTGGCCACCGTCGGCGTCTCGCCCGACCACCAGGGCAAGGGTCTGGGCAGCGCCGTCGTGCTCCCCGGAGTGGAGGCGGCCGAGCGCGCCGGGGTGCCCGCCTTCCTGGAGACCTCCGCGCCCCGCAACCTCCCCTTCTACGAGCGGCTCGGCTTCACCGTCACCGCCGACGTCGAGGTGCCCGAAGGACCGCGCACCTGGTGCATGACCCGCAAGCCCGGTGCCTGATAGAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATGCGGCCGCAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTCGAGGTGAGCCCCACGTTCTGCTTCACTCTCCCCATCTCCCCCCCCTCCCCACCCCCAATTTTGTATTTATTTATTTTTTAATTATTTTGTGCAGCGATGGGGGCGGGGGGGGGGGGGGGCGCGCGCCAGGCGGGGCGGGGCGGGGCGAGGGGCGGGGCGGGGCGAGGCGGAGAGGTGCGGCGGCAGCCAATCAGAGCGGCGCGCTCCGAAAGTTTCCTTTTATGGCGAGGCGGCGGCGGCGGCGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCTGCGCGCTGCCTTCGCCCCGTGCCCCGCTCCGCCGCCGCCTCGCGCCGCCCGCCCCGGCTCTGACTGACCGCGTTACTCCCACAGGTGAGCGGGCGGGACGGCCCTTCTCCTCCGGGCTGTAATTAGCGCTTGGTTTAATGACGGCTTGTTTCTTTTCTGTGGCTGCGTGAAAGCCTTGAGGGGCTCCGGGAGGGCCCTTTGTGCGGGGGGAGCGGCTCGGGGGGTGCGTGCGTGTGTGTGTGCGTGGGGAGCGCCGCGTGCGGCTCCGCGCTGCCCGGCGGCTGTGAGCGCTGCGGGCGCGGCGCGGGGCTTTGTGCGCTCCGCAGTGTGCGCGAGGGGAGCGCGGCCGGGGGCGGTGCCCCGCGGTGCGGGGGGGCTGCGAGGGGAACAAAGGCTGCGTGCGGGGTGTGTGCGTGGGGGGGTGAGCAGGGGGTGTGGGCGCGTCGGTCGGGCTGCAACCCCCCCTGCACCCCCCTCCCCGAGTTGCTGAGCACGGCCCGGCTTCGGGTGCGGGGCTCCGTACGGGGCGTGGCGCGGGGCTCGCCGTGCCGGGCGGGGGGTGGCGGCAGGTGGGGGTGCCGGGCGGGGCGGGGCCGCCTCGGGCCGGGGAGGGCTCGGGGGAGGGGCGCGGCGGCCCCCGGAGCGCCGGCGGCTGTCGAGGCGCGGCGAGTCGCAGCCATTGCCTTTTATGGTAATCGTGCGAGAGGGCGCAGGGACTTCCTTTGTCCCAAATCTGTGTGGAGCCGAAATCTGGGAGGCGCCGCCGCACCCCCTCTAGCGGGCGCGGGGCGAAGCGGTGCGGCGCCGGCAGGAAGGAAATGGGCGGGGAGGGCCTTCGTGCGTCGCCGCGCCGCCGTCCCCTTCTCCCTCTCCAGCCTCGGGGCTGTCCGCGGGGGGGCGGCTGCCTTCGGGGGGGACGGGGCAGGGCGGGGTTCGGCTTCTGGCGTGTGACCGGCGGCTCTAGAGCCTCTGCTAACCATGTTCATGCCTTCTTCTTTTTCCTACAGCTCCTGGGCAACGTGCTGGTTATTGTGCTGTCTCATCATTTTGGCAAAGAATTCCTCGACCTCGAGATGACAGAGTTACCTGCACCGTTGTCCTACTTCCAGAATGCACAGATGTCTGAGGACAACCACCTGAGCAATACTGTACGTAGCCAGAATGACAATAGAGAACGGCAGGAGCACAACGACAGACGGAGCCTTGGCCACCCTGAGCCATTATCTAATGGACGACCCCAGGGTAACTCCCGGCAGGTGGTGGAGCAAGATGAGGAAGAAGATGAGGAGCTGACATTGAAATATGGCGCCAAGCATGTGATCATGCTCTTTGTCCCTGTGACTCTCTGCATGGTGGTGGTCGTGGCTACCATTAAGTCAGTCAGCTTTTATACCCGGAAGGATGGGCAGCTAATCTATACCCCATTCACAGAAGATACCGAGACTGTGGGCCAGAGAGCCCTGCACTCAATTCTGAATGCTGCCATCATGATCAGTGTCATTGTTGTCATGACTATCCTCCTGGTGGTTCTGTATAAATACAGGTGCTATAAGGTCATCCATGCCTGGCTTATTATATCATCTCTATTGTTGCTGTTCTTTTTTTCATTCATTTACTTGGGGGAAGTGTTTAAAACCTATAACGTTGCTGTGGACTACATTACTGTTGCACTCCTGATCTGGAATTTTGGTGTGGTGGGAATGATTTCCATTCACTGGAAAGGTCCACTTCGACTCCAGCAGGCATATCTCATTATGATTAGTGCCCTCATGGCCCTGGTGTTTATCAAGTACCTCCCTGAATGGACTGCGTGGCTCATCTTGGCTGTGATTTCAGTATATGATTTAGTGGCTGTTTTGTGTCCGAAAGGTCCACTTCGTATGCTGGTTGAAACAGCTCAGGAGAGAAATGAAACGCTTTTTCCAGCTCTCATTTACTCCTGCACAGAAAGGGAGTCACAAGACACTGTTGCAGAGAATGATGATGGCGGGTTCAGTGAGGAATGGGAAGCCCAGAGGGACAGTCATCTAGGGCCTCATCGCTCTACACCTGAGTCACGAGCTGCTGTCCAGGAACTTTCCAGCAGTATCCTCGCTGGTGAAGACCCAGAGGAAAGGGGAGTAAAACTTGGATTGGGAGATTTCATTTTCTACAGTGTTCTGGTTGGTAAAGCCTCAGCAACAGCCAGTGGAGACTGGAACACAACCATAGCCTGTTTCGTAGCCATATTAATTGGTTTGTGCCTTACATTATTACTCCTTGCCATTTTCAAGAAAGCATTGCCAGCTCTTCCAATCTCCATCACCTTTGGGCTTGTTTTCTACTTTGCCACAGATTATCTTGTACAGCCTTTTATGGACCAATTAGCATTCCATCAATTTTATATCTAGAGATCTGGCAGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGTTCGAAATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCTTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCGCCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAAGGTCTATATCACCGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGACCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTGAGAGCTCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCGATCG。

