CN114807293A - 一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂 - Google Patents
一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及杀菌技术领域，且公开了一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，包括实验器材和试剂，所述实验器材包括有超净工作台、培养箱、摇床、冰箱、PCR仪、pH计、琼脂凝胶电泳仪、离心机、超低温冰箱、SQ810C‑高压蒸汽灭菌器、MJM‑508霉菌培养箱。该用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂通过进行微生物菌种鉴定，典型杀菌剂杀菌能力评价等，季铵盐类杀菌剂杀嗜盐菌效果最优，聚六亚甲基双胍盐酸盐类杀霉菌剂效果最优，因此将两者进行复配：季铵盐(0.5g/L)/聚六亚甲基双胍盐酸盐(2.5g/L)，可以满足本项目对杀菌的指标要求，从而起到对新型杀菌剂进行配备的作用。
Description
技术领域
本发明涉及杀菌技术领域，具体为一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂。
背景技术
在密闭舱室的内部会生长致霉微生物，致霉微生物在密闭舱室未经过处理时，会在密闭舱室的内部大量生长，为了避免对致霉微生物进行清理，常见使用杀菌剂。
在现有的杀菌剂中，只能对单一的致霉微生物进行消除，同时使用季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类杀菌剂对不同的致霉微生物做有针对性地消除时，存在使用时间和持续时间均不同，从而导致季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类单一清理后，出现致霉微生物出现反复的问题。
发明内容
针对现有用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂的不足，本发明提供了一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，具备通过对霉菌进行制备，并经过霉菌在季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类内部消除效果进行观察，并制备出一种新型杀菌剂，并带动杀菌剂起到的效果增加的优点，解决了上述背景技术中提出的问题。
本发明提供如下技术方案：一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，包括实验器材和试剂，所述实验器材包括有超净工作台、培养箱、摇床、冰箱、PCR仪、pH计、琼脂凝胶电泳仪、离心机、超低温冰箱、SQ810C-高压蒸汽灭菌器、MJM-508霉菌培养箱，酶标仪、DNA提取试剂盒、2216C-培养基和PDA-培养基，所述试剂包括有Ta酶、dNTP、37.4g2216C培养基粉末、蒸馏水、15g琼脂粉、马铃薯200g薄片、20g葡萄糖、20g琼脂。
优选的，所述2216C-培养基：取出37.4g2216C培养基粉末添加蒸馏水定容至1L，固态培养基加15g琼脂粉，混合均匀后，121℃灭菌20min。
优选的，所述PDA-培养基：马铃薯200g薄片加400ml水煮沸30min，取汁加入20g琼脂，加热融化，定容至1L，pH值保持限定，自然分装，并带动分装后的PDA培养基121℃消毒杀菌20min。
优选的，样品采集与处理：样品采集与三组密闭舱室，三组密闭舱室为两两一组，样品采集中所有器材浸泡在75％的酒精中，盛放样品的容器均放置在121℃高压蒸汽灭菌容器内，容器放置20min。
优选的，微生物的鉴定包括有取新细菌菌液1-2mL至2mL离心管中，10000rpm高心1min，弃上清；向离心管中加入200uL缓冲液GA，轻微震荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，向离心管中加入4uLRNasecA(100mngmL)溶液，震荡15s，室温放置5min，向离心管中加入20uProteinase K溶液，翻转离心管使其混匀，向离心管中加入220uL缓冲液GB充分震荡15s，70℃水浴10min左右，向离心管中加220uL无水乙醇，震荡混勾15s，将离心管中液体特移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃离心液，向吸附柱中加入600uL加过无水乙醇的缓冲液GD。12000rpm高心1min，弃离心液，向吸附柱中加入600uL加过无水乙醇的漂洗液PW，2000rpm离心1min，弃离心液。将吸附柱放置离心机中，13000rpm离心2min，弃掉残留的离心液，吸附柱室温放畳10-20min，以充分去除残留的乙醇，将超纯水加热至60℃，向吸附柱中间部位悬空滴加30uL，室温放置2min，13000rpm离心2min，最后析出细菌基因DNA。
