CN1175731C - 银鲫品种培育和苗种生产的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种银鲫品种培育和苗种生产的方法，其特征是分别利用银鲫的两性生殖方式获得遗传重组的后代，选择不同银鲫品系的雌雄作为品种培育的亲本，催情产卵，将雌鱼卵子接入器皿中，加入盐水搅拌，发塘培育，然后进行银鲫品种的筛选和苗种生产，择出银鲫雌性个体和红鲤的雌性个体进行催情，将成熟卵子与红鲤产下的精子授精，发塘培育。本发明简便易行，防止了品种混杂和退化，提高了苗种存活率。

Description

银鲫品种培育和苗种生产的方法

                              技术领域

本发明涉及淡水水产养殖领域，更具体涉及一种快速进行银鲫品种培育和苗种生产的方法。

                              背景技术

在脊椎动物中行单性生殖方式的物种非常罕见，鱼类中有少数物种以雌核发育方式繁殖(桂建芳，1989)。分布于我国的银鲫因其具有雌核发育单性生殖方式，已在鱼类遗传育种方面取得了重大突破，由此培育的异育银鲫已在全国推广养殖，促进了水产业的发展(蒋一珪等，1983；桂建芳，1997)。

雌核发育银鲫最初发现于黑龙江方正县的双凤水库，鉴定为三倍体种群(单仕新、蒋一珪，1988)。该物种的卵子可以通过异源的精子激动雌核发育(俞豪祥，1982；蒋一珪等，1983)。与其它雌核发育物种相比，银鲫更为有趣，在其自然种群中存在少量的雄性个体(5-20％)(蒋一珪等，1983；桂建芳，1997)，而其它雌核发育物种都是由雌性个体组成(Vrijenhoek 1994)。繁育实验结果表明银鲫的卵子用其同源的银鲫精子授精能产生正常子代，而且在其子代中存在一定的雄性个体(蒋一珪等，1983；桂建芳，1997)。

雌核发育银鲫存在丰富的遗传多样性，种群内具有多个品系(朱蓝菲，1990)，其中以品系D为母本的人工繁殖的高体型异育银鲫在全国推广养殖，促进了鲫鱼养殖业的发展。不同的品系不仅在体型、生长速度、繁殖特性、染色体以及其它生物学特征上都存在差异(朱蓝菲等，1987；1993；Zhou et al.，2002)，而且在转铁蛋白、同工酶、线粒体DNA限制性长度多态性分析、RAPD(随机扩增多态性DNA)和SCAR(序列特异扩增区域)等分子遗传标记上也存在显著差异(樊连春等，2000；Zhou et al.，2000；2001；Yanget al.，2001)。这些证据表明银鲫的不同品系具有不同的遗传背景，品系间的遗传差异显著。近年来，在银鲫养殖的苗种生产实践中，常常出现品种混杂和苗种死亡率高的现象，这种现象可能与银鲫独特的生殖方式有关。

参考文献：

樊连春，赖宇鹏，朱蓝菲，梁绍昌，桂建芳。雌核发育银鲫两个不同品系线粒体DNA比较研究。海洋与湖沼，2000，31(4)：370-377。

桂建芳。单性脊椎动物的进化遗传学。自然杂志，1989，12(2)：116-122。

桂建芳。银鲫天然雌核发育机理研究的回顾与展望。  中国科学基金，1997，11(1)：11-16

蒋一珪，梁绍昌，陈本德等。异源精子在银鲫雌核发育子代中的生物学效应。水生生物学报，1983，8(1)：1-13。

单仕新，蒋一珪。银鲫染色体组型研究。水生生物学报，1988，12(4)：381-384。

俞豪祥。银鲫雌核发育的细胞学观察。水生生物学集刊，1982，7(4)：481-487。

朱蓝菲，蒋一珪。银鲫种内的遗传标记及其在选种中的应用。水生生物学报，1987，12(2)：105-111。

朱蓝菲、蒋一珪。银鲫不同雌核发育系的生物学特性比较研究。水生生物学报，，199317(2)：112-120。

Vrijenhoek RC.Unisexual fish：model system for studying ecology and evolution.A Rev.Ecol.Syst.，1994，25：71-96.

Yang，L.，Yang，S.T.，Wei，X.H.and Gui，J.F.，2001.Genetic diversity among different clones ofthe gynogenetic silver crucian carp，Carassius auratus gibelio，revealed by transferrinand isozyme markers.Biochemical Genetics，39(5/6)：213-225.

Zhou，L.，Wang，Y.and Gui，J.F.，2000.Analysis of genetic heterogeneity among fivegynogenetic clones of silver crucian carp，Carassius auratus gibelio Bloch based ondetection of RAPD molecular markers.Cytogenetics and Cell Genetics，88：133-139.

Zhou，L.，Wang，Y.and Gui，J.F.，2001.Molecular analysis of silver crucian carp(Carassiusauratus gibelio Bloch)clones by SCAR markers.Aquaculture，201：219-228.