インサートセグメントと宿主ゲノム間の５’末端ジャンクションでの配列は、次のように表される：
ACCCCACAGTGGGGCAAGCTTGGATCCTC及びその相補的な配列。

インサートセグメントと宿主ゲノム間の３’末端ジャンクションでの配列は、次のように表される：
CGATCGGCGGCCGCTACTAGGGACAGGATT及びその相補的な配列。

別の実施形態では、挿入された核酸配列は、ＢＡＣＥ１の任意の変異体および／またはＰＳ１の任意の変異体をコードする配列を含んでもよい。変異体は、例えば、異なる個体の対立遺伝子変異体（多型など）、選択的スプライシング形態などによって引き起こされる自然に存在する変異体を含む。変異体は好ましくは、本発明による配列と実質的に相同であり、すなわち、本発明の配列とは一般に、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を示す。本発明の遺伝子の変異体はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記で定義された配列（またはその相補鎖）にハイブリダイズする核酸配列を含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃を超える温度、２００ｍＭ以下の塩分を含む。

薬剤スクリーニング法
一つの実施形態では、本発明は、本発明の方法によって作製されたｈｉＰＳＣ細胞株を使用して、ＡＤの治療のための治療剤をスクリーニングする方法に係る。この方法は、ｈｉＰＳＣ細胞株を機能性ニューロンに再分化するステップ、薬剤化合物をニューロン培地に投与するステップ、薬剤化合物の存在下でニューロンを一定期間培養するステップ、β−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比などを測定するステップなど、複数のステップを含むことができる。

本発明のβ−セクレターゼのレベルは、本分野の従来の方法によってＲＮＡレベル及びタンパク質レベルで検出できる。

一つの具体的な実施形態では、ＢＡＣＥ１遺伝子を過剰発現するｈｉＰＳＣ細胞株は、大量の機能性ニューロンの生成に使用される。ｈｉＰＳＣ細胞株由来の神経細胞を９６ウェルプレートで培養する。スクリーニングされる化合物をニューロン培地に２日から２週間加える。β−セクレターゼのレベルおよび／またはＡβ−４２ペプチドの減少に対する化合物の効果は、並行して測定される。

別の具体的な実施形態では、ＰＳ１ｄＥ９遺伝子を過剰発現するｈｉＰＳＣ細胞株は、大量の機能性ニューロンの生成に使用される。ｈｉＰＳＣ細胞株由来の神経細胞を９６ウェルプレートで培養する。スクリーニングされる化合物をニューロン培地に２日から２週間加える。Ａβ−４２ペプチドの減少に対する化合物の効果は測定される。

別の実施形態では、ＡＡＶＳ１部位でＢＡＣＥ１遺伝子の任意の変異体および／またはＰＳ１遺伝子の任意の変異体を過剰発現するｈｉＰＳＣ細胞株を使用して、大量の機能性ニューロンを生成する。変異体は、例えば、異なる個体の対立遺伝子変異体（多型など）、選択的スプライシング形態などによって引き起こされる自然に存在する変異体を含む。変異体は好ましくは、本発明による配列と実質的に相同であり、すなわち、本発明の配列とは一般に、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列同一性を示す。本発明の遺伝子の変異体はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で上記で定義された配列（またはその相補鎖）にハイブリダイズする核酸配列を含む。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、４２℃を超える温度、２００ｍＭ以下の塩分を含む。

