CN109329128A

CN109329128A - 日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法及合方鲫2号的培育方法

Info

Publication number: CN109329128A
Application number: CN201811288974.9A
Authority: CN
Inventors: 刘少军; 刘庆峰; 梁秋丽; 刘俊梅; 陶敏; 张纯; 覃钦博; 王静; 罗凯坤
Original assignee: Hunan Normal University
Current assignee: Hunan Normal University
Priority date: 2018-10-31
Filing date: 2018-10-31
Publication date: 2019-02-15
Anticipated expiration: 2038-10-31
Also published as: CN109329128B

Abstract

本发明公开了一种日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法，分别以经人工诱导雌核发育得到的雌性日本白鲫和雄性红鲫为母本和父本，经杂交获得的后代进行饲养，筛选得到两性可育的二倍体合方鲫F₁；培育二倍体合方鲫F₁，自交繁殖后获得两性可育的合方鲫F₂，至少经过两次连续自交得到两性可育的二倍体合方鲫F_n，形成遗传性状稳定、两性可育的二倍体杂交鲫品系，该品系在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义，为培育新型优良鲫鱼提供了优质的种质资源库。本发明还公开了一种合方鲫2号的培育方法，以合方鲫F₁为母本，与雄性日本白鲫回交育种得到。该方法简单易操作，得到的合方鲫2号头小背高，生长速度快，肉质甜而鲜嫩，抗逆抗病能力强。

Description

日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法及合方鲫2号的培育方法

技术领域

本发明属于鱼类杂交领域，尤其涉及一种日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法及合方鲫2号的培育方法。

背景技术

日本白鲫(Carassius auratus cuvieri)属于鲤科(Cyprinidae)，鲫属(Carassius)，鲫种(Carassius auratus)是一种二倍体鱼(2n＝100)。日本白鲫原名源五郎鲫或河内鲫、大孤鲫、大阪鲫、日本鲫。原产日本琵琶湖，1976年引进我国，因其体色银白，故名“白鲫”。日本白鲫体型大，最大个体可达五斤，体高而侧扁，其背部隆起较明显，似驼背，头稍小，尾柄较细长，体色银白。日本白鲫杂食性，主要食浮游植物和底栖动物等。白鲫生长速度比本地鲫鱼快1倍～2倍，一龄性成熟，产粘性卵。日本白鲫具有适应性强，耐寒、耐高温、性成熟早、繁殖率高、养殖成本低等优点。红鲫(Carassius auratus,red variety)隶属于鲤科(Cyprinidae)，鲫属(Carassius)，鲫种(Carassius auratus)也是一种二倍体鱼(2n＝100)，红鲫为鲫的一个变种，主要分布在我国的江南一带。其体形侧扁，背部高而宽，腹部圆，呈纺锤形，头短而小，繁殖力强，体形优美，杂食性，具有抗逆性强和肉质甜而鲜嫩的显著优点。日本白鲫虽然生长速度快，但是肉质欠佳；红鲫虽然肉质甜而鲜嫩，但是生长速度比不上日本白鲫。

杂交技术是一种重要的快速获得优良性状的鱼类遗传育种方法。通过杂交可以改变鱼类的遗传特性，将亲本的优点集中，培育出具有杂种优势的后代。如果通过杂交形成两性可育且遗传稳定的杂交鲫品系(F₁-F₄)，则为遗传育种提供了重要的种质资源库，这在遗传育种方面具有重要意义。如何利用和改进现有的生物学技术和方法，挑选合适的亲本鱼进行杂交，对其进行遗传改良以获得性状更为优良、品种更加丰富和对遗传研究更有意义的新品种或新品系，就成为本领域技术人员长期面临和需要解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法及利用该品系培育合方鲫2号的方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一种日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法，包括如下步骤：分别以经人工诱导雌核发育得到的雌性日本白鲫和雄性红鲫为母本和父本，经杂交获得的后代进行饲养，通过倍性、育性检测筛选获得两性可育的二倍体合方鲫F₁；培育所述二倍体合方鲫F₁，当其达到性成熟年龄时，进行自交繁殖，再经孵化、养殖获得两性可育的合方鲫F₂；所述合方鲫F₂至少经过两次连续自交得到两性可育的二倍体合方鲫F_n，形成遗传性状稳定、两性可育的二倍体杂交鲫品系，即完成所述日本白鲫和红鲫杂交品系的建立。

通过人工诱导雌核发育而获得的亲本鱼在生长速度、抗逆性等方面更具有优势。

上述日本白鲫和红鲫间杂交品系的建立方法，优选的，所述人工诱导雌核发育的具体操作包括如下步骤：用经紫外线灭活的团头鲂精子与日本白鲫或红鲫的成熟卵子混合，经3～4min后将被激活的卵子置于3～4℃温度条件下冷休克处理35～45min，得到的胚胎在22～23℃水温下孵化后挑选出二倍体雌核发育的雌性日本白鲫或雄性红鲫。

