CN106212277A - 一种生产生姜菌根组织培养种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了生产生姜菌根组织培养种苗的方法：(1)取姜块催芽，无菌处理，切取茎尖在诱导培养，继代培养、生根培养，即得生姜组培苗；(2)取步骤(1)中具有2～3条根和3～4片叶的生姜组培苗炼苗；(3)组培苗进行移栽，将摩西球囊霉FCGX‑1631菌剂与育苗基质混合，培养。本发明所得菌剂对生姜生长有很好的促进作用，适应力以及定殖力强，能促进生姜对土壤中养分的吸收，促进生姜生长、高产；本发明将植物组织培养、菌根化育苗和大棚移栽技术相结合，建立一套生姜菌根化组织培养种苗育苗的技术体系，为生姜的工厂化生产提供技术支持，同时也为其它植物的菌根化育苗，快速繁殖提供相关技术依据。

Description

一种生产生姜菌根组织培养种苗的方法

技术领域

本发明属于植物菌根技术领域，特别涉及生姜菌根组织培养种苗生产技术。

背景技术

生姜是重要的经济作物，是我国部分地区重要的农业支柱产业。影响生姜种植的土传病害主要为姜瘟病，主要是由于土壤连作或由带病的姜种传播。它已严重制约生姜产业的发展。

利用生姜组织培养技术，规模化生产生姜种苗，能提高生姜种苗质量。同时，利用菌根技术，在移栽时对组培苗进行高效菌根真菌的人工辅助接种，实现种苗菌根化，这对提高生姜组织培养苗的移栽成活率、改善其生长状况将起到至关重要作用。此外，生姜幼苗在接种菌根真菌后，在大田种植中，可以提高植株对土传病菌的抗病力。因此，培育菌根化脱毒苗是生姜种苗培育的发展趋势。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

本发明分离得到一株丛枝菌根(AM)真菌的优势菌株——摩西球囊霉FCGX-1631，用该菌株制成AM菌剂，在适宜的共生培养体系条件下，对生姜有显著的促生及防病功能。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：

一种生产生姜菌根组织培养种苗的方法，利用摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中的应用，该菌剂对生姜生长有明显促进作用。

生产生姜菌根组织培养种苗的方法，包含以下操作步骤：

(1)组培苗培养条件：取生姜姜块催芽处理后埋入无菌沙中，等姜芽长至3～5cm后，将其进行无菌处理，切取茎尖在诱导培养，然后进行继代培养，再进行生根培养，生根培养条件为在温度25℃～26℃，光强度1500～1800Lx，光照时间l0h·d^-1，即得生姜组培苗；

(2)生姜组培苗菌根化培养：取步骤(1)中所得的具有2～3条根和3～4片叶的生姜组培苗，进行为期20～30天的炼苗；

(3)步骤(2)中组培苗经过炼苗后，将具有3～5条根、4～6片叶以上的生姜组培苗进行移栽，将摩西球囊霉FCGX-1631菌剂与育苗基质(育苗基质主要成分为草炭、蛭石、珍珠岩和大量元素及微量元素)按体积比1:1混合，将生姜组培苗在该培养基上培养。

优选的是，还包括步骤(4)养护管理，即养护管理为盖塑料薄膜保湿15～20天，保持湿度70～80％，30天后按照正常组培苗管理，同时每2周喷施50％Hoagland营养液。

优选的是，步骤(1)中所述的催芽处理温度为30℃，催芽时间为24h；诱导培养30天，然后进行继代培养30天，再进行生根培养。

优选的是，步骤(1)中所述的诱导培养为在培养基为MS+6-BA(3.5mg/mL)+NAA(0.1mg/mL)+利福平40mg/L的诱导培养基中培养。

优选的是，步骤(1)中所述的继代培养为在继代培养基为MS+6-BA(2.0mg/mL)+NAA(0.5mg/mL)的继代培养基中培养。

优选的是，步骤(1)中所述的生根培养为在培养基为MS+6-BA(1mg/L)+NAA(1mg/L)的生根培养基中培养。

优选的是，步骤(3)中所述的摩西球囊霉FCGX-1631菌剂，其制备方法包含如下步骤：

(a)以玉米为宿主，将摩西球囊霉FCGX-1631的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于以河沙沸石培养基质中，光照培养12～16周，即得摩西球囊霉菌丝；采用盆栽(780×350×250mm)生产模式，宿主密度为35～45株/盆；

(b)将步骤(a)中培养12～16周的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、培养基质和保留的玉米根系即为摩西球囊霉FCGX-1631菌剂，菌剂中孢子量为80～120个孢子/g，培养基质中除了有菌丝还含有摩西球囊霉的孢子；接种量按照每盆(780×350×250mm)玉米使用100g摩西球囊霉FCGX-1631菌剂。