本願で添付の図面を参照して説明された実施形態は説明的、例示的であり、本発明を一般的に理解するために使用される。実施形態は、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。同じまたは類似した要素、及び同じまたは類似した機能を有する要素は、説明全体を通して同じ図面符号で示される。また、本発明の範囲は添付の請求の範囲によってのみ限定されるため、本願で使用されている用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定を意図するものではないと理解されるべきである。

実施例は、説明の目的でのみ提供される。

実施例１：ゲノム編集用の親ｈｉＰＳＣ細胞株の生成
２つのｈｉＰＳＣ細胞株、すなわち、ＵＣＩＳ３００７とＩＰＳＮ００４１が生成され、同質遺伝子病変ｈｉＰＳＣ細胞株を調製するために親ｈｉＰＳＣ細胞株として使用された。ＵＣＩＳ３００７は、非罹患女性ドナーの尿細胞に由来し、この尿細胞は、４つの転写因子（Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ１、Ｋｌｆ４、およびｃＭｙｃ）を使用して、レトロウイルスベクターを介したリプログラミング法により得られた。ドナー尿上皮細胞を尿上皮細胞増殖培地（ＣＩＢ、カタログ番号ＵＣ−０３０２）で培養した。ウイルス感染の前日に、約２０，０００個の尿液における上皮細胞を１２ウェルプレートに播種した。レトロウイルスベクターでトランスフェクトした細胞を、ｈｉＰＳＣリプログラミング血清培地（ＣＩＢ、カタログ番号ＲＥ−０２０１）で培養した。６日目に、細胞をフィーダー細胞を含むＴ２５フラスコに播種し、マイトマイシンＣで処理した。約１０，０００個の細胞を各Ｔ２５フラスコに播種し、ｈｉＰＳＣクローンが現れるまで約２０日間リプログラミング培地で培養した。次に、クローンをマトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２４７７）で被覆されたプレートにピックアップして更なる精製および増殖に用いられた。

ＩＰＳＮ００４１は非罹患ドナーの臍帯マトリックス細胞に由来し、この臍帯マトリックス細胞は、６つの転写因子を有するエピソームベクターを使用したフットプリントフリー（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ−ｆｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄ）によって得られた。Ａｍａｘａ ＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒキットＩＩを使用して、核転移試薬（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号ＶＰＩ−１００５）と混合したエピソームプラスミド（３μｇｐＣＥＰ４−ＥＯ２Ｓ−ＥＮ２Ｋ、２．４μｇｐＣＥＰ４−Ｍ２Ｌ、３．２μｇｐＣＥＰ４−ＥＯ２Ｓ−１）で約１００万個の臍帯マトリックス細胞をエレクトロポレーション法でトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５２４７７）で被覆された２つのＴ２５フラスコに直ちに播種し、ｈｉＰＳＣリプログラミング培地（ＣＩＢ、カタログ番号ＲＥ−０２０２）で培養した。トランスフェクションしてから１５日目に、培地をｍＴｅＳｒ１に置き換え、ｈｉＰＳＣコロニーが現れるまでさらに７日間培養した。典型的なｈｉＰＳＣ形態を持つクローンを、更なる精製および増殖のために選択した。

ｈｉＰＳＣクローンの同定は国際標準^43-44に従って行われ、外因性遺伝子サイレンシングおよび多能性マーカー発現検出、外因性遺伝子組み込みアッセイ、プロモーター脱メチル化分析、核型分析テスト、分化能テスト（胚様体形成）、奇形腫テスト、セルＩＤ（ＳＴＲ）テストなどを含む（図１）。また、ゲノム編集作業を行う前に、これら２つの親ｈｉＰＳＣ細胞株の神経系統分化の可能性も検証された（図２）。

実施例２：ドナーベクターと標的ベクターの構築
最も一般的に使用されているゲノム編集技術ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを使用してｈｉＰＳＣ遺伝子工学改変が行われた。ＡＤ関連遺伝子のセーフハーバー部位（ＡＡＶＳ１部位）への標的組み込みについて、ＡＡＶＳ１部位を標的とする特異的なＣＲＩＳＰＲｓｇＲＮＡベクターが構築された。ｓｇＲＮＡの設計および構築は、文献に記載されている方法に従って行われた²⁹。ＢｐｉＩ酵素の標的部位はベクター上にあり、認識部位は切断部分にある。そのため、目標部位スペーサー配列は、一段階の消化によってベクターにクローニングすることができる。消化後、ベクターには５’ＧＴＧＧ３’と５’ＧＴＴＴ３’粘着末端が含まれている。ＣＡＣＣ＋ターゲットスペーサー配列の粘着末端と、ＡＡＡＣ＋逆相補配列の粘着末端とを合成することにより、ｓｇＲＮＡは、追加の粘着末端を持つ２本鎖オリゴ配列になり、ｃａｓ９ベクターに連結することができる。ＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９プラスミドは一般的に２ステップの方法で構築される。最初のステップは、合成されたオリゴ配列の切断部位を処理することであり、第２のステップは、処理されたオリゴ配列を制限酵素消化で処理されたＣＲＩＳＰＲ−ｃａｓ９ベクターと連結することである。