基于一个总的技术构思，本发明还相应提供了一种合方鲫2号的培育方法，包括如下步骤：利用所述建立方法中获得的二倍体合方鲫F₁作为母本，与雄性日本白鲫进行回交育种，获得合方鲫2号。选择合方鲫F₁代作为母本亲鱼，相较于其他几代F₁代更具有杂交优势。

上述的培育方法，优选的，所述回交育种的具体操作步骤如下：

(1)在当年的1-2月，拉网打鱼，从所述日本白鲫和红鲫杂交品系中挑选体重600g以上、性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的二倍体雌性合方鲫F₁作为母本亲鱼，同时挑选具备上述特征的雄性日本白鲫作为父本亲鱼，进行专池培育，专池培育期间注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，做好饲养管理工作，在繁殖期前一个月以精饵饲养，每隔3～4天以流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)在同年的3月下旬至5月下旬，当水温稳定在18-23℃时，从所述步骤(1)培育后得到的亲鱼中挑选腹部膨大、松软且有弹性的雌性合方鲫F₁作为母本，以及轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性日本白鲫为父本，先对得到的母本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，4-6h后再对得到的父本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，注射完毕后按1:2-4的数量比将母本亲鱼和父本亲鱼放入同一产卵池中，视水情及时向池中冲水，在产卵前2-3h，注入合适水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；

(3)在步骤(2)后得到的母本亲鱼和父本亲鱼中，挑选产卵顺利的母本亲鱼，与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，得到的受精卵置于水温为20℃-23℃的净水孵化装置中进行流水孵化，得到合方鲫F₁与日本白鲫的杂交后代鱼苗；净水孵化装置在具有净化水的功能同时还具有控温装置，可使水温保持恒定，从而孵化中的受精卵不易发霉，以致提高受精卵的孵化率和鱼苗的存活率；

(4)将步骤(3)后得到的杂交后代鱼苗置于净水孵化装置中继续培养，直至所述杂交后代鱼苗脱膜全部孵出且出现腰点后将其转入预先用豆浆培肥的水泥池中饲养，1-2天后向水泥池中泼洒豆浆，待鱼苗体长长至3.5cm后可开始喂饲料粉，对饲养长大后得到的杂交后代通过生物学方法进行检测筛分，得到所述合方鲫F₁与日本白鲫的杂交后代二倍体合方鲫2号。

优选的，所述步骤(1)中，体征良好表现为体型好、体色鲜艳和体质健壮；专池培育具体表现为：80-100m²水泥池中安装1-2台的增氧泵，在水泥池内壁一侧安装2-4台潜水泵作为流水刺激的动力，定时开启增氧泵，定时定量投喂饲料，80-100m²的水泥池中雌性合方鲫F₁的数量为400-500尾，80-100m²的水泥池中日本白鲫的数量为200-300尾。

优选的，所述步骤(2)中，产卵池的水面面积为60-80m²；为母本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂中，黄体素释放激素类似物的量10-12ug/kg，绒毛膜促性腺激素的量为600-700IU/kg；为父本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂中，黄体素释放激素类似物的量为5-6ug/kg，绒毛膜促性腺激素的量为300-350IU/kg；注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法。该亲本易产卵，采用一针注射即可，同时一针注射法可以保护亲本，不易产生由于注射而导致的亲本损伤。

优选的，所述步骤(3)中，人工干法授精的具体操作包括如下步骤：用湿毛巾将亲鱼包裹固定，用毛巾将打捞的亲鱼腹部擦干，然后轻压母本亲鱼腹部，将合方鲫F₁的卵子挤到干净无水的盆中，用同样的方法将产精量大的父本亲鱼精液挤到所述卵子上面，同时用羽毛端部轻轻地快速搅动，精液挤完后继续用羽毛轻轻搅动1-2min，使之完成授精。

优选的，所述步骤(4)中，预先用豆浆培肥的方法具体包括以下步骤：在面积为10-12m²、水深20-30cm的水泥池中，每天泼洒磨匀的豆浆200-300ml，持续两周，使豆浆在水泥池中充分发酵，待草履虫等微生物大量生长，可供幼苗食用即可；泼洒豆浆的次数为1～2次/天。

优选的，所述通过生物学方法进行检测筛分是利用肾组织染色体倍性检测法、流式细胞DNA含量测定法以及组织学切片观察法对杂交后代鱼进行染色体数目、DNA含量以及性腺发育的检测，再根据检测结果进行筛分。

