CN114875074B - 提高多克隆兔抗体产生的方法 - Google Patents

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    • C12N2510/00—Genetically modified cells

Abstract

一种提高多克隆兔抗体产生的方法，属于生物技术领域。本发明的目的是创建一种可以高产抗体兔，以获得效价更高的多克隆抗体，为抗体的进一步研发提供技术支持的提高多克隆兔抗体产生的方法。本发明步骤是：获得足够数量兔受精卵，胚胎显微注射，兔基因型鉴定。本发明促进抗体制备技术的发展，引领抗体药物研发的新方向，可以高产抗体兔，以获得效价更高的多克隆抗体，为抗体的进一步研发提供技术支持。

Description

提高多克隆兔抗体产生的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域。
背景技术
与各种来源的抗体相比，兔源抗体有更广泛的抗体谱，免疫球蛋白结构简单，且具有更高特异性和亲和力。近年来，CRISPR/Cas9基因编辑技术已为高效率基因编辑开辟了一条全新的思路，极大的推动了基因修饰动物的发展，并成功应用于斑马鱼、小鼠、大鼠、兔、猪、猴子等多个物种。
发明内容
本发明的目的是创建一种可以高产抗体兔，以获得效价更高的多克隆抗体，为抗体的进一步研发提供技术支持的提高多克隆兔抗体产生的方法。
本发明步骤是：
步骤一、获得足够数量兔受精卵：采用超数排卵方案，选用雌性新西兰大白兔，在发情期内经肌肉注射促卵泡激素50 IU，以促进卵泡发育成熟，每12小时注射一次，连续注射3天；最后一次注射后，与公兔进行交配，将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100IU人绒毛膜促性腺激素；在注射18-20h后，取出卵巢和输卵管放于培养皿中，使用冲卵液DPBS-BSA冲出受精胚胎，将胚胎移入培养液EBSS中，置于38.5℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育待用；
步骤二、胚胎显微注射：将体外合成的50ng/UL 的FcγRIIb-sgRNA、单链DNA和200ng/UL 的Cas9mRNA，短暂离心后混合，吸出3μL至注射针中，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵30-50枚移植到同期发情的受体母兔输卵管中，对代孕母兔提供充足的饲料和饮水，保持干净饲养环境，规范化饲养，妊娠至20天后，转至产房饲养至预产期；
步骤三、兔基因型鉴定：提取组织的DNA，进行PCR及测序，确定基因型，
PCR 引物： 上游引物：GGAGGAAGTAAATAGTGCACAGA
下游引物：GGGACTAGACTTTATCTTGGTGTC
PCR反应体系
模板 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2X taqplus 12.5 ul
二馏水 9.5ul
反应的条件：95℃预变性5min；95 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸27s；35个循环；72℃ 延伸5min；
PCR产物测序，若在sgRNA序列的第18位的T突变成C，则证明获得单碱基突变。
本发明针对兔FcγRIIb基因序列，针对人类SLE疾病位点设计突变，设计特异性sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。
本发明单链设计是依据sgRNA序列，在FcγRIIb基因序列上sgRNA序列的左右选择各加上55bp，并对sgRNA上的第18位的T突变成C，将Cas9识别的PAM（NGG）突变，通过同义突变将TGG突变成TAG，使得寡链不再被cas9识别靶向，获得的特异性的寡聚核苷酸单链序列为SEQ ID NO.2。
本发明鉴定兔的基因型的鉴定引物F序列为SEQ ID NO.3，鉴定兔的基因型的鉴定引物R序列为SEQ ID NO.4。
本发明促进抗体制备技术的发展，引领抗体药物研发的新方向，可以高产抗体兔，以获得效价更高的多克隆抗体，为抗体的进一步研发提供技术支持。
附图说明
图1是本发明基因敲除情况的测序峰图；
图2是兔瘟疫苗免疫后正常兔和基因编辑兔血清中IgG的含量。
具体实施方式
抗体药物是现代生物医药产业的主力军，目前占全球生物药物市场的50%，是生物医药产业增长最快的细分领域，抗体的应用广泛，在医疗、科研等方面发挥着重要作用，抗体产业的科研价值和经济价值都很相当可观，但它们的有限供应（效价低）削弱了它们的实用性。本发明提供一种制备高产抗体兔的方法，促进抗体制备技术的发展，引领抗体药物研发的新方向。
本发明步骤是：