优选的是，步骤(a)中所述的摩西球囊霉FCGX-1631，分类命名为摩西球囊霉(Glomus mosseae)FCGX-1631，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年04月21日，保藏号：CGMCCNo.10731。

优选的是，步骤(a)中所述的河沙沸石培养基质为河沙和沸石成3:1体积比；所述的河沙沸石培养基质预先在121℃高压蒸汽下灭菌1h。

优选的是，步骤(a)中培养期间每7～10天浇注质量浓度为25～50％的Hoagland营养液100mL。

本发明中摩西球囊霉(Glomus mosseae)FCGX-1631也能直接用于生姜生产中，对生姜同样具有促进作用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明所得菌剂对生姜生长有很好的促进作用，适应力以及定殖力强，能促进生姜对土壤中养分的吸收，促进生姜生长、高产；进一步的本发明将植物组织培养、菌根化育苗和大棚移栽技术相结合，建立一套生姜菌根化组织培养种苗育苗的技术体系，为生姜的工厂化生产提供技术支持，同时也为其它植物的菌根化育苗，快速繁殖提供相关技术依据。

附图说明

图1是本发明摩西球囊霉FCGX-1631的菌株形态特征。

图2是采用本发明制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中催芽后所得。

图3是采用本发明制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中诱导培养后所得。

图4是采用本发明制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中继代培养后所得。

图5是采用本发明制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中生根培养厚所得。

图6是本发明生姜菌根组培苗，其中A是培养1个月的早期菌根组培苗；B是中培养3个月期菌根组培苗，C是培养3个月菌根组培苗近照。

图7是生姜菌根组培苗根系，其中CK为空白对照，AM为菌根组培苗菌株，即采用本发明制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中运用后所得组培苗菌株。

图8是本发明生姜菌根与对照组生姜菌根侵染检测，其中A是菌丝及泡囊；B是菌丝；C为菌丝及孢子；D为对照组(CK)。

具体实施方式

下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。

下列实施例中单位：天表示为d，每天表示为d^-1，小时表示为h，分钟表示为min，秒表示为s；体积升表示为L，毫升表示为mL；度量单位米表示为m，厘米表示为cm，毫米表示为mm。

实施例中育苗基质购自长春赛世农业开发有限责任公司，主要成分为草炭、蛭石、珍珠岩和大量元素及微量元素。

各培养基中，如诱导培养基{MS+6-BA(3.5mg/mL)+NAA(0.1mg/mL)+利福平40mg/L}中，6-BA(3.5mg/mL)表示，每1ml培养基中加入3.5mg的6-BA；NAA(0.1mg/mL)表示，每1ml培养基中加入0.1mg的NAA。

实施例1

一株摩西球囊霉FCGX-1631的筛选过程如下：

(1)从广西扶绥县采集的多年宿根甘蔗根际土壤10～20g作为培养物放入食品搅拌机杯中，加入600mL去离子水高速离心3～5s；

(2)将步骤(1)中高速离心所得物质倒出，依次通过3个土壤标准筛(孔径为上层0.8mm，中间0.25mm，下层0.0385mm)，大部分砂砾余留在食品搅拌机杯中，用流水冲洗每层筛子，直至流出的水是清水；

(3)下层筛子里的残余物转至60％蔗糖的离心管中，1500转/min离心3min，离心管中上清液迅速倒至孔径0.0385mm筛子；

(4)用水冲洗筛子中的上清液遗留物1～2min后转移至玻璃培养皿，体视显微镜观察孢子；

(5)在体视显微镜下先观察记录孢子的颜色、大小、连孢菌丝的特征、孢子果形态等；在此基础上，用毛细吸管挑取新鲜的AM真菌孢子置于载玻片上，加浮载剂(如水、乳酸、乳酸甘油、PVLG)后，在Nikon E-600显微镜下观察，记录孢子的形状、大小、颜色、表面纹饰，孢子内含物、连孢菌丝的数目、宽度及形状、孢壁结构，辅助细胞(土生泡囊)，外生菌丝及附属结构产孢子囊等特征；同时辅助使用Melzer's试剂、棉蓝试剂，观察孢子的特异反应，对有代表性或特异性的特征进行拍照；根据孢子的形态特征，采用Sch üβler&Walker(2010)的分类系统，并参阅Schenck&Perez(1988)的“VA菌根真菌鉴定手册和相关网站：http://invam.caf.wvu.edu(INVAM,West Virginia University,USA)；http://www.zor.zut.edu.pl/Glomeromycota/Taxonomy.html(Department of Plant Pathology,University of Agriculture in Szczecin,Poland)及http://www.lrz.de/～schuessler/amphylo/amphylogeny.html的鉴定资料以及近几年发表新种的原始描述，进行种属的检索、鉴定。对于难确定的种或可能的新种、新记录种进一步进行单孢培养，获得大量的同源孢子，再确定种类，部分种类采用分子生物学方法辅助鉴定。AM真菌孢子以Melzer's:PVLG＝1:1或PVLG为浮载剂制成玻片标本，密封、编号、并进行贮藏。

