CN103355258B - 一种测定线虫对化学物质趋向性的方法及其装置 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种测定线虫对化学物质趋向性的方法及其装置，属植物线虫科学研究领域。装置由透明无盖圆柱体容器（1）和黑色圆形管（2）组成。方法是在透明无盖圆柱体容器（1）的壁上等距离打孔，黑色圆形管（2）插在透明无盖的圆柱体容器（1）壁上的孔中，在透明无盖圆柱体（1）和黑色圆形管（2）中分别灌满相同的填充介质，将计数的活体线虫放置在透明无盖圆柱体（1）内填充介质表面的中间位置，移入恒温箱内，25℃保温24小时后，取下黑色圆形管（2），从黑色圆形管（2）的填充介质中分离线虫到培养皿中，在体视镜下观察计数线虫的数量。本发明结构简单、方法方便、实验数据准确可靠；实验时间短，工作效率高，劳动强度低；应用范围广。

Description

一种测定线虫对化学物质趋向性的方法及其装置
技术领域：
本发明涉及一种测定线虫对化学物质趋向性的方法及其装置，属植物线虫研究技术领域。
背景技术：
植物寄生线虫是一类重要的植物病原，危害各种植物，从低等的苔藓、蕨类、藻类、菌类到高等的裸子和被子植物都有线虫病害的记录，所有的栽培植物几乎都会受到一种以上线虫的寄生和危害，造成严重的损失，而且对于多数植物线虫病害目前缺乏有效的防治方法。
植物寄生线虫属于低等动物，虫体微小，结构简单，由于与寄生生活相适应，其感觉器官多数已退化，仅靠对化学物质的感知来获取外部环境的信息，并据此进行运动。因此植物寄生线虫对植物的侵染与其他植物病原如真菌、细菌相比具有一定的主动性，即在自然环境中的植物寄生线虫必须感应到寄主植物所发出的化学信号刺激，才能进行有限的趋向性移动(通常不超过30cm)，到达寄主适合的寄生部位进行寄生危害，而对于多数能产生严重危害线虫种类，一旦其侵入植物体内与寄主植物建立了寄生关系，由于受到植物的保护，多数线虫防治措施将难以奏效。当前的植物线虫防治方法主要是依靠在植物的周边环境中施用化学杀线虫剂，在线虫侵入进植物以前将其杀死，这种方法对线虫的防效显著，但弊端是药剂施用量大带来的环境污染和生态破坏，特别是近年来随着一些高效化学杀线虫剂因生态安全的原因被全面禁用，对研发安全高效线虫病害防治方法的呼声越来越高。在众多的化学杀线虫剂使用替代方案中利用线虫化学趋性物质(如引诱物质或驱避物质)对线虫的取食趋向性运动进行干扰被认为是一种较为有前景的方法。这一策略在昆虫的防治中已有了一些成功的应用，但对于线虫病害还没有应用的先例，其主要难点在于线虫趋性物质的测定和筛选，与昆虫不同，线虫的虫体微小而且运动必须依赖水膜，成功应用于昆虫趋性物质研究的仪器和方法不适用于线虫。
本发明的一种用线虫化学趋向性的测定的方法及其装置，经文献检索，未见与本发明技术方案相同的公开报道。
发明内容：
本发明的目的在于克服现有技术之不足，而提供一种测定线虫对化学物质趋向性的方法及其装置。
本发明的测定线虫对化学物质趋向性的方法，其具体步骤如下：
a、将检测样品放入装有填充介质的黑色圆形管中，并插入透明无盖圆柱体容器壁上的孔中，同种检测样品间隔排布；填充介质为凝胶或无菌石英砂或土壤；
b、将同种填充介质装入透明无盖圆柱体容器中，至淹没透明无盖圆柱体容器壁上所开的圆孔为止，如填充介质为凝胶，置于常温环境下待凝胶凝固；
c、将计数的活体线虫置于透明无盖圆柱体容器中填充介质表面的中心位置，移入恒温箱内，25℃保温24-48小时，期间采用喷雾方法保持填充介质湿润，之后将黑色圆形管逐一取下，移出黑色圆形管中的填充介质；
d.按常规方法分离填充介质中的线虫；
e.在体视镜下，观察计数分离到的线虫数量，即得出测定线虫对化学物质的趋向性。
用于测定线虫对化学物质趋向性的装置，由壁上开有孔的透明无盖圆柱体容器和插在透明无盖圆柱体容器壁上的孔中黑色圆形管组成；其中：透明无盖圆柱体容器壁上的开孔数量和黑圆形管的数量视实验的需求确定。
本发明的装置采用市售材料按常规方法制备。
本发明优点在于：(1)结构简单、方法方便、实验数据准确可靠；(2)实验时间短，工作效率高，劳动强度低；(3)应用范围广，适宜植物组织或粗分离及单体化合物的测定。
附图说明：
图1为本发明装置的结构示意图。
具体实施方式：
实施例所用装置由壁上开有孔的透明无盖圆柱体容器1，及插在透明无盖圆柱体容器1壁上孔中的黑色圆形管2组成。采用市售产品或材料按常规方法制备。
实施例1测定小麦、番茄和万寿菊根系物质对爪哇根结线虫二龄幼虫的吸引作用
a.选用直径9cm、高1.5cm的透明无盖圆柱体塑料容器1，透明无盖圆柱体塑料容器1的壁上，每隔4.71cm开1个直径为1cm的圆孔，共开6个孔。准备6根长度为9cm、直径为1cm的黑色圆形管2。
b.分别将2g万寿菊、感病番茄和小麦根尖装入填充有pluronic F-127凝胶的黑色圆形管2中，每种植物装2根管；
c.将装好样品的黑色圆形管2分别插入透明无盖圆柱体容器1壁上的所开的孔中，同种样品间隔排布；
d.在低于15℃的环境下，将pluronic F-127凝胶灌入透明无盖圆柱体容器1中，至淹没透明无盖圆柱体容器1壁上所开的圆孔为止，后置于常温环境下，待凝胶凝固；
e.将1ml含有3000条活体爪哇根结线虫二龄幼虫的线虫悬浮液置于透明无盖圆柱体容器1中凝胶凝固表面的中心位置，移入恒温箱内，25℃保温24h，之后将黑色圆形管2逐一取下，置于4℃的环境下使凝胶融化从管中流入培养皿中；
f.培养皿中加入2倍胶液体积的无菌水稀释胶液，室温静置5～10min；
g.将经稀释的胶液置于体视镜下，观察计数培养皿中的线虫数量，即得出测定线虫对根系物质的趋向性。
实施例2测定细菌次生代谢物质对南方根结线虫二龄幼虫的吸引作用
a.选用直径9cm、高1.5cm的透明无盖的圆柱体容器1，在透明无盖的圆柱体容器1的壁上，每隔4.71cm开1个直径为1cm的圆孔，共开6个孔。准备6根长度为9cm、直径为1cm的黑色圆形管2。
b.在低于15℃的条件下分别将分离自土壤的抗生素溶杆菌和枯草芽孢杆菌的次生代谢产物粗提物溶于pluronic F-127液态胶，配置成0.01g干物重/ml的液态胶溶液，灌注于黑色圆形管2中，常温下5min使胶液凝固，每种物质装3根管；
c.将装好样品的黑色圆形管2分别插入透明无盖的圆柱体容器1壁上的所开的孔中，同种样品间隔排布；
d.在低于15℃的环境下，将pluronic F-127液态胶灌入透明无盖的圆柱体容器1中，至淹没透明无盖的圆柱体容器1壁上所开的圆孔为止，后置于常温环境下，待胶液凝固；
e.将1ml含有3000条活体南方根结线虫二龄幼虫的线虫悬浮液置于透明无盖圆柱体容器1中凝胶凝固表面的中心位置，移入恒温箱内，25℃保温24h，之后将黑色圆形管2逐一取下，置于4℃的环境下使凝胶融化从管中流入培养皿中；
f.培养皿中加入2倍胶液体积的无菌水稀释胶液，室温静置5～10min；
g.将经稀释的胶液置于体视镜下，观察计数培养皿中的线虫数量，即得出测定线虫对细菌代谢物的趋向性。
实施例3测定南方根结线虫的二龄幼虫对番茄、万寿菊根系的趋向性
a.选用直径9cm、高1.5cm的透明无盖的圆柱体容器1，在透明无盖的圆柱体容器1的壁上，每隔4.71cm开1个直径为1cm的圆孔，共开6个孔。准备6根长度为9cm、直径为1cm的黑色圆形管2。
b.分别将经无土栽培根系健壮的的万寿菊、感病番茄幼苗移栽入填充有无菌石英砂或土壤的黑色圆形管2的一端孔口中，另一端孔口用封口膜封住，每种植物装3根管；
c.将黑色圆形管2种有植物的一端朝上竖直放置于光照培养箱中，25℃,16光照，8h黑暗的条件下培养72h，期间每24h每管滴加无菌水1ml，第48h用浓度为1g/L的叶面肥对叶面进行喷雾施肥。
d.种有植物的黑色圆形管2揭去封口膜，分别插入透明无盖的圆柱体容器1壁上的所开的孔中，同种植物间隔排布；
e.将无菌石英砂或土壤填充入透明无盖的圆柱体容器1中，至淹没透明无盖的圆柱体容器1壁上所开的圆孔为止；
f.将5ml含有5000条活体南方根结线虫二龄幼虫的线虫悬浮液滴加于透明无盖圆柱体容器1中无菌石英砂或土壤的表面的中心位置，移入光照箱内，25℃,16h光照，8h黑暗的条件下保持48h，期间每12h用无菌水喷雾使无菌石英砂或土壤的表面保持湿润，之后将黑色圆形管2逐一取下，将黑色圆形管2中的石英砂倒入50ml离心管中；
g.采用常规离心漂浮分离法分离石英砂或土壤中的线虫，所获得的线虫分离液在体视镜下，观察计数培养皿中的线虫数量，即得出测定线虫对植物根系的趋向性。