步骤一、获得足够数量兔受精卵：采用超数排卵方案，选用雌性新西兰大白兔，在发情期内经肌肉注射促卵泡激素50 IU，以促进卵泡发育成熟，每12小时注射一次，连续注射3天；最后一次注射后，与公兔进行交配，将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100IU人绒毛膜促性腺激素；在注射18-20h后，取出卵巢和输卵管放于培养皿中，使用冲卵液DPBS-BSA冲出受精胚胎，将胚胎移入培养液EBSS中，置于38.5℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育待用；
步骤二、胚胎显微注射：将体外合成的50ng/UL 的FcγRIIb-sgRNA、单链DNA和200ng/UL 的Cas9mRNA，短暂离心后混合，吸出3μL至注射针中，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵30-50枚移植到同期发情的受体母兔输卵管中，对代孕母兔提供充足的饲料和饮水，保持干净饲养环境，规范化饲养，妊娠至20天后，转至产房饲养至预产期；
步骤三、兔基因型鉴定：提取组织的DNA，进行PCR及测序，确定基因型，
PCR 引物： 上游引物：GGAGGAAGTAAATAGTGCACAGA
下游引物：GGGACTAGACTTTATCTTGGTGTC
PCR反应体系
模板 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2X taqplus 12.5 ul
二馏水 9.5ul
反应的条件：95℃预变性5min；95 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸27s；35个循环；72℃ 延伸5min；
PCR产物测序，若在sgRNA序列的第18位的T突变成C，则证明获得单碱基突变。
本发明针对兔FcγRIIb基因序列，针对人类SLE疾病位点设计突变，设计特异性sgRNA的序列为SEQ ID NO.1。
本发明单链设计是依据sgRNA序列，在FcγRIIb基因序列上sgRNA序列的左右选择各加上55bp，并对sgRNA上的第18位的T突变成C，将Cas9识别的PAM（NGG）突变，通过同义突变将TGG突变成TAG，使得寡链不再被cas9识别靶向，获得的特异性的寡聚核苷酸单链序列为SEQ ID NO.2。
本发明鉴定兔的基因型的鉴定引物F序列为SEQ ID NO.3，鉴定兔的基因型的鉴定引物R序列为SEQ ID NO.4。
以下对本发明做进一步详细说明：
1.本发明的特异性sgRNA序列：上游：5’-ggcggtggtcactgggattg -3’
下游5’-caatcccagtgaccaccgcc -3’制备方法：根据在线网站(http://www.rgenome.net/cas-offinder/)，针对兔FcγRIIb基因序列，针对人类SLE疾病位点设计突变，sgRNA由金斯瑞生物科技有限公司合成。
2.特异性的寡聚核苷酸单链：该单链设计是依据sgRNA序列，在FcγRIIb基因序列上sgRNA序列的左右选择各加上55bp，并对sgRNA上的第18位的T突变成C，将Cas9识别的PAM（NGG）突变，通过同义突变将TGG突变成TAG，使得寡链不再被cas9识别靶向，单链序列由金斯瑞生物科技有限公司合成。合成方法：采用固相亚磷酰胺三酯法，以商业化DNA合成仪为主要合成平台进行生产，将单个核苷酸进行连接，形成短链DNA，合成时从3’-5’方向进行，相邻的核苷酸通过3’-5’磷酸二酯键连接，通常3’端第一个碱基结合在CPG上。步骤：一般经过脱保护，活化缩合，盖帽和氧化四个步骤完成一个碱基的添加。
3.Cas9 mRNA的准备
（1）Cas9质粒线性化
3x FLAG-NLS-SpCas9-NLS 载体(Addgene ID：48137)，经NotI酶线性化后，酶切体系（表1），37℃酶切过夜，取1 μL酶切产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，以未酶切原质粒为对照，电泳鉴定线性化完全后，用DNA胶回收试剂盒回收酶切产物。
表1 Not I单酶切体系
。
（2）Cas9质粒体外转录
冰上解冻mMessage mMachine SP6 Kit (Ambion) 试剂盒中的相关液体，按照表2体系转录体系进行，将产物置于冰上，加入1 μL Tubro DNaseIII，放入37℃水浴，2小时，以除去残留的DNA转录产物，利用2%的琼脂糖凝胶电泳进行鉴定体外转录产物的完整性及稳定性。
表2 Cas9质粒体外转录体系
。
（3）Cas9质粒体外转录产物纯化
使用miRNeasy Mini Kit (Qiagen)纯化试剂盒，将体外转录合成的Cas9进行纯化，具体操作按试剂盒说明书进行：
①取体外转录产物，向管中补加RNase-free水至100 μL，轻吹混匀，再向其中加入350 mL Buffer RTL，及预冷的250 μL无水乙醇，混匀。