结果

(一)菌株形态特征

孢子果：黄棕色至浅褐色，多不规则圆形，内含1至多个孢子，171～480μm有菌丝包被，如图1A所示；

孢子：桔杆黄色至暗棕色，多数黄褐色，幼嫩孢子颜色稍浅，乳白色至淡黄色，如图1B所示；

球形101.7～165(142)μm、近球形105.6×91.9μm～160.7×133.7(132.4～116.9)μm、有时不规则形；

孢子壁：3层，L1无色透明，易脱落，厚约0.5～1μm，Melzer’s试剂中粉红色呈；L2无色透明1～1.8μm，Melzer’s试剂中粉红色至浅紫色，乳酸酚棉蓝试剂中湖蓝色；L3浅黄色至黄棕色，层积壁，厚2.0～2.7μm，在连点处增厚至4.7～6.0μm，Melzer’s试剂和乳酸酚棉蓝试剂中不变色；

连孢菌丝：宽6～8μm，连点漏斗状，宽15～24μm，漏斗底部有厚凹隔；内含物油滴及细沙粒状，浅灰色至无色，乳酸酚棉蓝中浅蓝至湖蓝色。

(二)鉴定结果

综合形态学和分子生物学特征，将菌株鉴定为Glomus mosseae。

实施例2

菌株菌剂对盆栽生姜种植的促进作用

一、菌株菌剂的制备

一株摩西球囊霉FCGX-1631菌剂的制备方法如下：

(a)以玉米为宿主，将摩西球囊霉FCGX-1631的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于121℃高压蒸汽下灭菌1h、河沙：沸石＝3:1体积比的河沙沸石培养基质中，光照培养12～16周，即得摩西球囊霉菌丝；光照培养期间每7～10天浇注质量浓度为25～50％的Hoagland营养液100mL；其中，种植采用盆栽(780×350×250mm)生产模式，宿主密度为35～45株/盆；

(b)将步骤(a)中培养12～16周的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、培养基质和保留的玉米根系即为摩西球囊霉FCGX-1631菌剂，所得菌剂中孢子量为80～120个孢子/g，培养基质中除了有菌丝还含有摩西球囊霉的孢子；接种量按照每盆(780×350×250mm)玉米使用100g摩西球囊霉FCGX-1631菌剂。

二、菌株菌剂在生姜生产中的应用

2.1上述制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中的运用，操作步骤如下：

(1)组培苗培养条件：取生姜姜块，用清水冲洗干净，多菌灵浸泡20min，不冲洗晾干，在30℃恒温培养箱中进行催芽处理24h后埋入无菌沙中，用无菌沙覆盖、保湿，姜芽长至3～5cm的时候切取新芽带少量老姜，用加有洗洁精的自来水，软毛牙刷刷洗表面，自来水冲洗干净后再用流水冲2h，用小刀轻轻将姜芽多余的苞叶去掉，装到灭过菌的瓶子；无菌操作台上进行外植体灭菌，酒精(0～1min)+升汞(12～18min)，无菌水冲洗5次，姜芽的老姜部分全部切除，然后将姜芽接入外植体诱导培养基{MS+6-BA(3.5mg/mL)+NAA(0.1mg/mL)+利福平40mg/L}中进行诱导培养，诱导培养30d后在继代培养基{MS+6-BA(2.0mg/mL)+NAA(0.5mg/mL)}中进行继代培养，继代培养30d后在生根培养基{MS+6-BA(1mg/L)+NAA(1mg/L)}中进行生根培养，生根培养条件为在温度25℃～26℃，光强度1500～1800Lx，光照时间l0h·d^-1，即得生姜组培苗；

(2)生姜组培苗菌根化培养：取步骤(1)中所得的具有2～3条根和3～4片叶的生姜组培苗，进行为期20～30天的炼苗；

(3)步骤(2)中组培苗经过炼苗后，将具有3～5条根、4～6片叶以上的生姜组培苗进行移栽，将上述制备所得摩西球囊霉FCGX-1631菌剂与育苗基质(育苗基质主要成分为草炭、蛭石、珍珠岩和大量元素及微量元素)按体积比1:1混合，将生姜组培苗在该培养基上培养；

