CN117397621A - 一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法及其应用，属于水产养殖技术领域，孵化方法如下：S1漂白；S2过滤虫卵、无菌水洗涤；S3虫卵放入锥形瓶内，加入盐水；S4锥形瓶中放入经漂洗、冲洗后的软管和泵头，脱脂棉包裹瓶口；S5将软管的另一头连接滤膜，并用封口膜密封；S6装置放入生化培养箱内培养，并与培养箱中的气泵相连，培养48h；S7分离滤膜与气泵，装置喷洒酒精后分解装置，用无菌吸管吸出孵化好的丰年虫转移至无菌离心管中保存。本发明建立了一种有效的无菌丰年虫高孵化率生产方法，有效提高了无菌丰年虫的孵化率，降低了以无菌丰年虫作为食物的无菌鱼的饲养成本，使建立无菌鱼成鱼模型成为可能。
Description
技术领域
本发明涉及水产养殖技术领域，特别是涉及一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法及其应用。
背景技术
无菌动物可以用于研究微生物如何定植或者微生物代谢产物如何影响宿主生物进程，包括基因表达，发育、生理、免疫和寿命。无菌动物是一个非常好的平台，能在活体宿主的生理环境内研究微生物与微生物之间的相互作用，可以用确定的微生物种类或者基因型组合让它们定植在无菌宿主体内，然后就可以用培养或DNA序列检测微生物群落在活体内之间的竞争。
丰年虫，又称丰年虾、卤虫、盐水虾等，是一种生活在盐度较高水域中的小型低等甲壳动物。当前世界上有85％以上的水产动物育苗以丰年虫作为饵料来源。因为丰年虫的幼虾体型微小，营养丰富，适合初生小鱼摄食。刚孵化的丰年虫无节幼虫，含有大量蛋白质和不饱和脂肪酸，是鱼类的高级营养活饵料，使鱼类获得充分的营养补给。无菌丰年虫生产技术的研究对无菌鱼类的培育具有及其重要的意义，甚至能使无菌斑马鱼、青鳉等无菌鱼类培养至成鱼成为可能。
次氯酸钠是养殖领域首选的消毒剂。但次氯酸钠有效成分易降解、浓度不稳定，若使用时间控制不当，会影响到消毒效果；若使用浓度处理不当，容易影响卵的正常孵化，降低卵的孵化率。无菌处理容易导致无菌丰年虫孵化率降低，因此，如何提供一种能够提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法成为了本领域亟待解决的问题。
发明内容
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法及装置，提高了无菌丰年虾的孵化率，降低了无菌丰年虾的使用成本，为无菌鱼类提供安全可靠且富有营养的无菌饲料，使无菌鱼类培养至成鱼变为可能。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明第一方面提供一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法，孵化方法如下：
S1用漂白剂漂白丰年虫卵；
S2滤网过滤漂白后的虫卵，并用无菌水洗涤所得虫卵；
S3虫卵放入锥形瓶内，加入盐水；
S4锥形瓶中放入经漂洗、冲洗后的软管和泵头，用脱脂棉包裹瓶口；
S5将软管的另一头连接滤膜，并用封口膜密封；
S6装置放入生化培养箱内培养，并与培养箱中的气泵相连，培养48h；
S7分离滤膜与气泵，装置喷洒酒精后分解装置，用无菌吸管吸出孵化好的丰年虫转移至无菌离心管中保存。
进一步地，S1中所述漂白剂为次氯酸钠水溶液；漂白时间为3～5min；漂白剂为浓度为2～5g/L的次氯酸钠水溶液。
进一步地，S2中，所述滤网需经过灭菌；所述滤网的材质为不锈钢；所述滤网的网孔数为80～100目；所述无菌水为无菌纯水；所述无菌水冲洗虫卵时长为1～2min。
进一步地，S3中，所述盐水与虫卵的添加比例为：每1g虫卵添加50～100ml生理盐水。
进一步地，S4中软管和泵头使用次氯酸钠水溶液漂洗，软管和泵头全部没入次氯酸钠水溶液液面下；用镊子夹出软管和泵头，使软管内的次氯酸钠水溶液流空；使用无菌盐水持续冲洗软管和泵头，将无菌盐水从泵头浇入，使无菌盐水从泵头和软管中流出。
进一步地，S6中装置放入生化培养箱后，培养温度25～29℃，光照维持在1000～3000lx，并向盐水中充氧使其溶解氧维持在2～3mg/L。
进一步地，S7中将丰年虫放入离心管时，不可装满整个离心管，装入离心管后密封；密封好的无菌丰年虫放置在28℃培养箱内保存，保存时长≤48h。
任一方法培育出的无菌丰年虫在无菌鱼类培养中的应用。
一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法所用的装置，包括如下结构：
(1)锥形瓶；(2)脱脂棉花塞；(3)泵头；(4)软管；(5)封口膜；(6)滤膜；(7)气泵。
本发明第二方面提供一种根据第一方面所述的方法生产得到的无菌丰年虫。