②将①步骤中混合好的液体倒入粉色纯化柱内，静置2 min，12000rpm离心15s，弃去收集管中废液，将纯化柱重新放回收集管中。
③向纯化柱内加入500 μL Buffer RPE，12000 rpm离心15 s，弃液体。重复此步骤一遍。
④将纯化柱放入空收集管中，12000 rpm离心1 min，室温干燥2 min。
⑤将纯化柱放于RNase-free1.5mL离心管中，悬滴30 μL RNase-free水，12000rpm离心2 min，离心管中即为纯化好的Cas9-mRNA。
⑥测定mRNA浓度，将mRNA浓度稀释至200 ng/μL，分装2 μL/管，放置在-80℃冰箱待用。
4.为获得足够数量兔受精卵，本实验采用超数排卵方案。选用雌性新西兰大白兔（6-8月龄），在发情期内经肌肉注射促卵泡激素（FSH）50 IU，以促进卵泡发育成熟，每12小时注射一次，连续注射3天。最后一次注射后，与公兔进行交配，将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100 IU人绒毛膜促性腺激素（HCG）。在注射18-20h后，将母兔耳缘静脉注射空气处死，剖开腹腔取出卵巢和输卵管放于培养皿中，使用冲卵液DPBS-BSA冲出受精胚胎，将胚胎移入培养液EBSS中，置于38.5℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育待用。
5.胚胎显微注射：将体外合成的FcγRIIb-sgRNA（50ng/UL）、单链DNA和Cas9mRNA（200ng/UL），短暂离心后混合，吸出3μL至注射针中，进行胚胎细胞核注射。注射后的受精卵（约30-50枚）移植到同期发情的受体母兔输卵管中，对代孕母兔提供充足的饲料和饮水，保持干净饲养环境，规范化饲养。妊娠至20天后，转至产房饲养至预产期。
6.兔基因型鉴定
提取组织的DNA，提取方法按照试剂盒说明书操作（天根，北京，中国），进行PCR及测序，确定基因型。
PCR 引物： 上游引物：GGAGGAAGTAAATAGTGCACAGA
下游引物：GGGACTAGACTTTATCTTGGTGTC
PCR反应体系
模板 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2X taqplus 12.5 ul
二馏水 9.5ul
反应的条件：95℃预变性5min；95 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸27s；35个循环；72℃ 延伸5min。
PCR产物送于生工生物工程股份公司测序，若在sgRNA序列的第18位的T突变成C，则证明获得单碱基突变。
7.抗体水平检测
待基因修饰兔成长发育到8周龄，使用商品化兔瘟疫苗进行免疫，采用每隔7天进行免疫一次，按照每次免疫1ml的计量，并收集血清，收集的血清进行抗体效价检测，使用商品化兔瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒进行操作，方法如下:
1）设置2个酶标孔中加入100ul阴性对照；
2）在2个酶标孔中加入100ul阳性对照；
3）将待检样品经1:20稀释后取100ul加入相应的孔中；
4）37℃孵育30min；
5）弃液体，每孔加入250ul的洗涤液进行洗板，重复5次，每次30s；
6）每孔加100ul酶标结合物；
7）37℃孵育30min，重复步骤5）；
8）向每孔加入100ul底物液体；
9）37℃孵育15min（避光显色）；
10）每孔加入50ul终止液；
11）于450nm波长处测定各孔的吸光度值，即OD450值。
序列表
<110> 吉林大学
<120> 提高多克隆兔抗体产生的方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 兔(rabbit)
<400> 1
ggcggtggtc actgggattg 20
<210> 2
<211> 130
<212> DNA
<213> 兔(rabbit)
<400> 2
cttccccaga gccttcgtcc aacccagacg atgactcact ggtggtgacg attgtggcgg 60
tggtcactgg gactatggtc atggctactg ttgccatcgt agcagccttc gtctacctca 120
aacgcaggcg 130
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 兔(rabbit)
<400> 3
ggaggaagta aatagtgcac aga 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 兔(rabbit)
<400> 4
gggactagac tttatcttgg tgtc 24