Claims (2)

1.一种测定线虫对化学物质趋向性的方法，其特征在于该方法的具体步骤如下：
a、将检测样品放入装有填充介质的黑色圆形管(2)中，并插入透明无盖圆柱体容器(1)壁上的孔中，同种检测样品间隔排布；填充介质为凝胶或无菌石英砂或土壤；
b、将同种填充介质装入透明无盖圆柱体容器(1)中，至淹没透明无盖圆柱体容器(1)壁上所开的圆孔为止，如填充介质为凝胶，置于常温环境下待凝胶凝固；
c、将计数的活体线虫置于透明无盖圆柱体容器(1)中填充介质表面的中心位置，移入恒温箱内，25℃保温24-48小时，期间采用喷雾方法保持填充介质湿润，之后将黑色圆形管(2)逐一取下，移出黑色圆形管(2)中的填充介质；
d.按常规方法分离填充介质中的线虫；
e.在体视镜下，观察计数分离到的线虫数量，即得出测定线虫对化学物质的趋向性。
2.权利要求1所述测定线虫对化学物质趋向性方法所用的装置，其特征在于：该装置由壁上开有孔的透明无盖圆柱体容器(1)和插在透明无盖圆柱体容器(1)壁上的孔中黑色圆形管(2)组成；其中：透明无盖圆柱体容器(1)壁上的开孔数量和黑圆形管(2)的数量视实验的需求确定。
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