CN104357351A - 一种枯草芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法及应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物材料制备技术领域，提供一种枯草芽孢杆菌wdcjxq2266，利用该菌株生产的生防菌剂，及该菌株和生防菌剂的应用。枯草芽孢杆菌wdcjxq2266，于2014年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC NO.8993，通过将该菌株在LB培养液28℃ 180rpm振荡培养12～24小时，制成活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL的菌剂成品，将菌剂成品稀释10-100倍后在辣椒种植时浸种处理，或在移栽时进行灌根处理。其抑菌效果非常明显，经过试验证明，生防菌剂在温室条件下对辣椒疫病的防效可以达到69.06％，对辣椒的增产幅度达到38.5％。

Description

一种枯草芽孢杆菌菌株、生防菌剂及其制备方法及应用
技术领域
本发明属于植物保护技术技术领域，涉及一种枯草芽孢杆菌菌wdcjxq2266，利用该菌株生产的生防菌剂，以及该菌株和生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。
背景技术
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici Leonian)引起的一种细菌性病害。辣椒疫霉菌的寄主范围较广，除辣椒外还能寄生番茄、茄子和一些瓜类作物。病菌以卵孢子在土壤中或病残体中越冬，借风、雨、灌水及其他农事活动传播。发病后可产生新的孢子囊，形成游动孢子进行再侵染。病菌生育温度范围为10～37℃，最适宜温度为20～30℃。空气相对湿度达90％以上时发病迅速；重茬、低洼地、排水不良，氮肥使用偏多、密度过大、植株衰弱均有利于该病的发生和蔓延。这种病害由于地理分布范围广，寄主范围广，所以一旦侵染非常容易造成毁灭性打击，到目前为止还没有有效的防治手段。
辣椒是我国重要的经济作物，疫病一直是辣椒上的重要病害，近年来，随着设施蔬菜种植面积的扩大和连作密度的加大，发病趋势更加严重，据调查，严重时减产50％以上，甚至造成毁灭性的危害。
长期以来，国内外对辣椒疫病的防治多从农业防治和化学防治出发,虽然取得了一定的防效，但始终未能很好控制该病害的发生，且造成了一定程度的环境污染。生物防治由于其自身的优点开始受到越来越多的重视，利用微生物制剂防治辣椒疫病取得了一些进展，但效果并不理想。综上所述，开发新的、更为高效和安全的微生物杀菌剂控制辣椒疫病的发生是实现农业安全可持续发展的需要，符合社会发展要求。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中防治辣椒疫病的制剂防治效果不理想，易造成环境污染的问题，提供一种枯草芽孢杆菌菌株、包括该菌株的生防菌剂及该菌剂的制备，以及二者在防治辣椒疫病上的应用。
本发明的目的通过以下技术方案实现
1.本发明提供一种枯草芽孢杆菌菌株，所述枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilis)的名称为wdcjxq2266，于2014年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.8993，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。菌落特征：单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
2.本发明还提供一种生防菌剂，所述的生防菌剂包括上述1提供的枯草芽孢杆菌菌株wdcjxq2266。
3.上述2提供的生防菌剂，其中，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
4.上述3提供的生防菌剂，该生防菌剂主要由上述1提供的枯草芽孢杆菌菌株wdcjxq2266经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的。
5.上述2-4任一项所述的生防菌剂的制备方法，其中，将上述1提供防治辣椒疫病的生防菌株wdcjxq2266在LB培养液28℃180rpm振荡培养12-24h，然后4000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
6.上述1提供的枯草芽孢杆菌菌株在防治辣椒疫病中的应用。
7.上述2提供的生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。