优选的，所述合方鲫F₁与日本白鲫的杂交后代二倍体合方鲫2号，两性可育，继承了亲本的生长速度快、肉质甜而鲜嫩、抗逆抗病能力强优点的基础上，同时存在头部小、体背高的自身特征。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1、本发明的日本白鲫和红鲫杂交品系建立方法，可以获得两性可育且遗传稳定的杂交鲫品系(目前已稳定遗传到F₄代)，在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义；在生产应用上，该杂交鲫品系的建立，为培育新型优良鲫鱼提供了优质的种质资源库，如本发明中合方鲫2号的培育，即是利用两性鲫可育的杂交鲫品系中的合方鲫F₁与日本白鲫回交后制备得到。

2、本发明的合方鲫2号的培育方法，方法简单易操作，得到的合方鲫2号具有头小背高的特点，同时具有生长速度快、肉质甜而鲜嫩、抗逆抗病能力强等优势特征。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫的外形照片(其中A为合方鲫F₁，B为合方鲫F₂，C为合方鲫F₃，D为合方鲫F₄)。

图2为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫的染色体图(其中A为合方鲫F₁，B为合方鲫F₂，C为合方鲫F₃，D为合方鲫F₄)。

图3为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫F₁的DNA含量图。

图4为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫F₂的DNA含量图。

图5为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫F₃的DNA含量图。

图6为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫F₄的DNA含量图。

图7为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫的卵巢石蜡切片图(其中A为合方鲫F₁，B为合方鲫F₂，C为合方鲫F₃，D为合方鲫F₄)。

图8为本发明实施例1中日本白鲫(♀)×红鲫(♂)杂交获得的合方鲫的精巢石蜡切片图(其中A为合方鲫F₁，B为合方鲫F₂，C为合方鲫F₃，D为合方鲫F₄)。

图9为本发明实施例1中日本白鲫和红鲫及合方鲫F₁、F₂、F₃、F₄的5SrDNA编码区序列分析图。

图10为本发明实施例1中日本白鲫和红鲫及合方鲫F₁、F₂、F₃、F₄的5SrDNA非转录间隔区(NTS-83)序列分析图。

图11为本发明实施例1中日本白鲫和红鲫及合方鲫F₁、F₂、F₃、F₄的5SrDNA非转录间隔区(NTS-220)序列分析图。

图12为本发明实施例1中日本白鲫和红鲫及合方鲫F₁、F₂、F₃、F₄的5SrDNA非转录间隔区(NTS-351)序列分析图。

图13为本发明实施例2中合方鲫F₁(♀)×日本白鲫(♂)回交培育得到的合方鲫2号的外形照片。

图14为本发明实施例2中合方鲫F₁(♀)×日本白鲫(♂)回交培育得到的合方鲫2号的染色体图。

图15为本发明实施例2中合方鲫F₁(♀)×日本白鲫(♂)回交培育得到的合方鲫2号的DNA含量图。

图16为本发明实施例2中合方鲫F₁(♀)×日本白鲫(♂)回交培育得到的合方鲫2号的卵巢石蜡切片图。

图17为本发明实施例中2合方鲫F₁(♀)×日本白鲫(♂)回交培育得到的合方鲫2号的精巢石蜡切片图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。

除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。

除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。

实施例1：

一种本发明的日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法，包括如下步骤：

1.合方鲫F₁的培育

分别用经紫外线灭活的团头鲂精子与日本白鲫/红鲫的成熟卵子混合，经3～4min后将被激活的卵子置于3～4℃温度条件下冷休克处理35～45min，得到的胚胎在22～23℃水温下孵化后挑选出二倍体雌核发育的雌性日本白鲫/雄性红鲫，得到的雌性日本白鲫和雄性红鲫经杂交后的后代进行饲养，通过倍性、育性进行检测，筛选获得两性可育的二倍体合方鲫F₁(见图1A)。

肾细胞直接制片法对合方鲫F₁的体细胞染色体数目进行抽样检测(即肾组织染色体倍性检测法)，发现合方鲫F₁均为二倍体(2n＝100)，染色体图如图2A所示。

以普通红鲫为参照，用流式细胞仪测定合方鲫F₁红细胞中的DNA含量(即流式细胞法)。结果如图3所示。由图中数据可知，合方鲫F₁的DNA平均含量为106，与红鲫的DNA平均含量比值为1.06，该比值与预计的理论比值(1︰1)间无显著差异。流式细胞仪检测的DNA含量结果与肾组织染色体倍性检测所获得的结果是一致的，均说明合方鲫F₁为二倍体鱼。

用组织学切片观察合方鲫F₁的性腺发育情况，结果表明，合方鲫F₁的性腺发育正常。如图7A、8A所示，合方鲫F₁的卵巢中可观察到接近成熟的Ⅳ时相卵母细胞，精巢的精细小管内充满成熟的精子。一龄的合方鲫F₁能够产生成熟的配子，它们与亲本一样都为一年性成熟。