ドナー構築について、まず、ＰＧＫ−ＰＵＲＯ−ＳＶ４０ＰＡ、Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＢＧＨＰＡおよびＣＡＧプロモーターを含む骨格ベクターとマルチクローニングサイト（ＭＳＣ）が生成された。最終的なドナーを構築するために、１）Ｔ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＡＧ−ＥｃｏＲＩ、２）Ｔ−ＳａｌＩ−Ｐ２Ａ−ＥＧＦＰ−ＢＧＨＰＡ−ＮｏｔＩ、３）Ｔ−Ｈｉｎｄ ＩＩＩ−ＰＧＫ−ＰＵＲＯ−ＳＶ４０ＰＡ−ＨｉｎｄＩＩＩ、４）合成されたＰＵＣ１９−ＥｃｏＲＩ−ＢＡＣＥ１ｃｄｓ−ＳａｌＩ、及び５）ＰＺＤベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）の５つのプラスミドが生成された。最初のステップは、プラスミド１、２、４および５を消化して、ＨｉｎｄＩＩＩ−ＣＡＧ−ＥｃｏＲＩ−、−ＬＡＬＩ−ＥＧＡ−ＥＧＦＰ−ＢＧＨＰＡ−ＮоｔＩ−、ＥｃｏＲＩ−ＢＡＣＥ１ｃｄｓ−ＳａｌＩ−およびＨｉｎｄＩＩＩ−ＰＺＤｏｎｏｒ−ＨｉｎｄＩＩＩ−の４つのフラグメントを回収して、すべてのフラグメントを連結した。ＤＨ５α細胞へ形質転換した後、陽性クローンは、ＰＣＢＥＢ６の中間ベクターとして同定された。ＨｉｎｄＩＩＩ消化を介して、ＰＣＢＥＢ６とＴ−ＨｉｎｄＩＩＩ−ＰＧＫ−ＰＵＲＯ−ＳＶ４０ＰＡ−ＨｉｎｄＩＩＩを連結して最終的なドナーベクターが生成された。このドナーベクターはＣＩＢ−ＰＣＢＥＢと呼ばれる（図３Ａ）。ＡＡＶＳ１部位での過剰発現のすべての外因性遺伝子は、両端にＢｇｌＩＩとＸｈｏＩ切断部位を持つ遺伝子配列を合成することによって完成された。目的の遺伝子は、ベクターをＢｇｌＩＩとＸｈｏＩで消化してベクターに挿入され、そしてインサートセグメントと前記ベクターを連結した。最終的なドナープラスミドを使用してＤＨ５α細胞に形質転換し、そしてシーケンシングによって検証した。ＢＡＣＥ１遺伝子とＰＳ１ｄＥ９遺伝子の過剰発現のドナーの構築は、図３Ｂと３Ｃに示されている。

実施例３：ＡＡＶＳ１部位でのＡＤ関連遺伝子の標的組み込み
ＡＤ関連遺伝子をＡＡＶＳ１部位に導入するために、ｍＴｅＳＲ１（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５８５０）を使用して、親ｈｉＰＳＣを、マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３５４２７７）で被覆された６ウェルプレート上に３７℃、５％ＣＯ₂で培養した。細胞を８０％コンフルエンスで収穫し、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡプラスミドとドナープラスミドと共に、エレクトロポレーション法（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ ＩＩ、プログラムＡ−０２４）によって同時トランスフェクションした。各トランスフェクション反応の細胞数は０．５〜１×１０⁶であり、プラスミドの量は、Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ２．５μｇ、ドナープラスミド４μｇであった。トランスフェクションされた細胞を、マトリゲルで被覆された６ウェルプレートに直ちに播種し、ｍＴｅＳＲ１および１０μＭＹ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｙ０５０３）とともにインキュベーションした。４８時間インキュベーションした後、薬剤選択のために、０．５μｇ／ｍｌのピューロマイシン（Ｘｉｙａ Ｒｅａｇｅｎｔ、カタログ番号１０１４５５３）を培地に添加して２４時間インキュベーションした。ピューロマイシン耐性細胞を、マトリゲルで被覆されたＴ２５フラスコに１０００細胞／ｍｌの密度で播種し、ｍＴｅＳＲ１および１０ｕＭ Ｙ−２７６３２でインキュベーションすることによって、単細胞クローンを調製した。１０日後に顕微鏡の下で単細胞クローンをピックアップして、マトリゲルで被覆された９６ウェルプレートに移された。各クローンを２つの等しい部分に分け、２つの９６ウェルプレート上に培養し、１つは増殖用、１つは同定用であった。遺伝子組み込みを検証するために、ＤＮＡ溶解キット（ＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ ^TM ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ １．０、Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ、カタログ番号ＱＥ０９０５０）で細胞を溶解した後、ジャンクションＰＣＲでインサートフラグメントの存在を確認した（図４Ｂ）。ジャンクションＰＣＲによって同定された陽性クローンは、シーケンシングによってさらに検証された（図４Ｃ）。また、選択されたクローンについて多能性測定および核型分析を行って、単細胞のクローニングプロセスによって導入された変異を排除した（図４Ｄ）。ＢＡＣＥ１とＰＳ１ｄＥ９遺伝子を構成的に過剰発現する２つのｈｉＰＳＣ細胞株は、類似したストラテジーを施用して生成された（図４Ａと図５Ａ）。