8.上述7提供的应用，该应用方法为，在使用前，将该菌剂成品稀释10-100倍，在辣椒种植时浸种处理或在移栽时进行灌根处理达到防治辣椒疫病的作用。
9.上述2提供的生防菌剂在辣椒促生增产中的应用
本发明的有益效果：
1.生防制剂中含有抑制辣椒疫病病原菌生长的专一性菌株枯草芽孢杆菌菌株wdcjxq2266，其抑菌效果非常明显，经过试验证明，本发明提供的生防制剂在室温条件下对辣椒疫病的防效可以达到69.06％,施入土壤中可以形成优势群，并能保持活性存活下来。
2.本发明的芽孢杆菌菌株wdcjxq2266，生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可以通过简单、快捷低成本的制备方法获得防治辣椒疫病的生防制剂。
3.本发明提供的生防制剂为微生物防治剂，无公害，不产生环境污染，可以不用或减少其他相应化学农药的用量，不仅节省农民开支，而且有利于蔬菜的出口。
4.经过试验证明，本发明提供的生防制剂，具有抗病、增产作用，可为农民增加收入。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域的公知手段。
实施例1
1.wdcjxq2266生防菌剂的制备
本发明涉及一种防治辣椒疫病的生防菌株wdcjxq2266，为2013年在江苏南京市郊病田健株上分离得到。
分离方法：采用5点取样法将生长至成熟期的整株番茄(连根、茎、叶和粘附土)装入灭菌的封口塑料袋中，立即带回实验室。在分离番茄生境相关细菌前用自来水冲洗采集到的番茄根，直到冲洗干净，然后在灭菌水中润洗3遍。采集到的茎和叶采取同样的处理方法。分别称取植物的根、茎、叶放入含有27mL无菌0.85％NaCI溶液的三角瓶中，加入少许直径2mm的玻璃珠，200rpm 30℃振荡30min后，分别移于灭菌培养皿中，先用1.5％次氯酸钠溶液(NaCIO)浸泡5min，灭菌水润洗5次，将组织剪成2-3cm长的小块，用镊子把根、茎和叶分别接入RZA及KBA平板上，置于30℃培养箱中培养，5d后把没有任何污染的组织用剪刀剪碎后研细，浸软组织，灭菌棉布过滤，再用无菌0.85％NaCI溶液以10倍梯度稀释，分别取梯度稀释液0.1mL涂在RZA平板及KBA平板上(根部稀释液涂10-2、10-3、10-4和10-5四个浓度，茎、叶部稀释液涂10-1、10-2、10-3和10-4四个浓度)，30℃培养箱中培养，进行根内、茎内、叶内细菌的分离。根据平板上菌落大小及形态进行分离纯化。细菌种群密度以CFU/g表示。将纯化好的细菌进行编号，用80％灭菌甘油保存，放入-70℃备用。
按照平板拮抗活性、蛋白酶活性、几丁质酶活性、纤维素酶活性、葡聚糖酶活性以及产嗜铁素活性，采用赋值法，选择出综合得分较高菌株，通过温室试验最终筛选出防治效果最好的wdcjxq2266。
菌落特征：单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭。需氧菌。可利用蛋白质、多种糖及淀粉，分解色氨酸形成吲哚。
将分离出的wdcjxq2266单菌落于LB液体培养基，28℃180rpm摇床振荡培养12h，获得种子液。将种子液以1％的接种量接种于发酵培养基，于30℃180rpm摇床振荡培养5d，菌剂成品中活菌总浓度为1×108-1×109CFU/mL。LB培养基为：酵母粉5g/L、胰蛋白胨10g/L、氯化钠10g/L。发酵培养液为：蔗糖2g/L、玉米粉20g/L、黄豆粉10g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、七水硫酸镁0.2g/L、酵母膏0.4g/L、碳酸钙1g/L、氯化铁0.005g/L。
2温室盆钵试验检测wdcjxq2266生防菌剂对辣椒疫霉的防效
移栽之前，用生防菌wdcjxq2266(107CFU/mL)浸种处理辣椒幼苗30min；移栽时采用20mL 107CFU/mL菌剂灌根处理，移栽7天后接种1000个/mL辣椒疫霉病菌Phytophthora capsici Leonian游动孢子悬液20mL。另外不用生防菌wdcjxq2266处理，直接接种辣椒疫霉病菌游动孢子悬液的处理作为对照Control。每个处理组24株，三次重复。在温度25～28℃，相对湿度50％，光照12h/12h条件下，培养3周后调查病级数，计算病害严重度和防效。
灌根接种法的分级标准：
DI 0，无任何症状；
DI 1，幼苗根茎部稍有变黑，叶片不萎蔫或可恢复性萎蔫；
DI 2，幼苗根茎部变黑达1～2cm，叶片不可恢复性萎蔫，下部叶片偶有脱落；
DI 3，幼苗根茎部变黑超过1～2cm，叶片明显萎蔫或落叶明显；
DI 4，幼苗根茎部变黑、皱缩，生长点外部叶脱落或整株萎蔫；
DI 5，植株枯死.