Claims (1)

1.一种提高多克隆兔抗体产生的方法，其特征在于：其步骤是：
步骤一、获得足够数量兔受精卵：采用超数排卵方案，选用雌性新西兰大白兔，在发情期内经肌肉注射促卵泡激素50 IU，以促进卵泡发育成熟，每12小时注射一次，连续注射3天；最后一次注射后，与公兔进行交配，将交配成功的供体母兔通过耳缘静脉注射100 IU人绒毛膜促性腺激素；在注射18-20h后，将母兔耳缘静脉注射空气处死，剖开腹腔取出卵巢和输卵管放于培养皿中，使用冲卵液DPBS-BSA冲出受精胚胎，将胚胎移入培养液EBSS中，置于38.5℃，5% CO2饱和湿度的培养箱内孵育待用；
步骤二、胚胎显微注射：将体外合成的50ng/UL 的FcγRIIb-sgRNA、单链DNA和200ng/UL的Cas9mRNA，短暂离心后混合，吸出3μL至注射针中，进行胚胎细胞核注射，注射后的受精卵30-50枚移植到同期发情的受体母兔输卵管中，对代孕母兔提供充足的饲料和饮水，保持干净饲养环境，规范化饲养，妊娠至20天后，转至产房饲养至预产期；所述的FcγRIIb-sgRNA的引导序列的DNA序列如序列1所示，单链DNA的序列如下：
cttccccagagccttcgtccaacccagacgatgactcactggtggtgacgattgtggcggtggtcactgggactgtagtcatggctactgttgccatcgtagcagccttcgtctacctcaaacgcaggcg
步骤三、兔基因型鉴定：提取组织的DNA，进行PCR及测序，确定基因型，
PCR 引物： 上游引物：GGAGGAAGTAAATAGTGCACAGA
下游引物：GGGACTAGACTTTATCTTGGTGTC
PCR反应体系
模板 1ul
上游引物 1ul
下游引物 1ul
2X taqplus 12.5 ul
二馏水 9.5ul
反应的条件：95℃预变性5min；95 ℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸27s；35个循环；72℃延伸5min；
PCR产物测序，若在对应于sgRNA引导序列的第18位的T突变成C，则证明获得基因突变兔。
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Defining the immunological phenotype of Fc receptor-like B (FCRLB) deficient mice: Confounding role of the inhibitory FcγRIIb;Keiji Masuda等;《Cellular Immunology》;第266卷;全文 *
PREDICTED: Oryctolagus cuniculus low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor II (LOC100359306), transcript variant X1, mRNA, Accession No. XM_008264171.2.《Genebank数据库》.2016,序列部分. *

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