実施例４：神経細胞の大規模生成
上記のように、ＡＤ関連のヒトニューロンを一貫して重複可能に大量に生成できることは、薬剤スクリーニングのための生理学的な細胞プラットフォームを構築するために重要である。現在の技術では、ｈｉＰＳＣからの機能的ニューロンへの分化は長いプロセスであり、しかも培養条件の一連の変化にさらされる。したがって、９６ウェルプレートにｈｉＰＳＣを直接に播種してニューロンを生成すると、分化したニューロンの数と質の点で、ウェル間で大きな変異が生じる。この大きな変異は、薬剤スクリーニングには適していない。この問題を解決するために、変異を制御するための段階的なプロセス（Ｓｔｅｐ−ｗｉｓｅ ｐｒｏｃｅｓｓ）が開発された。最初のステップは、ｈｉＰＳＣから高質の神経幹細胞（ＮＳＣ）を生成することであり、このステップにより、ｈｉＰＳＣから成熟したニューロンまでのプロセス全体が６〜８週間短縮された。第２のステップは、ＮＳＣを神経前駆細胞（ＮＰＣ）に分化させることであり、これにより、成熟したニューロンを生成する分化時間がさらに短縮された。ＮＳＣストックの生成のために、ｈｉＰＳＣを神経誘導培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０５８３５）および１０ｕＭ Ｙ−２７６３２（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｙ０５０３）を含む１２ウェルプレート上に播種した。５日後、形成された胚様体球をマトリゲルで被覆された１２ウェルプレート上に広げ、３７℃のＣＯ₂インキュベーターでインキュベーションし、神経誘導培地を毎日変更した。７日後、ＮＳＣ様ロゼット細胞を選んで２４ウェルプレートに移した。培地は、ＮＳＣ増殖培地（ＣＩＢ、カタログ番号ＮＥ−０６０３）で置き換えられた。７〜８日後、ＮＳＣ様細胞を選んで４８ウェルプレートに移した。ＮＳＣ密度が９０％コンフルエンスに達したら、更なる増殖と保管のために６ウェルプレートに移した。機能性ニューロンを生成するために、８×１０⁴／ｃｍ²のＮＳＣを、ポリ−Ｌ−オルニチン（Ｓｉｇｍａ、Ｃａｔ Ｎｏ．Ｐ４９５７）およびラミニン（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号２０２０）で被覆された６ウェルプレートに移し、ニューロン誘導培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０８５００）で培養した。７日後、培地をニューロン成熟培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０８５１０）に置き換えて２〜３週間培養を続けた。成熟ニューロンは、Ｔｕｊ１などのニューロン特異的バイオマーカーの免疫染色によって検証された（図６）。

実施例５：修飾されたｈｉＰＳＣ細胞株におけるβ−セクレターゼの過剰発現
上記のように、本発明により作られたベクターを使用して２つのｈｉＰＳＣ細胞株が生成された。１つのｈｉＰＳＣ細胞株（ＩＰＳＮ００４１−２１）は、ＡＡＶＳ１部位で構成的に発現されたＢＡＣＥ１（β−セクレターゼ１）遺伝子を含む。この細胞株について、ＲＮＡおよびタンパク質レベルでのＢＡＣＥ１遺伝子の発現を、その同質遺伝子の親細胞株（ＩＰＳＮ００４１）のＲＮＡおよびタンパク質レベルでの発現と比較した。ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡ発現を定量化するために、全ＲＮＡをＴＲＩｚоｌ（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ９４２４）で抽出した。ＡＢＩＴＭ７５００システムと蛍光色素ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸＴａｑＴＭＩＩ（ＴａＫａＲａ、カタログ番号ＲＲ８２０Ａ）を使用してｑＰＣＲを行った。ハウスキーピング遺伝子β−アクチンを参照として使用し、各データポイントは３回の繰り返しの平均値であった。その結果、ＩＰＳＮ００４１と比べて、ＩＰＳＮ００４１−２１のＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡ発現は、ｉＰＳＣとｉＰＳＣ由来のニューロンではるかに高く、トランスフェクトされたＢＡＣＥ１遺伝子がＩＰＳＮ００４１−２１で確かに過剰発現していることは示された（図７Ａ）。ＢＡＣＥ１タンパク質の発現は、ＥＬＩＳＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ｐ００１３）を使用して行われた。上記方法によってＮＳＣと成熟ニューロンが取得され、細胞はタンパク質溶解緩衝液（Ｂｉｙｕｎｔｉａｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号Ｐ００１３）によって溶解され、ＥＬＩＳＡキットを使用して製造元のプロトコルに従ってＢＡＣＥ１タンパク質濃度は測定された。ＲＮＡの結果と同様に、ＩＰＳＮ００４１−２１におけるＢＡＣＥ１タンパク質（β−セクレターゼ１）レベルは、ｈｉＰＳＣ由来のＮＳＣおよびニューロンの親系ＩＰＳＮ００４１のＢＡＣＥ１タンパク質レベルよりも有意に高いことが示された（図７Ｂ）。