本发明第三方面提供根据第一方面所述的方法在生产无菌丰年虫上的应用。
本发明第四方面提供根据第二方面所述的无菌丰年虫在作为鱼类或无菌鱼类饲料、鱼类或无菌鱼类培育中的应用。
本发明第五方面提供一种鱼类或无菌鱼类饲料，为根据第一方面所述的方法生产得到的无菌丰年虫。
上述技术方案的有益效果在于：
本发明通过化学物质处理，获得无菌的丰年虫卵，最后放置在无菌的环境中进行培养，最终获得无菌丰年虫。通过改进培养技术，提高了无菌丰年虾的成活率，降低了无菌丰年虾在养殖中的使用成本。制得的无菌丰年虫为无菌鱼类提供了安全可靠富有营养的无菌饲料，使无菌鱼类培养至成鱼变为了可能，为研究微生物与鱼类之间的相互作用及许多生物学进程提供了方便的材料，对于人们进一步研究微生物和其脊椎动物宿主之间关系的内在机制也具有十分重要的参考意义。
附图说明
图1显示为本发明实施例中无菌丰年虫孵化装置的结果示意图。
具体实施方式
以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1一种无菌丰年虫的孵化方法
包括如下试剂和装置：NaClO溶液、虫卵、泵头、软管、0.22μm滤膜和高压灭菌并风干后的锥形瓶、150mm×90mm结晶皿、2.25％盐水和医用脱脂棉灭备用。见图1。
孵化方法如下：
S1用浓度为3.6g/L的NaClO溶液漂洗4g虫卵3min，期间隔段时间轻轻摇晃保证每一颗虫卵都能充分与漂白剂接触。注意溶液中尽量不要有气泡。
S2用灭菌滤网过滤漂洗过后的虫卵，并用灭菌盐水持续冲洗1分钟彻底去除卵壳表面的NaClO。
S3将冲洗干净的虫卵加入锥形瓶中，向锥形瓶中加入200mL无菌盐水。
S4将泵头及软管连接放置于结晶皿中，向结晶皿中加入300mL(一般没过泵头为宜)浓度为6g/L的NaClO溶液，使泵头和软管全部没入液面以下，用镊子辅助赶出软管中的空气；
用镊子夹住泵头和软管连接处并慢慢夹出液面，使软管内的NaClO溶液彻底流出，并用无菌盐水持续冲洗泵头和软管。注意冲洗时要从泵头浇入，使无菌盐水可以从泵头和软管中流出，确保其中的NaClO全部去除。
S5将冲洗干净的泵头放入锥形瓶中，使泵头接触瓶底。用灭菌的医用脱脂棉包裹住软管封住瓶口；将0.22μm滤膜的一端和留在瓶外的软管的一端相连，并用封口膜密封接口处。
S6将处理好的装置移出生物安全柜，放置于生化培养箱并与培养箱中的气泵通过软管与滤膜另一端相连。使培养箱温度保持在28℃，光照维持在2000lx，培养48小时后。
S7培育48h后，将滤膜与气泵分离，装置喷洒酒精后于生物安全柜中取出泵头、软管及棉花，用无菌吸管从瓶底吸出孵化好的丰年虫转移至无菌离心管密封保存。注意吸取时避开漂浮的卵壳，保存时不要装满整个离心管。将密封好的无菌丰年虫放置在28℃培养箱保存。在此状态下丰年虫可继续存活2天左右。
实施例2效果验证试验
取100μL培养液进行TSA平板培养，200μL培养液进行TSB液体培养，200μL培养液进行BHI液体培养，100μL培养液进行绵羊血平板培养，100μL培养液进行TSA双层板培养，200μL培养液进行厌氧TSB液体培养，10μL培养液进行16sV3PCR来检测所得丰年虫的无菌性。
TSA平板培养法检测丰年虫无菌性的操作方法：将待测的培养液涂布于TSA平板上，倒置后于30℃在有氧条件下培养一周，每日观察平板上是否有菌落生长。结果判断方法：如果平板上有菌落生长，则用上述培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果平板上无菌落生长，则确定所用培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。其中，TSA平板为6g胰蛋白胨、2g大豆蛋白胨、2gNaCl、6g琼脂、400mLRO水，摇晃混匀后高温高压灭菌，倒板，冷却后即可以用。
TSB液体培养法检测丰年虫无菌性的操作方法：将待检测培养液注入TSB培养液中，于180rpm，37℃的摇床中有氧条件下培养一周，每日观察培养液是否浑浊。结果判断方法：如果TSB培养液浑浊，则用上述培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果TSB培养液澄清，则确定所用培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。其中，TSB液体为6g胰蛋白胨、2g大豆蛋白胨、2gNaCl、400mLRO水，摇晃混匀后高温高压灭菌，冷却后即可以用。