2.合方鲫F₂的培育

培育上述步骤1获得的合方鲫F₁，当其达到性成熟年龄时，进行自交繁殖，再经孵化、养殖获得两性可育的合方鲫F₂。该自交繁殖的过程具体包括以下步骤：

(1)亲鱼的选择和培育：在当年的1-2月，拉网打鱼，从中挑选性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的雌性和雄性合方鲫F₁分别作为母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育，专池培育期间，注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，做好饲养管理工作，特别是在繁殖期前一个月以精饵饲养，每隔3～4天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)人工催产：在当年的3月下旬至5月下旬(即3月20日至5月31日，下同)，当水温稳定在18-23℃时，从所述步骤(1)中培育后得到的亲鱼中挑选腹部膨大、松软且有弹性的雌性合方鲫F₁作为母本，以及轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性合方鲫F₁为父本，然后为亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，为母本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物的用量为10-12ug/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为600-700IU/kg；先对母本亲鱼进行注射催产，4～6h后再对父本亲鱼进行注射催产，父本亲鱼的注射剂量减半，即所述黄体素释放激素类似物的用量为5-6ug/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为300-350IU/kg；注射完毕后按1:2～4的数量比将母、父本亲鱼放入同一水面面积为60-80m²的产卵池中，然后视水情及时向池中冲水，尤其在产卵前2-3h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；为了提高亲鱼的存活率，注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；

(3)授精孵化：当亲鱼在产卵池中相互追逐且产卵池中出现适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼，在水中进行检测。挑选产卵顺利的母本亲鱼，用湿毛巾将亲鱼包裹固定，然后与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，具体步骤为，用毛巾将打捞的亲鱼腹部擦干，轻压母本亲鱼腹部，将合方鲫F₁卵子挤到干净无水的盆中，用同样的方法将产精量大的父本亲鱼精液挤到所述卵子上面，同时用羽毛端部轻轻地快速搅动，精液挤完后继续用羽毛轻轻搅动1-2min；将得到的受精卵置于水温为20℃-23℃的净水孵化装置中进行流水孵化，得到合方鲫F₁的自交后代鱼苗；

(4)饲养：鱼苗全部孵出后，于培养箱中继续培育2～3天，直至所述杂交后代鱼苗脱膜全部孵出且出现腰点后将其转入预先用豆浆培肥的水泥池中饲养。预先用豆浆培肥的方法具体包括以下步骤：在面积为12m²、水深30cm的水泥池中，每天泼洒磨匀的豆浆200ml，持续两周，使豆浆在水泥池中充分发酵，待草履虫等微生物大量生长，可供幼苗食用即可。转入水泥池中饲养1～2天后泼洒豆浆，2～3次/天，力求细、匀。待鱼苗体长长至3.5cm后可开始喂饲料粉，对饲养长大后得到的杂交后代肾组织染色体倍性检测法、流式细胞DNA含量测定法以及组织学切片观察法对杂交后代鱼进行染色体数目、DNA含量以及性腺发育的检测等手段对实验鱼的生物学特性进行检测，得到所述合方鲫F₁的自交后代鱼合方鲫F₂(见图1B)。

孵化期间，对二倍体合方鲫F₁杂交获得的合方鲫F₂的受精率和孵化率进行统计，结果显示，其受精率和孵化率分别为90.2％和81.5％。说明相比于同类杂交鱼，本发明杂交方法具有较高的受精率和孵化率。

肾细胞直接制片法对合方鲫F₂的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现合方鲫F₂均为二倍体(2n＝100)，染色体图如图2B所示。

以普通红鲫为参照，用流式细胞仪测定合方鲫F₂红细胞中的DNA含量。结果如图4所示。由图中数据可知，合方鲫F₂的DNA平均含量为103，与红鲫的DNA平均含量比值为1.03，该比值与预计的理论比值(1︰1)间无显著差异。流式细胞仪检测的DNA含量结果与肾组织染色体倍性检测所获得的结果是一致的，均说明合方鲫F₂为二倍体鱼。

用组织学切片观察合方鲫F₂的性腺发育情况，结果表明，合方鲫F₂的性腺发育正常。如图7B、8B所示，合方鲫F₂的卵巢中可观察到接近成熟的Ⅳ时相卵母细胞，精巢的精细小管内充满成熟的精子。一龄的合方鲫F₂能够产生成熟的配子，它们与亲本一样都为一年性成熟。

3.合方鲫F₃的培育

培育上述步骤2获得的合方鲫F₂，当其达到性成熟年龄时，进行自交繁殖(该自交繁殖与上述步骤2的操作相同)，再经孵化、养殖获得两性可育的合方鲫F₃(见图1C)。

孵化期间，对二倍体合方鲫F₂杂交获得的合方鲫F₃的受精率和孵化率进行统计，结果显示，其受精率和孵化率分别为91.3％和82.1％。相比于同类杂交鱼，本发明杂交方法具有较高的受精率和孵化率。