実施例６：修飾されたｈｉＰＳＣ細胞株におけるＡβ−４２ペプチドの発現
Ａβ−４２ペプチドの検出について、成熟したニューロンをニューロン成熟培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０８５１０）で長くとも７週間培養した。上澄みを１週間間隔で収集した。Ａβ−４２ペプチドの濃度を、ヒト／ラットＡβ４２ＥＬＩＳＡキット（ＷＡＫＯ、カタログ番号２９０−６２６０１）を使用して測定した。標準化のために、毎回収集した総タンパク質をも測定した（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔ、カタログ番号２３２２５）。予想通り、ＩＰＳＮ００４１−２１ニューロン培地でのＡβ−４２ペプチドの発現量は、ＩＰＳＮ００４１ニューロンでのＡβ−４２ペプチドの発現量より高いことが観察された（図８Ａ）。６週間の期間にわたる更なる研究により、ＩＰＳＮ００４１−２１由来のニューロンは、ＩＰＳＮ００４１由来のニューロンと異なる発現パターンを持つことが明らかになった。ＩＰＳＮ００４１由来のニューロン（野生型）におけるＡβ−４２ペプチドレベルは、ニューロン培養の最初の週で非常に低く、時間の経過とともに増加し、５週目でピークになり、６週目で減少した。これに対して、ＩＰＳＮ００４１−２１由来のニューロンにおけるＡβ−４２の発現は、ニューロン培養の最初の２週間で高く、時間の経過とともに減少した（図８Ｂ）。６週間のインビトロでの神経細胞培養は成熟ニューロンの老化プロセスを模擬しているため、観察した結果、野生型ニューロンの場合、Ａβ−４２レベルはニューロンの老化プロセス中に増加することがわかり、これは、ＡＤの疾患メカニズムと一致している。６週目のＡβ−４２の低減は、培地におけるニューロンの死による可能性がある。一方、初期のＩＰＳＮ００４１−２１ニューロンにおけるＡβ−４２の高レベルの発現は、ＢＡＣＥ１導入遺伝子の過剰発現として解釈でき、３週間後のＡβ−４２発現の低減は、未成熟ニューロンの機能障害またはβ−セクレターゼが多すぎて前記ニューロンの死を引き起こしたことが原因である可能性がある。この観察結果は、β−セクレターゼ発現の上昇がニューロンの生存に有害であることを示した。

実施例７：修飾されたｈｉＰＳＣ細胞株を使用した薬剤化合物のスクリーニング
修飾されたｈｉＰＳＣ細胞株ＩＰＳＮ００４１−２１から大量のニューロン前駆細胞（ＮＰＣ）が生成された。化合物スクリーニングアッセイを実施するために、ＮＰＣを５０，０００細胞／ウェルの細胞密度の９６ウェルプレートに播種した。ＮＰＣをニューロン成熟培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号０８５１０）で長くとも４週間培養した。上澄みを１週間間隔で収集した。Ａβ−４０とＡβ−４２濃度を、ヒト／ラットＡβ４２ＥＬＩＳＡキット（ＷＡＫＯ、カタログ番号２９０−６２６０１）を使用して２週目、３週目、または４週目に測定した。Ａβ−４０とＡβ−４２ペプチドの測定の１週間前に、測定される化合物をニューロン培地に加えた。図９に示すように、２つの新規化合物（Ｂ３とＢ１６）によるＡβペプチドへの影響を測定した。その結果、Ｂ３とＢ１６が、Ａβ−４０とＡβ−４２ペプチドの生成を減少させるが、Ａβ−４２とＡβ−４０との比率には影響しないことは示された。注目されたのは、Ｂ３とＢ１６の処理状況と比較して、Ａβ−４２とＡβ−４０との高い比率によって示されたように、陽性対照（一般的に使用されるβ−セクレターゼ阻害剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、カタログ番号Ｓ４５６２））がＡβ−４２ペプチドとＡβ−４０ペプチドの生成を不均衡に減少させた。この結果は、ＢＡＣＥ１遺伝子の過剰発現によってＩＰＳＮ００４１−２１におけるＡβペプチドの発現が上昇し、Ａβ−４０とＡβ−４２ペプチド測定の感度を確実に高め、異なるＡβペプチドに対する潜在的な薬剤化合物の影響の区別付けを可能にすることを示した。特に、このシステムは、Ａβ−４２の生成を効果的に減少させる化合物をスクリーニングできる。