优选的，嗜盐单胞菌和黑曲霉菌的制备方法包括有：嗜盐单胞菌菌种的活化及菌液的制备，菌种从超低温冰箱中取出，菌种进行40℃解冻100s，所述菌种加入30ml液体培养基中，菌种放置在37℃，150r/min摇床内24h；黑曲霉菌种的活化；超低温冰箱中取出黑曲霉菌，所述黑曲霉菌放置在4℃冰箱中2h，所述黑曲霉菌取出房子在PDA平板上，所述PDA平板控制在28℃保持3-4d。
优选的，杀菌剂研发及性能评价包括有；杀菌剂选用季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类，嗜盐单胞菌杀菌性能评价；用已灭菌的琼脂打孔器在试验平板上打开，将圆孔外部的培养基小块去除，原理内部注入80uL杀菌剂溶液。
优选的，杀菌剂放置在316L不锈钢材质的喷壶盛装和喷洒，所述喷壶的外部安装有磁铁或挂钩。
优选的，三种典型杀菌剂对嗜盐单胞菌生长影响，分别将杀菌剂的浓度控制在1g/L。
优选的，模拟杀菌剂的使用情况；所述喷雾器每次最大可喷出10uL药液，实验平板直径90mm，每个平板喷涂200uL。
与现有用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂对比，本发明具备以下有益效果：
该用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂通过进行微生物菌种鉴定，典型杀菌剂杀菌能力评价等，季铵盐类杀菌剂杀嗜盐菌效果最优，聚六亚甲基双胍盐酸盐类杀霉菌剂效果最优，因此将两者进行复配：季铵盐(0.5g/L)/聚六亚甲基双胍盐酸盐(2.5g/L)，可以满足本项目对杀菌的指标要求，从而起到对新型杀菌剂进行配备的作用。
附图说明
图1为本发明实验用器材示意图；
图2为本发明16SrDNA反应体系示意图；
图3为本发明结构物料反应方程式示意图；
图4为本发明结构三种杀菌剂浓度为1g/L时的抑菌圈数据示意图；
图5为本发明聚六亚甲基双胍盐酸盐培养4天后的黑曲菌落图示意图；
图6为本发明结构聚六亚甲基双胍盐酸盐培养2天后嗜盐单细胞的菌落图示意图；
图7为本发明200uL0.5g/L药液喷涂排版实验示意图；
图8为本发明黑曲霉在含有不同浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐培养基中培养四天的生长情况示意图；
图9为本发明浓度为1g/L时抑菌实验数据示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1至图9，一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，包括实验器材和试剂，实验器材包括有超净工作台、培养箱、摇床、冰箱、PCR仪、pH计、琼脂凝胶电泳仪、离心机、超低温冰箱、SQ810C-高压蒸汽灭菌器、MJM-508霉菌培养箱，酶标仪、DNA提取试剂盒、2216C-培养基和PDA-培养基，试剂包括有Ta酶、dNTP、37.4g2216C培养基粉末、蒸馏水、15g琼脂粉、马铃薯200g薄片、20g葡萄糖、20g琼脂。
2216C-培养基：取出37.4g2216C培养基粉末添加蒸馏水定容至1L，固态培养基加15g琼脂粉，混合均匀后，121℃灭菌20min，通过将培养基粉末和琼脂粉之间进行混合后，并经过121℃灭菌20min，即可带动2216C-培养基生产过程中起到效率化，同时经过消毒处理，即可避免环境造成污染的问题。
PDA-培养基：马铃薯200g薄片加400ml水煮沸30min，取汁加入20g琼脂，加热融化，定容至1L，pH值保持限定，自然分装，并带动分装后的PDA培养基121℃消毒杀菌20min，通过PDA-培养基孔经过放置马铃薯并进行加热消毒后，即可在时方便对细菌进行培养。
参考图2，样品采集与处理：样品采集与三组密闭舱室，三组密闭舱室为两两一组，样品采集中所有器材浸泡在75％的酒精中，盛放样品的容器均放置在121℃高压蒸汽灭菌容器内，容器放置20min，通过对样品进行采集，并采集三组密闭舱室内，且通过两两一组，即可增加对样品采集时增加充分性，同时将所有采集样品浸泡在75％的酒精中，并即将样品容器放置在121℃高压蒸汽灭菌装置中进行灭菌处理，即可在对样品采集时增加有效性，同时避免外界有害物质对样品造成影响。