BHI液体培养法检测丰年虫无菌性的操作方法：将待检测培养液注入到的BHI培养液中，于180rpm，37℃的摇床中有氧条件下培养一周，每日观察培养液是否浑浊。结果判断方法：如果BHI培养液浑浊，则用上述培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果BHI培养液澄清，则确定所用培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。其中，BHI液体为80g牛脑、100g牛心浸出汁、4g蛋白胨、0.8g葡萄糖、2gNaCl、8g琼脂，400mLRO水，摇晃混匀后高温高压灭菌，冷却后即可以用。
绵羊血平板培养法检测丰年虫无菌性的操作方法：将待检测培养液均匀涂布于绵羊血平板培养法上，于如30℃培养箱中倒置，在有氧条件下培养一周，每日观察平板上是否有菌落生长。结果判断方法：如果平板上有菌落生长，则用上述培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果平板上无菌落生长，则确定所用培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。其中，绵羊血平板为6g琼脂、400mLRO水，摇晃混匀后高温高压灭菌，冷却至50℃加入200mL绵羊血摇匀后倒板，冷却后即可以用。
TSA双层板培养法检测丰年虫无菌性的操作方法：将待测培养液均匀涂布于TSA平板上，然后将提前制备的冷却至50℃左右未凝固的TSA培养基倒在涂布后的TSA平板上，凝固后于30℃培养箱中倒置，培养一周，每日观察平板上是否有菌落生长。如果平板上有菌落生长，则用上述培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果平板上无菌落生长，则确定所用培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。其中，TSA平板为6g胰蛋白胨、2g大豆蛋白胨、2gNaCl、6g琼脂、400mLRO水，摇晃混匀后高温高压灭菌，倒板，冷却后即可以用。
厌氧TSB液体培养法检测丰年虫无菌性的操作方法：将待测培养液注入到无氧TSB培养液中，37℃的摇床中无氧条件下培养一周，每日观察是否浑浊。结果判断方法：如果TSB培养液浑浊，则用上述培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果TSB培养液澄清，则确定所用培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。其中，TSB液体为6g胰蛋白胨、2g大豆蛋白胨、2gNaCl、400mLRO水，摇晃混匀高温处理使各成分彻底融化，然后每支厌氧培养管加入3mLTSB液体并充入氮气，再高温高压灭菌，冷却后即可以用。
16sV3PCR法：检测丰年虫无菌性的原理：根据细菌在16S核糖体DNAV3区的一段保守序列设计引物进行PCR扩增，扩增片段为198bp。检测方法：以待测的培养液为模板，用16s核糖体RNA目标基因来检测容器中任何细菌的存在。反应体系为：10xPCRbuffer2.5μl，dNTPmix(2.5mmol/L)2μl，引物338F(20μmol/L)0.5μl，引物519R(20μmol/L)0.5μl，rTaq(2.5U/μL)0.5μl，10μl模板，4μ1水总体积20μl。PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，53℃30s，72℃30s，30个循环；72℃延伸10min。结果判断方法：如果PCR扩增产物有大小为198bp的目的条带，则用所测培养液孵化的丰年虫并非无菌；如果PCR扩增产物没有大小为198bp的目的条带，则确定用所测培养液孵化的丰年虫为无菌丰年虫。
338F：
5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGCGGGCGGGGCACGGGGGGCCTACG GGAGGCAGCAG-3’；
519R：
5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’。
参照上述生产方法，共进行了10次实验，结果取10次试验平均值。每次实验均采用上述7种无菌检测方法进行检测，结果如表1显示全部无菌。每次实验均采用动态镜检法进行孵化率的统计，结果如表2所示，在本方法48小时培养后的无菌丰年虫孵化率达74.998％。
表1.10次重复无菌检测结果(“√”表示无菌，“×”表示有菌)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