結論
本発明は、ｈｉＰＳＣにおけるＡＤ関連遺伝子の過剰発現によって生理学的に関連するＡＤ細胞モデルを作製することを記載しており、前記ＡＤ関連遺伝子は、例えば、ＢＡＣＥ１とＰＳ１およびその変異体である。ヒトゲノムのセーフハーバー部位（ＡＡＶＳ１）でＡＤ関連遺伝子を効率的に標的組み込むためのいくつかのユニークなドナーベクターが生成されている。ＡＡＶＳ１部位でのＡＤ関連遺伝子の標的組み込みは、安全で制御された導入遺伝子発現を提供し、未知のコピー数や内因性遺伝子への潜在的な破壊など、一般的に使用されるランダム組み込み法の欠点を克服した。これらのドナーベクターを使用して生成したｈｉＰＳＣ細胞株は、高いレベルのβ−セクレターゼ活性および／または高いレベルのＡβ−４２ペプチドを示し、前記Ａβ−４２ペプチドは、アミロイドプラーク形成の主成分である。本発明は、ｈｉＰＳＣ細胞株由来の神経細胞を使用してＡＤ関連遺伝子を過剰発現する新しい細胞アッセイプラットフォームを確立した。現在の本分野の従来技術と比較して、本発明により作製された細胞アッセイプラットフォームが、新しいβ−セクレターゼ阻害剤および／またはＡβ−４２ペプチド阻害剤のスクリーニングに明確な利点を提供することは、潜在的な薬剤候補化合物の予備スクリーニングによって示されている。

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Claims (46)