肾细胞直接制片法对合方鲫F₃的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现合方鲫F₃均为二倍体(2n＝100)，染色体图如图2C所示。

以普通红鲫为参照，用流式细胞仪测定合方鲫F₃红细胞中的DNA含量。结果如图5所示。由图中数据可知，合方鲫F₃的DNA平均含量为106，与红鲫的DNA平均含量比值为1.06，该比值与预计的理论比值(1︰1)间无显著差异。流式细胞仪检测的DNA含量结果与肾组织染色体倍性检测所获得的结果是一致的，均说明合方鲫F₃为二倍体鱼。

用组织学切片观察合方鲫F₃的性腺发育情况，结果表明，合方鲫F₃的性腺发育正常。如图7C、8C所示，合方鲫F₃的卵巢中可观察到接近成熟的Ⅳ时相卵母细胞，精巢的精细小管内充满成熟的精子。一龄的合方鲫F₃能够产生成熟的配子，它们与亲本一样都为一年性成熟。

3.合方鲫F₄的培育

培育上述步骤3获得的合方鲫F₃，当其达到性成熟年龄时，进行自交繁殖(该自交繁殖与上述步骤2的操作相同)，再经孵化、养殖获得两性可育的合方鲫F₄(见图1D)。

孵化期间，对二倍体合方鲫F₃杂交获得的合方鲫F₄的受精率和孵化率进行统计，结果显示，其受精率和孵化率分别为90.8％和82.7％。相比于同类杂交鱼，本发明杂交方法具有较高的受精率和孵化率。

肾细胞直接制片法对合方鲫F₄的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现合方鲫F₄均为二倍体(2n＝100)，染色体图如图2D所示。

以普通红鲫为参照，用流式细胞仪测定合方鲫F₄红细胞中的DNA含量。结果如图6所示。由图中数据可知，合方鲫F₄的DNA平均含量为104，与红鲫的DNA平均含量比值为1.04，该比值与预计的理论比值(1︰1)间无显著差异。流式细胞仪检测的DNA含量结果与肾组织染色体倍性检测所获得的结果是一致的，均说明合方鲫F₄为二倍体鱼。

用组织学切片观察合方鲫F₄的性腺发育情况，结果表明，合方鲫F₄的性腺发育正常。如图7D、8D所示，合方鲫F₄的卵巢中可观察到接近成熟的Ⅳ时相卵母细胞，精巢的精细小管内充满成熟的精子。一龄的合方鲫F₄能够产生成熟的配子，它们与亲本一样都为一年性成熟。

抽取二倍体杂交鲫品系(F₁-F₄)及其亲本日本白鲫和红鲫血液，血液凝剂(ACD)防止血液凝固，利用UNIQ-10柱式基因组DNA抽提试剂盒(sangon)提取其基因组DNA，采用聚合酶链式反应(PCR)扩增其5SrDNA序列，杂交鲫品系(F₁-F₄)的5SrDNA编码区和非转录间隔区(NTS)序列分析结果与其亲本进行比较，如图9-12所示。由图9可见，杂交鲫品系(F₁-F₄)的5S编码区序列具有高度的遗传稳定性，尤其是杂交子代中的特异性碱基也可以稳定遗传(图中黑框所示)，由图10-12可见，杂交子代杂交鲫品系(F₁-F₄)的NTS-83、NTS-220、NTS-351的具有较高的保守性，杂交子代中的特异性碱基可以稳定遗传(图中黑框所示)。从分子层面说明了合方鲫是一种具有遗传稳定性的杂交品系。这为本发明方法获得的杂交鲫品系(F₁-F₄)的遗传稳定性提供了直接的证据。

实施例2：

一种本发明的合方鲫2号的培育方法，包括如下步骤：

(1)亲鱼的选择和培育：在当年的1-2月，拉网打鱼，从上述实施例1中挑选体重600g以上、性成熟特征明显、无病无伤体型好、体色鲜艳和体质健壮的两性可育的二倍体雌性合方鲫F₁和雄性日本白鲫分别作为母本亲鱼和父本亲鱼进行专池培育，专池培育期间，80-100m²水泥池中安装1-2台的增氧泵，在水泥池内壁一侧安装2-4台潜水泵作为流水刺激的动力，定时开启增氧泵，定时定量投喂饲料，池中雌性合方鲫F₁的数量为400-500尾，日本白鲫的数量为200-300尾，注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，做好饲养管理工作。特别是在繁殖期前一个月以精饵饲养，每隔3～4天流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)人工催产：在当年的3月下旬至5月下旬，当水温稳定在18-23℃时，从所述步骤(1)中培育后得到的亲鱼中挑选腹部膨大、松软且有弹性的雌性合方鲫F₁作为母本，以及轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性日本白鲫为父本，然后为亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，为母本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物的用量为10-12ug/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为600-700IU/kg；先对母本亲鱼进行注射催产，4～6h后再对父本亲鱼进行注射催产，父本亲鱼的注射剂量减半，即所述黄体素释放激素类似物的用量为5-6ug/kg，绒毛膜促性腺激素的用量为300-350IU/kg；注射完毕后按1:2～4的数量比将母、父本亲鱼放入同一水面面积为60-80m²的产卵池中，然后视水情及时向池中冲水，尤其在产卵前2-3h，注入一定水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；为了提高亲鱼的存活率，注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法；