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                              发明内容

本发明的目的在于提供一种快速进行银鲫品种培育和苗种生产的方法，它利用银鲫独特的生殖方式，突破了传统育种的繁琐，简便易行，可防止品种混杂现象，提高苗种的存活率。

本发明是在运用分子遗传标记证实银鲫具有两种生殖方式的基础上提出的。利用银鲫品系的多样性和种群内存在的雄性个体，运用已鉴定的RAPD标记，结合用不同精子(如银鲫不同雌核发育系的雄鱼精子和来源于其它鱼类如鲤鱼的异源精子)所进行的繁育试验、细胞学观察、RAPD分析、特异DNA片段的克隆和测序等研究，证实银鲫卵子具有雌核发育生殖和两性融合生殖两种不同的生殖方式。即当银鲫的卵子与异源的精子(如红鲤)授精后，进入卵内的精核不解凝，仅起刺激胚胎发育作用。在这种情况下，父本的基因组对子代没有贡献，或仅掺入微量的DNA物质。这种生殖方式导致产生了遗传一致的后代，不产生雄性个体。这是一种典型的雌核生殖。当银鲫的卵子与其同源的精子授精后，进入卵内的精核解凝，形成雄性原核，并与雌性原核融合。在这种情况下，产生遗传分化的两性子代，这是一种两性生殖方式。进一步的研究发现，银鲫的遗传多样性和两性生殖方式为银鲫种群提供了丰富的遗传变异，雄性个体的存在为种群创造了更多的遗传多样性。

针对银鲫品种混杂和苗种死亡率高等问题，在阐明银鲫两种生殖方式的基础上，进行了多年的人工繁育试验、对各个繁育组合的胚胎发育存活率、性比和表型分化进行了统计分析，结果表明：银鲫卵子在用异源或同源的精子授精后，表现出不同的发育命运。银鲫卵子无论是与异源的红鲤精子还是与同源的银鲫精子授精后，胚胎都能产生正常的后代。但是，在以异精雌核发育方式繁衍的组合中，其胚胎发育正常，鱼苗的孵化率和存活率都高，畸苗少，下塘养殖后很少死亡。而在用银鲫不同品系的雌雄个体以两性生殖方式繁衍的试验组合中，其胚胎的孵化率及开口摄食时鱼苗的存活率明显低于以异精雌核发育方式繁衍的结果。两性生殖产生的畸苗游动不正常，在水中不断打转，直至扭曲为弯月形，在下塘前相继死亡。因此，异精雌核发育子代的存活率显著高于两性生殖子代的存活率。

就体型而言，用异源的红鲤精子授精所产生的雌核发育后代具有与其母本一致的表型，而与同源的银鲫精子授精后所产生的子代性状发生分化，除产生与母本或父本一致的表型外，还可产生新的表型。

异精雌核发育的子代与两性生殖子代中的性比也有显著差异。所有异精雌核发育子代都为可育的雌性个体，而两性生殖子代中大约有11-14％可育的雄性个体，即在第二年春季时，体表粗糙、鳃盖和胸鳍上有“追星”，轻挤腹部有精液溢出，解剖观察发现具有发育成熟的精巢；两性生殖子代中还存在15-23％的不育个体，即腹部非常扁平，轻挤腹部无卵子也无精液溢出，解剖发现不具成熟的卵巢或精巢，仅有一细线状的性腺，周围包裹着大量的脂肪组织。

将同一两性生殖繁育组合的后代在同一池中养殖一年的鱼按性别分别称重。结果表明，各个繁育组合中大多数较小个体为雄性或为不育个体，雄性的生长速度明显低于雌性个体的生长速度，从而大大影响每公顷的平均产量，导致产量降低。

依据上述发现和观点，确立了银鲫品种培育的技术路线和方法。简单地说，利用银鲫种群的品系多样性和其具备的两性生殖能力，选择优良的两个品系，通过一次两性生殖的方式获得大量遗传重组的后代，并从中选择出有生长潜力的个体；而异精雌核生殖的方式可以突破杂种不育的障碍，也可克服两性生殖后代分离的缺陷，由此再通过一次异精雌核生殖将包括生长在内的优良性状稳定遗传下去。因此，仅需两代的遗传育种，就有可能建立稳定的优良品系。

银鲫两性生殖子代的孵化率和出苗率明显低于异精雌核发育子代的孵化率和出苗率，而且鱼苗下塘后，两性生殖子代的死亡率也比异精雌核发育子代要高，这是因为两个不同的克隆经两性融合生殖后，由于染色体数不同等遗传差异引起的不平衡。导致了一些个体死亡，解答出银鲫养殖中为什么出现品种混杂和苗种死亡率高的原因。因此，在银鲫优良品种的苗种生产中，应该严格采取异精雌核发育的生殖方式，才能保证优良性状的稳定遗传。而银鲫的两性生殖方式必须在鱼类遗传育种研究工作者的严格控制下合理地利用，才能有望从中获得具有优良性状的重组个体，否则会导致品种混杂和退化。