1. ｈｉＰＳＣのβ−セクレターゼのレベルの増加および／またはＡβ−４２ペプチドの増加を誘発するようにＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに組み込むことを含む、アルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製する方法。
2. 前記ＡＤ関連遺伝子がｈｉＰＳＣにおいて構成的に過剰発現される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤの発症を引き起こす変異ＡＰＰ遺伝子または変異ＰＳ遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記変異ＰＳ遺伝子がＰＳ１ｄＥ９遺伝子である、請求項３に記載の方法。
5. 前記ＡＤ関連遺伝子がＢＡＣＥ１遺伝子である、請求項１または２に記載の方法。
6. 前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤの発症を引き起こす変異ＡＰＰ遺伝子、ＰＳ１ｄＥ９遺伝子、およびＢＡＣＥ１遺伝子から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記ＡＤ関連遺伝子が部位特異的な方法によりｈｉＰＳＣに組み込まれる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 前記ＡＤ関連遺伝子がＡＡＶＳ１部位でｈｉＰＳＣに組み込まれる、請求項７に記載の方法。
9. 請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法により生成されたアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデル。
10. ＡＤ関連遺伝子をｈｉＰＳＣに導入して構成的に過剰発現させることを含む、ｈｉＰＳＣを修飾する方法。
11. 前記ＡＤ関連遺伝子が、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクターによってｈｉＰＳＣに導入され、前記ヌクレオチド配列が、哺乳動物発現ベクターにおおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターに機能的に連結されている、請求項１０に記載の方法。
12. 前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、請求項１１に記載の方法。
13. 哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子が、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む同一の発現ベクターまたはそれぞれの発現ベクターによって前記ｈｉＰＳＣにさらに導入される、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記発現ベクターがさらに、部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列を含む、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列が、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同なヌクレオチド配列である、請求項１５に記載の方法。
17. 哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターに機能的に連結され、ＡＤ関連タンパク質とレポーター分子をコードするヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
18. 前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、請求項１７に記載のベクター。
19. 哺乳動物発現ベクターにおける遺伝子の高いレベルの発現を駆動するためのプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子をコードするヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７または１８に記載のベクター。
20. 前記プロモーターがＰＧＫ−１プロモーターまたはＣＡＧプロモーターである、請求項１９に記載のベクター。
21. 部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載のベクター。
22. 前記部位特異的組み込みのためのヌクレオチド配列が、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同なヌクレオチド配列である、請求項２１に記載のベクター。
23. 前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、請求項１７〜２２のいずれか一項に記載のベクター。
24. 前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載のベクター。
25. 前記ベクター内のすべてのエレメントが、前記ＡＤ関連遺伝子の発現に寄与する順序で排列している、請求項１７〜２４のいずれか一項に記載のベクター。
26. 前記ベクター内のすべてのエレメントが、シス順で排列している、請求項２５に記載のベクター。
27. 第１のプロモーターと、前記第一のプロモーターによって制御される薬剤選択遺伝子と、第二のプロモーターと、前記第二のプロモーターによって制御されるレポーター遺伝子に連結されているＡＤ関連遺伝子と、ヒトＡＡＶＳ１部位に相同な配列との核酸配列を含む遺伝子構築体であって、前記エレメントがシス順で排列している、遺伝子構築体。
28. 前記第１のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、前記第二のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記ＡＤ関連遺伝子が、ＢＡＣＥ１をコードする遺伝子であり、前記レポーター遺伝子が、緑色蛍光タンパク質または赤色蛍色タンパク質をコードする遺伝子である、請求項２７に記載の遺伝子構築体。
29. 前記第１のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記薬剤選択遺伝子が抗生物質耐性遺伝子であり、前記第二のプロモーターがＰＧＫ−１またはＣＡＧプロモーターであり、前記ＡＤ関連遺伝子が、ＰＳ１ｄＥ９をコードする遺伝子であり、前記レポーター遺伝子が、ＧＦＰをコードする遺伝子である、請求項２７に記載の遺伝子構築体。
30. 抗生物質耐性遺伝子が、ピューロマイシン、ネオマイシン、カナマイシン、またはジェネティシン耐性遺伝子である、請求項２８または２９に記載の遺伝子構築体。
31. 請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子構築体によって転換されたｈｉＰＳＣ細胞株。
32. ＡＤ細胞モデルの生成のための、請求項３１のｈｉＰＳＣ細胞株の使用。
33. ヒトＡＡＶＳ１部位でＢＡＣＥ１遺伝子が組み込まれ、前記組み込まれたＢＡＣＥ１遺伝子が構成的に過剰発現されている、ＡＤ細胞モデルとして使用される遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。
34. 前記ＢＡＣＥ１遺伝子が組み込まれていない同質遺伝子ｈｉＰＳＣと比較して、増加したβ−セクレターゼおよび／またはＡβ−４２ペプチドを示す、請求項３３に記載の遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。
35. ヒトＡＡＶＳ１部位でＰＳ１ｄＥ９遺伝子が組み込まれ、前記組み込まれたＰＳ１ｄＥ９遺伝子が構成的に過剰発現されている、ＡＤ細胞モデルとして使用される遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。
36. 前記ＰＳ１ｄＥ９遺伝子が組み込まれていない同質遺伝子ｈｉＰＳＣと比較して、増加したβ−セクレターゼおよび／またはＡβ−４２ペプチドを示す、請求項３５に記載の遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣ。
37. ＡＤ治療薬のハイスループットスクリーニングのための、請求項３３〜３６のいずれか一項に記載の遺伝子修飾されたｈｉＰＳＣの使用。
38. ｉ）請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子構築体をｈｉＰＳＣに導入することにより、ｈｉＰＳＣからアルツハイマー病（ＡＤ）の細胞モデルを調製することと、
    ｉｉ）上記細胞モデルで候補化合物を２日から２週間培養することと、
    ｉｉｉ）前記候補化合物を添加する前後のβ−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比を測定することとを含み、
    ここで、β−セクレターゼのレベル、Ａβ−４２濃度、及びＡβ４２／Ａβ−４０比から選択される一つ以上の測定値の減少は、前記候補化合物がＡＤの治療のための潜在的な治療薬であることを示す、
    ＡＤ治療薬をハイスループットスクリーニングするための方法。
39. 前記ｈｉＰＳＣがヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、請求項３８に記載の方法。
40. 前記ｈｉＰＳＣが、ＡＤを有さない正常なヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、請求項３９に記載の方法。
41. 初期のＡＤ薬スクリーニング用の、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載のハイスループットスクリーニングするための方法。
42. ｉ）ＢＡＣＥ１遺伝子またはＰＳ１ｄＥ９遺伝子を構成的に過剰発現させることによりｈｉＰＳＣ細胞株を修飾することと、
    ｉｉ）前記ｈｉＰＳＣ細胞株を機能性ニューロンに再分化することと、
    ｉｉｉ）候補化合物の存在下で前記機能性ニューロンを培養することと、
    ｉｖ）β−セクレターゼのレベル、Ａβ４２／Ａβ−４０比、及び／またはＡβ−４２濃度を測定し、β−セクレターゼのレベル、Ａβ４２／Ａβ−４０比、及び／またはＡβ−４２濃度を低減できる化合物を選択することとを含む、
    β−セクレターゼまたはＡβ−４２阻害剤をスクリーニングするための薬剤スクリーニング方法。
43. 候補薬剤化合物の存在下で前記機能性ニューロンを２日から２週間培養することを含む、請求項４２に記載の方法。
44. 前記ｈｉＰＳＣがヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、請求項４２または４３に記載の方法。
45. 前記ｈｉＰＳＣが、ＡＤを有さない正常なヒトドナーに由来し、通常のリプログラミング法によりインビトロでｈｉＰＳＣに転換される、請求項４４に記載の方法。
46. 請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の発現ベクターまたは請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の遺伝子構築体をｈｉＰＳＣに導入することによって前記ｈｉＰＳＣを調製する、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。