(3)授精孵化：当亲鱼在产卵池中相互追逐且产卵池中出现适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼，在水中进行检测。挑选产卵顺利的母本亲鱼，用湿毛巾将亲鱼包裹固定，然后与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，具体步骤为，用毛巾将打捞的亲鱼腹部擦干，轻压母本亲鱼腹部，将合方鲫F₁卵子挤到干净无水的盆中，用同样的方法将产精量大的父本亲鱼精液挤到所述卵子上面，同时用羽毛端部轻轻地快速搅动，精液挤完后继续用羽毛轻轻搅动1-2min；将得到的受精卵置于水温为20℃-23℃的净水孵化装置中进行流水孵化，得到合方鲫F₁与日本白鲫的杂交后代鱼苗；

(4)饲养：鱼苗全部孵出后，于培养箱中继续培育2～3天，直至所述杂交后代鱼苗脱膜全部孵出且出现腰点后将其转入预先用豆浆培肥的水泥池中饲养。预先用豆浆培肥的方法具体包括以下步骤：在面积为12m²、水深30cm的水泥池中，每天泼洒磨匀的豆浆200-300ml，持续两周，使豆浆在水泥池中充分发酵，待草履虫等微生物大量生长，可供幼苗食用即可。转入水泥池中饲养1～2天后泼洒豆浆，1～2次/天，力求细、匀。待鱼苗体长长至3-5cm后可开始喂饲料粉，对饲养长大后得到的杂交后代通过流式细胞DNA含量测定、肾组织染色体倍性检测方法等手段对实验鱼的生物学特性进行检测，得到所述合方鲫F₁与日本白鲫的二倍体杂交鱼合方鲫2(见图13)。

孵化期间，统计胚胎的受精率和孵化率。合方鲫2号的受精率和孵化率分别为90.5％和80.3％。相比于同类杂交鱼，其具有较高的受精率和孵化率。

再用肾细胞直接制片法对合方鲫2号的体细胞染色体数目进行抽样检测，发现合方鲫2号均为二倍体(2n＝100)，染色体图如图14所示。

以普通红鲫为参照，用流式细胞仪测定合方鲫2号红细胞中的DNA含量。结果如图15所示。由图中数据可知，合方鲫2号的DNA平均含量为105，与红鲫的DNA平均含量比值为1.05，该比值与预计的理论比值(1︰1)间无显著差异。流式细胞仪检测的DNA含量结果与肾组织染色体倍性检测所获得的结果是一致的，均说明合方鲫2号为二倍体鱼。

用组织学切片观察合方鲫2号的性腺发育情况，结果表明，合方鲫2号性腺发育正常。如图16、17所示，合方鲫2号的卵巢中可观察到接近成熟的Ⅳ时相卵母细胞，精巢的精细小管内充满成熟的精子。一龄的合方鲫2号能够产生成熟的配子，它们与亲本一样都为一年性成熟。

苗饲养5-6个月后，随机抽样、测量分析其外形相关数据，并分别与日本白鲫、红鲫和合方鲫F₁成鱼的各项数据进行比较，结果如表1所示：

表1：日本白鲫、红鲫和合方鲫F₁及杂交后代的可比性状比较(单位：㎝)

注：^a代表与合方鲫2号有显著性差异(P<0.05)

上述生物学性状相关数据分析表明，合方鲫2号在形态特征方面，即遗传了亲本的特征，也出现了自身变异。尤其是在体长/体高，体长/头长和头高/尾高方面，与亲本存在显著性差异(P<0.05)，体现出了合方鲫2号体背高、头部小的特征。