| TSA平板培养法 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| TSB液体培养发 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| BHI液体培养法 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 绵羊血平板培养法 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| TSA双层板培养法 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 厌氧TSB液体培养法 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
| 16sV3PCR法 | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ | √ |
由表1可见，通过本发明的方法可以简单快速地获得无菌丰年虫，无论经何种检测途径，均可见孵化出的丰年虾均为100％无菌，从而为无菌鱼类提供了安全可靠富有营养的无菌饲料，使无菌鱼类培养至成鱼变为了可能，为研究微生物与鱼类之间的相互作用及许多生物学进程提供方便的材料，这对人们进一步研究微生物和其脊椎动物宿主之间关系的内在机制也具有十分重要的参考意义。
表2.10次重复孵化率(％)
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 平均 | |
| 孵化率 | 69.31 | 75.69 | 77.41 | 63.26 | 69.38 | 78.81 | 82.91 | 73.46 | 76.57 | 83.18 | 74.998 |
由表2可见，本发明的孵化方法孵化丰年虾的孵化率维持在63.26％以上，平均孵化率可达74.998％，最高孵化率可达83.18％，本发明公开的孵化方法能够提高无菌丰年虾的孵化率，降低无菌丰年虾的孵化成本和使用成本，从而进一步促进了无菌鱼培养至成鱼成为可能。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
Claims (9)
1.一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法，其特征在于，孵化方法具体如下：
S1用漂白剂漂白丰年虫卵；
S2滤网过滤漂白后的虫卵，并用无菌水洗涤所得虫卵；
S3虫卵放入锥形瓶内，加入盐水；
S4锥形瓶中放入经漂洗、冲洗后的软管和泵头，用脱脂棉包裹瓶口；
S5将软管的另一头连接滤膜，并用封口膜密封；
S6装置放入生化培养箱内培养，并与培养箱中的气泵相连，培养48h；
S7分离滤膜与气泵，装置喷洒酒精后分解装置，用无菌吸管吸出孵化好的丰年虫转移至无菌离心管中保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S1中所述漂白剂为次氯酸钠水溶液；漂白时间为3～5min；漂白剂为浓度为2～5g/L的次氯酸钠水溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S2中，所述滤网需经过灭菌；所述滤网的材质为不锈钢；所述滤网的网孔数为80～100目；所述无菌水为无菌纯水；所述无菌水冲洗虫卵时长为1～2min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S3中，所述盐水与虫卵的添加比例为：每1g虫卵添加50～100ml生理盐水；所述盐水优选为活性海盐；盐水浓度为1～6％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S4中软管和泵头使用次氯酸钠水溶液漂洗，软管和泵头全部没入次氯酸钠水溶液液面下；用镊子夹出软管和泵头，使软管内的次氯酸钠水溶液流空；使用无菌盐水持续冲洗软管和泵头，将无菌盐水从泵头浇入，使无菌盐水从泵头和软管中流出。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S6中装置放入生化培养箱后，培养温度25～29℃，光照维持在1000～3000lx，并向盐水中充氧使其溶解氧维持在2～3mg/L；虫卵培养时间为36～48h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
S7中将丰年虫放入离心管时，不可装满整个离心管，装入离心管后密封；密封好的无菌丰年虫放置在28℃培养箱内保存，保存时长≤48h。
8.权利要求1-7任一方法培育出的无菌丰年虫在无菌鱼类培养中的应用。
9.一种提高无菌丰年虫孵化率的孵化方法所用的装置，其特征在于，包括如下结构：
(1)锥形瓶；(2)脱脂棉花塞；(3)泵头；(4)软管；(5)封口膜；(6)滤膜；(7)气泵。
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