注:本标准经中华人民共和国农业部1999-01-25批准
移栽3周后的调查结果显示，生防菌剂wdcjxq2266对辣椒疫霉的防效达到69.06％。
表1温室中生防菌剂wdcjxq2266对辣椒疫病的生防效果
3.wdcjxq2266生防菌剂对辣椒的促生及增产作用
待番茄幼苗子叶平展后，用注射器在距幼苗根部1.5cm处对基质进行注射接种浓度为1×108CFU/mL的wdcjxq2266生防菌剂悬浮液，接种量每株30ml，对照为等量消毒蒸馏水。接种处理和对照CK重复3次，随机区组排列。
测定方法：处理后14、21、28d，进行辣椒幼苗株高、茎粗、茎叶及根系鲜重、干重、根体积的测定。每处理每重复随机取样20株，取样时，将幼苗根系冲洗干净后用吸水纸擦干，茎叶和根系分别称重后放入烧杯中，105℃杀青30min，80℃烘至恒重，并分别称重。壮苗指数＝茎粗(cm)/株高(cm)×全株干重(g)。结果见表2。定植后，调查初花节位及开花期、单株坐果数、单果质量，统计产量。结果见表3。
表2wdcjxq2266对辣椒幼苗生长的影响
注：字母表示Duncan’s新复极差检验结果，同一时期内，同一列的小写字母表示差异在P<0.05水平，下同。
表3wdcjxq2266对植株产量形成的影响
由表3可以看出，wdcjxq2266处理对于辣椒初花期的影响比较明显，初花期比对照提早了3d，虽未显著影响辣椒的初花节位及单果质量，但对单株坐果数的作用明显，与对照相比达到了差异显著水平，并进而有效提高了单位面积产量，增产幅度达到38.5％。
可以知道，上述实施例仅为了说明发明原理而采用的示例性实施方式，然而本发明不仅限于此，本领域技术人员在不脱离本发明实质情况下，可以做出各种改进和变更，这些改进和变更也属于本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种枯草芽孢杆菌菌株，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌菌株(Bacillussubtilis)的名称为wdcjxq2266，于2014年4月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.8993。
2.一种生防菌剂，其特征在于：所述的生防菌剂包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株wdcjxq2266。
3.权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于：菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
4.权利要求3所述的生防菌剂，其特征在于：该生防菌剂主要由权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株wdcjxq2266经菌体活化、种子培养、扩大培养后得到的。
5.权利要求2-4任一项所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：将权利要求1所述防治辣椒疫病的生防菌株wdcjxq2266在LB培养液28℃180rpm振荡培养12-24h，然后4000rpm离心10min，用灭菌水进行稀释制成菌剂，菌剂成品中活菌总浓度为1×109～1×1010CFU/mL。
6.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株在防治辣椒疫病中的应用。
7.权利要求2所述的生防菌剂在防治辣椒疫病中的应用。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于：在使用前，将该菌剂成品稀释10-100倍，在辣椒种植时浸种处理或在移栽时进行灌根处理达到防治辣椒疫病的作用。
9.权利要求2所述的生防菌剂在辣椒促生增产中的应用。
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