本实施例中，肾细胞直接制片法检测染色体倍性的具体检测方法为：在18℃～22℃水温下培育实验鱼1～3天后，对实验鱼注射植物血凝素(PHA)，PHA的配方：一般PHA粉末规格为8㎎，加入2ml超纯水完全溶解后，浓度为4㎎/ml，置于冰箱备用。在当天晚上20:30给鱼注射第一针PHA，剂量为10μg/g；在次日上午8:30给鱼注射第二针PHA，剂量为15μg/g；中午11:30给鱼注射第三针PHA，剂量为6μg/g，同时注射第四针秋水仙素，剂量为4μg/g；一个小时后通过剪断鱼头部的红鳃给鱼放血，15分钟后，取鱼肾脏鱼于0.8％的生理盐水中洗涤，放入培养皿中剪碎呈液体状(剪碎时间不要超过30min)，然后移于离心管中加入生理盐水至4ml，用力吹打200次以上，最后加至12ml，吹打，静止5min,取上清到一个新的离心管中，1500rpm，离心5min弃上清；将离心后的肾脏组织置于0.5％KCl低渗液中，先加入4ml吹打，再加至11ml，轻吹打，每隔十分钟，轻吸出沉淀，轻吹打数次，低渗60min；低滲完成后1500rpm，离心5min弃上清，加入固定液(现用现配，甲醇：冰醋酸＝3：1)固定。先加2ml轻吹打，再加至4ml轻吹打，固定15分钟，1500rpm，离心5min弃上清，重复两次，一共固定3次，每次静置15min；固定完成后弃上清，固定液加至2ml，从冰箱取出冰冻好的玻片，将混匀好的固定液取上层白色液体，从高处滴落在玻片上，有利于细胞散开，靠近外焰烤一下，用吉姆萨染液染色45min，反面洗片，观察。

本实施列中，流式细胞DNA含量测定法步骤为：用经肝素润湿的一次性注射器从鱼尾静脉血管采血约0.2mL，注入装有0.8％生理盐水的Eppendorf管中，在血液和生理盐水混合液中加入1mL细胞核提取液DAPI-A(nuclei extraction solution，德国Partec Gmbh提供)，处理时间10～15min；样品经过20μm尼龙滤器(德国Partec GmbH提供)过滤；DNA染色液(DAPI-B，德国Partec GmbH提供)静置于暗处染色样品约5～10min，然后上机检测。

利用石蜡切片技术对其性腺发育情况进行检测。具体步骤为：1)取实验鱼称重解剖，取性腺用Bouin氏液固定1～2天；2)洗涤：Bouin氏液固定的材料直接换70％酒精更换数次即可；3)脱水：70％、80％、95％、100％酒精梯度脱水，其中，95％、100％酒精重复两次，可以保证组织中水分脱除干净，各级酒精脱水的时间约45min～1h，然后加入1/2100％酒精+1/2二甲苯30min～45min，再入二甲苯直到组织透明为止约为15min～30min；4)透蜡：透蜡以前做好准备工作，如准备蜡杯，事先熔蜡，放入温箱，保持温度55℃～60℃左右，注意勿使温度过高防止组织发脆。将已经透明的组织放入二甲苯石蜡混合液内约20min～30min，然后入纯蜡杯，每杯透蜡45min～1h，共2～3小时透蜡完毕；5)折纸盒：按组织块大小折成纸盒，盒上注明材料名称、代号等；6)包埋：准备好小镊子、酒精灯、冷水等；将透蜡后的组织块放入加热后的熔融状态的石蜡中(用小纸盒盛之)，待其冷却凝固；7)修切和固着蜡块；8)切片和烘片：37℃烘片1～3天；9)染色：二甲苯20min，两次，1/2100％酒精+1/2二甲苯5min，100％、95％、80％、70％酒精各5min，蒸馏水5min，吸水纸吸干。苏木精染20min～40min，水冲洗干净。分色(1％HCl 3～10秒；蒸馏水3～10秒，1％氨水3～10秒)，70％、80％、90％、95％(加0.5％的伊红)、95％、100％、100％酒精脱水各2min，1/2100％酒精+1/2二甲苯5min，二甲苯5min，两次；10)树胶封片，镜检，拍照。

本实施例的培育方法培育得到的合方鲫2号两性可育，具有头部小、体背高、生长速度快、肉质甜而鲜嫩、抗逆抗病能力强等优良性状，在生产上具有重要的应用前景。在分子生物学方面，合方鲫2号表现出较高的遗传性和杂交性，在生物进化研究和鱼类遗传育种方面具有重要的生物学意义。

Claims

1.一种日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法，包括如下步骤：分别以经人工诱导雌核发育得到的雌性日本白鲫和雄性红鲫为母本和父本，经杂交获得的后代进行饲养，通过倍性、育性检测筛选获得两性可育的二倍体合方鲫F₁；培育所述二倍体合方鲫F₁，当其达到性成熟年龄时，进行自交繁殖，再经孵化、养殖获得两性可育的合方鲫F₂；所述合方鲫F₂至少经过两次连续自交得到两性可育的二倍体合方鲫F_n，形成遗传性状稳定、两性可育的二倍体杂交鲫品系，即完成所述日本白鲫和红鲫间杂交品系的建立。