本发明的优点：在阐明银鲫两种生殖方式的遗传基础上，解答出银鲫养殖中为什么出现品种混杂和苗种死亡率高的原因，确立了银鲫品种培育和苗种生产的技术路线和方法，以快速培育银鲫品种，提高了苗种存活率，防止了品种混杂和退化。

                            具体实施方式

银鲫品种培育和苗种生产的方法，其具体步骤是：

1、利用银鲫的两性生殖方式获得遗传重组的后代。即首先采用已鉴定的转铁蛋白、RAPD和SCAR等分子遗传标记来鉴定银鲫的不同品系，选择分别来自于两个不同银鲫品系(具有生长快或其它优良性状)的雌雄个体作为品种培育的亲本。其次是亲鱼的选择、培育、人工催产、人工受精、受精卵孵化和苗种培育参照桂建芳所述进行(桂建芳等，1999)。作为繁殖用的母本亲鱼，一般在冬季起鱼时选择个体在0.25千克以上的1龄或2龄的银鲫，以每亩放养400-500尾进行专池培育，待开春气温稍有回升后，开春后亲鱼的日投喂量一般为鱼体重的5％-7％。第三是人工催产，通常，催情产卵通过人工注射鲤鱼丙酮干燥的脑垂体(PG)、人绒毛膜促性腺激素(HCG)和促排卵素(LRH)的混合液。第四是母本的有效剂量为：1mg/kg的PG，300～500国际单位的HCG，1.0～2.0ug/kg的LRH。第五是父本剂量一般为母本剂量的二分之一。第六是人工受精的方法有干法授精、湿法授精和半干法授精方法。主要采用干法授精，即将成熟排卵的银鲫雌亲鱼和成熟的银鲫雄鱼捕起，将雌鱼卵子挤入擦干的器皿中，同时挤入雄鱼的精液，用干羽毛轻轻均匀搅拌1～2分钟，加入少量生理盐水后再轻轻搅拌，然后倒入泥浆水脱粘，搅动3分钟后，用筛绢滤出卵子，在水中漂洗2-3次后，放入孵化设施中流水孵化。第七是大约孵出3天后，鱼苗开始平游，现出腰点，将鱼苗投喂蛋黄后，进行发塘养殖至当年年底并将每个个体称重。通过这样一次两性生殖的方式可以获得大量遗传重组的后代，并有望从中选择出有生长潜力等优良性状的个体。年底称重后选择生长快的雌性个体作为第二次繁育的亲鱼进行培育。

2、利用银鲫的雌核发育生殖方式，进行银鲫优良品种的筛选和苗种生产。即将上述选择出的生长快和品质优的银鲫雌性个体和红鲤的雄性个体进行催情，将雌性个体产下的成熟卵子与红鲤产下的精子授精，所获得的子代进行发塘养殖并进行生长对比试验。由于异精雌核生殖方式可以突破杂种不育的障碍，也可克服两性生殖后代分离的缺陷，因此通过这样一次异精雌核生殖可将包括生长在内的优良性状稳定遗传下去。经过生长对比试验后，就能选择出具有生产潜力的优良新品种。选出的优良品种必须严格按异精雌核发育生殖方式进行规模化的苗种生产，以避免品种混杂和退化，保证优良性状稳定遗传。

Claims (1)

1、一种银鲫品种培育和苗种生产的方法，它包括下列步骤：

A、利用银鲫的两性生殖方式获得遗传重组的后代，首先采用已鉴定的转铁蛋白、RAPD和SCAR分子遗传标记来鉴定银鲫的不同品系，选择分别来自于两个不同银鲫品系的雌雄个体作为品种培育的亲本；其次是亲鱼的选择和培育，作为繁殖用的母本亲鱼，在冬季起鱼时选择1龄或2龄的银鲫，以每亩放养400-500尾进行专池培育，待开春气温回升后，日投喂量为鱼体重的5％-7％；第三是人工催产，催情产卵通过人工注射鲤鱼丙酮干燥的脑垂体、人绒毛膜促性腺激素和促排卵素的混合液；第四是母本的有效剂量为：1mg/kg的PG，300～500国际单位的HCG，1.0～2.0ug/kg的LRH；第五是父本剂量为母本剂量的二分之一；第六是干法授精，将成熟排卵的银鲫雌亲鱼和成熟的银鲫雄鱼捕起，将雌鱼卵子挤入擦干的器皿中，同时挤入雄鱼的精液，用干羽毛均匀搅拌1～2分钟，加入生理盐水后再搅拌，然后倒入泥浆水脱粘，搅动3分钟后，用筛绢滤出卵子，在水中漂洗2-3次后，放入孵化设施中流水孵化；第七是孵出3天后，鱼苗开始平游，现出腰点，将鱼苗投喂蛋黄后，进行发塘养殖至当年年底，获得遗传重组的后代；

B、利用银鲫的雌核发育生殖方式，进行银鲫品种的筛选和苗种生产，将A步骤中择出的银鲫雌性个体和红鲤的雄性个体进行催情，将雌性个体产下的成熟卵子与红鲤产下的精子授精，所获得的子代进行发塘养殖。