(4)养护管理：盖塑料薄膜保湿15～20天，保持湿度70～80％，30天后按照正常组培苗管理，同时每2周喷施50％Hoagland营养液，培育2～3个月后种植大田。

2.2上述2.1摩西球囊霉FCGX-1631菌剂在生姜生产中的运用作为实验组(AM)；以不添加摩西球囊霉FCGX-1631菌剂，其他操作与2.1中相同，作为对照组(CK)。

结果与分析：

实验组(AM)中生姜组培苗移栽后与菌剂共生培养30天后，与对照组的生姜相比表现出旺盛的生长势，植株叶片深绿，植株健壮(图6)，且根系特别发达(图7)。

生姜根系菌根检测：

生姜苗移植到大田中种植后3个月，从实验组(AM)和对照组(CK)中随机抽取5株苗进行菌根侵染检测。生姜根系用自来水冲洗干净，滤纸吸干水。将根系剪成2cm长，加10％KOH溶液完全浸泡根系，90℃水浴10min后用自来水轻轻冲洗3次，再用10％H₂O₂脱色3h后用自来水冲洗3次。加2％HCl溶液室温酸化20min，去掉HCl溶液，用自来水轻轻冲洗3次。加5％醋酸墨水染色(5mL派克纯黑书写墨水+95mL家用白醋)。染色液室温过夜后，倒掉染色液，染色的根段放在水中保存。挑取脱色处理后的根段于载玻片上，每片平行摆放4个根段，加2～3滴乳酸于根系使起退色作用，盖上24mm×50mm盖玻片，用手指将根段稍用力压扁。使用奥林巴斯BX53-32p02显微镜观察和拍照。

上述对生姜植株根系进行侵染检测，可观察到菌根组培苗的根系有明显的菌丝及孢子(图8A、B、C)。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (10)

1.一种生产生姜菌根组织培养种苗的方法，包含以下操作步骤：

(1)组培苗培养条件：取生姜姜块催芽处理后埋入无菌沙中，等姜芽长至3～5cm后，将其进行无菌处理，切取茎尖在诱导培养，然后进行继代培养，再进行生根培养，生根培养条件为在温度25℃～26℃，光强度1500～1800Lx，光照时间l0h·d^-1，即得生姜组培苗；

(2)生姜组培苗菌根化培养：取步骤(1)中所得的具有2～3条根和3～4片叶的生姜组培苗，进行为期20～30天的炼苗；

(3)步骤(2)中将具有3～5条根、4～6片叶以上的生姜组培苗进行移栽，将摩西球囊霉FCGX-1631菌剂与育苗基质按体积比1:1混合，将生姜组培苗在该培养基上培养。

2.根据权利要求1所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：还包括步骤(4)养护管理，即养护管理为盖塑料薄膜保湿15～20天，保持湿度70～80％，30天后按照正常组培苗管理，同时每2周喷施50％Hoagland营养液。

3.根据权利要求1所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的催芽处理温度为30℃，催芽时间为24h；诱导培养30天，然后进行继代培养30天，再进行生根培养。

4.根据权利要求1所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的诱导培养为在培养基为MS+6-BA(3.5mg/mL)+NAA(0.1mg/mL)+利福平40mg/L的诱导培养基中培养。

5.根据权利要求1所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的继代培养为在继代培养基为MS+6-BA(2.0mg/mL)+NAA(0.5mg/mL)的继代培养基中培养。

6.根据权利要求1所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：步骤(1)中所述的生根培养为在培养基为MS+6-BA(1mg/L)+NAA(1mg/L)的生根培养基中培养。

7.根据权利要求1所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于，步骤(3)中所述的摩西球囊霉FCGX-1631菌剂，其制备方法包含如下步骤：

(a)以玉米为宿主，将摩西球囊霉FCGX-1631的孢子接种于玉米幼苗根系，种植于以河沙沸石培养基质中，光照培养12～16周，即得摩西球囊霉菌丝；

(b)将步骤(a)中培养12～16周的玉米停止浇水，待植株干枯后除去茎秆，保留根系，培养基质中所得菌丝、培养基质和保留的玉米根系即为摩西球囊霉FCGX-1631菌剂。

8.根据权利要求7所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于，步骤(a)中所述的摩西球囊霉FCGX-1631，分类命名为摩西球囊霉(Glomus mosseae)FCGX-1631，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2015年04月21日，保藏号：CGMCC No.10731。

9.根据权利要求8所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：步骤(a)中所述的河沙沸石培养基质为河沙和沸石成3:1体积比；所述的河沙沸石培养基质预先在121℃高压蒸汽下灭菌1h。

10.根据权利要求8所述生产生姜菌根组织培养种苗的方法，其特征在于：步骤(a)中培养期间每7～10天浇注质量浓度为25～50％的Hoagland营养液100mL。