参考图2，微生物的鉴定包括有取新细菌菌液1-2mL至2mL离心管中，10000rpm高心1min弃上清；向离心管中加入200uL缓冲液GA，轻微震荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，向离心管中加入4uLRNasecA溶液，震荡15s，室温放置5min，向离心管中加入20uLProteinase K溶液，翻装离心管使其混匀，向离心管中加入220uL缓冲液GB充分震荡15sec，70℃水浴10min左右，向离心管中加220uL无水乙醇，震荡混勾15sec，将离心管中液体特移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃离心液，向吸附柱中加入600uL加过无水乙醇的缓冲液GD。12000rpm高心1min，弃离心液，向吸附柱中加入600uL加过无水乙醇的漂洗液PW，2000rpm离心1min，弃离心液。将吸附柱放置离心机中，13000rpm离心2min，弃掉残留的离心液，吸附柱室温放畳10-20min，以充分去除残留的乙醇，将超纯水加热至60℃，向吸附柱中间部位悬空滴加30uL，室温放置2min13000rpm离心2min，最后析出细菌基因DNA，通过将细胞经过离心、加热缓冲液、悬浮、加入4uLRNasecA溶液、震荡、静置、混合等操作后，即可带动新细菌细胞进行提取，从而获得细胞基因组DNA，从而起到方便带细菌基因组进行提取的作用。
参考图1，嗜盐单胞菌和黑曲霉菌的制备方法包括有：嗜盐单胞菌菌种的活化及菌液的制备，菌种从超低温冰箱中取出，菌种进行40℃解冻100s，菌种加入30ml液体培养基中，菌种放置在37℃，150r/min摇床内24h；黑曲霉菌种的活化；超低温冰箱中取出黑曲霉菌，黑曲霉菌放置在4℃冰箱中2h，黑曲霉菌取出房子在PDA平板上，PDA平板控制在28℃保持3-4d，通过将嗜盐单胞菌和黑曲霉菌的制备经过解冻并在培养皿的内部进行制备处理，即可带动嗜盐单胞菌和黑曲霉菌之间增加扩散，方便后期进行生产。
参考图3，杀菌剂研发及性能评价包括有；杀菌剂选用季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类；嗜盐单胞菌杀菌性能评价：用已灭菌的琼脂打孔器在试验平板上打开，将圆孔外部的培养基小块去除，培养基内部注入80uL杀菌剂溶液，杀菌剂分别选用季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类，抗菌机理：季铵盐带正电荷，细菌的细胞膜带负电荷，二者通过静电吸引结合，破环了细胞的正常活动：此外，季铵盐能影响微生物的DNA转录，使其不能正常繁殖。有N-Br或N-Cl键的化合物被称为卤胺化合物，由于N-Br不稳定，实际生产中的卤胺化合物多为氯胺化合物。抗菌机理：卤胺化合物与微生物接触时发生氧化还原反应生成N-H键，氧化卤素被转移到生物体上，使微生物失去活力，虽然N-H键不能杀菌，但是可以通过氯漂转换为N-Cl键，重复杀菌，达到持久抗菌的目的。聚六亚甲基双胍盐酸盐类的抗菌机理主要为静电作用，聚六亚甲基双胍盐酸盐类带正电荷，细菌细胞膜带负电荷，二者产生静电吸附，破坏细胞的正常活动，其抗菌活性随着分子聚合度增加而提高。
参考图1，杀菌剂放置在316L不锈钢材质的喷壶盛装和喷洒，喷壶的外部安装有磁铁或挂钩，通过将杀菌剂灌输至喷壶的内部，通过使用喷壶，即可带动杀菌剂进行喷洒，同时将喷壶的外部安装有磁铁或挂钩，通过磁铁与密封仓内产生吸附力和挂钩夹持在密封仓的内部，即可方便带动喷壶固定在密闭舱室的内部。
图4、图5和图9，三种典型杀菌剂对嗜盐单胞菌生长影响，分别将杀菌剂的浓度控制在1g/L，通过将三种典型杀菌剂对嗜盐单胞菌的浓度等进行调节，即可带动嗜盐单胞菌生长过程进行检测，其中季铵盐类需要1g/L，聚六亚甲基双胍盐酸盐类需要1g/L.这表明相同浓度下，聚六亚甲基双胍盐酸盐类抑制黑曲霉的效果最好，没有添加聚六亚甲基双胍盐酸盐的平板，有显著的黑曲霉菌落形成，且菌落形态与黑曲霉的标准菌落形态一致，因此说明实验中用的黑曲霉是单一菌落，实验过程没有外源性微生物的污染。添加1g/L的聚六亚甲基双胍盐酸盐，同样培养4天后，培养基平板没有发现黑曲霉菌的菌落，说明1g/L的聚六亚甲基双胍盐酸盐可以有效的杀灭介质中的黑曲霉菌，至此对实验数据进行对比，对不同的杀菌剂的使用效果均可进行调节和观察的作用。
图7和图8，模拟杀菌剂的使用情况；喷雾器每次最大可喷出10uL药液，实验平板直径90mm，每个平板喷涂200uL，通过将雾化器带动杀菌剂输送至检测平板上，并根据实验结果可见，0.5g/L聚六亚甲基双胍盐酸盐时，因为该溶液的铺展性不好，故杀菌效果不理想，同浓度下的季铵盐杀菌剂铺展效果较好，杀菌效果理想，故推荐季铵盐杀菌剂，使用浓度为0.5g/L。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