2.根据权利要求1所述日本白鲫和红鲫杂交品系的建立方法，其特征在于，所述人工诱导雌核发育的具体操作包括如下步骤：用经紫外线灭活的团头鲂精子与日本白鲫或红鲫的成熟卵子混合，经3～4min后将被激活的卵子置于3～4℃温度条件下冷休克处理35～45min，得到的胚胎在22～23℃水温下孵化后挑选出二倍体雌核发育的雌性日本白鲫或雄性红鲫。

3.一种合方鲫2号的培育方法，包括如下步骤：利用权利要求1或2所述建立方法中获得的二倍体合方鲫F₁作为母本，与雄性日本白鲫进行回交育种，获得合方鲫2号。

4.根据权利要求3所述的培育方法，其特征在于，所述回交育种的具体操作步骤如下：

(1)从所述日本白鲫和红鲫杂交品系中挑选体重600g以上、性成熟特征明显、无病无伤、体征良好的二倍体雌性合方鲫F₁作为母本亲鱼，同时挑选具备上述特征的雄性日本白鲫作为父本亲鱼，进行专池培育，专池培育期间注意保持水体水质良好、水中含氧量充足，做好饲养管理工作，在繁殖期前一个月以精饵饲养，每隔3～4天以流水刺激一次，以促进亲鱼性腺发育成熟；

(2)当水温稳定在18-23℃时，从所述步骤(1)培育后得到的亲鱼中挑选腹部膨大、松软且有弹性的雌性合方鲫F₁作为母本，以及轻挤压腹部便能挤出乳白色精液的雄性日本白鲫为父本，先对得到的母本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，4-6h后再对得到的父本亲鱼注射黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂进行催产，注射完毕后按1:2-4的数量比将母本亲鱼和父本亲鱼放入同一产卵池中，视水情及时向池中冲水，在产卵前2-3h，注入合适水量后，停止注水，让鱼在静水中催产，直至其开始顺利产卵和产精；

(3)在步骤(2)后得到的母本亲鱼和父本亲鱼中，挑选产卵顺利的母本亲鱼，与产精量大的父本亲鱼进行人工干法授精，得到的受精卵置于水温为20℃-23℃的净水孵化装置中进行流水孵化，得到合方鲫F₁与日本白鲫的杂交后代鱼苗；

5.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(1)中，体征良好表现为体型好、体色鲜艳和体质健壮；专池培育具体表现为：80-100m²水泥池中安装1-2台的增氧泵，在水泥池内壁一侧安装2-4台潜水泵作为流水刺激的动力，定时开启增氧泵，定时定量投喂饲料，80-100m²的水泥池中雌性合方鲫F₁的数量为400-500尾，80-100m²的水泥池中日本白鲫的数量为200-300尾。

6.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(2)中，产卵池的水面面积为60-80m²；为母本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂中，黄体素释放激素类似物的量10-12ug/kg，绒毛膜促性腺激素的量为600-700IU/kg；为父本亲鱼注射的所述黄体素释放激素类似物与绒毛膜促性腺激素的混合催产剂中，黄体素释放激素类似物的量为5-6ug/kg，绒毛膜促性腺激素的量为300-350IU/kg；注射时采用胸鳍基部无鳞处腹腔一针注射法。

7.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(3)中，人工干法授精的具体操作包括如下步骤：用湿毛巾将亲鱼包裹固定，用毛巾将打捞的亲鱼腹部擦干，然后轻压母本亲鱼腹部，将合方鲫F₁的卵子挤到干净无水的盆中，用同样的方法将产精量大的父本亲鱼精液挤到所述卵子上面，同时用羽毛端部轻轻地快速搅动，精液挤完后继续用羽毛轻轻搅动1-2min，使之完成授精。

8.根据权利要求4所述的培育方法，其特征在于，所述步骤(4)中，预先用豆浆培肥的方法具体包括以下步骤：在面积为10-12m²、水深20-30cm的水泥池中，每天泼洒磨匀的豆浆200-300ml，持续两周，使豆浆在水泥池中充分发酵，待草履虫等微生物大量生长，可供幼苗食用即可；泼洒豆浆的次数为1～2次/天。

9.根据权利要求4-8中任一项所述的培育方法，其特征在于，所述通过生物学方法进行检测筛分是利用肾组织染色体倍性检测法、流式细胞DNA含量测定法以及组织学切片观察法对杂交后代鱼进行染色体数目、DNA含量以及性腺发育的检测，再根据检测结果进行筛分。

10.根据权利要求4-8中任一项所述的培育方法，其特征在于，所述合方鲫与日本白鲫的杂交后代二倍体合方鲫2号，两性可育，继承了亲本的生长速度快、肉质甜而鲜嫩、抗逆抗病能力强优点的基础上，同时存在头部小、体背高的自身特征。