Claims (10)
1.一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，包括实验器材和试剂，其特征在于：所述实验器材包括有超净工作台、培养箱、摇床、冰箱、PCR仪、pH计、琼脂凝胶电泳仪、离心机、超低温冰箱、SQ810C-高压蒸汽灭菌器、MJM-508霉菌培养箱，酶标仪、DNA提取试剂盒、2216C-培养基和PDA-培养基，所述试剂包括有Ta酶、dNTP、37.4g2216C培养基粉末、蒸馏水、15g琼脂粉、马铃薯200g薄片、20g葡萄糖、20g琼脂。
2.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：所述2216C-培养基：取出37.4g 2216C培养基粉末添加蒸馏水定容至1L，固态培养基加15g琼脂粉，混合均匀后，121℃灭菌20min。
3.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：所述PDA-培养基：马铃薯200g薄片加400ml水煮沸30min，取汁加入20g琼脂，加热融化，定容至1L，pH值保持限定，自然分装，并带动分装后的PDA培养基121℃消毒杀菌20min。
4.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：样品采集与处理：样品采集与三组密闭舱室，三组密闭舱室为两两一组，样品采集中所有器材浸泡在75％的酒精中，盛放样品的容器均放置在121℃高压蒸汽灭菌容器内，容器放置20min。
5.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：微生物的鉴定包括有取新细菌菌液1-2mL至2mL离心管中，10000rpm高心1min，弃上清；向离心管中加入200uL缓冲液GA，轻微震荡或用移液器吹打使菌体充分悬浮，向离心管中加入4uL RNasecA溶液，震荡15s，室温放置5min，向离心管中加入20uLProteinase K溶液，翻装离心管使其混匀，向离心管中加入220uL缓冲液GB充分震荡15s，70℃水浴10min左右，向离心管中加220uL无水乙醇，震荡混勾15s，将离心管中液体特移至吸附柱中，12000rpm离心1min，弃离心液，向吸附柱中加入600uL加过无水乙醇的缓冲液GD。12000rpm高心1min，弃离心液，向吸附柱中加入600uL加过无水乙醇的漂洗液PW，2000rpm离心1min，弃离心液。将吸附柱放置离心机中，13000rpm离心2min，弃掉残留的离心液，吸附柱室温放置10-20min，以充分去除残留的乙醇，将超纯水加热至60℃，向吸附柱中间部位悬空滴加30uL，室温放置2min，13000rpm离心2min，最后析出细菌基因DNA。
6.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：嗜盐单胞菌和黑曲霉菌的制备方法包括有：嗜盐单胞菌菌种的活化及菌液的制备，菌种从超低温冰箱中取出，菌种进行40℃解冻100s，所述菌种加入30ml液体培养基中，菌种放置在37℃，150r/min摇床内24h；黑曲霉菌种的活化；超低温冰箱中取出黑曲霉菌，所述黑曲霉菌放置在4℃冰箱中2h，所述黑曲霉菌取出放置在PDA平板上，所述PDA平板控制在28℃保持3-4d。
7.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：杀菌剂研发及性能评价包括有：杀菌剂选用季铵盐类、卤铵盐类和聚六亚甲双胍盐酸类；嗜盐单胞菌杀菌性能评价：用已灭菌的琼脂打孔器在试验平板上打开，将圆孔外部的培养基小块去除，原理内部注入80uL杀菌剂溶液。
8.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：杀菌剂放置在316L不锈钢材质的喷壶盛装和喷洒，所述喷壶的外部安装有磁铁或挂钩。
9.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：三种典型杀菌剂对嗜盐单胞菌生长影响，分别将杀菌剂的浓度控制在1g/L。
10.根据权利要求1所述的一种用于特定密闭舱室空间内致霉微生物消杀的新型杀菌剂，其特征在于：模拟杀菌剂的使用情况；所述喷雾器每次最大可喷出10uL药液，实验平板直径90mm，每个平板喷涂200uL。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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